Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10 HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện CE-C4D gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Văn Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VĂN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn PGS.TS Dương Hồng Anh đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin trân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Môi trường và Phát triển Bền vững – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện và cung cấp các trang thiết bị nghiên cứu, đặc biệt là các anh chị, các bạn trong nhóm Điện di mao quản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài, luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài QG.18.05 của Đại học Quốc gia Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Hóa học nói chung và Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên

Bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Văn Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 SỮA ONG CHÚA 3

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa 3

1.1.2.Thành phần hóa học của sữa ong chúa 4

1.1.3.Thu hoạch sữa ong chúa 7

a Quy trình bắt cóc ong chúa 7

b.Quy trình giả làm tổ ong chúa 7

1.1.4.Tác dụng của sữa ong chúa 8

1.2.Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA) 9

1.2.1.Một số nghiên cứu về 10-HDA 11

a.Hoạt tính sinh học 11

b.Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa 13

c.So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thích hợp 17

1.3.Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản 18

1.3.1.Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 20

1.3.2.Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 21

1.3.3.Kỹ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 22

1.3.4.Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản 23

1.3.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản 24

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên CE 26

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu 27

2.3 Đánh giá phương pháp 28

2.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 30

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 30

2.3.2 Hóa Chất 31

2.4 Thông tin mẫu thực 32

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Khảo sát điều kiện tối ưu nhằm phân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa bằng phương pháp CE-C4D 35

3.1.1 Khảo sát thành phần và pH của dung dịch đệm điện li 35

3.1.2 Khảo sát nồng độ và pH của dung dịch đệm điện li 37

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 39

3.1.4 Khảo sát điện thế tách 41

3.2 Khảo sát và tối ưu quy trình xử lí mẫu 42

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích píc của 10-HDA 42

3.2.2 Khảo sát dung môi hòa tan 45

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ thành phần dung môi hòa tan 47

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan 49

3.3.2 Đánh giá độ chụm 51

3.3.3 Độ đúng (độ thu hồi) 52

3.3.4 So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC 54

3.3.5 Phân tích mẫu thực tế 55

KẾT LUẬN ………57 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ 4

Bảng 1.2 Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô 6

Bảng 1.3 Đề suất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức 10,11 Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu được nghiên cứu 33,34 Bảng 3.1 Điều kiện thiết bị điện di mao quản 42

Bảng 3.2 Khảo sát diện tích pic trung bình của 10-HDA với các tỉ lệ dung môi khác nhau 48

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 10-HDA 50

Bảng 3.4 Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường 51

Bảng 3.5 Các thông số đánh giá phương pháp 52

Bảng 3.6 Giá trị độ lệch chuẩn 53

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của 10-HDA 54

Bảng 3.8 Kết quả so sánh giữa CE-C4D và HPLC với số mẫu thực tế 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng bên trong sữa ong chúa 4

Hình 1.2: Sữa ong chúa 4

Hình 1.3: Công thức hóa học của 10-hydroxyl-trans-2-decenoic acid (10-HDA) 9

Hình 1.4: Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản 19

Hình 1.5: Hệ điện di mao quản 1 kênh 19

Hình 1.6: Bộ ghi tín hiệu 19

Hình 1.7: Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong 21

Hình 1.8: Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 22

Hình 1.9: Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 23

Hình 3.1: Điện di đồ của lựa chọn thành phần đệm (tại pH 9) phân tích 10-HDA (20 mg/L) 36

Hình 3.2 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 20 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 37

Hình 3.3 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 50 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38

Hình 3.4 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 100 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38

Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới tín hiệu của 10-HDA 40

Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách tới tín hiệu 10-HDA 41

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến việc phân tích 10-HDA (mẫu 1) 43

Hình 3.8 Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44

Hình 3.9 Điện di đồ phân tích 10-HDA với không ly tâm, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện diện tích pic trung bình của 10-HDA với các dung môi hòa tan 46

Hình 3.11 Điện di đồ phân tích 10-HDA với các dung môi chiết khác nhau (mẫu 1) 46

Hình 3.12 Điện di đồ phân tích 10-HAD với các tỉ lệ dung môi chiết khác nhau (mẫu 4) 48 Hình 3.13 Đường chuẩn 10-HDA 50 Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu thêm chuẩn 53 Hình 3.15 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong một số mẫu sản phẩm sữa ong chúa; mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 4

và 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ong sữa chúa 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, các ngành sản xuất thực phẩm chức năng và sản phẩm làm đẹp ngày càng phát triển trên toàn thế giới đặc biệt là ở Việt Nam giúp duy trì sức khỏe, cải thiện nét đẹp của con người Các sản phẩm làm đẹp và dinh dưỡng hiện nay tập trung chủ yếu vào những sản phẩm tự nhiên có sẵn như sữa ong chúa, đông trùng hạ thảo, sâm… Trong dân gian, Sữa ong chúa (RJ) đã được biết đến với nhiều tác dụng như cải thiện trí nhớ, tăng năng lượng, giảm lo lắng hoặc căng thẳng, kháng viêm, chống ung thư, và đặc biệt có khả năng chống oxi hóa, ngăn ngừa lão hóa Nhiều năm trở lại đây, sữa ong chúa đã được sử dụng trong các chế độ ăn kiêng, làm đẹp và trở thành sản phẩm thương mại được ưa dùng Với thành phần hóa học đa dạng phong phú, giàu protein, chứa nhiều axit amin thiết yếu, các axit béo cần thiết như axit pantothenic (B-5) và pyridoxin (B-6) … sữa ong chúa có nhiều tác dụng tốt với con người ở mọi lứa tuổi

Trong tất cả các sản phẩm làm từ ong như phấn hoa, keo ong, mật ong, … thì điểm khác biệt giữa sữa ong chúa và những sản phẩm khác là chỉ trong sữa ong chúa

có thành phần axit Hydroxy-2-decenoic (HDA) Do đó sự hiện diện của HDA có thể được sử dụng làm dấu chuẩn (“marker”) để phân biệt sữa ong chúa với các sản phẩm khác Và hàm lượng của 10-HDA có thể được sử dụng như một thông

10-số cho chất lượng sữa ong chúa Theo quy định của Bộ Nông nghiệp (MOA) Trung Quốc, hàm lượng 10-HDA không được thấp hơn 1,4% đối với sữa ong chúa nguyên chất dạng kem và 4,2% đối với dạng đông khô Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng chống và ngăn ung thư, kháng viêm và chống oxi hóa,… của 10-HDA [9] Với những tác dụng của sữa ong chúa và đặc biệt là 10-HDA đã dẫn đến sự nhập khẩu số lượng lớn sữa ong chúa mỗi năm ở nhiều quốc gia Nhu cầu sử dụng tăng cao dẫn đến sự xuất hiện của các mặt hàng giả, hàng kém chất lượng Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần của sữa ong chúa được sản xuất, đánh giá chất lượng của các sản phẩm thương mại là rất cần thiết

Việc phân tích 10-HDA ở Việt Nam hiện này vẫn là vấn đề mới, chưa có tiêu chuẩn quy định cho sản phẩm cũng như quy trình tiêu chuẩn theo QCVN 10-HDA được phân tích định tính, định lượng chủ yếu bằng phương pháp sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC-MS),…) Các phương pháp này đều có độ nhạy, độ chính xác cao, nhưng phải sử dụng thiết bị có chi phí đầu tư lớn

và sử dụng nhiều dung môi hữu cơ Việc xây dựng một phương pháp phân tích nhanh, thuận tiện, dễ áp dụng và kinh tế để xác định 10-HDA là nhu cầu cần thiết trong điều kiện Việt Nam, một trong số các lựa chọn đó là phương pháp điện di mao quản Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu

tụ điện (CE-C4D) gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại Việt Nam, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và dung môi hóa chất ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các

phương pháp phân tích sắc ký Với đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân

tích hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản”, bản luận văn này tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng

dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định 10-HDA trong một số sản phẩm sữa ong chúa

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 SỮA ONG CHÚA

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa

Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong, được sản sinh từ tuyến tiết niệu và tuyến sau tại vùng hàm dưới của ong thợ trên 7 ngày tuổi[17] Ong thợ chọn một vài ấu trùng nhỏ để phát triển thành ong chúa và cho chúng

ăn một lượng lớn sữa ong chúa, kiểu cho ăn này kích hoạt sự phát triển về kích thước, khả năng sinh sản và tuổi thọ Ong chúa dùng loại thức ăn này cả cuộc đời, còn những

ấu trùng ong được dùng trong 3 ngày đầu tiên của cuộc đời đến ngày thứ tư thì được chuyển qua ăn mật ong và phấn ong, lớn lên thành ong thợ, điều này gây ra sự khác biệt giữa ong chúa và ong thợ Ong chúa là con ong cái duy nhất có quyền đẻ trứng trong đàn ong, dài và to hơn các ong đực, ong thợ (là ong cái mất khả năng sinh sản

và có khả năng làm ra mật), cánh ngắn hơn thân, có nhiệm vụ đẻ trứng nhưng không làm ra mật Tuổi thọ của ong chúa khoảng 5 - 6 năm, gấp 40 lần so với ong thợ là chỉ sống được từ 30 - 40 ngày tuổi Vào thời gian sinh sản, ong chúa có thể đẻ lên đến

2000 quả trứng trong một ngày (lớn hơn cả trọng lượng cơ thể của nó) Kích thước

cơ thể của ong chúa lớn gấp rưỡi ong thợ, không có giỏ phấn hóa trên chân sau của mình và không có tuyến giáp như ong thợ Mỗi tổ chỉ có một con ong chúa, nếu trong

tổ có nhiều ong sẽ tách thành tổ mới, thường vào mùa xuân Ong chúa sinh sản tốt

nhất là đầu năm Nếu mất ong chúa, các ong thợ có thể tạo chúa mới [3, 13, 25]

Ong là côn trùng, không có tuyến vú nên không tiết sữa Sở dĩ gọi là “sữa” vì loại thức ăn đặc biệt này ở nhiệt độ thường sánh như bơ, khi nằm trong nụ chúa, nó

có màu trắng ngà giống sữa, và nó dùng để nuôi các ấu trùng ong non

Hình 1.1 Sự phát triển của ấu trùng

bên trong sữa ong chúa

Hình 1.2 Sữa ong chúa

Quy trình phát triển của ong chúa và ong thợ được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ

Ong

chúa Ngày 1-3 Ngày 4-9

Ngày 10-15

Ngày 16 5-6 năm

Ong thợ Ngày 1-3 Ngày 4-9

Ngày 10-20

Ngày 21 30-40

ngày

1.1.2 Thành phần hóa học của sữa ong chúa

Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú, bao gồm các thành phần chính là nước, cacbonhydrat, protein, lipit và axit béo, còn lại là các vitamin, amino axit tự do, muối khoáng… Hàm lượng của các thành phần trong sữa ong chúa được thể hiện trong bảng 1.2 [12, 27]

Hàm lượng các nhóm chất trong sữa ong chúa thay đổi phụ thuộc vào nguồn sản xuất như chất lượng đàn ong, thời tiết, môi trường nuôi; vào điều kiện bảo quản như nhiệt độ, thời gian

Nước (60%-70%): Hàm lượng nước trong sữa ong chúa khá ổn định, chiếm

khoảng 60% với mọi điều kiện thu hoạch, bảo quản khác nhau và có cùng hoạt độ aw

(là lượng nước có trong sữa ong chúa) là khoảng 0,92 Ở bên trong các tổ ong, sữa ong chúa liên tục được tạo ra bởi những con ong thợ cùng sự hút ẩm từ môi trường xung quanh và khả năng hòa tan của một số hợp chất Do đó độ ẩm hay hàm lượng nước trong sữa ong chúa hầu như không thay đổi [4, 12]

Protein: Theo một số nghiên cứu, protein chiếm khoảng 27-41% là một trong

những phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô Các axit amin có mặt với hàm lượng phần trăm cao nhất là: prolin, lysin, axit glutamic, β-alanin, phenylalanine, aspartatin và serin [11, 12, 27]

Cacbonhydrat: Trung bình phần này chiếm 30% sữa ong chúa khô Giống

như trong mật ong, có hai loại monosaccarit chính chiếm hơn 90% tổng lượng đường

là glucozo và chủ yếu là fructozo Saccarozo thường ở nồng độ rất cao, các oligosaccarit khác như trehalozo, mantozo, gentiobiozo, isomantozo, raffinozo, erlozo, melezitozo mặc dù có nồng độ rất nhỏ nhưng chúng rất hữu ích để so sánh với mật ong và xác định được tính thật giả của sản phẩm [4, 12, 27]

Lipid và axit 10-hydroxy-2-decenoic: Thành phần này cũng xuất hiện trong

sữa ong chúa cũng khá khiêm tốn, chỉ khoảng 8-19% trong thành phần sữa ong chúa khô Nhưng không thể phủ nhận nó là thành phần quan trọng nhất của các thành phần của sữa ong chúa Thực tế, phần lipid bao gồm chủ yếu là các axit hữu cơ (chiếm khoảng 80-90%), hầu hết là tồn tại ở dạng tự do, với cấu trúc hiếm gặp trong tự nhiên Chúng là axit mono-, axit dihydroxy và axit dicacboxylic với 8 và 10 nguyên tử cacbon, được sắp xếp theo cách đặc trưng Các axit hydroxy với 10 nguyên tử cacbon (như axit 10-hydroxydecenoic và 10-hydroxy-2-decenoic) có thể được tìm thấy ở nồng độ cao Chúng không chỉ được coi là một thành phần quan trọng để so sánh sữa ong chúa và các sản phẩm khác được làm từ ong, mà còn được xác định là chất có các hoạt tính sinh học quan trọng gắn liền với chất lượng của sản phẩm sữa ong chúa [13]

Các muối khoáng: chiếm khoảng 0,8-3% trong sữa ong chúa Các khoáng

chất này giảm dần theo thứ tự: K, Ca, Na, Mg, Zn, Fe, Cu và Mn

Các vitamin: Vitamin B-complex, vitamin B1 (thiamin), vitamin B2

(riboflavin), axit pantothenoic, biotin, niacin, axit folic, inositol, axetincolin, một lượng nhỏ vitamin C Các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K thường không có hoặc nếu có thì hàm lượng cũng ít [3]

Bảng 1.2 Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô [4]

Sữa ong chúa tươi Sữa ong chúa đông khô

1.1.3 Thu hoạch sữa ong chúa

Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể phân tích, xác định mà “không thể tái tạo” Do đó điều mà các nhà khoa học có thể làm là nghiên cứu cặn kẽ mọi sinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào đó lấy sản phẩm phục vụ con người

Trong công nghệ nuôi ong lấy mật, con người đã vô tình nhưng may mắn biết cách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống Ngày nay, sữa ong chúa được bán trên khắp thế giới chủ yếu là sản phẩm thu được từ công nghệ nuôi ong Còn sữa ong chúa được lấy từ tự nhiên hầu như không được làm sản phẩm thương mại Sau đây là trình bày sơ lược về quy trình sản xuất và thu hoạch sữa ong chúa:

a Quy trình bắt cóc ong chúa

Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong nhiệm kỳ Theo đặc tính của loài ong, để cho đàn ong được tồn tại, khi các chú ong thợ thấy mất

đi ong chúa, chúng lập tức chọn một trong những ấu trùng ong thúc dưỡng để trở thành ong chúa Việc bắt cóc, biệt lập hay giết đi ong chúa đương nhiệm nhằm thúc đẩy ong thợ sớm chọn và thúc dưỡng nhiều ấu trùng ong để trở thành ong chúa Quy trình này chỉ thích hợp dưới dạng tiểu sản xuất, lượng sữa ong chúa thu được ít

b Quy trình giả làm tổ ong chúa

Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những mùi vị

từ ong chúa đem trét vào những tổ ong mới đã chuẩn bị sẵn Mùi vị của các tổ ong giả đã đánh lừa các chú ong thợ Khi các chú ong thợ khám phá ra tổ ong đang bị trống, chúng liền chọn lựa những con ấu trùng ong và thúc dưỡng để trở thành những con ong chúa mới Quy trình này hiện đại hơn so với quy trình bắt cóc ong chúa và mang nhiều tính khoa học hơn như việc lấy enzym, tạo mùi vị… Nhiều nhà sản xuất với quy mô dạng xuất khẩu, họ có thể tạo hàng loạt ấu trùng ong và đặt máy hút tự động tại các tổ ong chúa lúc còn là ấu trùng ong Sự hút sữa liên tục gây thiếu dinh

dưỡng cho ấu trùng chúa làm cho các ong thợ phải liên tục tiết ra sữa để nuôi ong chúa Do vậy con người thu được nhiều sữa ong chúa hơn

1.1.4 Tác dụng của sữa ong chúa

Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú nên nó có nhiều tác dụng tốt đối với cơ thể con người Sữa ong chúa có chứa colagen, lecithin và các loại vitamin A, E… tất cả đều có lợi cho da Nếu thoa sữa ong chúa lên da hàng ngày

có thể làm da trắng mịn và chống viêm da Ngoài ra sữa ong chúa còn có nhiều hợp chất có thể làm giảm hàm lượng cholesterol Một đánh giá cho thấy sử dụng 50 - 100

mg sữa ong chúa mỗi ngày có thể giảm 14% cholesterol và 10% triglycerit Sử dụng sữa ong chúa thường xuyên có thể ngăn ngừa và làm chậm sự phát triển của xơ vữa động mạch

Trong một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố, sữa ong chúa được báo cáo như một tác nhân làm thay đổi miễn dịch, cũng được báo cáo là có tác dụng đối với hệ thần kinh đệm và các tế bào tủy sống Ngoài ra, sữa ong chúa còn được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng có khả năng chống lại mệt mỏi, chống dị ứng, chống lão hóa, chống vi khuẩn… rất có lợi cho cơ thể Sữa ong chúa còn làm tăng khả năng sinh dục ở cả hai giới… [3]

Một số nghiên cứu vào năm 2005, L.A Salazar Olivo [23] và các cộng sự cũng

đã khẳng định sữa chúa có hoạt tính sinh học đa dạng, nó có thể ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, có khả năng chống lại sự phát triển của các tế bào ung thư của RJP30 (phần chiết protein bằng amoni sulfat 30%), ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa

ở người, làm giảm mật độ tế bào ban đầu gấp 2,5 lần sau bảy ngày điều trị Šimúth,

J [36] cũng đã quan sát thấy apalbumin-1 và apalbumin-2, hai protein chính trong

RJ, kích thích các đại thực bào chuột giải phóng TNF-α (tế bào hoại tử khối u)

Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các chất phân hủy enzym (pepsin, trypsin và papain) và protein của RJ [32,33] Thời gian thu hoạch

và tuổi ấu trùng có nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa của RJ và RJ đã thu thập được 24 giờ sau khi chuyển ấu trùng cho thấy có tác dụng chống oxy hóa mạnh

nhất [18] Hoạt tính chống oxy hóa của RJ cũng đã được chứng minh trong các mô hình thí nghiệm in vitro khác nhau Năm 2007, Aziza A El-Nekeety [5] đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên chuột và kết quả là RJ có tác dụng bảo vệ chống lại độc

tính của Fumonisins (chất được sinh ra từ nấm, là chất độc hại cho con người và động

vật) Năm 2008, Polona Jamnik [30] đã nghiên cứu trên các tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae như một sinh vật mẫu, cho thấy rằng RJ làm giảm quá

trình oxi hóa nội bào Và khả năng chống lại tổn thương gan do paracetamol gây ra

và tác dụng đối với độc tính sinh tinh của cisplatin đã được xác nhận trong các thí

nghiệm trên các động vật thí nghiệm [7, 28, 37]

Hoạt động giống như insulin: có tác dụng chống lại bệnh tiểu đường, RJ có thể làm giảm lượng đường trong máu thông qua các peptit Và giữ cho lượng đường trong máu ở trạng thái bình thường bằng cách tham gia vào quá trình oxy hóa glucozo

để thu được năng lượng [6, 7]

Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của một số peptit thu được thông qua quá trình thủy phân enzym của RJ đối với chuột bị huyết áp cao Các

peptit đã ức chế enzym chuyển đổi angiotensin 1 (ACE) và áp lực sanguine đã giảm

sau khi uống RJ Hiệu quả chống tăng huyết áp đã lên tới 38% [7]

1.2 Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA)

Tên IUPAC: Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic hoặc axit (E) 2-enoic (10-HDA) là axit béo dồi dào nhất (FA – fatty acid) và là thành phần lipid chính của sữa ong

-10-hydroxydec-Hình 1.3 Công thức hóa học của axit 10-hydroxy-trans-2-decenoic

Một số tiêu chuẩn của hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa của một số nước

Mặc dù sữa ong chúa là một sản phẩm đầy hứa hẹn với giá trị tài chính ngày càng tăng cho người nuôi ong và ngành công nghiệp nhưng phát triển thị trường lại khá chậm Điều mà phần lớn những người nuôi ong không khuyến khích mở rộng kinh doanh là thiếu các tiêu chí chất lượng, kiểm soát tính xác thực và nguồn gốc địa

lý Ngày nay, không có tiêu chuẩn nào ở cấp độ châu Âu hoặc quốc tế cho các sản phẩm của ong, chỉ có một số quốc gia đã thiết lập các tiêu chuẩn Quốc gia đầu tiên đặt tiêu chuẩn cho RJ là Argentina năm 1979, tiếp theo là Bungari năm 1984, Ba Lan năm 1996, Thổ Nhĩ Kỳ năm 2000, Brazil năm 2001, Serbia năm 2003, Thụy Sĩ năm

2005 (sửa đổi năm 2014), Nhật Bản và Trung Quốc năm 2008, Ấn Độ năm 2012 và Hàn Quốc năm 2014 Một vài năm trước, một nhóm nghiên cứu của Ủy ban ong mật Quốc tế (IHC) đã đề xuất sơ bộ về tiêu chuẩn dựa trên những thông tin họ thu thập được [9]

Bảng 1.3 Đề xuất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức [9]

Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia

Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia

1.2.1 Một số nghiên cứu về 10-HDA

Một số tính năng độc đáo và thú vị của sữa ong chúa có được là do sự có mặt của các chất béo Axit béo chính trong sữa ong chúa là 10-HDA, một loại axit béo không bão hòa tự nhiên Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng 10-HDA thúc đẩy sự tăng trưởng của các tập hợp tế bào lympho T và interleukin-2, điều này có thể gợi ý

là loại axit béo này có tác dụng ức chế miễn dịch và chống ung thư Đây là một hướng điều trị có lợi để hạ đường huyết, chống lão hóa và khối u; vì vậy 10-HDA có giá trị quan trọng trong lĩnh vực điều trị y tế và chăm sóc sức khỏe [19]

a Hoạt tính sinh học

Hoạt tính chống ung thư của 10-HDA

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng sữa ong chúa giúp bảo vệ cơ thể khỏi bệnh ung thư Sử dụng thường xuyên thậm chí có thể ngăn ngừa bệnh này xảy ra

Vào năm 1959, trên tạp chí Nature Publishing Group, Gordon F., Townsend

và cộng sự đã khẳng định sữa ong chúa có khả năng chống u biếu Nguyên nhân là vì trong sữa ong chúa có chứa nhiều loại axit béo, đặc biệt là 10-HAD Sữa ong chúa có khả năng ngăn chặn sự phát triển khối u cổ trướng và bệnh bạch cầu ở AKR chuột [33, 34]

Vào năm 2007, Hiroshi Izuta [14] và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế đối với VEGF (vascular endothelial growth factor – yếu tố tăng trưởng mô mạch máu) trong tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người (HUVECs – Human umbilical vein endothelial cells) gây ra sự hình thành tế bào, ức chế sự tăng sinh và di chuyển của tế bào ung thư dẫn đến ức chế mạch máu khối u Ngoài ra, RJ cũng đã được chứng minh là có hoạt tính chống estrogen bằng cách ức chế sự tăng trưởng của bisphenol (BPA) – một loại estrogen kích thích sự tăng sinh của tế bào ung thư vú ở người

MCF-7 [21, 26] Tuy nhiên, việc điều trị các tế bào MCF-7 bằng các hợp chất lipit trong RJ thì làm tăng sinh các tế bào này, nhưng điều trị đồng thời với tamoxifen thì

sẽ ngăn chặn được sự tăng sinh của tế bào MCF-7, do các hợp lipit ức chế liên kết 17b-estradiol với ERb (estrogen b) nhưng không ảnh hưởng đến sự gắn kết của 17-bestradiol với Era (estrogen a) [22]

Vào năm 2017, Chi Chung Peng [9] và các cộng sự đã chứng minh rằng HDA trong RJ có khả năng ức chế hoạt động tyrosinase, ức chế sự biểu hiện của melanogen bao gồm tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 (tyrosinase-related protein 1 và 2) bằng cách ức chế MITF (microphthalmia-associated transcription factor) trong các tế bào u ác tính Đo đó, làm giảm sắc tố của melanin trong tế bào u ác tính B16F10

10-Một bằng chứng chống ung thư khác là RJ có tác dụng kích thích miễn dịch, bằng cách ngăn chặn sự suy tủy gây ra bởi sự tiến hóa của khối u qua ức chế tạo máu lách ở những người mang khối u hạch (EAT - Ehrlich ascetic tumor) và điều trị tùy thuộc vào thời gian và liều RJ [8]

Hoạt tính chống oxi hóa của 10-HDA

Khi peroxid hóa lipid bị ức chế trong ống nghiệm và trong các thí nghiệm trên chuột, 10-HDA đã được tìm thấy để bảo vệ tế bào DNA khỏi quá trình oxy hóa Nghiên cứu về chế độ ăn kiêng RJ đối với chuột, người ta đã chứng minh rằng sau khi cho chuột ăn RJ trong 16 tuần, nồng độ 8- hydroxy-2-deoxyguanosin (một chất chống oxy hóa) đã giảm đáng kể trong DNA và huyết thanh của thận và tuổi thọ trung bình của chuột C3H / HeJ được tăng lên thông qua cơ chế chống oxy hóa [7, 38]

10-Hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA), đã được chứng minh là làm tăng tuổi

thọ của Caenorhabditis elegans (loài giun tròn) không thông qua insulin mà thông

qua chế độ ăn kiêng và tín hiệu TOR (một loại protein trong người), cụ thể là ức chế mTOR để giảm quá trình lão hóa [41]

Hyejung Gu và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của sữa ong chúa sau khi được khử với enzyme (ERJ) bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Tác dụng chống oxy hóa của ERJ là do giảm số phản ứng oxy hóa nội bào

(ROS) và sản sinh oxit nitric (NO) trong các đại thực bào Hơn nữa, ERJ làm tăng

hoạt động chống oxy hóa superoxide effutase (SOD) và glutathione (GSH) Các hoạt

động chống oxy hóa này của ERJ mạnh hơn so với các hoạt động của RJ không được qua xử lý [15]

Một số hoạt tính khác

Tác dụng nơron thần kinh: Theo dân gian, sữa ong chúa đã được biết đến để cải thiện trí nhớ, ngăn ngừa lão hóa, tăng năng lượng, giảm lo lắng và làm giảm tính hiếu động 10-HDA của RJ có khả năng làm tăng sự sản sinh tế bào thần kinh và bảo

vệ các tế bào thần kinh của não chuột trưởng thành [7]

Tác dụng kháng sinh, kháng viêm: Axit 10-hidroxy-2-decenoic cũng có hoạt

tính kháng sinh chống lại một số vi khuẩn và nấm (trong đó có Micrococcus pyogenes,

Escherichia coli, Neurospora sitophila) 10-HDA đã được nghiên cứu với chức năng

chống viêm trên các tế bào ung thư ruột của con người (WiDr), cũng như tác dụng của nó đối với sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh 10-HDA đóng vai trò là chất diệt khuẩn mạnh chống lại mầm bệnh đặc trưng cho động vật hoặc người, bao gồm

Staphylococcus aureus, Streptococcus alactolyticus, Staphylococcus trung gian B, Staphylococcus xylosus, Salmonella cholearasuis, Vibro parahaem Điều đó cho thấy

tiềm năng của nó như là khả năng chống viêm và diệt khuẩn để mang lại lợi ích cho đường tiêu hóa của con người [40]

Ngoài ra, 10-HDA còn có tác dụng làm đẹp, gia tăng sản xuất collagen Trong một nghiên cứu in vitro, RJ đã thúc đẩy sự hiện diện sản xuất collagen của các nguyên bào sợi trong axit theascorbic-2-O-α-glucoside (AA2G) [7]

b Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa

Xác định 10-HDA bằng phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục

giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau [11] Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này, để phân tích 10-HDA có thể kể đến như:

Năm 2007, Jinhui zhou [19] và các cộng sự đã xây dựng phương pháp xác định 10-HDA trong mẫu sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô bằng phương pháp HPLC pha đảo với chất nội chuẩn methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Các điều kiện sắc kí được dùng để phân tích như sau: Cột sử dụng là cột C18 (3,9 nm 𝖷 150

nm 𝖷 5µm) với nhiệt độ 30oC, pha động là methanol : nước : axit photphoric có tỉ lệ

50 : 50 : 0,3 (v/v/v), với tốc độ dòng là 0,8 mL / phút, tổng thời gian chạy sắc kí để tách được 10-HDA là 7,2 phút Trước khi bơm mẫu vào thiết bị HPLC, mẫu sữa ong chúa được chiết bằng etanol tuyệt đối và lọc bằng màng nilon 0,2 µm Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 - 99,2% với RSD = 1,3% - 2,1%, giới hạn phát hiện LOD = 0,5 mg/kg, giới hạn định lượng là LOQ = 1,5 mg/kg

Năm 2010, Joonyeong Kim [20] và cộng sự đã nghiên cứu xác định hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp HPLC và sử dụng chất nội chuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điều kiện sắc kí để phân tích 10-HDA như sau: Sử dụng cột XDB-C18 (150 nm 𝖷 4,6 nm) với nhiệt độ là 25oC, bước sóng

UV là 215 nm, pha động là hỗn hợp metanol : nước : axit photphoric (55 : 45 : 2,7, v/v/v), với tốc độ dòng chảy là 1,0 mL / phút và tổng thời gian chạy sắc kí là 10 phút Mẫu được chiết bằng metanol với tỉ lệ metanol : nước là 50 : 50 (v:v), rồi lọc qua màng nilon 0,2 µm và 0,45 µm rối sau đó được đưa vào thiết bị HPLC với thể tích bơm là 3 µL Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình trong khoảng 97,4%

- 100,4% với RSD = 2,4% - 3,4%, giới hạn phát hiện LOD = 0,05 µg/mL và giới hạn phát hiện LOQ = 0,25 µg/mL

Năm 2017, Ivana Flanjak [16] và các cộng sự đã xác định 10-HDA trong sữa ong chúa ở Croatia bằng phương pháp HPLC với detector UV, có bước sóng hấp thụ

là 215 nm và sử dụng chất nội chuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điều kiện phân tích sắc kí 10-HDA là: Sử dụng cột pha đảo C18 (4,6 µm 𝖷 150 µm) điều chỉnh đến 35 oC, pha động là metanol : nước (50 : 50, v/v) và tốc độ dòng là 1,0 µL / phút thể Mẫu được chiết và hòa tan bằng dung môi metanol với tỉ lệ metanol : nước là 50 : 50 (v:v), sau đó đem lọc lần lượt qua màng lọc nilon 0,2 µm, rồi đưa vào hệ sắc kí HPLC, trong đó tỉ lệ hỗn hợp giữa thể tích mẫu : thể tích MHB là 75 : 25 (v:v) Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 – 99,0%

Xác định 10-HDA bằng phương pháp GC-MS

Trong sắc kí khí, pha động là một khí mang, thường là một khí trơ như Heli hoặc một khí không hoạt động như Nitơ Pha tính là một vi lớp chất lỏng hoặc polymer được phủ trên một lớp rắn đặt trong cột sắc kí Các hợp chất cần phân tích

sẽ được chuyển sang dạng khí và tương tác với thành cột – được phủ bởi pha tĩnh, dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác nhau – gọi là thời gian lưu của hợp chất Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ được phát hiện và xác định bằng detector như là MS

Năm 1992, Hikoto ohta [42] và các cộng sự đã tiến hành xác định 10-HDA bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS) Phương pháp được thực hiện theo nguyên tắc là dẫn xuất hóa 10-HDA bằng việc cho phản ứng với acetamide N,O-bis (trimethylsilyl) ở pH = 2,5 tại nhiệt độ phòng trong 15 phút và sau

đó được chiết bằng dichlorometan Mẫu sau khi chiết được đưa vào hệ thiết bị

GC-MS với điều kiện GC-GC-MS được sử dụng trong nghiên cứu là: Sử dụng cột mao quản (0,25 mm 𝖷 30 m 𝖷 0,25µm), với nhiệt độ tách từ 100 oC – 280 oC (tăng 8 oC / phút)

và nhiệt độ buồng tiêm là 280 oC, tốc độ dòng He là 1 mL / phút Phương pháp cho

độ nhạy là 16,7 ppm và độ thu hồi trung bình của 10-HDA là 99,5%

Năm 2011, V.A Isidorov [39] và cộng sự đã công bố đề tài xác định các hợp chất axit béo có trong sữa ong chúa bằng phương pháp GC-MS kết hợp với chiết pha rắn SPE Cụ thể các axit béo là: axít 7- và 8-hydroxyoctanoic, 3-hydroxydecanoic, 9-hydroxydecanoic, 9-hydroxy-2-decenoic, 10-hydroxydecanoic, 10-hydroxy-2-

decenoic (10-HDA), 3,10-dihydroxydecanoic, 2-octene-1,8-dioic và dioic Dẫn xuất hóa 10-HDA với bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamit (BSTFA) và pyridin để có thể tách ra được trên máy sắc kí khí Trước khi đưa vào hệ sắc kí, hỗn hợp phản ứng được làm nóng ở 60 oC trong 30 phút Điều kiện thiết bị GC – MS để phân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa là: Sử dụng cột mao quản silica nóng chảy HP-5MS (30 m 𝖷 0,25 mm 𝖷 0,25 µm), với nhiệt độ tách ban đầu là 50 oC

2-decene-1,10-và tăng lên 300 oC với tốc độ tăng 5 oC / phút, nhiệt độ ở buồng tiêm là 250 oC nhiệt

độ ở tranferline là 250 oC, nhiệt độ của nguồn ion là 270 oC và tốc độ dòng khí He là

1 mL / phút,.Kết quả thu được độ nhạy của phương pháp cỡ 0,05 µg/µL

Xác định 10-HDA bằng phương pháp điện di mao quản với detector UV

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện giải (có chất đệm pH), dưới tác dụng của điện trường E nhất định (do thế V đặt vào hai đầu mao quản sinh ra) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (EOF) [1,2] trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng

Theo Orlando Munoz [29] và các cộng sự đã nghiên cứu phương pháp xác định 10-HDA với cột mao quản có bước sóng hấp thụ là 215 nm Điều kiện thiết bị điện di để phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa như sau: Tổng chiều dài mao quản

là 85 cm với chiều dài hiệu dụng là 60 cm, thời gian bơm mẫu vào hệ thiết bị là 20 s tại thế cao áp là 15 kV, đệm được sử dụng trong phương pháp phân tích 10-HDA là hỗn hợp 20 mM photphat pH 7,2 và 0,4 mM MTAB Kết quả cho thấy LOD của phương pháp là 12,618 ppm và LOQ là 42,06 ppm

Ứng dụng của điện di mao quản (CE) để tách và xác định thành phần hoạt chất, cụ thể là axit 10-hydroxy-2-decenoic trong sữa ong chúa với detector UV ở bước sóng 215 nm được nghiên cứu bởi Li Jia và các cộng sự [24] Phương pháp sử dụng

có đầu bơm mẫu là catot và đầu gắn với detector là anot Mẫu được bơm vào thiết bị phân tích trong 40 s, tại điện áp 20 kV Axit 10-HDA được tách ra và được phát hiện trong cột mao quản bằng silica có chiều dài là 60 cm với đường kính trong là 75 µm

Dung dịch đệm được sử dụng là đệm photphat ở pH 7,3 Trong nghiên cứu này sử dụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) làm chất điều chỉnh dòng điện cho phép tách nhanh 10-HDA khỏi các thành phần khác trong sữa ong chúa bằng cách đảo ngược hướng của dòng điện Kết quả cho thấy độ nhạy của phương pháp cỡ 0,02 mg/mL.

c So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thích hợp

Các phương pháp sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao đều có ưu điểm chung là khả năng tách chất tốt, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị cao Ngoài ra, khi vận hành với các detector khác nhau kết hợp với làm giàu mẫu có thể mang lại những đặc tính ưu việt như giới hạn phát hiện khá thấp (cỡ vài ppm) với các detector FID và detector MS Tuy nhiên, đây là các phương pháp sử dụng thiết bị có giá thành cao (GC-MS hay HPLC) và chi phí phân tích cũng cao khi phải sử dụng pha động là khí mang (như heli) hay dung môi chuyên dụng cho HPLC (như axetonitril, metanol) với độ tinh khiết cao Hơn thế nữa, quy trình xử lý mẫu khi sử dụng các phương pháp này tương đối phức tạp, do cần có bước dẫn xuất hóa chất phân tích

Phương pháp điện di mao quản ngoài những ưu điểm là khả năng tách chất cao, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị khá cao, còn có ưu điểm về giá thành phân tích vì chỉ sử dụng pha động là các dung dịch đệm có giá thành thấp, dễ vận hành và cũng có thể kết hợp sử dụng nhiều loại detector như detector MS, detector UV,… và đặc biệt quy trình xử lý mẫu khi sử dụng phương pháp điện di mao quản tương đối đơn giản, không yêu cầu việc dẫn xuất hóa các chất phân tích Hơn thế nữa, ở môi trường pH khác nhau, 10-HDA là chất mang điện, nên việc sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) là phù hợp vì detector này cho sự phân tách tốt giữa các tiểu phần mang điện Bởi vậy, với ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quản trong phân tích 10-HDA sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (phương pháp CE-C4D) sẽ có thể là sự lựa chọn tiềm năng

1.3 Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh

ra do thế V Hiện nay, CE được phân loại theo các cơ chế tách như sau: điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE), điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF), điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP), điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis - CGE) và sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (Micellar electrophoresis capillary chromatography

- MECC) Tuy nhiên điện di mao quản vùng (CZE) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất do đơn giản trong vận hành và hiệu quả trong phân tích Trong nghiên cứu này, thuật ngữ CE được hiểu là CZE

Theo phương pháp CE, các ion trong mao quản di chuyển với tốc độ khác nhau theo công thức:

có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn

Hình 1.4 Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản

Mao quản trong điện di có thể được làm từ teflon, polyme, tuy nhiên vật liệu thường dùng là silica, và thường có đường kính trong nằm trong khoảng 25 ÷ 100

μm Dưới đây là hình ảnh của hệ điện di mao quản được sử dụng trong nghiên cứu:

Hình 1.5 Hệ điện di mao quản 1 kênh

Trong đó: (1): dung dịch điện li nền

(2): Detector C4D

Hình 1.6 Bộ ghi tín hiệu

Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Dòng điện di thẩm thấu trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thành mao quản và chất điện li chứa trong nó Với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trên bề mặt mao quản có khả năng bị deproton hóa chuyển thành SiO- khi tiếp xúc với dung dịch chất điện li, đặc biệt là trong môi trường kiềm Đây là điều kiện để

hình thành nên lớp điện kép, trong đó lớp di động nằm bên ngoài mang điện dương

Khi áp vào hai đầu mao quản một điện thế, lớp di động này di chuyển về phía cực âm

với một vận tốc nhất định, tạo thành dòng, gọi là dòng EOF

Độ lớn của dòng EOF tỉ lệ thuận với lực điện trường E do thế V đặt vào hai đầu mao quản, độ lớn của thế ξ, hằng số điện môi và tỉ lệ nghịch với độ nhớt của pha

động điện di theo biểu thức sau:

vEOF = µEOF E=

ɛ ξ

(cm/s) (2) 4ȠΠ

Trong đó: ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm

ξ: thế zeta của lớp điện tích kép Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF Do vậy để có được hiệu quả tách cao, cần tìm được dòng EOF

có cường độ phù hợp với chất phân tích, có nghĩa là phải tối ưu hóa các điều kiện của quá trình điện di

Hình 1.7 Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong EOF 1.3.1 Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C 4 D)

Việc phát hiện chất trong CE được thực hiện nhờ detector Một số detector thông dụng như detector đo quang (hấp thụ phân tử, huỳnh quang), điện hóa (đo dòng,

đo thế, độ dẫn) và khối phổ Trong đó, detector điện hóa loại đo độ dẫn, đặc biệt là detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) được sử dụng rộng rãi

do có khả năng phân tích rộng và độ nhạy tốt

Nguyên tắc thiết kế của detector độ dẫn không tiếp xúc là sử dụng hai điện cực hình ống đặt vòng quanh và không tiếp xúc với mao quản Khi áp vào một hiệu điện thế, hai điện cực này sẽ đóng vai trò hai tụ điện còn khối dung dịch trong mao quản giữa hai điện cực đóng vai trò điện môi Sự chênh lệch về giá trị điện trở sẽ tạo ra các tín hiệu đo Tại đầu ra của điện cực thứ hai, tín hiệu sẽ được thu nhận đưa đến bộ khuếch đại và xử lý cho ra tín hiệu phân tích Khi sử dụng detector này, tín hiệu của chất phân tích (pic) thu được là giá trị điện thế dưới dạng tín hiệu số Việc hiển thị tín hiệu được thực hiện dễ dàng bằng các phần mềm ghi tín hiệu trên máy tính

Hình 1.8 Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D)

1.3.2 Kỹ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản

Có hai kĩ thuật bơm mẫu chủ yếu được sử dụng, bao gồm bơm mẫu kiểu thủy động học và bơm mẫu kiểu điện động học

- Phương pháp thuỷ động học: dùng một áp suất khoảng 50 đến 300 mBar áp vào vùng mẫu ở đầu cột sau một thời gian t nhất định

- Phương pháp thủy tĩnh (xy phông): dựa vào lực hút của trái đất, sự chênh lệch chiều cao giữa hai đầu mao quản tạo ra một lực đẩy dung dịch mẫu đi vào mao quản

- Phương pháp điện động học: dựa vào tính chất điện di thẩm thấu khi có điện

áp được cấp cho mao quản, người ta đã đưa mẫu vào mao quản chính bằng dòng điện di thẩm thấu EOF

Hình 1.9 Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 1.3.3 Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản

Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trong

CE Diện tích pic tỉ lệ với nồng độ chất phân tích đi qua detector Dựa vào giá trị diện tích pic, ta có thể xác định được nồng độ của chất phân tích có trong mẫu

Trong đó: ti và tj là thời gian di chuyển của hai chất i và j (ti > tj ) (s)

wi và wj là độ rộng đáy của hai pic chất i và j

Theo lí thuyết, hai pic được coi là tách hoàn toàn khỏi nhau (với độ tin cậy 95%) khi độ phân giải R ≥ 1,5

1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản

Dung dịch điện di nền

Dung dịch điện di nền (BGE) có vai trò quyết định trong quá trình tách chất Như đã thấy trong công thức (1), chất điện di nền ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của các ion, thông qua giá trị độ nhớt của dung dịch và khả năng solvat hóa (thể hiện qua bán kính hiđrat r)

BGE thường được sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trường nước Thành phần của hệ đệm bao gồm một hợp phần mang tính axit, hợp phần còn lại mang tính bazơ Các yếu tố cần quan tâm khi lựa chọn dung dịch điện di nền phù hợp bao gồm thành phần, nồng độ các hợp phần và pH dung dịch

Điện thế tách

Điện trường được tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớn,

cỡ kV, theo công thức E = V/L Đây là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tách chất và tín hiệu thu được Khi hiệu điện thế nhỏ, chân pic dãn và diện tích pic lớn hơn, tuy nhiên thời gian phân tích dài hơn Trong khi đó, hiệu điện thế lớn có thời gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thu hẹp lại, đồng thời còn gây ra hiệu ứng nhiệt Do đó, giá trị độ lớn của hiệu điện thế đặt vào là yếu tố quan trọng cần quan tâm

Lượng mẫu đi vào mao quản

Lượng mẫu đi vào mao quản ảnh hưởng lớn tới diện tích và khả năng phân tách các pic Lượng mẫu ít dẫn tới diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiện chất, trong khi lượng mẫu lớn, diện tích pic tăng, làm giảm độ phân giải Đối với một

hệ điện di mao quản đơn giản, vận hành bằng tay, sử dụng phương pháp bơm mẫu xi phông thì lượng mẫu đi vào mao quản phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu Mặc dù vậy, với phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cố định

Ngoài ra, còn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưởng tới quá trình tách chất như chiều dài và đường kính trong của mao quản Tuy nhiên, thông thường, các yếu tố này được giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp điện di mao quản để phân tích xác định hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa Thực nghiệm bao gồm: khảo sát lựa chọn dung môi chiết thích hợp và vận dụng phương pháp đã xây dựng được tiến hành xác định hàm lượng 10-HDA trong các mẫu thực tế được thu mua ngoài hiện trường Trên cơ sở kết quả nghiên cứu cụ thể, tiến hành so sánh, đánh giá với phương pháp tiêu chuẩn HPLC

Phương pháp nghiên cứu

Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách 10-HDA được thực hiện trên

hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có tổng chiều dài 60 cm, đường kính trong 50

µm Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao 10

cm so với đầu mao quản còn lại Độ cao này được cố định trong tất cả các thí nghiệm Dung dịch chuẩn của 10-HDA ở nồng độ 20 mg/L được sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích Trong các thí nghiệm, điện thế tách được giữ cố định ở giá trị -15 kV

và thời gian bơm mẫu 30 s; trừ các thí nghiệm khảo sát điều kiện điện thế và thời gian bơm Điều kiện phân tích được lựa chọn trên cho cơ sở đường nền ổn định, tín hiệu của các chất phân tích có diện tích lớn, hình dạng sắc nét

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên CE

Khảo sát thành phần dung dịch điện li nền

Qua tham khảo tài liệu, một số loại dung dịch điện li nền có giá trị pH thấp (pH< 2) là các axit hữu cơ với các nồng độ khác nhau được lựa chọn để nghiên cứu quy trình phân tách 10-HDA, bao gồm axit axetic, axit lactic, hydroxymetyl aminometan (Tris), axit 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MES), axít 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MOPS), axít N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic

(CHES) với cùng một nồng độ là 100 mM và pH = 9 Sau khi lựa chọn được thành phần dung dịch điện ly nền thích hợp, tiếp tục nghiên cứu sự thay đổi nồng độ và pH với các giá trị khảo sát pH = 8 ÷ 9 và nồng độ là 20 mM, 50 mM và 100 mM

Khảo sát và tối ưu thời gian bơm mẫu

Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích và hình dạng tín hiệu của chất phân tích được khảo sát với thời gian bơm mẫu thay đổi từ 10 s tới 60 s

Khảo sát và tối ưu điện thế tách

Điện thế đặt vào hai đầu mao quản tạo ra một điện trường, là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng tới quá trình tách chất Trong khảo sát này, điện thế tách thay đổi từ 10 ÷ 20 kV

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu

Mẫu trước khi bơm vào thiết bị CE để tách và nhận biết cần phải hòa tan trong dung môi thích hợp và lọc Việc khảo sát quy trình xử lý mẫu được thực hiện như sau:

Khảo sát giấy lọc và quy trình ly tâm mẫu

Ba loại giấy lọc được lựa chọn trong nghiên cứu này là: giấy lọc xenluloso axetat, giấy lọc nilon và giấy lọc PTFE đều có cỡ lỗ 0,2 µm Mẫu được hòa tan trong

50 mL nước deion, sau đó được chia làm 2 phần Phần 1 được đem đi ly tâm 1500 rpm trong 15 phút và lọc với từng loại giấy lọc đã nêu trên Phần 2 không ly tâm mà được đem lọc trực tiếp trên từng loại giấy lọc Dịch lọc được bơm trực tiếp vào thiết

bị CE-C4D và so sánh diện tích tín hiệu 10-HDA thu được

Khảo sát dung môi hữu cơ và hệ dung môi hòa tan

Bốn hệ dung môi dùng để hòa tan mẫu được khảo sát là : nước deion, hỗn hộp của nước deion với metanol, etanol và isopropanol có tỷ lệ thể tích nước deion : dung môi hữu cơ là 1:1 Thực nghiệm được tiến hành với ba loại mẫu: mẫu sữa ong chúa tươi, mẫu sữa ong chúa dạng gel và mẫu sữa ong chúa dạng bột Cân lượng chính xác