Tuyển chọn chủng nấm men saccharomyces và tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Vật liệu

Có 96 chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces, bao gồm các loài như S cerevisiae, S carlsbergensis, S bruxellensis và S checvalieri, đã được phân lập từ các mẫu ở nhiều tỉnh thành trong nước cũng như từ các nguồn nước ngoài như Thụy Điển, Pháp, Đức và Thái Lan Các chủng nấm men này hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm Việt Nam.

− Môi trường dùng trong nghiên cứu: Môi trường lên men vi sinh vật YM (3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l pepton, 10g/l glucose, 1000ml nước cất).

3.1.2 Hóa chất và vật liệu

- Glucose, glactose, frutose, lactose, maltose, sucrose (Ấn độ, 98%);

- Cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, bacto pepton (Ấn độ, 98%);

- Box cấy (Bioblock Scientific-Pháp);

- Cân điện tử (Precisa, Thụy Điển);

- Kính hiển vi quang học (Lieca DM2700M);

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc);

- Máy đo pH HANNA 98107(Rumani);

- Máy lắc ổn nhiệt GYROMAX 373R (Hàn Quốc);

- Máy ly tâm cao tốc (Heraeus, Sepatech);

- Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật Bản);

- Thiết bị lên lên men, nhân giống Genenis 20L (Solaris Biotechnology, Italia);

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-6800 Shimadzu (Nhật Bản);

- Tủ sấy MEMMERT (Nhật Bản);

- Tủ lạnh SANYO (Nhật Bản);

- Máy ly tâm MIKRO 220R (Đức);

- Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản): Vô khuẩn có đèn UV;

- Các dụng cụ khác: Pipet Nichipet EX (Nhật Bản), đầu típ, nồi, đĩa peptri, ống nghiệm, bình tam giác, ống falcon,…

Nội dung

Nội dung 1: Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ kẽm cao từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm.

Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn muối kẽm đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.

Nội dung 3: Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.

Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện lên men phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.

Nội dung 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích luỹ kẽm cao

Nghiên cứu đã tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích lũy kẽm cao từ 96 chủng khác nhau, được cung cấp bởi trung tâm Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men YM được bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l và tỷ lệ tiếp giống là 10% Quá trình lên men thu sinh khối diễn ra trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là 100ml, và điều kiện lên men được thực hiện trong máy lắc.

150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Thí nghiệm 2: Lựa chọn, xác định nồng độ và thời điểm bổ sung muối kẽm.

Để chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, các loại muối kẽm như Zn(NO3)2, ZnSO4 và ZnCl2 đã được khảo sát với các nồng độ 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l Những muối này được bổ sung vào môi trường lên men chứa 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton và 10g/l glucose, với tỷ lệ tiếp giống là 10% Thí nghiệm diễn ra trong môi trường có pH 6,0, được điều chỉnh bằng dung dịch HCl 0,1M, và quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 28°C trong 72 giờ với chế độ lắc 150 vòng/phút.

Sau khi lựa chọn nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp, tiến hành lên men bổ sung muối kẽm vào các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ để xác định điều kiện tối ưu nhất cho quá trình.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Thí nghiệm 3: Lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường lên men.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình tích lũy kẽm.

Quá trình lựa chọn nguồn cacbon cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản gồm 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton và 1g/l ZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10% Nguồn cacbon khảo sát bao gồm glucose, galactose, fructose, lactose, maltose và sucrose, với việc bổ sung thêm 10g/l Sau khi chọn được nguồn cacbon phù hợp, nồng độ cacbon được khảo sát ở các mức 10, 50, 100 và 150g/l để xác định nồng độ tối ưu cho việc tích lũy kẽm Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ 28°C trong 72 giờ với tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

+ Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein,10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l dịch chiết malt,

Nghiên cứu này sử dụng môi trường có 10g/l glucose và 1g/l ZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10% để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến quá trình tích lũy kẽm Các thí nghiệm tiếp theo xác định nồng độ nitơ thích hợp với các mức 5; 10; 15; và 20g/l Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 28°C trong 72 giờ với chế độ lắc 150 vòng/phút.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Nghiên cứu lựa chọn ion kim loại bổ sung cho quá trình tạo sinh khối nấm men đã khảo sát các ion kim loại như MgSO4 (với nồng độ 0; 0,5; 1,5 g/l), KH2PO4 (với nồng độ 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l) và Fe2(SO4)3 (với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l) Các ion này được bổ sung vào môi trường YM có chứa 1 g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ giống 10% Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 28°C trong 72 giờ với chế độ lắc 150 vòng/phút.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Thí nghiệm 4: Lựa chọn điều kiện cho quá trình lên men.

Khảo sát điều kiện pH, nhiệt độ, chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm

Trong nghiên cứu, môi trường YM được bổ sung 1 g/l ZnSO4 và thí nghiệm được thực hiện trong bình tam giác 250ml chứa 100ml dung dịch môi trường lên men pH của dịch môi trường trước khi lên men được khảo sát tại các giá trị 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, và 7, được điều chỉnh bằng dung dịch H2SO4 0,1M hoặc NaOH 0,1M Nhiệt độ thí nghiệm được kiểm tra ở các mức 25, 28, 30 và 35 độ C, cùng với các chế độ lắc từ 0 đến 200 vòng/phút nhằm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình lên men.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn 2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Thí nghiệm 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

Sau khi nghiên cứu về nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường và điều kiện lên men, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy.

Ba yếu tố chính ảnh hưởng đến hàm lượng kẽm trong sinh khối được khảo sát qua thí nghiệm leo dốc, bao gồm x1, x2 và x3 Hàm mục tiêu (y) được xác định bởi phương trình hồi quy: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3, trong đó b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 là các hệ số hồi quy Quá trình thiết kế thí nghiệm và phân tích dữ liệu nhằm tối ưu hóa sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0.

Phương pháp xử lý mẫu sinh khối nấm men giàu kẽm bao gồm các bước rửa sinh khối nấm men bằng nước khử ion với tỉ lệ 1:5, thực hiện rửa 3 lần Sau đó, sử dụng máy li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút để thu được sinh khối sau khi rửa Cuối cùng, tiến hành làm khô sinh khối nấm men ở nhiệt độ 60°C trong 2 giờ, sau đó sấy ở 105°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi.

Phương pháp phân tích AAS được sử dụng để xác định hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấm men Đầu tiên, cân 50 mg mẫu nấm men khô và chuyển vào bình phá mẫu, sau đó thêm 2 ml HNO3 đặc và ngâm qua đêm Tiếp theo, thêm 1 ml H2O2 đặc và thực hiện phá mẫu bằng lò vi sóng Sau khi để nguội, mẫu được định mức thành 10 ml, từ đó lấy 1 ml pha loãng thành 10 ml bằng dung dịch HNO3 2% Cuối cùng, mẫu xử lý được đưa vào máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử để phân tích hàm lượng kẽm ở bước sóng 213,9 nm (Shet et al., 2011).

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng Excel, Minitab 16, và các thuật toán thống kê như T’test, F’test, cùng với phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) Kết quả được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0.05, ngược lại, nếu p > 0.05, sự khác biệt không có ý nghĩa Quá trình tối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện thông qua phần mềm JMP 10.0.

Kết quả nghiên cứu

Kết quả tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao

Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men YM có bổ sung muối vô cơ Zn(NO 3 ) 2 với nồng độ 1g/l Quá trình lên men thu sinh khối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là 100ml, pH của môi trường được điều chỉnh tới 4,5 bằng HCl 0,1M Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ.

Quá trình sàng lọc cho thấy khả năng tích luỹ kẽm ở các chủng S.cerevisiae rất khác nhau, với chủng S.cerevisiae CNTP 4087 có khả năng tích luỹ kẽm cao nhất đạt 8,91 mg/g sinh khối khô, trong khi chủng S.cerevisiae CNTP 4100 chỉ tích luỹ 0,56 mg/g Thông tin chi tiết về hàm lượng kẽm và lượng sinh khối của các chủng được trình bày trong Phụ lục.

Chủng có hàm lượng kẽm trong sinh khối 3 mg/g

Hình 4.1 Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men được sàng lọc

Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số 96 chủng nấm men, có 39 chủng (chiếm 40,62%) thể hiện khả năng tích kẽm thấp, dưới 1 mg/g sinh khối khô Trong khi đó, 42 chủng còn lại tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối.

43,75% và 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm với hàm lượng trên 3 mg/g sinh khối, chiếm tỷ lệ 15,63% được thể hiện qua bảng dưới đây:

Bảng 4.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh khối của 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm cao STT

Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc bổ sung muối kẽm với nồng độ 1 g/l vào môi trường cơ bản đã làm tăng đáng kể hàm lượng muối kẽm trong sinh khối khô của nấm men, đặc biệt là ở chủng S.cerevisiae CNTP, với giá trị đạt tới 8,91 mg/g.

S.cerevisiae có khả năng tích lũy các nguyên tố vi lượng, đặc biệt là kẽm, điều này được xác nhận một lần nữa Do đó, chủng nấm men này có tiềm năng ứng dụng cao trong việc cung cấp kẽm cho các sản phẩm dinh dưỡng.

S.cerevisiae CNTP 4087 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả ảnh hưởng nguồn muối kẽm khác nhau đến quá trình lên men

Để chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, ba loại muối kẽm được khảo sát là Zn(NO3)2, ZnSO4 và ZnCl2, thường dùng trong nghiên cứu tích lũy kẽm trong tế bào nấm men Các muối này được bổ sung vào môi trường lên men với các dải nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l, cùng với 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton và 10g/l glucose Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường có pH 6,0, điều chỉnh bằng dung dịch HCl 0,1M, và quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ 28°C trong 72 giờ với tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Sau khi chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp, tiến hành lên men bổ sung muối kẽm vào các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ để xác định điều kiện tối ưu nhất.

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Các giá trị A, B, C, D thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nồng độ muối kẽm khác nhau Trong khi đó, các giá trị a, b, c, d cho thấy khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các loại muối kẽm ở cùng nồng độ.

Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05

Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men S.cerevisiae CNTP 4087 khác nhau giữa ba loại muối kẽm: kẽm nitorat, kẽm sunphat và kẽm clorua, với sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Cụ thể, muối kẽm sunphat và kẽm clorua cho khả năng tích lũy kẽm cao hơn so với muối kẽm nitorat.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, khối lượng sinh khối khô thu được sau quá trình lên men với muối kẽm sunphat cao hơn so với hai loại muối còn lại ở tất cả các nồng độ thử nghiệm Do đó, muối kẽm sunphat đã được chọn làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp theo.

Nồng độ muối kẽm trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Cụ thể, khi nồng độ kẽm sunphat tăng lên, hàm lượng kẽm trong sinh khối cũng tăng theo Tại nồng độ 0,25 g/l, lượng kẽm tích lũy chỉ đạt 2,48 mg/g mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men Tuy nhiên, ở nồng độ 1 g/l và 2 g/l, hàm lượng kẽm tích lũy tăng mạnh lên 9,15 mg/g và 11,96 mg/g, nhưng nồng độ 2 g/l lại gây ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của nấm men Do đó, để thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm, nồng độ tối ưu nên được chọn là 1 g/l ZnSO4.

Sau khi chọn được nguồn muối kẽm phù hợp, thí nghiệm tiếp tục khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm để tối ưu hóa lượng kẽm tích lũy trong sinh khối khô Cụ thể, chủng nấm men được lên men trong môi trường YM với kẽm sunphat nồng độ 0,5 g/l tại các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả được trình bày ở hình 4.2.

Thời gian (h) khối lượng sinh khối khô hàm lượng kẽm trong sinh khối khô

Thời điểm bổ sung muối kẽm sunphat có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men, với hàm lượng kẽm giảm dần sau 9 giờ lên men Cụ thể, hàm lượng kẽm tại 0 và 9 giờ là khoảng 8,92 - 8,89 mg/g, nhưng giảm xuống còn 4,53 và 2,26 mg/g tại 18 và 27 giờ Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Roepcke et al (2011) về ảnh hưởng của thời điểm bổ sung kẽm, cho thấy quá trình hấp thụ ion kim loại diễn ra chủ yếu ở pha sớm của quá trình lên men, khi nguồn năng lượng đạt cao nhất (Waters et al., 2002).

Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung kẽm sunphat với nồng độ 1g/l ngay tại thời điểm đầu (0 giờ) của quá trình lên men ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh trưởng của nấm men, dẫn đến sự sụt giảm sinh khối rõ rệt so với các thời điểm 9, 18 và 27 giờ Điều này do nấm men cần thời gian để thích nghi với môi trường mới, và việc bổ sung kẽm ở nồng độ cao ngay lúc này có thể cản trở quá trình phát triển Ngược lại, việc bổ sung kẽm sau 9 giờ không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của nấm men và vẫn đảm bảo sự tích lũy kẽm trong sinh khối, do đó thời điểm này được chọn cho quá trình lên men tích kẽm.

4.3 KẾT QUẢ LỰA CHỌN NGUỒN DINH DƯỠNG CHO QUÁ LÊN MEN 4.3.1 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng

4.3.1.1 Kết quả lựa chọn nguồn cacbon

Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản gồm 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, và 1g/l ZnSO4, với 10g/l nguồn cacbon khảo sát như glucose, galactose, fructose, lactose, maltose và sucrose Kết quả thí nghiệm cho thấy sự ảnh hưởng của các nguồn cacbon này đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men.

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Glucose Galactose Frutose Lactose Maltose Sucrose

Các giá trị A, B, C, D thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nguồn cacbon Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05.

Bảng 4.3 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng tích lũy kẽm và tốc độ sinh trưởng của nấm men khi sử dụng các nguồn cacbon khác nhau Cụ thể, khả năng tích lũy kẽm vào sinh khối của S cerevisiae CNTP 4087 giảm dần theo thứ tự: glucose > sucrose > fructose > galactose > lactose > maltose Do đó, glucose được chọn làm nguồn cacbon cho các nghiên cứu tiếp theo Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cha về tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nấm men giàu kẽm trên chủng S cerevisiae FF10 (Cha et al., 2009) Tiếp theo, nghiên cứu sẽ khảo sát ảnh hưởng của glucose đến khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ở các nồng độ: 10, 50.

100 và 150g/l Kết quả được trình bày hình 4.3.

K hố i l ư ợn g si n h k hố i k hô ( g/ 10 0m l)

(m g/ g) khối lượng sinh khối khô (g/100ml) hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g)

Hình 4.3 Ảnh hưởng bởi nồng độ glucose tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men tăng mạnh khi nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tăng từ 10g/l đến 100g/l, thể hiện qua khối lượng sinh khối thu được sau lên men Tuy nhiên, khi nồng độ glucose đạt 150g/l, sự phát triển của nấm men không có sự thay đổi đáng kể Kết quả cho thấy hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men giảm dần khi nồng độ glucose tăng, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Điều này cho thấy glucose không ảnh hưởng đến khả năng hấp thu kẽm, nhưng lại có tác động tích cực đến sự sinh trưởng và khối lượng sinh khối của nấm men Glucose là nguồn năng lượng chính cho nấm men trong quá trình đồng hóa và xây dựng cấu trúc tế bào Nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ glucose 100g/l là phù hợp nhất cho quá trình lên men nhằm thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.

4.3.1.2 Kết quả lựa chọn nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong nghiên cứu bao gồm cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò và casein, với mỗi loại được bổ sung 10g/l vào môi trường cơ bản Môi trường này chứa 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose và 1g/l ZnSO4 Nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến quá trình tích lũy kẽm, đồng thời tiếp tục thí nghiệm để xác định nồng độ nitơ thích hợp với các mức 5, 10, 15 và 20g/l.

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Cao nấm men Tripton Pepton Cao thịt bò Casein

Các giá trị A, B, C, D thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô từ các nguồn nitơ khác nhau Các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt về ý nghĩa thống kê với mức α = 0,05.

Kết quả lựa chọn điều kiện lên men

4.4.1 Kết quả lựa chọn nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật, với mỗi sinh vật có ngưỡng nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa khác nhau Nấm men, thuộc nhóm sinh vật ưa mát, thường phát triển tốt trong khoảng 26 o C - 32 o C, nhưng mỗi chủng nấm men lại có giá trị nhiệt độ tối ưu riêng Do đó, quá trình lên men được khảo sát ở các mức nhiệt độ 25, 28, 30 và 35 o C trong 72 giờ, với kết quả được trình bày trong bảng 4.6 nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men.

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

( A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các mức nhiệt độ.

Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của nấm men, với mức tối ưu từ 28 đến 30 o C, tại đó sự phát triển đạt giá trị cực đại Nhiệt độ 30 o C không chỉ là điều kiện lý tưởng cho sự phát triển mà còn giúp nấm men tích lũy kẽm hiệu quả nhất, đạt 9,11 mg/g Do đó, nhiệt độ 30 o C được lựa chọn cho quá trình lên men, phù hợp với nhiều nghiên cứu về tạo sinh khối nấm men giàu kẽm (Roepcke et al., 2011; Cha và Cho, 2009).

4.4.2 Kết quả lựa chọn pH

Trong quá trình lên men, các chủng nấm men Saccharomyces làm giảm độ pH của môi trường, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tích lũy kẽm Để xác định pH tối ưu cho sự phát triển và tích lũy kẽm, các chủng nấm men được nuôi cấy trong môi trường cơ bản.

YM được bổ sung 1g/l muối kẽm ngay từ đầu quá trình lên men với tỉ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men diễn ra trong 72 giờ ở nhiệt độ 28°C, với giá trị pH ban đầu từ 4 đến 7 Kết quả được trình bày trong bảng 4.7.

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của pH tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy pH

Các giá trị A, B, C, D thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô tương ứng với các giá trị pH Các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt về ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05.

Kết quả trên cho thấy giá trị pH cho chủng nấm men S cerevisiae CNTP

Nghiên cứu cho thấy rằng chủng nấm men 4087 phát triển tốt nhất trong khoảng pH 5-5,5, nhưng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối khô đạt tối đa ở pH 6,5 với giá trị 9,22 mg/g Trong khi đó, từ pH 5,5 đến 7, quá trình sinh trưởng và tích lũy kẽm của nấm men giảm dần Do đó, để tạo ra sinh khối nấm men giàu kẽm, pH 6,5 được chọn làm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men.

Nghiên cứu toàn cầu cho thấy pH ảnh hưởng đến khả năng tích lũy kẽm trong tế bào Brady và Duncan (1994) đã chỉ ra rằng, khả năng bắt giữ các ion kim loại hóa trị hai của S cerevisiae giảm khi pH thấp hơn mức nhất định.

5 pH thấp có thể làm tăng tính di động kim loại, trong khi ở mức pH trung tính hoặc kiềm các tế bào có xu hướng hình thành các oxit không hòa tan, hydroxit và cacbonat Tác giả cho rằng ở ngưỡng pH từ 5-9 là thuận lợi cho quá trình tích lũy sinh học các ion kim loại trong tế bào Trên cơ sở đó, Roepcke et al (2001) đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện môi trường trên chủng P guilliermondii trên môi trường Soybean molasses: 5◦bric; 5g/l (NH 4 ) 2 SO 4 ; 5g/l cao nấm men; 5g/l KH 2 PO 4 5; 0,5g/l MgSO 4 , 10g/l ZnSO 4 ; 0,1g/l Fe 2 (SO 4 ) 3 với 2 giá trị pH là 6 và

7 Kết quả cho thấy ở ngưỡng pH này cho khả năng hấp thụ tốt và không có sự sai khác giữa 2 giá trị pH đã chọn (Roepcke et al., 2001) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cha and Cho (2009) về ảnh hưởng của pH tới khả năng tích lũy kẽm trên chủng S cerevisiae FF10.

4.4.3 Kết quả lựa chọn chế độ lắc

Sự khuấy lắc trong quá trình lên men không chỉ tăng cường lượng oxy hòa tan mà còn cải thiện khả năng tiếp xúc của tế bào nấm men với các nguồn dinh dưỡng.

Nấm men thuộc chi Saccharomyces là sinh vật yếm khí tùy tiện, có khả năng hô hấp trong môi trường có đủ oxy để sinh trưởng và tăng sinh khối Khi thiếu oxy, chúng chuyển sang quá trình lên men đường thành rượu Nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng và gia tăng lượng sinh khối của nấm men, với các chế độ lắc được khảo sát trong khoảng từ 0.

200 rpm Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8.

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của chế độ lắc tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Chế độ lắc (Vòng/phút)

( A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các chế độ lắc.

Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05

Quá trình khuấy lắc trong môi trường nuôi cấy tăng cường khả năng hòa tan oxi, ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng của nấm men Phân tích cho thấy, khi tốc độ lắc tăng từ 0 đến 150 vòng/phút, hàm lượng kẽm tích lũy và sinh khối nấm men tăng đáng kể Tuy nhiên, khi tốc độ lắc đạt 200 vòng/phút, sự gia tăng này không còn đáng kể Do đó, tốc độ lắc 150 vòng/phút được chọn làm thông số kỹ thuật cho các lần lên men tiếp theo.

4.4.4 Kết quả tối ưu hóa điều kiện lên men

Trong nghiên cứu này, các yếu tố như glucose, cao nấm men, hàm lượng kẽm, nhiệt độ và pH đã được khảo sát để xác định ảnh hưởng của chúng tới quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Kết quả cho thấy nồng độ muối kẽm, glucose và cao nấm men có ảnh hưởng đáng kể tới hàm lượng kẽm tích lũy và khối lượng sinh khối thu được Do đó, nghiên cứu đã thiết lập các giá trị khảo sát cho ba yếu tố: X1: glucose từ 10 – 100 g/l, X2: cao nấm men từ 5 – 15 g/l, và X3: nồng độ muối kẽm từ 0,5 – 1,5 g/l Mô hình thiết kế ma trận thực nghiệm đã được áp dụng để xác định khối lượng sinh khối Y1 (g/100ml) và hàm lượng kẽm trong sinh khối Y2 (mg/g) sau quá trình lên men ở các điều kiện khác nhau.

Bảng 4.9 Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy sau lên men ở các điều kiện khác nhau

Hình 4.5 Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

Dựa trên các giá trị thực nghiệm và quá trình xử lý số liệu, phần mềm JMP đã xác định phương trình đường cong mô hình bề mặt đáp ứng cho hàm lượng kẽm trong sinh khối là Y2 = 4,07 – 0,185X2 + 5,835X3 – 0,002X1X2 Đường cong này thể hiện mối quan hệ giữa các yếu tố với hệ số tương quan R² = 0,98, cho thấy mô hình có khả năng dự đoán giá trị Y2 với độ chính xác cao đạt 98%.

Hình 4.6 Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối (A), khối lượng sinh khối (B) và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm

Nghiên cứu cho thấy nồng độ kẽm sunphat trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối, với việc tăng lượng muối kẽm dẫn đến tăng hàm lượng kẽm tích lũy Tuy nhiên, nồng độ từ 0,5 – 1,5g/l có tác động tiêu cực đến khối lượng sinh khối nấm men, đặc biệt nồng độ 1,5g/l ức chế sự phát triển của chủng S.cerevisiae CNTP 4087 Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Sillerova et al (2012) về ảnh hưởng của các muối kẽm vô cơ đối với khả năng tích lũy kẽm và khối lượng sinh khối nấm men.