Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2 4 ở lúa (oryza sativa)

Trong nghiên cứu công bố năm 2011[32], tác giả đã phân tích khả năng vận chuyển chọn lọc cation của OsHKT2;4, OsHKT2;4 thể hiện cách thức chọn lọc và vận chuyển ion K+ và Na+ tương đối k

-

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-** -

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Đỗ Thị Phúc

H Nội

Thị Phúc , người đã hướng dẫn, quan tâm và tận tình chỉ bảo, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Cảm ơn cô,

người đã luôn truyền cảm hứng và niềm tin cho tôi trong từng thí

nghiệm, từng công việc

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô công tác tại

Bộ môn Di truyền học đã quan tâm và tạo mọi điều kiện

thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn Các thầy cô đã chỉ bảo cho tôi

sự cẩn thận, kiên trì và nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới CN Trần Xuân An, CN

Phạm Quỳnh Hoa, CN Ngô Thị Hạnh đã luôn giúp đỡ tôi

trong các thí nghiệm Các em đã luôn quan tâm và truyền đạt cho tôi

những kinh nghiệm quý báu trong thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Protein và Enzyme; Học viện Nông

nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực

hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người

thân, những người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt

nhất để tôi học tập Cảm ơn mọi người đã luôn động viên, khuyến

khích tôi trong quá trình học tập và thí nghiệm

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Nguyễn Tiến Đạt

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Lúa (Oryza sativa) 3

1.2 Giới thiệu về họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT ở thực vật và ở lúa 4

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật 5

1.2.2 Họ protein HKT ở cây lúa 8

1.2.3 Gen OsHKT2;4 9

1.2.4 Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 10

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa hình nucleotide 11

1.3.1 Phương pháp RFLP-PCR 11

1.3.2 Phương pháp giải trình tự 14

1.4 Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen 16

1.4.1 Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ 16

1.4.2 RT-PCR và Real-time PCR 17

1.4.3 Các phương pháp sử dụng chip 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22

Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 25

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 29

3.1.2 Khuếch đại gen OsHKT2;4 bằng PCR 30

3.1.3 Giải trình tự gen OsHKT2;4 31

3.1.4 Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 32

3.2 Phân tích biểu hiện gen 42

3.2.1 Kết quả trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 42

3.2.2 Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 42

3.2.3 Phản ứng Real-time PCR và phân tích mức độ biểu hiện gen OsHKT2;4 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phụ lục 3

Phụ lục 4

Bảng 1.2 Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) 9

Bảng 2.1 Các giống lúa trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Hai nhóm giống lúa phân chia theo các đa hình nucleotide 32

Bảng 3.2 Vị trí các đa hình nucleotide ở nhóm 2 34

Bảng 3.3 Các đa hình amino acid tương ứng với đa hình nucleotide 35

Bảng 3.7 Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ lá giống Nipponbare và Pokkali tại các thời điểm 46

Hình 1.2 Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress

mặn ở thực vật 5

Hình 1.3 Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome 10

Hình 1.4 Phương pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử 13

Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp Sanger cải biến 14

Hình 1.6 Các bước cơ bản trong phương pháp Northern blot 17

Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR 18

Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện 19

Hình 2.1 Các bước thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22

Hình 2.2 Các bước thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện gen OsHKT2;4 25

Hình 2.3 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 26

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá của 14 giống lúa 30

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 30

Hình 3.3 Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit 31

Hình 3.4 Một phần kết quả so sánh các trình tự bằng công cụ MultAlin 33

Hình 3.5 Mô hình dự đoán cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 36

Hình 3.6 Phân bố góc quay của các amino acid trong mô hình cấu trúc 3D qua phân tích Ramachandran Plot 37

Hình 3.7 Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 38

Hình 3.8 Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 39

Hình 3.9 Mô hình dự đoán cấu trúc xuyên màng 40

Hình 3.10 Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa 41

Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số 43

Hình 3.12 Biểu đồ Association curve thể hiện nhiệt độ gắn mồi 44

Hình 3.13 Biểu đồ Amplification curve các mẫu gen OsHKT2;4 45

Pokkali (B) 47

HKT High-affinity Potassium Transporter

DNA Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic acid

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism -

Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide) ddNTP Dideoxynucleotide

MỞ ĐẦU

Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp Việt Nam là một trong những nước chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi khí hậu Với đường bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sông ngòi chằng chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp của nước ta Ở đồng bằng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng Hạn hán và đất nhiễm mặn đã và đang ảnh hưởng đến trên 30 tỉnh thành của nước ta

Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cường peroxide lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy như các gốc superoxide và hydroxyl

Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng, việc hiểu được các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết sức quan trọng Khả năng chịu mặn là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có vai trò rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu mặn Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium transporter) có vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress mặn OsHKT2;4 thuộc nhóm 2 họ protein HKT, OsHKT2;4 được biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+

và K+ Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về gen mã hóa cho protein OsHKT2;4 trên các giống lúa Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở lúa

QH.2014.T.CH - 60420121

2

(Oryza sativa)” với mục tiêu: Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 và nghiên cứu mức

độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở một số giống lúa có khả năng chịu mặn khác

nhau

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA (Oryza sativa)

Lúa (Oryza sativa) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz)

và khoai tây (Solanum tuberosum L.)[39] Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi

Oryza; người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại

thuộc chi này và 2 loài lúa đã được thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73]

Hình 1.1 Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73]

QH.2014.T.CH - 60420121

4

Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á; sau đó được nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và Japonica Japonica được trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn đới trong khi Indica được tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á Hai nhóm sinh thái

này được phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm

sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh, còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung

bình, hạt tròn ngắn

Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện môi

trường và được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới [70] Với tầm quan trọng trong cung cấp lương thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây lúa đang ngày càng được chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong những hướng nghiên cứu đầy tiềm năng

1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỌ PROTEIN VẬN CHUYỂN ION XUYÊN MÀNG HKT Ở THỰC VẬT VÀ Ở LÚA

Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các quốc gia trên thế giới Cây trồng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở nồng độ muối cao [9] Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl-

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học

gây ra (Hình 1.2.) Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51]

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật

Schachtman và Schroeder là hai người đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhưng có trình tự và chức năng tương tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và nấm [56]

HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63] HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien nồng độ [15;26;30]

Hình 1.2 Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp

ứng stress mặn ở thực vật [75]

QH.2014.T.CH - 60420121

6

Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57] Một số protein HKT có tính chọn lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na+ và

K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc vào các ion trong môi trường [57]

Bảng 1.1.Các protein họ HKT đã được nghiên cứu [57]

CaHKT1 Cochlearia anglica AFH37929.1

EcHKT1;1 Eucalyptus camaldulensis AF176035_1

EcHKT1;2 Eucalyptus camaldulensis AF176036_1

EsHKT1 Eutrema salsugineum AFJ23835.1

HbHKT Hordeum brevisubulatum AER42622.1

McHKT1;1 Mesembryanthemum crystallinum AF367366_1

McHKT1;2 Mesembryanthemum crystallinum AAO73474.1

MtHKT1;5 Medicago truncatula AES77170.1

OrHKT1 Oryza rufipogon AAY33540.1

PaHKT1 Phragmites australis BAE44384.1

PtHKT1 Populus trichocarpa EEF03794.1

PutHKT2;1 Puccinellia tenuiflora ACT21087.1

SbHKT1 Salicornia bigelovii ADG45565.1

SmHKT1 Selaginella moellendorffii EFJ18587.1

TaHKT1;5-D Triticum aestivum ABG33949.1

TaHKT1;5-B1 Triticum aestivum ABG33947.1

TaHKT1;5-B2 Triticum aestivum ABG33948.1

TmHKT1;5-A Triticum monococcum ABG33946.1

ThHKT1 Thellungiella halophila BAJ34563.1

VvHKT1;3 Vitis vinifera XP_002267717.1

ScTRK1 Saccharomyces cerevisiae AAA34728

ScTRK2 Saccharomyces cerevisiae AAA35172

VpTrkH Vibrio parahaemolyticus Q87TN7.1

1.2.2 Họ protein HKT ở cây lúa

Ở lúa (Oryza sativa), họ protein HKT cũng được chia ra hai nhóm và được

mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống Trong đó, họ protein HKT nhóm I được

mã hóa bởi các gen OsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và nhóm II được mã hóa bởi các gen OsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4

[57]

OsHKT1;5 được xác định nằm trên locus định lượng SKC1 mã hóa cho một

protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+ trong thân bẹ của cây OsHKT1;1 có thể được biểu hiện ở chồi và rễ OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57] OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57] Dưới điều kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ được điều hòa giảm hoạt động [35;61] Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhưng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc cho cây [31] Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng được biểu hiện trong lá [23;35;44] OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và K+ [64] Cây lúa xử lý mặn ở

150 mM NaCl làm tăng cường biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào

diệp lục Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít

biểu hiện ở rễ [25;29;33]

Bảng 1.2 Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57]

Gen Mã số Nucleotide Nhóm Mã số protein

1.2.3 Gen OsHKT2;4

Gen OsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74] Gen OsHKT2;4 ít biểu

hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân

sinh Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận

chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32]

QH.2014.T.CH - 60420121

10

Hình 1.3 Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome [74]

1.2.4 Tình hình nghiên cứu họ gen OsHKT

Hiện nay, một số thành viên trong họ gen OsHKT đã được nghiên cứu ở các

giống lúa Việt Nam: Đa hình của gen OsHKT1 (OsHKT2;1) trong công bố năm

2016 của Hoa và cộng sự (Pham Quynh Hoa, Rice Science 23:334-338); đa hình của gen OsHKT1;2 công bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32: 189-193); đa hình của gen OsHKT1;4 công bố năm 2015 của Hoa (Đặng Ngọc Hoa, Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN, số 31, 129-135); nghiên cứu mức độ biểu hiện của OsHKT2;1 công bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 2, 54-58) [66-69]

Trên thế giới có một số nghiên cứu về gen OsHKT2;4 nhằm đánh giá về mối

liên hệ của gen này và các quá trình đáp ứng stress mặn ở lúa Nổi bật là các nghiên cứu của T Horie và các cộng sự tại Đại học Shinshu, Nhật Bản Trong nghiên cứu công bố năm 2011[32], tác giả đã phân tích khả năng vận chuyển chọn lọc cation của OsHKT2;4, OsHKT2;4 thể hiện cách thức chọn lọc và vận chuyển ion K+ và

Na+ tương đối khác biệt so với các protein vận chuyển HKT khác

Tác giả đã mô tả sự chọn lọc ion của nhóm II họ gen HKT thông qua protein vận chuyển của lúa OsHKT2;4 biểu hiện trên nấm men và trên trứng ếch châu Phi

(Xenopus laevis) Ở nấm men đột biến làm giảm khả năng hấp thụ K+, OsHKT2;4

đã khắc phục được khiếm khuyết trong phát triển của nấm men Ở tế bào trứng ếch, OsHKT2;4 biểu hiện khiến các tế bào trứng có khả năng thẩm thấu K+ mạnh mẽ Tuy nhiên các tế bào trứng biểu hiện OsHKT2;4 thẩm thấu K+ không yêu cầu sự kích thích ngoại bào bởi Na+, điều này không giống với các protein vận chuyển HKT lớp II khác Hơn nữa, OsHKT2;4 thể hiện khả năng thẩm thấu cả Mg2+ và

Ca2+ khi không có sự cạnh tranh của ion K+, nhưng khả năng thẩm thấu các cation hóa trị 2 là không đáng kể khi có mặt K+ Điều này chứng tỏ OsHKT2;4 giống với một kênh vận chuyển K+ chuyên biệt, không phụ thuộc vào ion Na+, khác với các kênh vận chuyển HKT nhóm II khác, vốn là kênh đồng vận chuyển ion K+/Na+ [32]

Hiện nay chưa có nghiên cứu về gen OsHKT2;4 thực hiện trên các giống lúa

Việt Nam Do đó những thông tin về đa hình hay mức độ biểu hiện của gen

OsHKT2;4 để phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lúa ở Việt Nam còn rất hạn chế

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH NUCLEOTIDE

1.3.1 Phương pháp RFLP-PCR

Phương pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymerase Chain Reaction) sử dụng kỹ thuật phát triển trên cơ sở phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA

PCR là phương pháp được xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980 Phản ứng được thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với trình tự khuôn DNA ban đầu của DNA polymerase Enzyme này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức 3’- OH tự do của

QH.2014.T.CH - 60420121

12

nucleotide trước đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc khuếch đại một vùng DNA mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu

Phản ứng PCR được thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác định ở mỗi chu kỳ Đầu tiên, hai sợi của phân tử DNA kép phải được tách ra để cho phép các cặp mồi bám vào khuôn, được gọi là giai đoạn biến tính DNA (94OC –

98OC) Sau khi tách sợi, nhiệt độ được làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép mồi xuôi và mồi ngược liên kết với các sợi DNA đơn Tùy vào mục đích nghiên cứu, cặp mồi có thể được thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự của vùng DNA quan tâm Tiếp theo enzyme DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA mới từ mỗi sợi đơn theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ kéo dài chuỗi (72OC) Quá trình này được lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ Phản ứng có thể tổng hợp được rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong thời gian vài giờ [72]

Ở nhiệt độ biến tính DNA (khoảng 95OC), các polymerase của đa số sinh vật đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là enzyme chịu nhiệt Người ta đã phân lập được một số vi khuẩn phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, như vi khuẩn suối nước nóng Thermus aqaticus và tách được polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase) Việc tìm ra

enzyme chịu nhiệt đã mở ra bước tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử

1.3.1.2 RFLP-PCR

RPLP-PCR là phương pháp phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thường được

sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền Phương pháp sử dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn Đa hình di truyền của các mẫu DNA được phân tích dựa trên sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sản phẩm cắt bằng enzyme cắt giới hạn [72] Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sẽ cho biết sự đa hình đoạn DNA phân tích

Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện,

có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide Tuy nhiên, nhược điểm là không xác định được chính xác trình tự gen, trình tự và vị trí đa hình Mỗi enzyme

Hình 1.4 Phương pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu

di truyền phân tử [79]

QH.2014.T.CH - 60420121

14

giới hạn thường chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ khó có thể phân tích được các gen có tính đa hình cao, do đó phương pháp không thích hợp cho phân tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt

1.3.2 Phương pháp giải trình tự

Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu

di truyền phân tử Từ phương pháp giải trình tự đầu tiên của Sanger, đến nay các phương pháp giải trình tự ngày càng được phát triển để đáp ứng với yêu cầu về độ chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao [73]

Phương pháp giải trình tự DNA đầu tiên được mô tả bởi Sanger và Coulson được gọi là phương pháp “cộng và trừ” [54] Phương pháp này sử dụng DNA

polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside

triphosphate khác nhau [19;20] Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase được điện di trên gel acrylamide Do sự không hiệu quả của phương pháp này, nên 2 năm sau đó ông và cộng sự đã mô tả một phương pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các

Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp Sanger cải biến[76]

oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme [55]

Phương pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và được biết đến như phương pháp Sanger hay phương pháp dideoxynucleotide Bao gồm một enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ sung với các mẫu DNA quan tâm Phản ứng sẽ được kéo dài cho đến khi các enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) được đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc Phản ứng được thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngoài thành phần của phản ứng PCR thông thường sẽ chứa một loại ddNTP được đánh dấu

Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các DNA kích thước khác nhau được điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đường chạy song song

và được đọc bằng phóng xạ tự ghi Các phương pháp giải trình tự bằng enzyme khác cũng được sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu

di truyền [27]

Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert

đã phát minh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình tự các nucleotide trong chuỗi DNA Theo phương pháp này, trước hết phân tử DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể được phát hiện bằng hình ảnh phóng xạ Sau đó các nucleotide trong phân tử DNA được đánh dấu sẽ được xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại những vị trí nucleotide khác nhau Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,

và C Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base [41] Các đoạn này được điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme [4;53]

Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn DNA, từ đó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen

QH.2014.T.CH - 60420121

16

Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng

xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản,

hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu

sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [73]

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN

1.4.1 Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ

Phương pháp lai Northern blot được ra đời vào năm 1977, là một kĩ thuật được sử dụng để phát hiện và định lượng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn hợp các RNA Northern blot được ứng dụng để phân tích các mẫu RNA từ một mô hay tế bào cụ thể để định lượng mức độ biểu hiện của những gen quan tâm

Phương pháp Northern blot sử dụng mẫu RNA đã được biến tính thành các sợi đơn Các phân tử RNA này sau đó được phân tách theo kích thước nhờ điện di Sau khi điện di, RNA trên các băng được chuyển lên màng thấm Các màng thấm này sẽ được lai với các mẫu đầu dò được thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với chuỗi RNA quan tâm trong mẫu Các đầu dò được phát hiện và định lượng nhờ được gắn các nhãn phóng xạ nhờ đó xác định được kích thước và nồng độ của phân tử RNA quan tâm [34]

Cùng với sự phát triển của khoa học, các cải tiến trong lai Northern blot cũng được ra đời Tiêu biểu là việc sử dụng huỳnh quang thay thế cho các nhãn phóng xạ

Ưu điểm của huỳnh quang là an toàn, ít đòi hỏi các thiết bị máy móc phức tạp như

sử dụng nhãn phóng xạ [78]

Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ là phương pháp mạnh mẽ nhằm định tính và bán định lượng mức độ biểu hiện gen; phương pháp được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền phân tử Tuy nhiên lai Northern blot đòi hỏi một lượng mẫu tương đối lớn, do đó phương pháp khó áp dụng cho các trường hợp gen

có mức độ biểu hiện thấp hay mức chênh lệch biểu hiện giữa các giống là tương đối nhỏ

1.4.2 RT-PCR và Real-time PCR

Phương pháp RT-PCR và Real-time PCR phát triển từ phản ứng PCR cơ bản nhằm phân tích và định lượng chuỗi RNA quan tâm một cách đặc hiệu Với ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, đặc hiệu và độ nhạy cao, có thể phân tích với lượng mẫu rất nhỏ, phương pháp RT-PCR và Real-time PCR đang ngày càng phổ biến và phát triển trong nghiên cứu di truyền phân tử [3]

Hình 1.6 Các bước cơ bản trong phương pháp Northern blot [78]

QH.2014.T.CH - 60420121

18

Phản ứng RT-PCR được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cDNA từ RNA bằng enzyme phiên mã ngược cDNA sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Sản phẩm của RT-PCR có thể được định lượng nhờ điện di trên gel agarose sau khi chạy phản ứng PCR hoặc sử dụng phản ứng Real-time PCR Real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm được phân tích dựa trên cường độ tín hiệu huỳnh quang,

từ đó tính toán được nồng độ khuôn ban đầu [3;70]

Real-time PCR cho phép định lượng nồng độ sản phẩm và nồng độ khuôn với độ chính xác và độ nhạy cao Phương pháp Real-time PCR có thời gian thực hiện ngắn với ít thao tác thí nghiệm, nhờ đó tránh được hiện tượng nhiễm hay suy thoái mẫu so với sử dụng phản ứng RT-PCR Nhờ những đặc điểm ưu việt, Real-time PCR được xem là một công cụ mạnh mẽ trong định tính và định lượng các mẫu sinh học phân học phân tử [10;22].

Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR [77]

1.4.3 Các phương pháp sử dụng chip

Phương pháp sử dụng chip Microarray là những phương pháp dựa trên nguyên tắc lai phân tử, trong đó các đoạn đầu dò mang chỉ thị được gắn lên bề mặt rắn bằng các liên kết hóa học Các dạng phân tử quan tâm sẽ được chạy qua giá thể gắn đầu dò Quá trình lai phân tử diễn ra một cách đặc hiệu giữa đầu dò và phân tử cần quan tâm, nhờ các chỉ thị như phóng xạ hay huỳnh quang gắn trên đầu dò, người ta xác định được chính xác vị trí và trình tự của phân tử

Phương pháp này có thể thực hiện để định tính và định lượng cùng lúc nhiều gen trong một thời gian ngắn, với hiệu quả và độ nhạy rất cao Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi hệ thống máy móc phức tạp cùng chi phí vận hành cao [71]

Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện [71]

QH.2014.T.CH - 60420121

20

CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 14 giống lúa được cung cấp bởi Học viện Nông

nghiệp Việt Nam (Bảng 2.1.) Trong đó 14 giống lúa được sử dụng để phân tích đa

hình và 2 giống lúa (giống Nipponbare và Pokkali) để phân tích mức độ biểu hiện gen

Bảng 2.1 Các giống lúa trong nghiên cứu

Số thứ tự Tên giống lúa Nguồn gốc

13 Nipponbare Giống chuẩn mẫn cảm

14 Pokkali Giống chuẩn chịu mặn

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

- Kit tổng hợp cDNA: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit;

- Kit tinh sạch: GeneJET ® PCR Purification Kit;

- Dream Taq polymerase, Dream Taq buffer 10x, dNTPs;

- Luminaris HiGreen Low ROX qPCR Master Mix (2X SYBR Green mix)

- Mồi sử dụng cho phản ứng PCR (Bảng 2.2.)

- Thang chuẩn điện di 1Kb, 100bp;

- Dung dịch thủy canh Yoshida;

- Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng một số hóa chất thường dùng trong

nghiên cứu sinh học phân tử khác như agarose, đệm TAE, EtBr …

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong nghiên cứu

Kích thước sản phẩm PCR

OsHKT2;4-Fw 5’-GACAGATACACTAT

TACAGTGCCTT-3’

Khuếch đại toàn bộ gen

OsHKT2;4

từ cDNA

113 bp RT-HKT2;4-Rv 3’-ACCCCGAGAAGCTG

TATGG-5’

91 bp RT-Actin1-Rv

3’-TGAATGAGTAACCAC GCTCCG-5’

Thiết bị: Máy ly tâm 22R Hettich, máy PCR 9700/Kyratex, bể điện di

Biorad, bể ổn nhiệt, máy chiếu UV… (phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4

Để nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4, chúng tôi tiến hành các phương pháp

theo sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Các bước thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4

Tách chiết DNA tổng số

Điện di kiểm tra

Khuếch đại vùng chứa gen Điện di kiểm tra

Giải trình tự Phân tích đa hình

2.2.1.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của 14 mẫu lúa được tách chiết từ mẫu lá cây lúa trồng trong đất khoảng 2 – 3 tuần Mẫu được nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu Mixer mill (Retsch, CHLB Đức) ở nhiệt độ lạnh sâu, sau đó tiến hành tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB

50 mg mẫu lá được nghiền nhỏ, sau đó bổ sung thêm 500µl đệm CTAB, hỗn hợp được chứa trong ống ly tâm 1,5ml và được trộn đều bằng máy votex Sau khi ủ

ở 65O

C trong 15 phút, mẫu được để nguội ở nhiệt độ phòng và bổ sung 500µl Chloroform-Isoamylacohol (tỷ lệ 24:1), tiếp tục trộn đều bằng máy votex Ly tâm mẫu ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4OC Sau khi ly tâm, tiến hành thu dung dịch bên trên và chuyển sang ống ly tâm mới Bổ sung 300µl Isopropanol và giữ ở nhiệt độ lạnh trong 10 phút, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4OC Thu tủa DNA và rửa bằng 500µl EtOH 70% Ly tâm thu lại tủa ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4OC Để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ Hood trong khoảng 60 phút, sau đó hòa tan tủa DNA trong đệm TE và bảo quản ở -20OC

DNA sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng các điện

di trên gel agarose 1% và đo OD bằng máy Nanodrop Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Mỹ)

2.2.1.2 Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR

Gen quan tâm được khuếch đại bằng phản ứng PCR với thể tích 50µl với cặp

mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen OsHKT2;4 đã được công bố trên

QH.2014.T.CH - 60420121

24

 Mồi Rv (10 µM) 1,5 µl

 Taq polymerase (5U/µl) 0,3 µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

2.2.1.3 Điện di trên gel agarose

Điện di là một phương pháp phổ biến và đơn giản sử dụng trường điện từ để phân tách và xác định các phân đoạn nucleotide acid với kích thước khác nhau Điện di trên gel agarose sử dụng gel agarose với cấu trúc lưới gồm các lỗ gel Trong quá trình di chuyển trong trường điện từ, các phân tử có kích thước nhỏ hơn sẽ dễ dàng đi qua các lỗ gel do đó sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử

có kích thước lớn

5µl mẫu được trộn đều với 1µl dye 6X, mẫu được chạy trên gel agarose 2% ở 90V trong 25-35 phút trong điều kiện tối sau đó được nhuộm với EtBr trong vòng 3 - 15 phút và được kiểm tra dưới đèn cực tím Kích thước tương đối của sản phẩm được xác định dựa vào thang chuẩn 1Kb hoặc thang chuẩn 100bp

1-2.2.1.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra trên gel agarose được tinh sạch bằng kit GeneJET ® PCR Purification (Thermo Scientific) và được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất DNA sau khi tinh sạch được giải trình tự bằng máy giải trình

tự ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer bởi công ty First Base (Singapore) Kết quả giải trình tự được phân tích trên phần mềm Chromas và BioEdit, sau đó chúng

tôi sử dụng công cụ Clustal Omega của European Bioinformatics Institute và công

cụ Multiple sequence alignment (MultAlin) để so sánh các trình tự

2.2.1.5 Dự đoán cấu trúc protein OsHKT2;4

Kết quả giải trình tự sau khi phân tích đa hình nucleotide được sử dụng để xây dựng và dự đoán cấu trúc protein HKT2;4 Trình tự nucleotide được loại bỏ vùng intron và được phiên mã sang trình tự amino acid bằng công cụ Translator Từ trình tự amino acid thu được, mô hình cấu trúc protein bậc ba và mô hình cấu trúc xuyên màng được dự đoán và xây dựng bằng công cụ Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 (PHYRE 2) của Structural Bioinformatics Group, kết quả được đọc trên hệ thống phần mềm JMol, Chimera và được kiểm tra độ tin cậy qua phân tích Ramachandran Plot Analysis

2.2.2 Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen

Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen OsHKT2;4 được

chúng tôi tiến hành theo sơ đồ Hình 2.5

Hình 2.2 Các bước thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện gen OsHKT2;4

Trồng lúa thủy canh trong growth chamber

QH.2014.T.CH - 60420121

26

2.2.2.1 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn

Hạt giống được ngâm ủ 4 ngày trong điều kiện tối Hạt lúa sau khi nảy mầm được chuyển sang khay chứa dncnung dịch thủy canh Yoshida Sau 1 tuần, cây lúa được chuyển vào growth chamber với điều kiện 12 giờ chiếu sáng ở 26OC và 12 giờ tối ở 22OC pH của dung dịch thủy canh được duy trì trong khoảng 5.0 – 5.5 và được thay mới hàng tuần

Ba nhóm mẫu được đánh dấu: nhóm cây đối chứng (không xử lý mặn); nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 50 mM và nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 100 mM Sau 14 ngày trồng trong dung dịch dinh dưỡng, thí nghiệm xử lý mặn được tiến hành ở hai nhóm cây bị xử lý mặn bằng cách bổ sung NaCl vào dung dịch dinh dưỡng để đạt nồng độ tương ứng là 50 mM và 100 mM Nhóm đối chứng không bổ sung NaCl vào dung dịch dinh dưỡng

Hình 2.3 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn

Mô lá và mô rễ được thu thập ở cả 3 nhóm mẫu tại các thời điểm 1h, 3h, 5h, 24h, 48h, 72h và 7 ngày sau khi xử lý mặn Các mẫu thu được tại mỗi thời điểm sẽ

được nghiền ngay trong nitơ lỏng và được lưu trữ ở -80oC để sử dụng làm vật liệu cho phân tích biểu hiện gen

2.2.2.2 Tách chiết RNA tổng số và xử lý với DNaseI

Chúng tôi sử dụng kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit của Thermo Scientific để tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá

Mẫu mô lá sau khi được nghiền nhỏ sẽ được trộn đều với đệm Lysis, ly tâm hỗn hợp và thu dịch nổi pha trên Dịch nổi được bổ sung cồn tuyệt đối và chuyển lên cột lọc chứa màng gel silica có ái lực với nucleotide acid và được rửa với Wash Buffers RNA được thu rửa giải bằng dung dịch Nuclease-Free RNA sau khi thu được sẽ được lưu trữ ở nhiệt độ -80OC

Để loại bỏ DNA trong mẫu, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu sau khi tách với DNaseI 20µl mẫu RNA được bổ sung 1µl DNaseI (1U/µl) và 1µl Buffer, ủ ở 37OC trong 30 phút DNaseI sau đó được gây ức chế hoạt động bằng cách ủ ở 70OC trong

15 phút với 1µl EDTA 50 mM

2.2.2.3 Tổng hợp cDNA và Real-time PCR

RNA sau khi được xử lý DNAseI được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp cDNA Chúng tôi sử dụng kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit của Thermo Scientific và thực hiện theo quy trình: 2µl mẫu RNA tổng số được trộn đều với 1µl mồi oligodT và 9µl H2O, hỗn hợp được ủ ở 65OC trong 5 phút và được làm lạnh nhanh trên nước đá trong 1 – 2 phút Sau đó bổ sung 4µl 5X Reaction Buffer, 1µl RiboLock Rnase Inhibitor (20U/µl), 2µl dNTPs 10mM và 1µl Revert Aid M-MuLV RT (200U/µl); hỗn hợp được ủ ở 42OC trong 60 phút, sau đó ủ ở 70O

C trong

5 phút

Để đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4, chúng tôi định lượng

mRNA thông qua phản ứng Real-time PCR cDNA sau khi tổng hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với mồi RT-HKT2;4 và mồi Actin Thành phần của phản ứng với tổng thể tích 20 µl bao gồm:

Sản phẩm của phản ứng khuếch đại sẽ được định lượng ngay khi phản ứng

đang diễn ra nhờ tín hiệu huỳnh quang Nồng độ sản phẩm được phân tích dựa trên

cường độ tín hiệu huỳnh quang

Mức độ khác biệt về nồng độ mRNA trong các mẫu được tính dựa trên công

thức (Ct):

N= 2-(Ct)

Trong đó Ct là giá trị thể hiện mức độ khác biệt của các mẫu thí nghiệm so

với đối chứng nội tại Actin; (Ct) là giá trị thể hiện mức độ khác biệt của các mẫu

xử lý mặn so với mẫu đối chứng thí nghiệm; N là chỉ số Fold change [62]