Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng parvovirus gây bệnh trên chó tại hà nội

TRÍCH YẾU LUÂṆ VĂN Tên tác giả: Phaṃ Hồng Ngoc ̣ Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của môṭsố chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội Tên

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHAṂ HỒ

NG NGOC̣

“NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ

CHỦNG PARVOVIRUS GÂY BỆNH TRÊN CHÓ

T BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIÊP ̣– 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luâṇvăn này là trung thực và chưa từng dùng để bảo vệ một học vị nào.Tôi xin cam đoan rằng các thông tin được trích dẫn trong luâṇvăn này đều được chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS Đoàn Thị Thanh Hương – Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học và TS Nguyêñ Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh hoc ̣Động Vât,̣Khoa Công nghê ̣ sinh hoc,̣ Học viện Nông nghiệp Việt Nam là những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập vànghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện luâṇvăn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các cô chú, anh chi ̣cán bộ phòng Miễndịch học, Viện Công nghệ Sinh học đã luôn tận tình chỉ bảo, động viên và cho tôinhững lời khuyên quý báu trong công việc cũng như cuộc sống

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Công nghê ̣Sinh hoc ̣– Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình họctập tại trường

Tôi cũng xin được cảm ơn sự tài trợ của quỹ phát triển khoa học và công nghệquốc gia (NAFOSTED) cho đề tài mã số 106.02-2017.10 do TS Đoàn Thị ThanhHương làm chủ nhiệm đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ và toàn thểnhững người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khíchtôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh muc ̣bảng v

Danh muc ̣hı̀nh vi

Danh muc ̣chữ viết tắt vii

Trı́ch yếu luâ ̣n văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Mục tiêu 2

1.2 Nội dung 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu về canine parvovirus 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 4

2.2 Đặc điểm sinh học của parvovirus 4

2.2.1 Cấu tạo chung 4

2.2.2 Vị trí xếp loại 6

2.2.3 Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2 6

2.2.4 Con đường xâm nhập và cách lây lan 8

2.2.5 Cơ chế gây bệnh 8

2.2.6 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 9

2.2.7 Các phương pháp chẩn đoán 10

2.2.8 Vaccine phòng bệnh 11

Phần 3 Vật liệu và phương pháp 12

3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 12

3.2 Vật liệu nghiên cứu 12

3.2.1 Nguyên liệu 12

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 12

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu 14

3.3.2 Phương pháp tách chiết dna tổng số 14

3.3.3 Phương pháp PCR 16

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 17

3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 18

3.3.6 Phân tích và xử lý số liệu 18

Phần 4 Kết quả và thảo luận 20

4.1 Kết quảthu nhâṇdna tổng số 20

4.2 Kết quảthu nhâṇchuỗigen VP2 20

4.3 Kết quảgiảitrı̀nh tư ̣vàtruy câp ̣ngân hàng gen xác đinḥ chủng CPV 21

4.3.1 Trı̀nh tư ̣chuỗigen Vp2 của mâũ TH1-VN 21

4.3.2 Trı̀nh tư ̣chuỗigen VP2 của mâũ TH2-VN 24

4.3.3 Trı̀nh tư ̣chuỗigen VP2 của mâũ HN-VN 27

4.4 Phân tı́ch mức đô ̣đồng nhất về nucleotide giữa các mâũ CPV hànôịso với các chủng trên thế giớ 30

Phần 5 Kết luận và kiến nghi ̣

42

5.1 Kết luâṇ 42

5.2 Kiến nghị 42 Tài liệu tham khảo 43

DANH MUC̣ BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách mâũ CPV thu thâp ̣đươc ̣ 12

Bảng 3.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số 15

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR 17

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 17

Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 18

Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sửdung ̣ trong nghiên cứu 19

Bảng 4.1 Nồng độDNA của các chủng nghiên cứu 20

Bảng 4.2 Bảng so sánh tỷlê ̣đồng nhất nucleotidèvatỷlê ̣tương đồng amino acid

DANH MUC̣ HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc capsid của CPV 5

Hình 2.2 Một số quá trình tiến hoá của CPV-2 ở chó 7

Hı̀nh 2.3 Vi ̣trı́Parvovirus tấn công trên cá nhung mao ruôṭgây xuất huyết niêm mac ̣ruôṭ 9 Hình 2.4 Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó 10

Hı̀nh 3.1 Môṭsô trang thiết bitrong ̣ phòng thı́nghiêṃ 13

Hı̀nh 3.2 Sơ đồ quy trı̀nh thı́nghiêṃ 17

Hı̀nh 4.1 Kết quảđiêṇdi sản phẩm PCR thu nhận vùng gen VP2 20

Hı̀nh 4.2 Kết quảBLAST mâũ TH1-VN 23

Hınh̀ 4.3 Kết quảBLAST của mẫu TH2-VN 26

Hınh̀ 4.4 Kết quảBLAST của mâũ HN-VN 29

Hình 4.7 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài và genotype giữa các chủng

DANH MUC̣ CHỮ VIẾT TẮT

Canine ParvovirusDeoxyribose Nucleic AcidHaemagglutination

Open Reading Frame

Polymerase Chain Reaction

TRÍCH YẾ

U LUÂṆ VĂN

Tên tác giả: Phaṃ Hồng Ngoc ̣

Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của môṭsố

chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt

Nam Mục đích nghiên cứu

Giảima toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội

Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưu hành

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 03 nôịdung là giải mã gen kháng nguyên VP2, xác đinḥ kiểu gen vàmối quan hê ̣di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội Vâṭliệu nghiêncứu là phân của chónghi nhiêm Parvovirus đươc ̣thu nhâṇtại các phòng khám thúy trên địabàn HàNôị Nghiên cứu sửdung ̣ các phương pháp sinh học phân tửbao gồm tách chiết DNA tổng số, PCR, điêṇ di, giải trınh̀ tư ̣trưc ̣ tiếp, so sánh trınh̀ tự nucleotide với các chủng của thế giới vàxây dựng cây phân loaịbằng cá phần mềm tin sinh hoc ̣

Kết quả chính và kết luận

Thu nhâṇvàgiảitrınh̀ tư ̣toàn bô ̣chuỗigen VP2 (gồm 1755 bp, mã hóa cho 584amino acid) của ba mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội Xác đinḥ đươc ̣kiểu gen của ba mâũtrong nghiên cứu là CPV-2c vàcó tỷ lệ đồng nhất cao về nucleotide (từ 98% đến 100%)

so với các chủng trên thế giới Xây dưng ̣ đươc ̣cây phảhê ̣nguồn gốc̉acuba mâũ CPV thunhận taịHàNôịvới 30 chủng CPV trên thế giớ Từđó, xác đinḥ ba mâũ trong nghiên cứu

có sư ̣tương đồng cao vớicác chủng CPV Trung Quốc về măṭdi truyền

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Hong Ngoc

Thesis title: Molecular characterization and phylogenic analysis of Canine Parvovirus

strains collected from Hanoi

Materials and Methods

The study includes 3 contents: sequencing antigen VP2, identifying genotypesand genetic relationships of some CPV strains in Ha Noi Research materials are thefaecal samples from parvovirus suspected dogs collected in Hanoi The study usesmolecular biological methods including total DNA extraction, PCR, electrophoresis,sequencing, comparing nucleotide sequences and phylogenetic analysis base on usingbioinformatic software

Main findings and conclusions

Collecting and sequencing the entire VP2 gene (including 1755 bp, encoded for 584 amino acids) of the three CPV samples collected in Hanoi The gene of the three samples was identified as CPV-2c and had a high similarity (from 98% to 100%) compared to the orther strains in the world Phylogenetic analysis was built with three CPV samples collected in Hanoi and 30 CPV strains in the world Three samples in the study were identified to has a high similarity to the genetically Chinese CPV strains.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Bệnh Parvo là một bệnh truyền nhiễm rất nghiêm trọng và nguy hiểm, có tỷ

lệ tử vong cao ở chó Nguyên nhân của bệnh do Canine Parvovirus type 2

chứng lâm sàng rõ ràng nhất ở chó con là nôn mửa, tiêu chảy

Bệnh xuất hiện lần đầu tiên vào những năm 1970, lây nhiễm cho những conchó nuôi trong nhà và nhanh chóng lan rộng trên toàn thế giới, và được xác định là

do CPV type 2 (2) gây ra Tuy nhiên, cuối những năm 1980, genotype

CPV-2 đã hoàn toàn bị thay thế bởi một loại biến thể kháng nguyên mới, được gọi làCPV-2a Các tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa

các chủng CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al., 1991) Tiếp theo, trong

khoảng thời gian từ năm 1984 đến năm 2000, trên thế giới, đã xuất hiện thêm cácbiến thể mới bao gồm CPV-2b và CPV-2c Trong đó CPV-2b lần đầu tiên được

phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al.,, 1991) và CPV-2c lần đầu tiên được phát hiện năm 2000 tại Italia (Buonavoglia et al., 2001) Ở Châu Á, các công bố về

CPV vẫn còn hạn chế Các công bố gần đây cho thấy CPV-2a và CPV-2b đã có

mặt tại Trung Quốc (Zhong et al., 2014), CPV-2b có mặt ở Hàn Quốc (Park et al., 2012) và CPV-2c có mặt ở Đài Loan (Chiang et al., 2016) Tại Việt Nam, cho đến

nay, các nghiên cứu về canine parvovirus chưa có nhiều, và mới chỉ tập trung ởcác nghiên cứu về bệnh lý và triệu chứng lâm sàng (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; LêThị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao KEONAM, 2012; Nguyễn Thị Lan vàTrần Trung Kiên, 2010) Nghiên cứu về sinh học phân tử của CPV-2 đượcNakamura và cộng sự tiến hành từ 2004 trên các mẫu bệnh phẩm của chó và mèo

tại thành phố Hồ Chí Minh (Nakamura et al., 2004) Nghiên cứu này chỉ phát hiện

có sự lưu hành của duy nhất biến thể CPV-2b và cho rằng đây là loại virus phổbiến tại Việt Nam Cũng tại thành phố Hồ Chí Minh, công bố năm 2018 củaNguyễn Văn Dũng và cộng sự đã xác định các chủng CPV đang lưu hành thuộcCPV-2c Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về CPV tại các địaphương khác của Việt Nam ngoài thành phố Hồ Chí Minh

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc tính phân

tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng Parvovirus gây bệnh trên

chó tại Hà Nội” nhằm xác định các genotype CPV gây bệnh trên chó đang lưu

hành tại Hà Nội

Giải mãtoàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại HàNội Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưuhành

Nội

Nội với các chủng CPV trên thế giới

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ CANINE PARVOVIRUS

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong những năm 1970, CPV-2 xuất hiện như một loại virus mới đối với chónuôi trong nhà, và lan rộng sang châu Á, Úc, New Zealand, châu Mỹ và châu Âu vào

đầu năm 1978 (Parrish et al., 1988, 1999) Loại virus này được xác định là CPV-2 để

phân biệt nó với virus nguyên thủy (MVC) hay còn được gọi là CPV type 1 (CPV-1)

(Carmichael et al., 1994) Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài cho thấy CPV-2 có

khả năng xuất hiện vài năm trước khi lan rộng toàn cầu trên chó vào năm 1978 và

1979 (Parrish et al., 1988; Shackelton et al., 2005; Hoelzer et al., 2008b) Kết quả

kiểm tra kháng thể cho thấy có sự xuất hiện của CPV-2 ở Hy Lạp và Bỉ từ năm 1974

đến năm 1976 (Schwers et al., 1979; Koptoulos et al., 1986), trong khi lần đầu phát

hiện CPV-2 ở Mỹ, Nhật Bản và Úc vào đầu năm 1978 (Parrish, 1999) Kể từ đấy,virus đã phổ biến trên chó trên toàn cầu (Parrish, 1999) Năm 1979, những con sói

hoang dã ở Mỹ cũng bị lây nhiễm nặng (Thomas et al., 1984).

Tuy nhiên, chỉ sau khi xuất hiện từ 2-3 năm, CPV-2a đã thay thế toàn bộ

CPV-2 ở các nước này cũng như ở Pháp và Đan Mạch (Parrish et al., 1988) Các

tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa các chủng

của Decaro và cs năm 2007 cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm

1996 Đây là bằng chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 nămtrước khi được phát hiện lần đầu tiên ở Ý

Kiểm tra huyết thanh thu được từ chó sói hoang dã (Canis latrans) giữa

năm 1979 và 1984 tại Mỹ cũng chỉ ra rằng chúng ban đầu đã bị nhiễm CPV-2

(Thomas et al., 1984), nhưng sau năm 1980 chó sói con đã bị nhiễm với CPV-2a

và CPV-2b (Parrish et al.,1988).

Các kiểu gen khác nhau của CPV-2 được xác định ở một số vị trí quantrọng trên gen kháng nguyên VP2 Cụ thể như sau: giữa CPV-2a và CPV-2 được

phân biệt ở bốn vị trí Leu 87 Met, Thr 101 Ile, Gly 300 Ala và Tyr 305 Asp Giữacác genotype CPV-2a, 2b và 2c được xác định ở vị trí 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ởCPV-2b và Glu ở CPV-2c), là vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên VP2 của

parvovirus (Martella et al., 2006; Miranda and Thompson, 2016) Mặc dù các triệu

chứng lâm sàng của chó nhiễm CPV-2c cũng tương tự như với chó nhiễm CVP-2a

và CPV-2b bao gồm chán ăn, nôn mửa, viêm dạ dày, ruột cấp tính, tiêu chảy, đi

ngoài ra máu nhưng mức độ bệnh nặng hơn và nguy hiểm hơn (Aldaz et al., 2013; Decaro et al.,, 2008).

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Cho đến hiện nay, đã có một số nghiên cứu về bệnh Parvo trên chó, tuy nhiêncác nghiên cứu này mới chủ yếu tập trung vào khảo sát tỉ lệ nhiễm bệnh ở một số

tỉnh và khu vực (Trần Ngọc Bích et al., 2013; Nguyễn Thị Yến Mai et al., 2018).

Những nghiên cứu về virus gây bệnh, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh học phân

tử chưa có nhiều

Nakamura et al., 2004 đã công bố một nghiên cứu trên các mẫu CPV của chó

và mèo Nghiên cứu này đã cho thấy có sự xuất hiện của chủng CPV-2b xuất hiện

ở Việt Nam Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thể sẽ có sự tiến hóa của chủng CPVtại Việt Nam Khảo sát mới nhất trên chótaịthành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 2chủng CPV-2a và CPV-2c đang lưu hành trong đó CPV-2c có xu hướng vượt trội(Nguyễn Văn Dũng, 2017; Nguyễn Văn Dũng và cs., 2018)

Nghiên cứu gần đây của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sư ̣đãphát hiêṇchủng Parvovirus type 2c đang lưu hành taịHàNội (Đoàn Thi ̣Thanh Hương và cs.,2018)

2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS

2.2.1 Cấu tạo chung

Canine Parvovirus có đường kính nhỏ (~25 nm), không có vỏ bao phủ Cấu

trúc ba chiều của CPV-2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao et al., 1991; Xie and Chapman, 1996) Loại virus này có bộ gen DNA thẳng, sợi đơn âm, kích

thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF) Một trong số đó mã hóa cácprotein không cấu trúc NS1NS2 và một khung khác mã hóa hai protein cấu trúckhác VP1 và VP2 Ở hai đầu của hệ gen, cấu trúc kẹp tóc đọc xuôi ngược giống

nhau có 150 base được sử dụng cho việc tái bản DNA virus (Reed et al., 1988;

Parrish, 1999)

Capsid chứa 60 tiểu đơn vị protein của VP1 (5-6 bản) và VP2 (54-55 bản),những protein khác có chung cấu trúc Các vùng mã hóa cho VP1 (727 aminoacid) và VP2 (584 amino acid) chồng lên nhau, trừ một vùng đầu N duy nhất có

143 amino acid ở VP1 (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993) Hai protein cấu trúc được tạo ra bằng cách nối tiếp các mRNA của virus (Reedet et al., 1988; Wang et al., 1998; Parrish and Kawaoka, 2005) Protein VP2 có thể được cắt gần

đầu N của nó bằng các proteaza của vật chủ để tạo ra một protein cấu trúc khác,VP3, chỉ xuất hiện trong các virion hoàn chỉnh (chứa DNA)

Các protein capsid có một lõi trung tâm gồm tám đoạn xoắn, β-barrel khôngsong song với vòng linh hoạt giữa các sợi β tương tác để tạo thành hầu hết cáccapsid bề mặt Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhọn dài 22 Åtrên trục gấp ba lần, một trũng sâu 15 Å (hẻm núi) xung quanh cấu trúc hình trụ ởtrục gấp năm lần và một trũng sâu 15 Å (chỗ trũng) ở trục gấp hai lần Ngoài ra,trục gấp ba lần là vùng kháng nguyên nhất của capsid và hoạt động như một mục

tiêu để trung hòa các kháng thể (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993).

Hình 2.1 Cấu trúc capsid của CPV (Xie Q và Chapman, 1996).

Nguồn: http://www.virology.wisc.edu/virusworld/images/cpv-pymol_surf01.jpg

2.2.2 Vị trí xếp loại

CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, đã được đưa vào trong loài Carnivore protoparvovirus 1 theo Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (Tijssen

et al., 2011).

2.2.3 Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2

Mối quan hệ phát sinh loài giữa các CPV-2 phân lập từ chó và các virus từ mèo(FPV), chồn (MEV), chó gấu mèo (RDPV) và cáo xanh (BFPV) cho thấy rằng tất cảcác chủng CPV xuất phát từ một tổ tiên chung và các chủng này rất giống với virus từ

các động vật hoang dã bao gồm gấu mèo và cáo (Allison et al., 2012, 2013).

CPV-2 có khả năng xuất hiện khi có đột biến cho phép liên kết với thụ thể

transferrin của chó (TfR) type 1 (Truyen et al., 1996a; Shackelton et al., 2005; Allison et al., 2012) Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng TfR đóng vai trò quan trọng trong tính nhạy cảm của các tế bào nhiễm virus này (Hueffer et al., 2003; Palemo et al., 2006).

CPV-2 và FPV giống nhau 98% trình tự DNA, nhưng có các vật chủ riêng,tính kháng nguyên và haemagglutination (HA) được kiểm soát bởi capsid protein

(Chang et al., 1992; Truyen et al., 1995; Shackelton et al., 2005) Việc trao đổi

chéo thành công và thích nghi với vật chủ mới có liên quan đến sự thay đổi một

vài amino acid (Truyen et al.,1995) Sự thay đổi về gen này đã đủ để CPV-2 có được vật chủ chó, nhưng lại mất khả năng tái bản trên mèo (Chang et al., 1992;

Truyen and Parrish, 1992) Ba sự khác biệt ở VP2 amino acid 93 (Lys sang Asn),

103 (Val sang Ala), 323 (Asp sang Asn) giữa FPV và CPV-2 bắt đầu cho sự thayđổi vật chủ sang chó Sự thay đổi của VP2 amino acid 80 (Lys sang Arg), 564(Asn sang Ser) và 568 (Ala sang Gly) liên quan đến việc mất khả năng tái bản trên

mèo (Truyen et al., 1994) và được thể hiện ở Hình 2.2 Tuy nhiên, amino acid 232

(Val sang Ile) và 375 (Asp sang Asn) cũng thay đổi giữa các trình tự của FPV vàCPV-2 Biến thể amino acid 375 chỉ tìm được một số dòng phân lập ban đầu củaCPV-2 và các biến thể sau của CPV lại quay về Asp, có thể thấy 375Asn khôngquan trong ̣ trong viêc ̣thay đổi vâṭchủ từmèo sang chócủa CPV trong tự nhiên.Măṭkhác, amino acid VP2 375 cùng với VP2 323 xác định độ pH của HA (Parrish,

1991a,b; Chang et al., 1992).

Sự tiến hóa toàn cầu trong tự nhiên của CPV-2 bằng CPV-2a trong thời gian 2-3

năm cho thấy CPV-2a có lợi thế dịch tễ học mạnh mẽ hơn CPV-2 (Parrish et al.,

1988) CPV-2a trở thành dòng chủ yếu mới và trải qua quá trình tiến hóa xa hơn

nữa, tăng số đột biến điểm trong nhiều dòng khác Một vài đột biến đã làm thay

đổi tính kháng nguyên của capsid và có tần số cao trong quần thể virus (Maya et

al., 2013) Chủng CPV-2a xuất hiện năm 1979 chỉ khác năm hoặc sáu amino acid

so với CPV-2 (Parrish et al., 1991b) Sự thay đổi amino acid 87 (Met sang Leu),

300 (Ala sang Gly) và 305 (Asp sang Tyr) cho phép CPV-2a tái bản được trên mèo(hình 2.2) Các thay đổi khác cũng xảy ra trong gene protein capsid giữa CPV-2gốc và CPV-2a, amino acid 101 (Ile sang Thr), 297 (Ser sang Ala) và 555 (Val

sang Ile) (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993; Truyen et al.,1996a).

Hình 2.2 Một số quá trình tiến hoá của CPV-2 ở chó.

Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27389721

Chú thích: Các số trên hình là vị trí amino acid của CPV và FPVNgoài CPV-2a, còn có hai loại biến thể kháng nguyên khác là CPV-2b (hoặcVP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu) CPV-2b lần đầu tiên được phát hiện

năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được phát hiện tại

thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm 1996, do đó cung cấp bằng chứng cho thấy

biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 năm trước khi được phát hiện ở Ý (Decaro et al., 2007).

Sự khác biệt giữa ba loại biến thể kháng nguyên có liên quan sự thay đổi tại

vị trí amino acid 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c) Sự độtbiến này ảnh hưởng đến vùng kháng nguyên chính (nhân tố quyết định khángnguyên A), nằm trong protein VP2

Từ phân tích trình tự DNA của CPV-2a và CPV-2b, đã cho thấy biến thể thứhai khác biệt chỉ có hai amino acid so với biến thể đầu tiên trong protein VP2 Haithay đổi cụ thể của CPV-2b đã dẫn đến sự khác biệt ở VP2 426 và 555 trong vùngVP2 (Hình 2.2) Tuy nhiên, chỉ có sự khác biệt ở amino acid 426 đươc ̣công nhận

lànhân tố quyết định kháng nguyên cho CPV-2b (Parrish et al., 1991b) Vì CPV-2b

và CPV-2c khác với CPV-2a chỉ ở một vị trí duy nhất (VP2 426), hiện nay một sốtác giả chỉ coi chúng là các biến thể của CPV-2a thay cho các dòng phụ (Organtini

et al., 2015).

2.2.4 Con đường xâm nhập và cách lây lan

Canine Parvovirus lây lan qua tiếp xúc miệng với phân bị nhiễm hoặc bề mặt bị

ô nhiễm (ví dụ: đất, giày, đồ chơi cho chó, v.v.) Nguồn nhiễm trùng CPV là chất thảiphân của chó bị nhiễm bệnh CPV có thể được tìm thấy ở những nơi có chó xuất hiện

như: chuồng nuôi, cửa hàng vật nuôi, nơi trú ẩn, công viên và sân chơi (Black et al., 1979) Chó bị nhốt trong nhà và không tiếp xúc với những con chó khác có ít cơ hội

tiếp xúc với CPV hơn Nó dễ dàng truyền qua lông hoặc bàn chân của những con chó

bị nhiễm bệnh và các vật thể bị ô nhiễm như lồng hoặc giày

CPV có thể tồn tại trong đất 5 tháng hoặc hơn nếu điều kiện thuận lợi Phâncủa những con chó bị nhiễm bệnh làm ô nhiễm những nơi như bệnh viện thú y, cửahàng thú cưng, chuồng trại và các cơ sở sản xuất giống thương mại Những cơ sở

bị ô nhiễm này là nguồn lây nhiễm thứ cấp cho những chú chó nhạy cảm (Jacob et

al., 1980).

2.2.5 Cơ chế gây bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua miệng khi chó con ăn thức ăn nhiễm nguồnbệnh hoặc tiếp xúc với các bề mặt đã từng tiếp xúc với nguồn bệnh Thời gian ủbệnh trong 3–7 ngày trước khi biểu hiện ra bên ngoài

Khi xâm nhập vào cơ thể, virus tái bản với số lượng lớn trong các hạch bạch

huyết (Stann et al., 1984) Sau vài ngày, lượng virus đáng kể đã được giải phóng

vào máu Trong 3–4 ngày tiếp theo, các virus này đi đến các cơ quan có chứa các

tế bào phân chia nhanh chóng như tủy xương và các tế bào đường ruột

nhạy bén và tạo thành các cơ quan bao gồm bạch cầu hạt nhân eosinophilic lớn.Trong tủy xương, virus phá hủy các tế bào mới của hệ thống miễn dịch và sau đóloại bỏ cơ chế bảo vệ tốt nhất của cơ thể.

Hınh̀ 2.3 Vi trı ̣́Parvovirus tấn công trên các nhung mao ruôṭ

gây xuất huyết niêm mac ̣ruôṭ

Nguồn: Canine Parvovirus Infection and Other ViralEnteritides

Virus gây ra nhiều tổn hại nhất ở đường tiêu hóa Trong thành ruột chứanhiều nhung mao và vi nhung mao, giúp tăng diện tích tiếp xúc và dễ dàng hấp thu

biểu mô ruột và bào mòn các nhung mao không thể hấp thu các chất dinh dưỡng vàgây ra hiện tượng tiêu chảy (McCandlish, 1981) Khi hàng rào ngăn cách vi khuẩntiêu hóa bị phá vỡ, sẽ xuất hiện hiện tượng tiêu chảy có máu và vi khuẩn có thểxâm nhập vào cơ thể gây nhiễm trùng lan rộng CPV gây tiêu chảy và nôn mửadẫn đến mất nước nghiêm trọng và tử vong

2.2.6 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

Triệu chứng lâm sàng ở những con chó mắc bệnh Parvo là trầm cảm, chán

ăn, nôn mửa, sốt cao và tiêu chảy (Kramer et al.,, 1980) Phân lỏng, hoặc bị chảy

nước hoặc có máu trong các trường hợp bị nhiễm nặng Chó tiếp tục nôn mửa vàtiêu chảy, dẫn đến tình trang nhanh chóng và tử vong Thời gian phát bệnh tùythuộc vào lượng virus nhiễm

Các dấu hiệu lâm sàng thường xuất hiện từ 3 đến 5 ngày sau khi bị nhiễm

virus và thường kéo dài từ 5 đến 7 ngày (Fletcher et al., 1979) Tỷ lệ mắc bệnh và

tử vong thay đổi tùy theo độ tuổi của chó bị nhiễm bệnh và mức độ nghiêm trọngcủa bệnh

Viêm cơ tim cũng được quan sát thấy ở các chó con mới sinh đã có các dấu

hiệu lâm sàng sau khi bị nhiễm trùng vài tuần (Meunier et al., 1984; Sime et al.,

năm 2015) Tuy nhiên, triêụchứng này hiện nay kháhiếm

Hình 2.4 Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó.

Nguồn: http://www.vetshop.com.vn/2013/03/benh-parvo-virus-o-cho.html

2.2.7 Các phương pháp chẩn đoán

a Chẩn đoán huyếtthanh hoc ̣

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dựa trên sự kết hợp đặchiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với mộtenzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơchất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặchiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết đượcnồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Các xét nghiệm ELISA nhanh chóng, tương đối rẻ và có thể được thực hiệntrong bất kỳ phòng khám thú y nên đãtrởthành xétnghiêṃ phổbiến nhất để xác đinḥ

parvovirus ởchócon (Waner et al., 2003).

Ngoài ELISA, xétnghiêṃ ngưng kếthồng cầu (Haemagglutination – HA)cũng làmôṭxétnghiêṃ đơn giản và nhanh chóng để phát hiện CPV trong phân

(Carmichael et al., 1980).

b Chẩn đoán bằng phương pháp sinh hoc ̣phân tử

Gần đây, kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng như một công cụ để chẩnđoán nhiễm trùng parvovirus trên chó Phương pháp này cho chẩn đoán nhanhchóng và chính xác Ngoài ra, PCR còn có thể được xác đinḥ đươc ̣kiểu gen củachủng virus gây bênḥ bằng viêc ̣sửdung ̣ các căp ̣mồi đăc ̣hiêụ

Các sản phẩm PCR còn đươc ̣sửdung ̣ đểgiải trı̀nh tư ̣trưc ̣tiếp cho kếtquả làcáctrınh̀ tư ̣nucleotide Cùng với viêc ̣sửdung ̣ các phần mềm sinh hoc,̣ cóthể xác đinḥđươc ̣tỷlê ̣tương đồng vàphân tıch́ nguồn gốc phảhê ̣của các chủng CPV-2 từcác khuvưc ̣điạlýkhác nhau trên thếgiới Từđócũng cóthểxác đinḥ đươc ̣đường hướng tiếnhóa của virus

2.2.8 Vaccine phòng bệnh

Phương pháp chính để kiểm soát bệnh ở vật nuôi trong nhà là tiêm chủng.Sau khi xuất hiện bệnh, vaccine dựa trên virus sống đã sớm phát triển, loại vaccineCPV đầu tiên có mặt vào năm 1979

Các loại vaccine này có vẻ an toàn và mang lại khả năng miễn dịch bảo vệ vàkiểm soát được bệnh Tuy nhiên, virus vẫn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên,

và nếu những con chó con không được tiêm chủng và hoặc do kháng thể của mẹcan thiệp vào tiêm chủng thì chúng trở thành nhiễm bệnh tự nhiên (Parrish, 1999).Nghiên cứu thực nghiê ̣m năm 2014 ̉acuWilson cho thấy tiêm vaccine chủngCPV-2b sẽ bảo vệ chéo chống laịcả chủng CPV-2a vàCPV-2c, thậm chı́ làcảchủng

CPV-2 hiêṇđãkhông còn xuất hiêṇnhiều (Wilson et al., 2014).

Đô ̣tuổi khuyến cáo nên tiêm chủng vaccine phòng ngừa CPV làtừ10 – 12

tuần tuổi, muôṇ nhấtlà16 tuần tuổi đối với tất cảcác vaccine CPV (Alman et al.,

2017) Ngoài ra, trong nghiên cứu mới đây nhất của Jin vàcs cho thấy vi ̣trı́tiêm

vaccine taịhuyêṭhouhai tăng khảnăng miễn dicḥ ởchó(Jin et al., 2019).

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1.ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nguyên liệu

Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng khám thú y Hà Nội

Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng

trong nghiên cứu giải mã gen

12

- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)

Hınh̀ 3.1 Môṭsô trang thiết bi trong ̣ phòng thı́nghiêṃ

3.2.3 Hóa chất

(Mỹ)

của hãng Thermo (Mỹ)

3.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hınh̀ 3.2 Sơ đồquy trınh̀ thı́nghiêṃ

3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệSinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễmParvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội

Các mẫu này đã được chấn đoán sơ bộ bằng quan sát triệu chứng lâm sàng vàkiểm tra bệnh tích Tiếp đó được xác định dương tính với CPV bằng bộ kit chẩnđoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit Blot Test (BINOTE) tại phòngkhám thú y

3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Toàn bộ DNA tổng số được thu nhận bao gồm DNA của nhân tế bào chủ vàDNA của hệ gen virus bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết DNA tổng số theo đúnghướng dẫn của nhà sản xuất

Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạpnhiễm, mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tankhác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha khônghòa tan (phenol, chloroform/nước)

Phương pháp tiến hành theo thứ tự:

và 20 µl Protease K, vortex.

phía dưới ống hứng

Bổ sung 500 µl WB1, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phıa

dưới ống hưng

̀́

phía dưới ống hứng

hứng

12 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20oC.

15

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:

mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào vàenzyme polymerase xúc tác tổng hợp

Giai đoạn này để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tửDNA khuôn

thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại

Quá trình này thực hiện từ 30 – 40 chu kì Sau chu kì cuối, nhiệt độ được duy

Kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên thạch agarose 0,8 – 1% và băngDNA sẽ được nhìn thấy rõ dưới tia cực tím sau khi được nhuộm Ethidium Bromide

Cách tiến hành

Cặp mồi sửdung ̣ trong nghiên cứu được thiếtkếdưạtrên so sánh trı̀nh tư ̣ tương đồng chuỗi nucleotide của tất cảcác chủng CPV-2 hiện cótrên Ngân hàng gen theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương vàcs., 2018

Trình tự của căp ̣mồi như sau:

2179 của hê ̣gen)

5042 của hê ̣gen)

Căp ̣mồi trên đươc ̣sửdung ̣ đểkhuếch đaịvùng gen cókı́ch thước 2,9 kb chứa

toàn bô ̣gen VP2 gồm 1755 nucleotide

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel Agarose

Nguyên lý của phương pháp là: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi

trường pH trung tính do có các gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu

trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi, các phân tử di chuyển từ

cực âm sang cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điẹn đặc trưng của mỗi loại phân

tử acid nucleic Các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm hơn các phân tử có

trọng lượng phân tử nhỏ Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm Ethidium

bromide và soi dưới tia cực tím

Có hai loại gel sử dụng trong kĩ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh

học phân tử là gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử

dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA

Một trong các chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực

khuẩn thể Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII thành 8 phân

đoạn có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,125kb Nhờ chỉ thịphân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu

3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm sau PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch theohướng dẫn của kit GeneJET PCR Purification (Thermo, Mỹ)

Các bước cụ thể được trình bày ở bảng 3.4 như sau:

Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR

1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet

dịch trong ống hứng phía dưới

phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới

Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5ml để thu DNA, bổ sung 50 µl

Phân tích phả hệ nguồn gốc bằng chương trình MEGA6.06 sử dụng phương

18