TỔNG QUAN
Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm
1.1.1 Giới thiệu chung về nhân sâm
Bộ phận thường được sử dụng của Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) là rễ củ đã được phơi hoặc sấy khô Nhân sâm thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), còn được gọi là họ Ngũ gia bì Hầu hết các loài trong họ Nhân sâm đều được ứng dụng trong Y học cổ truyền ở nhiều quốc gia Á-Âu, đặc biệt là ở các nước Đông-Bắc Á Nhân sâm trồng được gọi là viên sâm, trong khi sâm mọc hoang được gọi là sơn sâm.
Viên sâm là loại thảo dược quý, được trồng, phơi hoặc sấy khô, có rễ cái hình thoi hoặc trụ tròn, dài từ 3 đến 15 cm và đường kính từ 1 đến 2 cm Bề ngoài rễ có màu vàng hơi xám, với nếp nhăn dọc và khía vân ngang rõ ràng Phần dưới có 2-3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, thường có mấu dạng củ nhỏ không rõ Thân rễ (Lô đầu) dài từ 1 đến 4 cm, đường kính 0,3 đến 1,5 cm, thường cong và co lại, có rễ phụ và vết sẹo thân Chất rễ tương đối cứng, màu trắng hơi vàng, có tinh bột rõ và vỏ có ống tiết nhựa màu vàng nâu với các kẽ nứt dạng xuyên tâm Viên sâm nổi bật với mùi thơm đặc trưng và vị hơi đắng, ngọt.
Hồng sâm là sản phẩm được chế biến từ rễ sâm qua các phương pháp hấp, sấy và phơi khô Rễ hồng sâm có hình dạng thon hoặc trụ, dài từ 3 đến 15 cm, đường kính từ 1 đến 2 cm, với bề mặt màu nâu hơi đỏ và có thể có vết đốm màu nâu vàng thẫm Rễ có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo của rễ con, phần đầu rễ có các vòng tròn không rõ nét, trong khi phần đuôi mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn và nhiều rễ con cong queo Một số thân rễ có rễ phụ còn nguyên dạng hoặc đã gẫy, tạo nên chất cứng và giòn với bề mặt bẻ gãy nhẵn Hồng sâm có mùi thơm đặc trưng, vị ngọt và hơi đắng.
Sơn sâm, hay còn gọi là nhân sâm mọc hoang, thường được phơi hoặc sấy khô Dược liệu chính là rễ cái, có chiều dài từ 2 đến 10 cm, với hình dạng chữ V, hình thoi hoặc hình trụ Bề ngoài của rễ có màu vàng hơi xám, với các vân nhăn dọc và các vòng vân ngang ở đầu trên Thường có hai rễ nhánh, các rễ con nhỏ và mảnh dẻ được sắp xếp có thứ tự, cùng với mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu” Thân rễ mảnh, dài và có các vết sẹo thân dày đặc, tạo hình tương tự như hạt táo.
Nhân sâm, một loại thảo dược quý, mọc hoang và được trồng chủ yếu ở Đông Bắc Trung Quốc, Triều Tiên và Liên Xô cũ Quá trình trồng trọt nhân sâm rất công phu, mất từ 5-6 năm mới có thể thu hoạch, yêu cầu đất đai phải tốt và cây ưa bóng râm Thời điểm thu hoạch thường vào mùa xuân và mùa thu, sau đó rễ củ được rửa sạch, phơi nắng nhẹ hoặc sấy khô Nhiều người tin rằng nhân sâm mọc hoang có giá trị hơn so với loại trồng Hiện tại, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được nhân sâm và phải nhập khẩu từ nước ngoài.
Nhân sâm chứa nhiều thành phần quý giá, trong đó ginsenosid là yếu tố chính quyết định tác dụng của nó Chất này có khả năng mang lại nhiều lợi ích tích cực cho sức khỏe.
1.1.2 Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm
Nhân sâm theo y học cổ truyền có tác dụng lớn trong việc bổ sung nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ và ích phế, đồng thời giúp sinh tân, an thần và ích trí Nhân sâm chủ trị các triệu chứng như khí hư, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hư, kém ăn, ho suyễn do phế hư, cùng với các vấn đề liên quan đến tân dịch, miệng khát, nội nhiệt, đái tháo, và tình trạng gầy yếu kéo dài Hoạt chất ginsenosid trong nhân sâm có các tác dụng đặc trưng khác nhau, được tóm tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid
Ginsenosid Tác dụng đặc trƣng
Ro Phân giải rƣợu, chống viêm gan và phục hồi hƣ tổn gan
Rb1 Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan
Rb2 Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đường, phòng chống xơ cứng gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan
Rc có khả năng làm giảm cơn đau và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein Đồng thời, nó cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, góp phần ngăn chặn hoặc hạn chế sự phát triển của ung thư vú.
Rd Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thƣợng thận
Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy
Rf Làm dịu cơn đau trong các tế bào não
Rg1 Khả năng gây hƣng phấn thần kinh trung ƣơng, chống và phục hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease
Rg2 có khả năng hạn chế sự gắn kết của tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, cải thiện lưu thông máu lên não và kéo dài tuổi thọ của tế bào.
Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu Rh2 Ức chế các tế bào ƣng thƣ, hạn chế khối u phát triển
1.1.3 Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid
Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen Khi thuỷ phân các saponin này thu đƣợc 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol và
Protopanaxatriol là một trong hai loại saponin có cấu trúc damaran trong Nhân sâm Các saponin này, được gọi là ginsenosid, được phân loại dựa trên cấu trúc của ba sapogenin Saponin, hay còn gọi là saponosid, là một nhóm glycosid phổ biến trong thực vật và đôi khi xuất hiện trong động vật như hải sâm và cá sao Tuy nhiên, saponin trong Nhân sâm có cấu trúc hóa học đặc biệt.
8 học khác so với giới thực vật khác, để phân biệt sự khác biệt này người ta gọi là Ginsenosid là từ ghép của Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid)
Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với bốn vòng steroid cố định, và nhiều gốc đường như glucose, rhamnose, xylose và arabinose gắn tại các vị trí C-3, C-6 hoặc C-20 Các ginsenosid được đặt tên theo định dạng 'Rx', trong đó 'R' đại diện cho gốc và 'x' thể hiện mức độ di động trên các tấm sắc ký lớp mỏng, với tính phân cực giảm dần từ chỉ số "một" đến "h" Ví dụ, Ra là hợp chất ít phân cực nhất, trong khi Rb có độ phân cực cao hơn Ra Độ phân cực khác nhau của các ginsenosid dẫn đến khả năng phân tách khác nhau, như được minh họa trong hình 1.1.
Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng
Chất lượng và thành phần ginsenosid trong nhân sâm chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như loài, tuổi, bộ phận cây, phương pháp canh tác, mùa thu hoạch và cách bảo quản Hàm lượng saponin trong nhân sâm tỷ lệ thuận với độ tuổi, đạt đỉnh điểm khoảng sáu tuổi.
Hợp chất Saponin thường được cấu tạo từ hai phần:
Phần đường : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic
Phần phi đường : aglycol ( còn gọi là Sapogenin), là phần chính quyết định hoạt tính của hợp chất Saponin
The aglycone portion of saponins found in ginseng is categorized into three types: protopanaxadiol, protopanaxatriol, and oleanane Protopanaxadiol and protopanaxatriol are tetracyclic triterpenoid saponins with a dammarane structure, while oleanane is a pentacyclic triterpenoid saponin The unique biological activities of ginseng are attributed to the dammarane-structured saponins The structure of saponins with protopanaxadiol aglycone is illustrated in figures 1.2, 1.3, 1.4, and tables 1.2, 1.3, 1.4.
Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol
Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol
Ginsenosid Rh1 Glc 2 -Rha Glc glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose; ara(f)= arabinose trong dạng furanose;
Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol
Ginsenosid-Rg1 G1c 2 -G1c Glc 6 -Xyl rha = rhamnose;
Hình 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic
Bảng 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic
Ginsenosid R0 Glc A2- Glc G1c glc = glucose;
1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1 a Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
Chất này có tên theo IUPAC: (3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β- D-glucopyranoside Cấu tạo chi tiết đƣợc biểu diễn trong hình 1.5
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
- Khối lƣợng phân tử: 1109,295g/mol
- Độ tan: Dễ tan trong nước (H 2 O), MeOH (MeOH), alcohol, pyridine, và dimethyl sulfoxide (DMSO), không tan trong diethyl ether và benzen b Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1
Chất này có tên theo IUPAC: (3β,6α,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,12- dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside Công thức cấu tạo đƣợc biểu diễn chi tiết trong hình 1.6
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1
- Độ tan: Dễ tan trong nước (H2O), methanol (MeOH), pyridime Ít tan trong ethyl acetat, cloroform Không tan trong diethyl và benzen.
Tổng quan về các phương pháp phân tích ginsenosid
Ginsenosid là một hỗn hợp phức tạp, thường chứa nhiều chất có tính chất tương tự nhưng khác nhau về một số nhóm thế hoặc thành phần Các chất trong cùng nhóm này có khung cơ bản giống nhau, dẫn đến sự tương đồng về tính chất vật lý và hóa học Do đó, việc sử dụng các phương pháp quang phổ như UV-VIS, IR, và huỳnh quang để phân tích định lượng một thành phần trong dược liệu gặp nhiều khó khăn và gần như không khả thi.
Sắc ký là phương pháp phổ biến trong phân tích hiện đại để xác định hàm lượng các chất, cho phép định lượng riêng từng chất trong hỗn hợp, đặc biệt hữu ích cho phân tích mẫu dược liệu Người dùng có thể định lượng một hoặc nhiều chất cùng lúc nếu điều kiện thích hợp được chọn Các phương pháp sắc ký thường được sử dụng bao gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản và sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hai phương pháp quan trọng trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên và dược liệu Ưu điểm nổi bật của HPLC là khả năng phân tích đa dạng các loại hợp chất, vượt trội hơn so với sắc ký khí, thường chỉ áp dụng cho các chất dễ bay hơi Nhờ vào sự cải tiến liên tục của pha tĩnh và độ nhạy của detector, HPLC hiện có thể phân tích các chất trong hỗn hợp với nồng độ từ ppm đến ppt, bao gồm cả chất phân cực và không phân cực Trong lĩnh vực dược liệu, HPLC thường được sử dụng để định lượng các chất trong hỗn hợp phức tạp, thông qua việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn Nhiều nghiên cứu đã ứng dụng HPLC để phân tích các ginsenosid Rg1 và Rb1 trong dịch sinh học.
Năm 1996, William A Court và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu xác định đồng thời các ginsenosids (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) trong Panax quinquefolium bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC Họ sử dụng cột Waters Symmetry C18 với kích thước 150mm x 3,9mm và tốc độ dòng 1,15 ml/phút, cùng với bước sóng hấp thụ 203 nm Pha động bao gồm dung dịch đệm phốt phát (A), dung dịch acetonitrile (B) và H2O (C) với chương trình gradient phức tạp Ngoài ra, nhóm tác giả còn áp dụng vòi phun tự động 1040A và detector diode array, sử dụng cột tách carbohydrate cartridge với tốc độ dòng 1,5 ml/phút và cùng bước sóng để đạt được kết quả chính xác.
Chương trình gradient pha động được thiết lập như sau: từ 0-28 phút, tỉ lệ A là 9-19% và B là 91-81%; từ 28-30 phút, A là 19% và B là 81%; từ 30-35 phút, A là 19-22% và B là 81-78%; từ 35-40 phút, A là 22-25% và B là 78-75%; từ 40-41 phút, A là 25-9% và B là 75-91% Độ chính xác của Rg1 đạt 1,2% và Rb1 là 3,8% Năm 2003, Aik-jiang Lau và cộng sự đã phân tích các saponin trong Tam thất thô và hấp chín bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng detector diode array để định lượng đồng thời các hợp chất Rg1, Re, R1, Rb1, Rc, Rd Hệ thống sử dụng bơm 1100, van bơm mẫu 20 µl, và cột pha đảo Waters Symmetry C18 (250x4,6 mm, 5 µm) Phân tích được thực hiện với pha động gradient, sử dụng nước (A) và acetonitril (B) với dung dịch B từ 20% đến 100% trong 80 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 5 µl và nhiệt độ cột duy trì ở 35°C Detector diode array quét trong khoảng 190nm - 400nm, với bước sóng hấp thụ là 203nm Độ chính xác trong ngày và khác ngày có RSD 0,995 Để kiểm tra độ phù hợp của đường chuẩn, chúng tôi đã tính lại nồng độ tương ứng của Rb1 và Rg1 từ diện tích pic, xác định các giá trị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 với phương trình y = 25261x + 53269 và R² = 0.9999.
Bảng 3.8 Độ lêch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1-Rb1
C kt (àg/mL) Độ lệch Bias (%) Ckt (àg/mL) Độ lệch
Theo quy định của AOAC, nồng độ tính toán tại tất cả các điểm trên đường chuẩn không được chệch quá ± 15% so với nồng độ lý thuyết Điều này cho thấy đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Rb1, Rg1 (5 – 500 ppm) đạt yêu cầu và được chấp nhận theo tiêu chuẩn AOAC.
Phân tích các dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 với nồng độ từ 37,5 ppm đến 600 ppm và ginsenosid Rb1 từ 50 đến 1600 ppm được thực hiện trên hệ thống HPTLC Kết quả cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng, được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.19.
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1 trên HPTLC
Nồng độ C ppm Diện tích pic S Nồng độ C ppm Diện tích pic S
Hình 3.19 Đồ thị đường chuẩn Rg1 – Rb1 phân tích trên HPTLC
Đường chuẩn của ginsenosid Rg1 và Rb1 thể hiện độ tuyến tính tốt với hệ số đạt yêu cầu > 0,995 Ginsenosid Rg1 có khoảng tuyến tính từ 75pm đến 600ppm, trong khi ginsenosid Rb1 có khoảng tuyến tính từ 100ppm đến 1600ppm Để kiểm tra độ phù hợp của đường chuẩn, chúng tôi đã tính toán nồng độ tương ứng của Rb1 và Rg1 từ diện tích pic, xác định giá trị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu, với kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và 3.11.
Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1
C kt (àg/mL) Độ lệch Bias (%)
Bảng 3.11 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rb1
C lt (àg/mL) C kt (àg/mL) Độ lệch Bias (%)
Theo quy định của AOAC, nồng độ tính toán được tại tất cả các điểm trên đường chuẩn không được chệch quá ± 15% so với nồng độ lý thuyết Điều này cho thấy đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của Rb1 (100-1600ppm) và Rg1 (75-600ppm), đáp ứng yêu cầu và được chấp nhận theo tiêu chuẩn AOAC Hình 3.20 minh họa sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 được phân tích bằng phương pháp HPTLC.
Hình 3.20 Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tích trên HPTLC
3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng a Đối với phương pháp HPLC
Kết quả kiểm tra lại cho thấy tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đạt 10 khi pha loãng dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 và Rb1 ở nồng độ 3,0 ppm trong dung dịch mẫu trắng Hình 3.21 minh họa sắc đồ ginsenosid 3ppm pha trong dung môi mẫu trắng.
Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịch mẫu trắng
Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp đối với ginsenosid Rg1 và Rb1 là 3ppm, tương ứng với LOQ trong mẫu rắn là 30 àg/g và trong mẫu lỏng là 7,5 àg/100mL Phương pháp HPTLC được áp dụng để xác định các giá trị này.