Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
Từ các nghiên cứu khảo sát trước đây, 68 chủng vi khuẩn (lactic và
Vi khuẩn Bacillus đã được phân lập từ sữa tươi, sữa chua và các nguồn đất khác nhau, được xác định sơ bộ bằng hình thái và phương pháp hóa sinh Các mẫu vi khuẩn này được lưu giữ tại ngân hàng giống của phòng Thí nghiệm Trung tâm, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, và được sử dụng để sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh.
Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn được sử dụng để nghiên cứu
3.1.2 Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm
Môi trường MRS và NA được dùng để hoạt hóa vi khuẩn lactic và Bacillus.
Bảng 3.2 Môi trường đĩa thạch MRS pH: 6-6,5 sử dụng lactose
Môi trường MRS lỏng dùng để hoạt hóa vi khuẩn lactic có thành phần giống với môi trường MRS thạch nhưng không bổ sung agar.
Bảng 3.3 Môi trường đĩa thạch NA (Mirac Yilmaz et al., 2006)
Môi trường NB (Mirac Yilmaz et al., 2006) dùng để hoạt hóa vi khuẩn
Bacillus có thành phần giống môi trường NA nhưng không sử dụng agar.
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.4 Danh sách các thiết bị sử dụng để nghiên cứu
2 Máy phá vỡ tế bào
3 Máy ly tâm Rotor 6 chỗ
4 Máy ly tâm lạnh Rotor 24 chỗ
5 Quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS
7 Cân phân tích điện tử
8 Cân kỹ thuật điện tử
11 Máy đo pH để bàn
12 Tủ ấm lạnh có lắc
15 Máy khuấy từ gia nhiệt
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò RID
17 Máy lọc nước khử ion
Trong nghiên cứu, các dụng cụ cơ bản đóng vai trò quan trọng, bao gồm cốc đong, pipet thủy tinh, bình đựng, que cấy, que trang, ống nghiệm và ống fancol Những dụng cụ này giúp đảm bảo quy trình thí nghiệm chính xác và hiệu quả.
(15 ml, 50 ml), đĩa peptri, bình tam giác (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml) bình định mức (50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml), ống đong, cốc thủy tinh, đũa thủy
Bảng 3.5 Danh sách các hóa chất
9 X- gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosit)
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Điạđiểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2017 đến 10/2018.
Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sư ̣sinh trưởng và khảnăng sinh tổng hợp β-galactosidase.
- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp.
- Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase.
- Xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ.
- Định tên vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh.
- Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng β-galactosidase ưa lạnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase
3.4.1.1 Phương pháp hoaṭhóa và nuôi cấy giống
Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và cs (1978) và được mô tả như sau:
• Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB (cho vi khuẩn Bacillus) hoặc môi trường MRS lỏng (cho vi khuẩn lactic) đã hấp khử trùng ở
Tiến hành tiệt trùng ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1 atm trong 15 phút Sử dụng đầu que cấy tiệt trùng để lấy khuẩn lạc và chuyển vào ống nghiệm Nút miệng ống nghiệm bằng màng bọc thực phẩm, ghi chú tên chủng và thời gian cấy Tất cả các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn Cuối cùng, chuyển các ống nghiệm vào tủ nuôi cấy, giữ ở nhiệt độ 37 độ C, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Tiếp giống 1% từ ống nghiệm đã hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi trường NB (Bacillus) hoặc MRS lỏng (lactic) với 1% đường lactose đã được hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút Sau đó, nuôi cấy ở 37°C, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
3.4.1.2 Xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal
Chủng vi khuẩn Bacillus/lactic sinh β-galactosidase được xác định theo phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi, 1996 Quá trình này dựa trên khả năng của β-galactosidase trong việc thủy phân X-gal, dẫn đến sự hình thành sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo Do đó, những vi khuẩn dương tính với β-galactosidase sẽ tạo ra khuẩn lạc màu xanh khi được nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch có bổ sung chỉ thị X-gal và lactose.
- Xác định khả năng sinh enzyme β–galactosidase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch.
Môi trường NA và MRS được chuẩn bị với 1% đường lactose để nuôi cấy vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn lactic Sau khi hấp và làm nguội, bổ sung 60 µl X-gal với nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1M vào mỗi đĩa, khuấy đều để đảm bảo sự phân bố đồng nhất.
+ Tiến hành cấy chấm điểm chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa bằng dịch hoạt hóa.
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 o C, trong điều kiện tối Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h.
3.4.1.3 Phương pháp xác định hoạt độ của β-galactosidase của vi khuẩn
Các bước xác định hoạt độ enzyme ngoại bào và nội bào của vi khuẩn được thực hiện như sau:
Sau 24 giờ, dịch lên men từ chủng vi khuẩn được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút tại 4ºC trong môi trường MRS hoặc NA có chứa 1% lactose Phần dịch trong thu được sau ly tâm sẽ được tách ra để xác định hoạt độ ngoại bào.
Sinh khối sau ly tâm được pha loãng bằng đệm phosphate pH 6.5 Tế bào được phá vỡ bằng sóng siêu âm trong 5 phút với cường độ dao động 70% và tần suất 10 giây on - 15 giây off Dịch tế bào sau khi phá vỡ được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút tại 4 độ C để thu phần dịch trong, phục vụ cho việc xác định hoạt độ nội bào.
Hoạt độ của β-galactosidase nội bào và ngoại bào được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thu Hà và cộng sự (2006) thông qua phản ứng với cơ chất ortho-nitrophenyl-β-galactopyranoside (oNPG) Khi β-galactosidase tác động lên oNPG, enzyme này sẽ thủy phân cơ chất thành galactose và o-nitrophenol Sự giải phóng o-nitrophenol làm cho hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu vàng, với độ hấp thụ (Abs) đạt cực đại ở bước sóng 420 nm.
Bước 1: Xây dựng đường chuẩn oNP
Sử dụng 0.5ml oNP và 0.75ml Na2CO3 để đo ở bước sóng 420nm, ta có thể xác định tốc độ phản ứng của oNP thông qua mối tương quan giữa nồng độ oNP và giá trị Abs tại bước sóng này, với đường chuẩn được dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.
Hình 3.1 Biểu đồ đường chuẩn oNP
Bước 2: Xác định hoạt độ của enzyme
Hãy cho 480 µl oNPG vào ống Eppendorf 1,5 ml Sau đó, đặt ống Eppendorf vào máy ổn nhiệt ở 30ºC và chờ trong 5 phút để nhiệt độ trong ống đạt 30ºC trước khi thêm enzyme vào.
+ Bắt đầu phản ứng bằng cỏch thờm 20 àl dung dịch enzyme ngoại bào hoặc nội bào sau đó lắc đều ở 600 vòng/phút trong 10 phút.
+Dừng phản ứng enzyme bằng cỏch bổ sung 750 àl Na 2 CO 3 0.4 M vào trong ống eppendorf.
+Đo độ hấp quang trên máy so màu ở bước sóng 420 nm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thớ nghiệm, trong đú 20 àl dung dịch enzyme được thay thế bằng 20 àl dung dịch đệm phosphate pH 6.5.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, sai số ở 3 thí nghiệm không được vượt quá 5%.
Hoạt độ enzyme có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau:
Abs 420nm : Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại 420 nm
Blank: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng
SlopeoNPstandardcurve: Hệ số góc của đường chuẩn oNP treaction:
Số liệu được xử lý dựa vào đường chuẩn và bằng phần mềm Microsoft Excel.
3.4.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gıan nuôi cấy đến sư ̣sinh trưởng và khảnăng sinh tổng hợp β-galactosidase Để xác định thời điểm nuôi cấy và thu nhận enzyme mà tại đó hoạt độ enzyme của vi khuẩn là cao nhất được tiến hành như sau: các vi khuẩn được tiến hành nuôi lỏng ở nhiệt độ 37 ºC sau 3h lấy mẫu một lần tại các thời điểm 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ đến 30 giờ, để đo mật độ quang tại 600nm và phá vỡ tế bào xác định hoạt độ Hoạt độ tại các thời điểm được so sánh với nhau để xác định thời điểm sinh enzyme có hoạt độ cao nhất.
3.4.3 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thị Vân Linh và cs.,
2013. Để xác định khả năng chịu lạnh của β-galactosidase, các enzyme được tiến hành xác định hoạt độ ở 30˚C và 4˚C với pH 6,5 (tương đương pH của sữa tươi).
Sau đó so sánh phần trăm quan hê ̣hoaṭđô ̣giữa 30 o C và4 o C đểxác đinḥ khả năng xúc tác của enyme ở 4 o C.
3.4.4 Phương pháp tinh sạch sơ bộ β-galactosidase
3.4.4.1 Phương pháp tinh sạch sơ bộ enzyme bằng muối amonisunfate
Sau khi tách, dịch enzyme thô vẫn còn chứa nhiều tạp chất Để loại bỏ những tạp chất này, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối amonsunfate thường được áp dụng Quy trình tinh sạch được thực hiện theo hướng dẫn của Wendry Setiyadi Putranto (2007).
Để tinh sạch sơ bộ β-galactosidase, thêm từ từ (NH4)2SO4 đến độ bão hòa 40%, 50%, 60% và 70% vào dịch enzyme thô, khuấy đều cho tan hoàn toàn, và để kết tủa ở 4°C qua đêm Sau đó, ly tâm ở 10,000 vòng/phút, 4°C trong 10 phút để tách phần tủa Phần tủa này được hòa tan bằng đệm phosphate pH 6.5 Hoạt độ enzyme được xác định theo phương pháp đã mô tả ở mục 3.4.1.3, và định lượng protein trong enzyme trước và sau tinh sạch được thực hiện bằng phương pháp Bradford (1976).
3.4.4.2 Phương pháp định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford
Phương pháp xác định protein tổng số theo Bradford, 1976 được mô tả như sau:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong môi trường acid, thuốc nhuộm có màu đỏ với bước sóng hấp thu cực đại 465 nm Khi kết hợp với protein, thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và có bước sóng hấp thu cực đại tại 595 nm.
Để xác định protein trong mẫu, bước đầu tiên là xây dựng đường chuẩn protein bằng dung dịch bovine serum albumin (BSA) có nồng độ đã biết Sau khi thêm dung dịch protein vào thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và duy trì ổn định trong 1 giờ.
Bảng 3.6 Pha dãy đường chuẩn protein Ống nghiệm
Nồng độ BSA (mg/ml)
Hãy cho mỗi ống nghiệm 25 µl dịch protein chuẩn vào các ống nghiệm khác đã chứa sẵn 1000 µl thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, lắc đều bằng máy lắc vortex và để yên trong 20 phút trong bóng tối Sau 20 phút, tiến hành đo dung dịch bằng máy đo quang phổ kế ở bước sóng 595 nm để thu được các giá trị OD, với độ hấp thu tỷ lệ thuận với lượng protein trong mẫu.