Ứng dụng bộ kit nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn fab

Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đoàn Văn Thuyết

ỨNG DỤNG BỘ KÍT NHUỘM HÓA HỌC

TẾ BÀO ĐỂ PHÂN LOẠI BỆNH BẠCH CẦU

CẤP THEO TIÊU CHUẨN FAB

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đoàn Văn Thuyết

ỨNG DỤNG BỘ KÍT NHUỘM HÓA HỌC

TẾ BÀO ĐỂ PHÂN LOẠI BỆNH BẠCH CẦU

CẤP THEO TIÊU CHUẨN FAB

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Trần Văn Tính

2 PGS.TS.Bùi Phương Thuận

HÀ NỘI - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu v t quả nghiên cứu của tôi là hoàn toàn

trung thực v đề tài này không trùng với bất cứ đề t i n o đã công bố N u sai tôi

xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả

Đoàn văn Thuyết

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh Học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, đã h t lòng tạo điều kiện để tôi có thể học tập tốt v đạt được những thành quả như ng y hôm nay

Đặc biệt, với lòng bi t ơn sâu sắc, tôi xin g i ời cảm ơn tới thầy cô hướng dẫn T Trần n T nh v PG T Bùi Phương Thuận đã tận tâm hướng dẫn gi p

đ tạo điều iện thuận ợi để tôi ho n th nh uận v n tốt nghiệp

Tôi c ng xin g i ời cảm ơn chân th nh nhất đ n cán bộ nhân vi n của iện

uy t học - Truyền máu Trung ương Trung tâm uy t học - Truyền máu v ãnh đạo Bệnh viện - Bộ ông an đã gi p đ v tạo điều iện để tôi thu thập số liệu, nghiên cứu và ho n th nh luận v n tốt nghiệp

Xin g i tới Ban ãnh đạo Công ty MEDLATEC lời cảm ơn sâu sắc đã tạo điều kiện về thời gian c ng như inh ph để tôi có thể hoàn thành khóa học này

Một lần nữa, tôi xin g i lời cảm ơn tới các thầy cô, bạn bè và toàn bộ những người thân trong gia đình đã uôn gi p đ nhiệt tình v động viên tôi trong suốt quá trình học tập

Học viên

Đoàn Văn Thuyết

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Quá trình sinh máu 3

1.1.1 Cơ quan sinh máu 3

1.1.2 Quá trình sinh máu 3

1.2 Bệnh bạch cầu cấp 3

1.2.1 Khái niệm chung 3

1.2.2 Dịch tễ học 3

1.2.3 Các nguyên nhân gây bệnh 4

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh 4

1.2.5 Phân loại 5

1.2.6 Đặc điểm lâm sàng 6

1.2.7 Đặc điểm xét nghiệm 7

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào 8

1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS) 9

1.3.2 Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER) 10

1.3.3 Kỹ thuật nhuộm sudan B 11

1.3.4 Kỹ thuật nhuộm esteraza 11

1.3.5 Kỹ thuật nhuộm photphataza 13

1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học 14

1.5 Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào 23

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 28

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28

2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu và số liệu 28

2.2.3 Kỹ thuật nghiên cứu 29

2.2.4 Xử lý số liệu 30

2.2.5 Biện pháp hạn chế sai số 30

2.2.6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

2.3 Thực nghiệm 30

2.3.1 Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc và hóa chất nghiên cứu 30

2.3.2 Quy trình nhuộm hóa học tế bào 32

2.3.3 Đánh giá kết quả 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu 37

3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 39

3.2.1 Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho 39

3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm HICYTEC 41

3.2.3 Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho 47

3.3 Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy 48

3.3.1 Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi 48

3.3.2 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết quả

chẩn đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương 50

3.3.3 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm HICYTEC 51

3.3.4 Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng

bộ kít HICYTEC và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW 53

3.4 Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T) 62

3.5 Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu 67

3.6 Kết quả nhuộm sắt trên mẫu tủy của bệnh nhân bạch cầu cấp tại Viện HH- TM trung ương 69

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 70

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

không có tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia, without maturation

tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia,

with granulocytic maturation

17 M3 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy Acute promyelocytic

leukemia

mono

Acute myelomonocytic leukemia

23 NE - NaF Esteraza không đặc hiệu ức chế

bằng NaF

Non-specific esteraza - NaF

inhibitor

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit 9

Hình 1.2 Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit 9

Hình 1.3 H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử 10

Hình 1.4 Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl 10

Hình 1.5 Thủy phân cơ chất este thành naphtol 11

Hình 1.6 Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo 12

Hình 1.7 Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol 14

Hinh 1.8 Quy trình thường quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể

bệnh bạch cầu cấp theo FAB 27

Hình 3.1 Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi và giới tính 38

Hình 3.2 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp 39

Hình 3.3 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi 40

Hình 3.4 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T- thể L1 42

Hình 3.5 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T - thể L2 42

Hình 3.6 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 43

Hình 3.7 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hiền A- Thể L2 43

Hình 3.8 Ảnh nhuộm PER mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 44

Hình 3.9 Ảnh nhuộm PER mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T- Thể L2 44

Hình 3.1 Ảnh nhuộm SD mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 44

Hình 3.11 Ảnh nhuộm SD mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T - Thể L2 44

Hình 3.12 Ảnh nhuộm photphataza axit 48

Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy theo độ tuổi và giới 50

Hình 3.14 Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp theo kết quả chẩn đoán của

Viện Huyết học - Truyền máu trung ương 51

Hình 3.15 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 55

Hình 3.16 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 55

Hình 3.17 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 55

Hình 3.18 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 55

Hình 3.19 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Bùi Thị T - thể M2 56

Hình 3.20 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Hồ Ngọc A - thể M2 56

Hình 3.21 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Đào Minh H-thể M2 56

Hình 3.22 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Đào Minh H-thể M2 56

Hình 3.23 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Văn T-thể M3 57

Hình 3.24 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 57

Hình 3.25 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 57

Hình 3.26 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 58

Hình 3.27 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 58

Hình 3.28 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Trần Thị T-thể M5a 58

Hình 3.29 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Đặng Thị Thu M-thể M5b 58

Hình 3.30 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Dương Quang T-thể M6 59

Hình 3.31 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của Dương Quang T-thể M6 59

Hình 3.32 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Thanh T- Thể M0 60

Hình 3.33 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Thanh T- Thể M0 60

Hình 3.34 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Nguyễn Thanh T 60

Hình 3.35 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của Nguyễn Thanh T 60

Hình 3.36 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Nguyễn Thanh T 60

Hình 3.37 Ảnh nhuộm esteraza đặc mẫu tủy hiệu của Nguyễn Thanh T 60

Hình 3.38 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P 61

Hình 3.39 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P 61

Hình 3.40 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P 62

Hình 3.41 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P 62

Hình 3.42 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân

Đỗ Thị P 62

Hình 3.43 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF mẫu tủy của

bệnh nhân Đỗ Thị P 62

Hình 3.44 Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Lý Trọng Đ 64

Hình 3.45 Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 64

Hình 3.46 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T 64

Hình 3.47 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 64

Hình 3.48 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T 65

Hình 3.49 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 65

Hình 3.5 Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T 65

Hình 3.51 Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 65

Hình 3.52 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T 66

Hình 3.53 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 66

Hình 3.54 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy của

Trương Thị T 66

Hình 3.55 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân

Trần Văn C 66

Hình 3.56 Ảnh nhuộm photphataza kiềm mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C 68

Hình 3.57 Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt mẫu tủy của bệnh nhân

Trương Thị T 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho 5

Bảng 1.2 Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB 6

Bảng 1.3 Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker

và di truyền 16

Bảng 1.4 Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker và di truyền 19

Bảng 1.5 Quy trình kỹ thuật của các bước nhuộm đơn 24

Bảng 2.1 Thành phần bộ kít nhuộm hóa học tế bào 31

Bảng 2.2 Pha chế dung dịch nhuộm 32

Bảng 2.3 Nhuộm glycogen và biệt hóa 33

Bảng 2.4 Nhuộm nhân và nền 34

Bảng 2.5 Nhuộm tăng màu 34

Bảng 2.6 Đánh giá kết quả định tính 35

Bảng 2.7 Đánh giá kết quả bán định lượng 36

Bảng 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp 37

Bảng 3.2 Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính 38

Bảng 3.3 Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính 39

Bảng 3.4 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 41

Bảng 3.5 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít HICYTEC

và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương trên từng

bệnh nhân 46

Bảng 3.6 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 46

Bảng 3.7 Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T 47

Bảng 3.8 Bảng phân bố bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính 49

Bảng 3.9 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính 49

Bảng 3.10 Kết quả phân loại thể bệnh bằng bộ kit nhuộm HICYTEC 51

Bảng 3.11 Kết quả chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng bộ kít HICYTEC

và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW từng đôi một 53

Bảng 3.12 Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy 63

Bảng 3.13 Kết quả nhuộm photphataza kiềm trên bệnh nhân bạch cầu cấp 67

Bảng 3.14 Kết quả nhuộm Perls trên các mẫu tủy bị bệnh bạch cầu cấp 68

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương Bạch cầu cấp được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy xương Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu dòng lympho Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương, chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng [23] Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời Vì vậy, việc xác định chính xác thể bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa

ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]

Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp Theo Trần Ngọc Vũ và cộng

sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc

hiệu là 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19 Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại,

đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết

Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986)

Nội dung nghiên cứu:

 Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

 Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB

 Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu

1.1.1 Cơ quan sinh máu

Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức)

và tổ chức võng mô Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch Sau khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của các xương Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy biệt hóa các dòng lympho T và B [6]

1.1.2 Quá trình sinh máu

Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra

từ tế bào gốc vạn năng Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức năng cần thiết [11] Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony-stimulating factors cùng với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13]

1.2 Bệnh bạch cầu cấp

1.2.1 Khái niệm chung

Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài máu ngoại vi, tủy xương có trên 3 % tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ quan [12]

1.2.2 Dịch tễ học

 Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2 14,

ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Tỷ lệ nam (3.100) và nữ (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450 người [52];

 Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3 trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho mới trên toàn quốc [44];

 Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai [7]

1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh

Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:

 Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có

nguy cơ bị bạch cầu cấp;

 Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để

chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;

 Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho,

Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm

 Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng

Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12]

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh

 Sự hoạt động của các gen ung thƣ (oncogene): Các gen bình thường do

yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen ung thư Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;

 Gen ức chế ung thƣ: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh

được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;

 Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và

kích thích tăng sinh tế bào Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với

Tốt Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21)

Trung bình Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình

thường); Chuyển đoạn t(1;19) Xấu Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn

t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14)

1.2.5 Phân loại

 Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy

theo FAB 1976 Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ M1 đến M7:

 Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa;

 Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;

 Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm:

 M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn;

 M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ

 Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:

 M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;

 M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu ái toan

 Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:

 M5a: ≥8 % tế bào mono là monoblast;

 M5b:<8 % tế bào mono là monoblast

 Thể M6: Thể bạch cầu cấp dòng tủy với hội chứng loạn sản hồng cầu;

 Thể M7: lơ xê mi cấp nguyên mẫu tiểu cầu

lympho được chia làm 3 thể từ L1 đến L3 thể hiện trên bảng 1.2

 Hội chứng thiếu máu: xảy ra nhanh, nặng dần với các biểu hiện da xanh, mệt

mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim nhanh Thường không cân xứng với tình trạng xuất huyết;

 Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự nhiên, hay ở da - niêm mạc (chấm nột

đám mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng ) có thể ở các tạng (xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, tử cung, não - màng não );

 Hội chứng nhiễm trùng: Sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng da;

 Hội chứng thâm nhiễm: Gan to, lách to, hạch to, phì đại lợi , thâm nhiễm da,

đau xương, cơ khớp

 Toàn trạng chung: mệt mỏi gầy sút, suy sụp nhanh

Đều đặn, hình bầu dục hoặc tròn

nhỏ

Một hay nhiều hạt nhân to

Một hay nhiều hạt nhân hình túi

Không bào trong

1.2.7 Đặc điểm xét nghiệm

 Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm;

 Bạch cầu: số lượng bạch cầu thường tăng, nhưng có thể bình thường hoặc giảm Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast Tuy nhiên một số trường hợp số lượng bạch cầu giảm nặng có thể không gặp tế bào blast ở máu ngoại vi;

 Tiểu cầu: số lượng giảm

 Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào Trong một số trường hợp tủy nghèo hoặc có mật độ bình thường;

 Tăng sinh tế bào blast trên 3 % tế bào có nhân trong tuỷ xương;

 Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át

sinh máu có nhiều tế bào ác tính, có thể có tình trạng xơ

có trong tế bào, qua đó xác định được dòng tế bào, kết hợp với kết quả hình thái học trên tiêu bản nhuộm giemsa có thể phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

Bằng kỹ thuật miễn dịch phát hiện các kháng nguyên dấu ấn trên màng các tế bào blast (CD-Cluster of Differentiation) và đối chiếu với sự xuất hiện các CD này trong quá trình biệt hóa và trưởng thành tế bào máu bình thường để biết bản chất dòng và giai đoạn biệt hóa của tế bào trong bệnh bạch cầu cấp

 Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu dòng tủy: Các

tế bào non thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các kháng nguyên CD33 hoặc CD14

 Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho B:

 Tế bào nguồn đầu dòng B: CD1 , CD19;

 Tế bào tiền lympho B: CD1 , CD19, CD2 ;

 Lympho B trưởng thành: CD19, CD2 , CD21, CD22, CD23;

 Tương bào: CD38

 Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T:

 Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA;

 Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3;

 Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4;

 Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8

Xét nghiệm di truyền thường được dùng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh

Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu cấp (chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau:

 t(8;12) trong bạch cầu cấp M2;

 t(15;17) trong bạch cầu cấp M3;

 Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo;

 t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào

Nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã trở thành đối tượng được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng như các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào Năm 1885, Ehrlich là người đầu tiên nhuộm enzym cytochrom oxidaza trong các mô tươi bằng phản ứng "Nadi" giữa

-naphtol và dimethyl-p-phenylethylendiamine và có thể quan sát được trên kính

hiển vi Neukirch (1910) giới thiệu kỹ thuật nhuộm phát hiện các glycogen trong các bạch cầu trung tính bằng phẩm màu carmin theo phương pháp Best [31, 40] Năm 1947, Bailllif và Kimbrough ứng dụng dùng Sudan B nhuộm hạt mỡ bạch cầu

để phân biệt dòng tuỷ và các dòng khác [31, 40 Đầu những năm 5 của thế kỷ XX,

sự phát triển mạnh mẽ của các loại phẩm màu azo đã giúp các nhà nghiên cứu đưa các tiến bộ trong ngành hóa màu vào ứng dụng nhuộm hóa học tế bào [30, 32, 51]

Năm 1953, Gomori là người đầu tiên phát triển kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng naphtol AS-D cloaxetat làm cơ chất [55] Việc phối hợp với các công nghệ khác như kỹ thuật kháng thể đơn dòng và các phương pháp phân tích dòng chảy đã cho phép tự động hóa đạt kết quả tin cậy cao [45 Phương pháp hình thái học-nhuộm hóa học tế bào cùng với miễn dịch và di truyền được ứng dụng rộng rãi trong chuyên ngành Huyết học để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28, 32, 34, 49] Hiện nay, trên thế giới thường sử

dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau:

1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS)

Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit theo hình 1.1:

Hình 1.1 Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit

Ghi chú: R 1 , R 2 là các gốc: amin (-RNH 2 ) hoặc alkyl amino thế (-RNHR')

Giai đoạn 2: Diandehit tạo thành tham gia vào phản ứng nhuộm hoàn nguyên bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2:

NH

Hình 1.2 Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit

Như vậy, về mặt bản chất đây là một phản ứng nhuộm hoàn nguyên nhằm bộc lộ glycogen có trong nguyên sinh chất của tế bào Kết quả dương tính khi có màu đỏ trên nguyên sinh chất của tế bào nghĩa là có glycogen và ngược lại

Phản ứng PAS thường dương tính đối với bạch cầu ung thư dòng lympho, tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh Các tế bào monoxit và lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp Các dòng tế bào khác như dòng tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào bạch cầu

ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính Những tính chất khác nhau đó

là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]

1.3.2 Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER)

Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên hình 1.3 và 1.4 [29, 46]:

Hình 1.4 Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl

Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị khử thành nước và oxi nguyên tử, oxi nguyên tử có tính oxi hóa mạnh đã oxi hóa benzidin thành 2-diimin diphenyl có màu vàng nâu Nếu trên nguyên sinh chất của

tế bào có màu vàng nâu chứng tỏ có mặt của peroxidaza

Peroxidaza dương tính đối với các tế bào dòng tủy, dương tính nhẹ với dòng mono; âm tính với dòng lymphoxít, dòng hồng cầu và tiểu cầu

Peroxydaza

1.3.3 Kỹ thuật nhuộm sudan B

Cơ chế của các phản ứng nhuộm rất khác nhau gồm khuếch tán vật lí đơn thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm nhuộm được ưa chuộng nhuộm lipit từ vàng (Sudan III) đến đen (Sudan B)

Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương tính mạnh, monoxit dương tính yếu, lymphoxit và hồng cầu âm tính Trong tủy xương bình thường, các tế bào dòng tủy dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào trưởng thành, dòng mono chỉ dương tính ở các tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu và tiểu cầu âm tính Trong nhiều trường hợp của bệnh bạch cầu cấp có thể phân biệt tương đối rõ dòng tủy và các dòng tế bào khác bằng kết quả nhuộm Sudan B Kết quả dương tính Sudan B của mẫu bệnh phẩm thường cũng cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm Peroxidaza Chính vì vậy kết quả nhuộm Sudan B là một trong những tiêu chuẩn được ứng dụng phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [28]

1.3.4 Kỹ thuật nhuộm esteraza

a) Nhuộm esteraza đặc hiệu [54]

Cơ chế phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất là các este tạo thành dẫn xuất của naphtol như hình 1.5:

CONH

Hình 1.5 Thủy phân cơ chất este thành naphtol

N N

Hình 1.6 Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo

Cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu gồm nhiều loại: naphtol AS-D cloaxetat, Naphtol AS-OL 2-clopropionat Trong giai đoạn 1, phân tử cơ chất dưới xúc tác của enzym tạo thành napthol theo cơ chế của hình 1.5 và 1.6 Giai đoạn 2 là giai đoạn ghép đôi giữa naphtol và muối điazo Về mặt bản chất đây là phản ứng thế electrophin của nhóm azo cho nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C4 trên vòng naphtol Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ hoặc màu đen Nếu xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza Tốc độ của quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ cơ chất, muối điazo, thành phần dung môi, nhiệt độ và pH môi trường các hóa chất sử dụng luôn đòi hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55]

b) Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế và không ức chế bằng NaF

Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên được công bố vào năm 1959 bởi Braunstein Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất

cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu Cơ chế phản ứng thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm esteraza đặc hiệu (hình 1.4, 1.5 và 1.6) Cơ chất thường sử dụng là naphtol AS axetat, -naphtyl axetat, -naphtyl butyrat và naphtol AS-D axetat Chất ghép đôi thường sử dụng là muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có phổ màu khác nhau từ đen đến đỏ Các cơ chất của -naphtyl axetat, -naphtyl butyrat thường cho phản ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu cầu; các dòng khác lên màu dưới dạng hạt và yếu Riêng tế bào lymphoxít B cho kết quả âm tính Đối với cơ chất naphtol AS-D axetat và naphtol AS Axetat thì dương tính mạnh ở tất cả các dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B Tuy có mức độ dương tính khác nhau nhưng chỉ

có dòng mono bị ức chế bởi NaF với nồng độ 1,5 mg/1 ml Chính nhờ tính chất này

mà kỹ thuật nhuộm với chất ức chế NaF thường dùng để phân biệt dòng mono với các dòng tế bào khác trong bệnh bạch cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]

1.3.5 Kỹ thuật nhuộm photphataza

Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat từ nhiều loại phân tử, bao gồm các nucleotide, protein, và ancaloit [3, 30]

Photphataza có mặt chủ yếu trong lysosom và được giải phóng qua hệ thống lưới nội nguyên sinh chất Photphataza là một hệ enzym không đồng nhất gồm nhiều iso enzym có thể hoạt động ở pH tối ưu khác nhau và được gọi tên gắn liền với điều kiện pH hoạt động tối ưu như: photphataza kiềm (pH=8-9), photphataza axit (pH=5-6,5) [35, 38 Trong các phương pháp nhuộm hóa học tế bào có hai kỹ thuật nhuộm photphataza là: Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm và photphataza axit Với sự phát triển mạnh của kỹ thuật hóa màu đặc biệt là phát hiện phẩm màu azo đã được ứng dụng vào để nhuộm photphataza kiềm và axit

Nguyên lý của kỹ thuật đi qua hai giai đoạn [40, 43]

Giai đoạn 1: Thủy phân cơ chất naphtyl photphat thành các naphtol tương ứng dưới sự xúc tác của photphataza kiềm (ALP) hoặc axít (AP) theo hình 1.7:

ALP/AP PA

Hình 1.7 Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol

Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza

Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ hậu tủy bào đến bạch cầu hạt Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh Ngoài ra các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43]

Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại

tế bào B, tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu Dòng hồng cầu, mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc-tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56]

1.4 Ứng dụng phương ph p nhuộm hóa học tế bào trong y học

Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh học và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học-Truyền máu Trong bệnh bạch cầu cấp, kết quả của phương pháp hình thái học-nhuộm hóa học tế bào, phương pháp marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp cũng như thể bệnh Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng thuốc điều trị đặc biệt là các thuốc nhắm đích Trong bệnh bạch cầu kinh, nhuộm photphataza kiềm thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với các bệnh nhiễm trùng,

về tổ hợp các kết quả của ba phương pháp: Hình thái học-hóa học tế bào, marker

CD, di truyền để phân loại dòng tế bào lympho và thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986)

Bảng 1.3 Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker và di truyền [26]

L1 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là

tế bào blast loại I:

 Hầu hết là tế bào nhỏ;

 Nhân mịn, đồng nhất, hình thoi

dẹt;

 Hạt nhân nhỏ hoặc không rõ;

 Nguyên sinh chất không có hạt ưa

bazơ

hạt to trên một số lymphoblast trong 80%

trường hợp;

2) Peroxidaza, Sudan

B, CE âm tính;

3) NE âm tính trừ tế bào non dòng lymphoxít T

có thể dương tính hạt

1) 1CD (+): TdT; CD (-): Smlg;

2) Early Pre B: (+): CD10, DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, Cylg

3) Pre B: (+): CD19, Cylg, DR; (-/+): CD10; (-): CD3,5

2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13) 3) Pre T và T: t(1; 14) (p32:q11); t(7;v)(q32-q36; v), t(8;14) (q24;q11), t(10;14)(q24;q11),

t(11;14)(p13;q11-q13), inv(14)(q11;q32)

L2 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là

tế bào blast loại I:

 Tế bào to, nhỏ không đều;

2) Peroxidaza, Sudan B,

CE âm tính;

3) NE âm tính trừ tế bào non dòng lymphoxit T

có thể dương tính hạt

1) CD (+): TdT; CD (-): Smlg;

2) Early Pre B: (+): CD10, DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, Cylg

3) Pre B: (+): CD19, Cylg, DR; (-/+): CD10; (-): CD3,5

2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13) 3) Pre T và T: t(1; 14) (p32:q11); t(7;v)(q32-q36; v), t(8;14) (q24;q11), t(10;14)(q24;q11),

t(11;14)(p13;q11-q13), inv(14)(q11;q32)

L3 1) <50% SLTBT là nguyên hồng

cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là

tế bào blast loại I:

 Tế bào to và đồng nhất;

 Nhân đồng nhất, có các chấm hình

tròn hoặc oval;

 Có 1 hoặc nhiều hạt nhân lớn;

 Bào tương vừa, bắt màu bazơ nhẹ

có thể dương tính hạt

1) CD (-): Smlg, TdT;

2) Early Pre B: (+): CD10, DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, Cylg

3) Pre B: (+): CD19, Cylg, DR; (-/+): CD10;

2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13) 3) Pre T và T: t(1; 14) (p32:q11); t(7;v)(q32-q36; v), t(8;14) (q24;q11), t(10;14)(q24;q11),

t(11;14)(p13;q11-q13), inv(14)(q11;q32)

Bảng 1.4 Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker và di truyền [26]

Thể Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy (SLTBT) Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts

3) Không có tế bào trưởng thành dòng hạt

4) Không có hạt đặc hiệu và thể Auer trên

nguyên sinh chất tế bào

1) Peroxidaza dương tính trên kính hiển vi điện tử;

2) Tất cả kỹ thuật nhuộm khác đều âm tính

1) CD (+): 13, 33;

2) CD dòng lympho âm tính (-): TdT, 3, 5, 10,

19

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts

3) Có thể Auer trên nguyên sinh chất tế bào

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) 30-89% tế bào không phải dòng hồng cầu là

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao

gồm cả blasts;

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh

chất;

6) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu

>5.109 hoặc <5.1 9 kèm tăng lysozym trong huyết tương

Peroxidaza, Sudan B, CE, NE-NaF dương tính

1) CD (+): 13, 14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(9; 11) (p22; q23)

Thể Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy (SLTBT) Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

M4eo 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao

gồm cả blasts;

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh

chất;

6) ≥5% tế bào không phải dòng hồng cầu là

bạch cầu ưa axit và gặp các tế bào ưa axit bất thường;

7) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu

>5.109 hoặc <5.1 9 kèm tăng lysozym trong huyết tương

Peroxidaza, Sudan B, CE, NE-NaF dương tính

1) CD (+): 13, 14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(16; 16) inv(16)

M5a 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) ≥8 % tế bào không phải dòng hồng cầu là

monoxít;

4) ≥8 % tế bào monoxít là monoblast;

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên

2) HLA-DR (+)

t(9; 11) (p22:q23)

Thể Hình thái học-số lƣợng tế bào tủy (SLTBT) Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

M5b 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) ≥8 % tế bào không phải dòng hồng cầu

trong tủy là monoxít;

4) <80% tế bào monoxít là monoblast;

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên

2) HLA-DR (+)

t(8;16) (p11:p13)

thường có loạn sản;

2) ≥3 % tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh

2) HLA-DR (+)

1) del(5 và/hoặc 7q); 2) Ba nhiễm sắc thể

số 8

M7 1) ≥3 % tế bào có nhân là blasts;

2) Có thể chẩn đoán bằng máu ngoại vi trong

trường hợp không thể lấy mẫu tủy

1) PAS dương tính 2) Peroxidaza, Sudan B, CE

1.5 Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào

Từ đầu những năm 197 , bộ môn Huyết học-Truyền máu đã triển khai các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào tại khoa Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai Năm 1984, đã xuất bản cuốn kỹ thuật xét nghiệm huyết học-truyền máu trong đó có giới thiệu về các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào Các kỹ thuật nhuộm chủ yếu là nhuộm PAS, peroxidaza và sudan B Sau đó các kỹ thuật nhuộm enzym theo phương pháp muối kim loại và hình thành phẩm màu azo đã được nghiên cứu đưa vào ứng dụng tại các khoa Huyết học-Truyền máu tại các bệnh viện Trung ương ở Việt Nam

Năm 1993, Lê Đức Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến phương pháp đánh giá một số thay đổi hóa sinh trong tế bào bạch cầu ung thư dòng tủy [15 Năm 2 1 , Lưu Văn Bôi và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa, sản xuất các cơ chất và kít nhuộm esteraza bạch cầu người tại Việt Nam với giá thành thấp và đã tìm được cơ chất có độ đặc hiệu cao hơn so với cơ chất của Sigma là hợp chất naphtol AS-OL 2-clopropionat Các tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian của các nhóm thế và các góc nhị diện tạo bởi nhóm cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của

cơ chất đối với phản ứng nhuộm esteraza cho thấy: Các nhóm thế đẩy cho điểm nhuộm

cao hơn các nhóm thế hút điện tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm cao hơn ở vị trí para-; điểm nhuộm cao nhất thuộc về các nhóm N-hiđrocacbon

amit thế và cacboxylat kích thước trung bình [16] Nguyễn Đình Triệu và cộng sự (2 ) đã tiến hành nghiên cứu cơ chế động học bằng phần mềm Hyperchem và thực nghiệm kiểm tra cơ chế của phản ứng nhuộm esteraza không đặc hiệu đã cho thấy phản ứng đi qua giai đoạn tạo phức trung gian, từ đó đưa ra pH tối ưu bằng 8,0 [4, 18]

Ở Việt Nam, hiện chưa có nhiều công trình nghiên cứu về pha chế và chế tạo

bộ kít nhuộm hóa học tế bào Các phòng xét nghiệm đều tự pha các dung dịch nhuộm hóa học tế bào để tiến hành nhuộm dùng trong chẩn đoán và chủ yếu gồm 3

kỹ thuật: PAS, peroxidaza và sudan B Nguyên nhân là các cơ chất dùng cho các kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu, không đặc hiệu ức chế và không ức chế, photphataza kiềm, axit rất dễ bị phân hủy đều phải nhập ngoại với giá thành cao (>10 triệu đồng 1g) và điều kiện bảo quản đòi hỏi ở nhiệt độ <-200

C Mặt khác các kỹ thuật này thường không đồng bộ do mỗi kỹ thuật có thời gian nhuộm, dung dịch cố định khác nhau dẫn đến kỹ thuật viên rất khó thực hiện (xem Bảng 1.5)

Nhuộm các chất cần phát hiện

Tẩy Màu

Nhuộm nền

Số ƣớc nhuộm

Tổng thời gian

Hotchkiss

Hơi formol,

5 phút

Periodic 1%,

Hematoxylin,

10 phút

2 Nhuộm peroxidaza, Kỹ thuật

Quaglino & Flemans

Formalin 10%, trong ethanol

3 Nhuộm sudan B, Kỹ thuật

Sheehan & Storey

Giemsa 7%,

20 phút

4

Nhuộm esteraza đặc hiệu,

Kỹ thuật Wachstein & Wolf

Hơi formol,

5 phút

Naphtol AS-D Cloaxetat 1%,

30 phút

Nuclear Fast Red, 0,1%:

10 phút

Nhuộm các chất cần phát hiện

Tẩy Màu

Nhuộm nền

Số ƣớc nhuộm

Tổng thời gian

5

Nhuộm esteraza không đặc

hiệu, kỹ thuật Wachstein &

Wolf

Hơi formol,

5 phút

Naphtol AS axetat 1%,

60 phút

Nuclear Fast Red 0,1%, 10 phút

&NaF, 60 phút

Nuclear Fast Red 0,1%, 10 phút

thuật Kaplow

Axeton trong đệm xitrat,

30 giây

Naphtol AS-BI phosphate 0,009%, 10 phút

Hematoxylin,

Quy trình chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp hình thái học-hóa học tế bào được thực hiện qua các bước thể hiện trên hình 1.8 Với quy trình này, quá trình nhuộm thường được tiến hành tuần tự nên thời gian thường kéo dài, các kỹ thuật nhuộm enzym đòi hỏi nhuộm càng sớm càng tốt để không bị giảm hoạt tính Ngoài ra, kỹ thuật chọc tủy là một thủ thuật khó, cần tiến hành bởi các bác sỹ có chuyên môn cao và gây đau đớn cho người bệnh Do vậy, mẫu tủy cần phải được xét nghiệm với hiệu quả cao tránh phải chọc tủy nhiều lần, nên việc tiến hành nhuộm đồng bộ một lúc sẽ rút ngắn thời gian chẩn đoán, đảm bảo chất lượng nhuộm Giá thành bộ kít HICYTEC với 10 kỹ thuật nhuộm tốn khoảng 3 đ Số tiền này bằng giá 1 marker (CD) và bằng 1/10 giá

1 xét nghiệm gen (3.2 đ), hơn nữa chỉ sau 1 giờ nhuộm là có thể giúp chẩn đoán nhiều bệnh như: Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB, giảm điểm của nhuộm photphataza kiềm bạch cầu và ứ sắt

Bộ kít này đã được Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp bộ mang mã số: 2011-BV198-11 nghiệm thu và cho phép triển khai tại các cơ sở khám chữa bệnh

BH-trong cả nước

Bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC gồm 10 kỹ thuật đồng bộ gồm:

2 Periodic-Axit Schiff (PAS) Glycogen

6 Esteraza không đặc hiệu Enzym esteraza không đặc hiệu

7 Esteraza không đặc hiệu-NaF Enzym esteraza không đặc hiệu

Hinh 1.8 Quy trình thường quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo FAB

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

 Bệnh nhân có các triệu chứng nằm trong tiêu chuẩn về mặt lâm sàng bạch cầu cấp;

 Bệnh nhân chọc tủy lần đầu, được chẩn đoán xác định bạch cầu cấp và chưa điều trị

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân hoặc thân nhân không đồng ý chọc tủy;

 Bệnh nhân cũ đã và đang điều trị;

 Bệnh nhân không bị bệnh bạch cầu sau khi có kết quả xét nghiệm marker và

di truyền trong chẩn đoán phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB

2.2 Phương ph p nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu và số liệu

Hồi cứu: Sử dụng kết quả nghiên cứu của đề tài cấp bộ "Nghiên cứu chế tạo

bộ kít nhuộm hóa học tế bào để chẩn đoán các dòng tế bào trong bệnh ung thư máu", mã số: BH-2011-BV198-11 của Trần Văn Tính và cộng sự Phương pháp thu thập mẫu của đề tài cụ thể như sau: Thu thập các mẫu tủy của bệnh nhân chọc tủy lần đầu chưa điều trị có các triệu chứng nằm trong tiêu chuẩn về mặt lâm sàng hoặc được chẩn đoán là bệnh bạch cầu cấp từ tuyến khác chuyển đến Viện Huyết học-Truyền máu trung ương từ 27/08/2014-15/06/2015 Mỗi mẫu kéo 10 tiêu bản, chuyển về Trung tâm Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện 19-8, Bộ Công an tiến hành nhuộm bằng bộ nhuộm HICYTEC gồm 10 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào Tiến hành đọc kết quả và phân loại thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB dựa trên kỹ thuật