Nghiên cứu bệnh thối gốc rễ (phytophthora SP ) và bệnh đốm nâu (alternaria SP ) cây chanh leo tại một số tỉnh tây nguyên, miền trung và miền bắc

Đã xác định được nấm gây bệnh thối gốc rễ hại chanh leo là Phytophthora nicotianae dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS của 1 mẫu nấm đã thu thập tại Gia Lai.. Xuất phát từ nh

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

NGUYỄN XUÂN VÂN

Ng ườ ướ i h ng d n khoa h c: ẫ ọ TS Nguy n Đ c Huy ễ ứ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Vân

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt, sâu sắc nhất và lòng biết ơn chân thành đến TS.Nguyễn Đức Huy, người đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo trực tiếp và tạo mọi điều kiện,giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộmôn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡtôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ công chức, viên chức Chi cụcTrồng trọt và Bảo vệ thực Hải Phòng đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thờigian tôi học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm Kiểmdịch thực vật sau nhập khẩu đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và tạomọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Vân

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Danh mục đồ thị viii

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu nghiên cứu 4

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về cây chanh leo 4

2.1.2 Nghiên cứu về bệnh hại cây chanh leo 7

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

2.2.1 Bệnh đốm nâu do Alternaria 16

2.2.2 Bệnh do Phytophthora 18

2.2.3 Nghiên cứu về các biện pháp sinh học trong phòng trừ Phytophthora 19

Phần 3 Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 22

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ và diễn biến bệnh ngoài đồng ruộng 23

3.3.2 Phương pháp chẩn đoán bệnh 23

3.3.3 Phương pháp thu thập mẫu 23

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 24

3.3.5 Phương pháp phân lập Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ cây chanh leo .25 3.3.6 Xác định nấm gây bệnh tàn lụi bằng kĩ thuật PCR, giải trình tự vùng ITS của nấm và phân tích trình tự 26 3.3.7 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của Phytophthora nicotinanae 29

3.3.8 Phương pháp kích thích sinh bọc bào tử 30

3.3.9 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 30

3.3.10 Phương pháp khảo sát hiệu lực của chế phẩm sinh học 31

3.3.11 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá và xử lý số liệu 32

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 33

4.1 Kết quả điều tra thành phần bệnh, hiện trạng và diễn biến bệnh thối gốc rễ, đốm nâu lá chanh leo tại vùng Tây Nguyên, miền Trung và miền Bắc 33 4.1.1 Kết quả điều tra thành phần bệnh và diễn biến bệnh hại chanh leo tại vùng Tây Nguyên 33

4.1.2 Kết quả điều tra thành phần bệnh và diễn biến bệnh hại chanh leo tại các tỉnh miền Bắc 36

4.2 Diễn biến bệnh thối gốc rễ trên chanh leo tại Gia Lai và Sơn La 38

4.2.1 Tình hình bệnh thối gốc rễ trên chanh leo tại Gia Lai 38

4.2.2 Tình hình bệnh thối gốc rễ trên chanh leo tại Sơn La 39

4.2.3 Tình hình bệnh đốm nâu lá chanh leo tại các tỉnh Tây Nguyên 40

4.3 Kết quả phân thu thập và giám định Phytophthora sp 41

4.3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh 41

4.3.2 Kết quả xác định nấm gây bệnh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gene vùng ITS của nấm gây bệnh 44

4.3.3 Kết quả lây bệnh nhân tạo Phytophthora nicotianae gây bệnh trên chanh leo trong điều kiện invitro 44

4.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học của Phytophthora nicotianae 46

4.4.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học của Phytophthora nicotianae 46

4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae 47

4.5 Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm, vi khuẩn đối kháng và thuốc đến

sự phát triển của Phytophthora nicotianae 52 4.5.1 Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng Bacillus velezensis đến sự phát

triển của Phytophthora nicotianae 53 4.5.2 Hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Tricoderma asperellum đến sự phát

triển của Phytophthora nicotianae 55

4.5.3 Thử nghiệm phòng trừ Phytophthora nicotianae bằng biện pháp hóa học 58

4.5.4 Thử nghiệm phòng chống Phytophthora nicotianae gây bệnh thối gốc rễ chanh leo 59 4.5.5 Hiệu lực ức chế của sản phẩm KR833 chiết tách từ xạ khuẩn Streptomyces đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae 61 Phần 5 Kết luận và kiến nghị 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Kiến nghị 64

Tài liệu tham khảo 65

Phụ lục 71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTChữ viết tắt

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Tình hình bệnh hại chanh leo tại các tỉnh Tây Nguyên 33

Bảng 4.2 Tình hình bệnh hại chanh leo tại các tỉnh miền Bắc 36

Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh thối gốc rễ tại Gia Lai, Tây Nguyên 38

Bảng 4.4 Tỷ lệ bệnh thối gốc rễ tại Sơn La 39

Bảng 4.5 Tình hình bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên 40

Bảng 4.6 Tình hình bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một số tỉnh miền Trung và miền Bắc 41

Bảng 4.7 Kết quả thu thập và phân lập Phytophthora sp từ một số mẫu tại Tây Nguyên và các tỉnh miền Bắc 42 Bảng 4.8 Kết quả xác định mẫu Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ chanh leo tại Gia Lai bằng giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên ngân hàng gene (GenBank) 44 Bảng 4.9 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo Phytophthora nicotiana trên cây chanh leo 45

Bảng 4.10 Đặc điểm hình thái Phytophthora nicotiana trên môi trường PDA 46

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ sự phát triển của Phytophthora nicotianae 48

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae (sử dụng môi trường PDA) 49

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae 51

Bảng 4.14 Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng Bacillus velezensis đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae 53

Bảng 4.15 Hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma asperellum đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae 56 Bảng 4.16 Khảo sát hiệu lực ức chế Phytophthora nicotiana của 3 loại thuốc: Aliette 800WG, Ridomil Gold 68 WG, Anvil 5SC 58

Bảng 4.17 Kết quả thử nghiệm phòng chống Phytophthora nicotianae gây bệnh thối gốc rễ chanh leo 60

Bảng 4.18 Thử nghiệm hiệu lực ức chế của sản phẩm KR833 chiết tách từ xạ khuẩn Streptomyces đối với Phytophthora nicotianae trên môi trường PDA 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Một số hình ảnh bệnh hại chanh leo tại Tây Nguyên 34Hình 4.2 Một số triệu chứng bệnh hại chanh leo tại Sơn La và Cao Bằng 37Hình 4.3 Mẫu Phytophthora sp phân lập từ đất phần gốc rễ bị thối của cây

chanh leo tại La Gra - Gia Lai (a, d), Cư M’gar - Đắk Lắk (b) và NgọcHồi - Kon Tum (c) 43

Hình 4.4 Thí nghiệm lây Phytophthora nicotiana trên cây chanh leo 45

Hình 4.5 Tản và bọc bào tử của Phytophthora nicotiana 47

Hình 4.6 Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng B velezensis đến sự phát triển

của P nicotianae 54Hình 4.7 Thí nghiệm hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma

asperellum đối với Phytophthora nicotiana a) T cấy trước P 24 giờ,

T và P cấy cùng thời điểm và c) T cấy sau P. 56

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Diễn biến của bệnh thối gốc rễ chanh leo tại Gia Lai 39

Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của Phytophthora

nicotianae trên môi trường PDA 48

Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của Phytophthora nicotianae

trên môi trường PDA 50

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển của Phytophthora

nicotianae 51

Đồ thị 4.5 Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng B velezensis đến sự phát

triển của P nicotianae 55

Đồ thị 4.6 Hiệu lực của nấm đối kháng Trichoderma asperellum đối với

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Nguyễn Xuân Vân

Tên Luận văn: “Nghiên cứu bệnh thối gốc rễ (Phytophthora sp.) và bệnh đốm nâu

(Alternaria sp.) cây chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên, Miền Trung và Miền Bắc”.

Phương pháp nghiên cứu

Điều tra thành phần, mức độ phổ biến, diễn biến bệnh trên ruộng theo phươngpháp điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịchhại cây trồng QCVN 01-38:2010/BNNPTNT

Phân lập nấm gây bệnh bằng kỹ thuật phân lập đơn bào tử trên môi trường WA.DNA của nấm được chiết theo phương pháp CTAB Sử dụng nguồn nấm thuần để quansát các đặc điểm như sự phát triển của nấm, màu sắc tản nấm, hình thái của sợi nấm, bọcbào tử và du động bào tử trên kính hiển vi

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học của nấm được thực hiện trong điều kiện in

vitro như ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và pH đến sự phát triển của nấm

gây bệnh Ba loại thuốc bảo vệ thực vật Anvil 5SC, Aliete 800WG, Ridomil Gold

68WG, một nấm đối kháng (Trichoderma asperellum, một vi khuẩn đối kháng (Bacillus

velezensis) và một sản phẩm xạ khuẩn Streptomyces nhập từ Hàn Quốc đã được sử dụng

để khảo sát hiệu lực ức chế đối với Phytophthora.

Kết quả chính và kết luận

1 Trong thời gian từ tháng 8/2018 đến tháng 7/2019 chúng tôi đã xác định được

4 loài bệnh hại chanh leo tại vùng Tây Nguyên Trong đó ghẻ quả và thối gốc rễ là haibệnh tần xuất bắt gặp từ 11 - 50% Tại các tỉnh phía Bắc chúng tôi phát hiện 5 loại bệnhhại Trong đó bệnh thối gốc rễ có tần xuất bắt gặp từ 5 - 10% Đây là những loại bệnhgây thiệt hại lớn đến năng xuất, chất lượng và mẫu mã quả

2 Bệnh thối gốc rễ chanh leo chủ yếu phát sinh, phát triển trong điều kiện thờitiết nóng ẩm Bệnh phát triển nhanh nhất trong giai đoạn từ tháng 7 đến tháng 9, khiđiều kiện nhiệt độ 28 -30°C, trời có mưa rào Vào mùa khô ở Tây Nguyên và mùa Đông

lạnh ở miền Bắc bệnh gần như không phát triển.

3 Đã thu thập và làm thuần được 7 mẫu Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hại

chanh leo từ 6 địa điểm điều tra Các mẫu được phân lập và làm thuần bằng phươngpháp cấy đơn bào tử

4 Đã xác định được nấm gây bệnh thối gốc rễ hại chanh leo là Phytophthora

nicotianae dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS của 1 mẫu nấm đã thu thập

tại Gia Lai

5 Đặc điểm hình thái của Phytophthora nicotianae: Tản phát triển theo kiểu

hình bông hoa, màu trắng, bông xốp, sợi phân nhánh kiểu san hô, không có vách ngăn,không màu, đơn bào, bọc bào tử có hình quả chanh yên và hình trứng, trên đầu có númhoặc không có núm, không màu, trong suốt, du động bào tử có hình cầu hoặc hình thận,chúng di chuyển rất nhanh sau khi được giải phóng

6 Phytophthora nicotianae có khả năng phát triển trên cả 04 loại môi trường,

đều có sợi nấm màu trắng hơi xốp Tuy nhiên hình thái tản nấm và tốc độ phát triển trên

từng loại môi trường là khác nhau Môi trường V8 là môi trường Phytophthora

nicotianae phát triển nhanh nhất, nhưng không đặc trưng.

7 Phytophthora nicotianae phát triển tốt ở nhiệt độ 25 - 30°C, pH 6-8 Trong

đó, ở nhiệt độ 25°C, pH 6-8, nấm phát triển thuận lợi nhất

8 Vi khuẩn Bacillus velezensis cho hiệu lực khá tốt trong phòng trừ Phytopthora

nicotianae Hiệu lực phòng trừ của vi khuẩn Bacillus velezensis đối với Phytopthora nicotianae đạt 73,2% ở 6 ngày sau khi cấy 2 vạch vi khuẩn Bacillus velezensis đồng thời

với Phytopthora nicotianae.

9 Khảo sát hiệu lực phòng trừ Phytopthora nicotianae của chế phẩm nấm

Tricoderma asperellum cho thấy: Tricoderma asperellum cho hiệu quả phòng trừ cao

đạt 73,6% khi được cấy trước Tricoderma asperellum Vì vậy, khi xử lý nấm đối kháng

khi bệnh chưa xuất hiện cho hiệu quả cao hơn so với xử lý khi bệnh đã xuất hiện

10 Ở nồng độ 0,01% thuốc Ridomil Gold 68 WG là loại thuốc có hiệu lực ức

chế Phytophthora nicotianae, cao nhất trong 4 loại thuốc được thí nghiệm, sau 7 ngày

xử lý hiệu lực đạt 100% Tuy nhiên cần tuân thủ nguyên tắc 4 đúng trong sử dụng thuốcbảo vệ thực vật để tạo ra các sản phẩm an toàn

THESIS ABSTRACTTên tác giả: Nguyen Xuan Van

Thesis title: “Study on root rot (Phytophthora sp.) and brown spot (Alternaria sp.)

diseases of passion fruit in Highlands, Central and Northern provinces”

Name of training institution: Vietnam National University of Agriculture

Research purposes

Field surveys of current status of passion fruit diseases, especially root rot andbrown spot diseases in some provinces in Highland, Centre and North of Vietnam.Studies on morphological and molecular identification of the main pathogen caused root

rot disease Evaluate the antagonistic activity of Trichoderma, Bacillus and extraction of

Seteptomyces against the growth of mainn pathogen in vitro.

Research Methods

Field surveys of disease incidence were carried out in Highland, Centre andNorthern provinces followed standard method of QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT.Pathogen caused root rot disease was isolated from infected soil by rose trap and frominfected fruits using WA culture Total DNAs of one isolate from Gia Lai was extractedusing CTAB method PCR was performed using primers ITS4 and ITS5 to multiply theITS region of the fungus PCR products were purified and sequenced Furthermore,mophological characteristics of the pathogen was observed using several culture media.Biological characteristics of the pathogen such as temperature, pH were studies Threefungicides including Anvil 5SC, Aliete 800WG, Ridomil Gold 68WG, an antagonist

fungus (Trichoderma asperellum), an antagonistic bacterium (Bacillus velezensis) and

an antibacterial product named H216 extracted from Streptomyces were used to test their inhibitor against pathogen in vitro.

Conclusions

From August 2018 to July 2019, we have isolated seven Phytophthora samples

collected from Hingland, Centre and Northern provinces Based ITS sequences, the

pathogen caused root rot was identified as Phytophthora nicotiana Root rot disease

occured mostly in rainny season The disease developed fastest in the period from July

to September, when the temperature is 28 -30°C and a lot of rain In the dry season in

the Highland and winter in the North, the disease is almost not occurred Phytophthora

nicotianae grows well at temperatures from 25 to 30°C, pH 6-8 In particular, at a

temperature of 25°C, pH 6-8, is best condition for growing Bacillus velezensis gave good inhibitor grow of Phytopthora nicotianae up to 73.2% after six days of inoculation Siminar to B velezensis, Tricoderma asperellum also showed high inhibitor against

Phytopthora nicotianae up to 73.6% when Tricoderma asperellum was cultured 24 hour

earlier than Phytopthora nicotianae The results of applying some fungicides to inhibit growth of Phytopthora nicotianae in vitro showed that Aliette 80WWG and Ridomil Gold 68 WG are the best fungicide to inhibite growth of Phytopthora nicotianae in vitro.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chanh leo (Passiflora edulis) là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Hầu như

tất cả các bộ phận của chanh leo đều có giá trị phục vụ con người Đầu thế kỷ 17, ởChâu Âu, hoa chanh leo đã được sử dụng để trang trí, lá và rễ chanh leo được sửdụng như một loại trà có đặc tính chữa bệnh, đặc biệt quả chanh leo là bộ phận cógiá trị sản phẩm về kinh tế rất cao Quả chanh leo có nhiều thành phần dinh dưỡng,được sử dụng làm nguyên liệu chế biến ra các loại nước giải khát có hương vị đặcbiệt, thực phẩm, thuốc chữa bệnh rất có lợi cho sức khỏe con người Từ đặc tính câychanh leo cũng như nhu cầu của thị trường ngày càng tăng nên loài cây này đã đượcphát triển ở nhiều địa phương trong cả nước, đem lại thu nhập cao

Tại Việt Nam, loài chanh leo được trồng phổ biến là chanh leo tím

(Passiflora edulis), mặc dù mới du nhập nhưng cây chanh leo đã có sức hấp dẫn

rất lớn nhờ hương vị thơn ngon đặc biệt, theo Đông y các hợp chất trong chanhleo có tính hàn, bổ dưỡng cho tim mạch, lưu thông khí huyết, hạ thân nhiệt Từcác đặc tính trên mà ngày càng có nhiều sản phẩm được chế biến từ loài quả này,chính vì vậy chanh leo ngày càng được chú ý khai thác và nhân rộng, hướng tớicanh tác trên quy mô lớn và đem lại lợi ích kinh tế lớn hơn cho nông dân

Theo Cục Bảo vệ thực vật, đến tháng 7 năm 2016, diện tích trồng chanh leocủa cả nước là hơn 4.000ha, trong đó các tỉnh như Gia Lai: 1.323ha, Nghệ An:900ha, Lâm Đồng: 656ha, Sơn La: 487 ha và nhiều tỉnh khác trên cả nước

Hiện nay, chanh leo được xem là cây xóa đói, giảm nghèo cho vùng núi, vùngsản xuất các cây công nghiệp lâu năm đang trong tình trạng gặp nhiều khó khăn.Theo số liệu thống kê sơ bộ của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh ĐăkNông, đến cuối tháng 6/2014, tổng diện tích trồng chanh leo trên địa bàn tỉnh khoảng

621 ha, chủ yếu được trồng ở vùng phía Nam của tỉnh Hiện nay, có khoảng 70%diện tích chanh leo bị nhiễm bệnh bã trầu, thối cổ rễ và nhiễm virus rất khó chữa trị

và phục hồi có khả năng chết toàn bộ vườn gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngườitrồng Theo quyết định về việc phê duyệt quy hoạch phát triển vùng chanh leonguyên liệu huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An (2013) được quy hoạch phát triển vùngsản xuất chanh leo nguyên liệu với mục tiêu đạt quy mô diện tích vùng nguyên liệuđịnh hình khoảng 900 ha, năng xuất bình quân chanh leo: 450-500 tạ/ha/năm,

tổng sản lượng chanh leo định hình: 45.000 tấn/năm,… Vào tháng 3/2014, sở Khoahọc và Công nghệ tỉnh Nghệ An đã kiểm tra tiến độ và kết quả triển khai thực hiện

đề tài nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất giống chanh leo tạo vùng nguyên liệucho công nghiệp chế biến tại Nghệ An Đề tài được triển khai thực hiện trong 36tháng và bắt đầu từ tháng 10/2012 Sau hơn 1 năm thực hiện điều tra và đánh giá cácgiống chanh leo được trồng tại địa phương, kết quả đã chọn được giống chanh leoĐài Loan quả tím Đây là giống phù hợp nhất với điều kiện khí hậu, đất đai của vùngđồi núi các tỉnh Tây Bắc, Nghệ An và tiến hành xây dựng mô hình vườn ươm nhângiống với 7.000 bầu giâm hom tại xã Tri Lễ, huyện Quế Phong Bắt đầu từ năm

2014, huyện Vị Xuyên tỉnh Hà Giang thực hiện đề án đưa cây chanh leo vào trồngsản xuất và đã thực hiện trồng 50 ha chanh leo ở 4 xã Trung Thành (20ha), NgọcLinh (10ha), Bạch Ngọc (15ha), Linh Hồ (5ha) (Phương Nguyên, 2014) Tại vùngnúi Hướng Hóa (Quảng Trị), trồng chanh leo là một mô hình mới cho hiệu quả kinh

tế cao Với điều kiện về đất đai và tiểu vùng khí hậu đặc biệt thuận lợi, cây chanh leođược trồng thử nghiệm ở xã Hướng Lộc đã mở ra một hướng đi mới cho người nôngdân nơi đây, nhất là đồng bào dân tộc ít người (Võ Thái Hòa, 2013)

Mặc dù hiện nay chanh leo vẫn là loại cây trồng khảo nghiệm và chưađược Bộ Nông nghiệp cho phép trồng rộng rãi; nhưng trước lợi nhuận kinh tế rấtcao từ việc sản xuất chanh leo mang lại mà người dân đã ồ ạt trồng và bất chấptất cả những rủi ro có thể xảy ra Đây là một trong số những nguyên nhân chínhchính làm gia tăng dịch hại trên cây chanh leo Đặc biệt là bệnh bệnh thối rễ do

Phytophthora sp là loài dịch hại nguy hiểm và cũng là một trong số các bệnh

quan trọng nhất gây thiệt hại sản suất rất lớn Nhiều diện tích trồng chanh leo tạicác tỉnh như Sơn La, Nghệ An, Gia Lai đã phải chuyển sang trồng ngô hoặc cácloại cây trồng khác do nhiễm bệnh thối gốc rễ Xuất phát từ những vấn đề cấpthiết nêu trên, để góp phần vào việc phòng trừ bệnh do nấm hại chanh leo antoàn, hiệu quả, nâng cao năng suất và phẩm chất chanh leo, dưới sự hướng dẫn

của Tiến sĩ Nguyễn Đức Huy, chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu

bệnh thối gốc rễ (Phytophthora sp.) và bệnh đốm nâu (Alternaria sp.) cây

chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên, miền Trung và miền Bắc”.

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục đích

Điều tra hiện trạng bệnh hại chanh leo, diễn biến bệnh thối gốc rễ và bệnh

đốm nâu chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên, miền Trung và miền Bắc của ViệtNam Phân lập, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và thử nghiệm hiệu lực

ức chế tác nhân gây bệnh trong điều kiện in vitro và phòng trừ bệnh trong điều kiện in vivo.

- Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh thối gốc rễ chanh leo do

Phytophthora sp bằng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ Trichoderma và Bacillus trong điều kiện in vivo và đồng ruộng.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về cây chanh leo

2.1.1.1 Nguồn gốc

Chanh leo còn có tên gọi khác là lạc tiên, chùm bao, chanh dây, mát mát,

dây mát, mê ly Tên khoa học là: Passiflora edulis, tên tiếng Anh là: Passion Fruit, thuộc họ Passifloraceae, bộ Violales Chi Passiflora hiện có khoảng 500

loài và 12 giống, trong đó có khoảng 50 - 60 loài cho quả ăn được nhưng chỉ mộtvài loài ngon và một số ít có ý nghĩa thu quả Chanh leo là loại cây lâu năm, dâyleo và thuộc loại cây rừng Chanh leo có nguồn gốc từ miền Nam Brazil, sau đóđược mang sang Úc và Châu Âu từ thế kỷ XIX (CABI, 2007) Nhà nghiên cứu

nông học Chandler (1967) cho biết: Chi Passiflora chỉ có 1 loài duy nhất Passiflora edulis nguồn gốc từ Brazil là loài có giá trị sử dụng trong lĩnh vực chế

biến thực phẩm và nuớc giải khát Còn lại các loài khác được trồng dưới dạng câycảnh hoặc vườn thực vật ở một số nước vùng Trung Mỹ Quả của một số loàikhác cũng được trồng với mục đích lấy hương liệu hoặc làm cảnh nhu P

mollissima hoặc để ăn quả.

Theo Morton (1987) thì giống chanh leo vỏ tím có nguồn gốc từ các vùngnam Brazil kéo dài tới Paraguay và bắc Argentiana, trong khi đó giống vỏ vàngđược phát hiện lần đầu tiên ở vùng Amazon của Brazil, sau đó được đem trồngnhiều trong các vườn nhà, trang trại

Giữa thế kỷ 19 chanh leo được phân bố rộng rãi và trở thành một loại cây ănquả quan trọng, các nước xuất khẩu chanh leo có thể được chia làm 2 nhóm: nhữngnước xuất khẩu chanh leo tím (Kenya, Nam Phi, Zambia) và những nước xuất khẩuloại màu vàng (Brazil, Ecuador, Venezuela, Colombia, Peru) Kenya là nước lâu đờinhất với quả chanh leo tím được xuất khẩu sang châu Âu từ những năm 1988 đã trởthành nhà cung cấp chính, trong năm 1990, nước này đã xuất khẩu 368 tấn chanhleo, trong đó 90% đến châu Âu Ở Colombia vào năm 1991 trồng 5.000 ha, sảnlượng sản xuất vào năm 1992 là 100.000 tấn giới tăng gấp đôi trong năm 1991, trong

đó 70% sản lượng sử dụng cho ngành công nghiệp nước hoa quả Chanh leo được

coi là cây trồng quan trọng nhất tại Kenya (Kahinga et al., 2006).

2.1.1.2 Vị trí phân loại ( CABI, 2007)

Giới (Kingdom): Viridiplantae

Tên khoa học khác:

Passiflora edulis f edulis

Passiflora edulis f flavicarpa

Tên tiếng anh:

-lá màu xanh và có màu hơi đỏ hoặc hơi hồng; -lá xẻ ba thùy, rìa -lá mịn, hình tim.Hoa đơn tính, mọc từ nách lá Mỗi hoa mang 5 nhị đực với 5 chỉ dính với nhauthành ống ở đáy và tách rời ở phần mang bao phấn Hoa của giống chanh leo quảmàu tím nở vào buổi sáng sớm, thường là lúc bình minh và đóng vào buổi trưa;hoa của giống chanh leo màu vàng nở vào buổi trưa và đóng vào khoảng 9 - 10giờ đêm Hai giống chanh leo quả màu tím và màu vàng không có khả năng thụ

phấn chéo (Akamine et al., 1974).

2.1.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Theo Đông y, "nạc" quả chanh leo có vị chua, ngọt, tính mát, tác dụng thanhnhiệt, giải khát, làm tăng hưng phấn, tăng cường khí lực và bổ dưỡng Ruột chanhleo (áo hạt) có tác dụng sinh tân, giải khát, khai vị, lợi tiểu, khử nóng, sát trùng Các

kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng: Những người bị bệnh cao huyết áp vàmạch vành uống nước chanh leo có tác dụng cải thiện tình trạng bệnh nhờ axitcitric kết hợp với canxi làm hoãn giải tình trạng máu bị đông do tích tụ tiểu cầu.Chanh leo còn có tác dụng giải cảm, hạ huyết áp, giảm béo, khỏi đau, gia tăng sựtuần hoàn của máu Trong Tây y, quả chanh leo tươi giàu beta carotene, kali, vàchất xơ Nước ép quả chanh leo là một nguồn tốt để cung cấp acid ascorbic(vitamin C), và tốt cho những người có bệnh huyết áp cao Một số nghiên cứucho thấy rằng quả chanh leo có vỏ màu tím có thể giúp kiểm soát các triệu chứnghen suyễn Trong vỏ quả chanh leo tươi và chín có chứa chất Lycopene Quảchanh leo cũng rất giàu vitamin A (cung cấp khoảng 1.274 IU mỗi 100 g), và chấtchống oxy hóa flavonoid như ß-carotene và cryptoxanthin-ß Chanh leo cũng rấtgiàu kali, 100 g bột trái cây có khoảng 348 mg kali Quả chanh leo rất giàu cáckhoáng chất như sắt, đồng, magiê và phốt pho, canxi, giàu formic, butyric,linoleic, linolenic, malic, myristic, acid oleic và palmitic như các hợp chấtasphenolic tốt, và amino acid α-alanine Este như ethyl butyrate, ethyl caproate,n-hexyl butyrate và n-hexyl caproategive các loại trái cây hương vị và mùi ngonmiệng Đường, có chủ yếu trong trái cây, đáng kể nhất d-fructose, d-glucoseandraffinose Chanh leo được sử dụng trong thực hành trị liệu và đã được sửdụng trong điều trị một số bệnh như lo âu, mất ngủ, co giật, rối loạn chức năng

tình dục, ho và ung thư (Patil et al., 2013).

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của quả chanh leo tím

2.1.2 Nghiên cứu về bệnh hại cây chanh leo

et al., 2009) Các bệnh chủ yếu tấn công gây hại trên chanh dây quả màu tím ở

Úc là bệnh thối do nấm Septoria, cháy lá do Phytophthora, héo Fusarium và bệnh bần hóa do virus passionfruit woodiness (PWV).

Kết quả nghiên cứu về bệnh hại trên cây chanh leo (Passiflora edulis) của

Joy and Sherin (2012) đã tổng hợp được 12 loài nấm hại, 5 loài virus hại, 2 loài

vi khuẩn hại và 1 loài phytoplasma Trong 12 loài nấm hại có 2 loài gây lở cổ rễ (Haematonectria haematococca và Fusarium solani), 1 loài gây héo (Fusarium oxysporum), 2 loài gây thối rễ và ngọn (Phytophthora cinnamomi, Phythophthora nicotianae), 1 loài gây bệnh thán thư (Coletotrichum gloeosporioides), 1 loài gây bệnh ghẻ (Cladosporium oxysporium), 3 loài Septoria gây đốm (Septoria fructigena, Septoria passifloricola, Septoria pasiflorae) trong đó Septoria passifloricola là loài phổ biến nhất , 2 loài gây đốm nâu (Alternaria passifloricola, Alternaria alternata).

2.1.2.2 Bệnh do vi khuẩn

Bệnh vi khuẩn nguy hiểm nhất trên chanh leo là bệnh đốm vi khuẩn do

Xanthomonas campestris pv passiflorae Bệnh được ghi nhận ở Úc, Colombia và

Brazil Bệnh nặng gây rụng lá Lá bị nhiễm bệnh có thể lây qua cành, qua rễ,bệnh nặng làm thâm đen mạch dẫn và làm khô cành Trên quả, vết bệnh có màuđen hoặc xanh nâu sáng, có giọt dầu và có đường viền rõ ràng xung quanh vếtbệnh Bệnh nặng nhiều vết bệnh liên kết với nhau ăn sâu vào phần cơm quả và

làm cho quả hư hoàn toàn (Manicom et al., 2003).

chứng khảm lá PPMVK và PFMVMY, đây là hai loại virus rất phổ biến trong cácvùng trồng chanh leo quả vàng ở huyện Bantung của Selangor, Malaysia.(Morton, 1987).

2.1.2.4 Nghiên cứu về bệnh đốm nâu do Alternaria

Nghiên cứu về sự phân bố và triệu chứng bệnh đốm nâu trên cây chanh dây:

Bệnh đốm nâu do nấm Alternaria sp xuất hiện khắp nơi trên thế giới Bệnh này

đã được ghi nhận tại Úc, Canada, Indonesia, Kenya, Mauritius, New Zealand,New Guinea, Nam Phi, Tanzania, Hoa Kỳ và Zambia Ba giống chanh dây

Passiflora quadrangularis, Pasiflora edulis f.edulis và Passiflora flavicarpa f.edulis rất mẫn cảm với loại bệnh này, tỷ lệ bệnh có thể lên đến 98% trong những

vùng có lượng mưa lớn (Manicom, 2003) Trên cây chanh dây triệu chứng do hai

loại nấm A passiflorae và A alternata rất khác biệt A passiflorae gây ra những

đốm màu nâu đỏ trên lá, đường kính vết bệnh 5mm, vết bệnh phát triển rộng radưới điều kiện độ ẩm cao Bào tử và cành bào tử của nấm được tìm thấy

ởtrung tâm của vết bệnh Triệu chứng do nấm A alternata gây ra là các vết đốm

nhỏ hơn, đường kính vết bệnh 1 – 5mm, với những quầng vàng trên lá Bệnh hạitrên thân do nấm này gây ra hiếm khi làm cho cây chết Trên quả là những đốm

có màu xanh đậm, mép tròn đều A alternata là loài mang tính độc cao và nó là

nguyên nhân gây ra hiện tượng rụng lá một cách nhanh chóng (Manicom, 2003)

Bệnh đốm nâu gây ra bởi nấm Alternaria sp trong thời tiết ấm áp, là một

tác nhân gây hại nghiêm trọng cho chanh dây quả tím ở New Zealand và Đông

Phi Tại Hawaii, bệnh này tấn công gây hại trên chanh dây quả vàng là do nấm A tenuis được tìm thấy năm 1969 và A macrospora gây hại nặng cho ngành sản

xuất chanh dây tại Ấn Độ (CABI, 2007)

(Maraky et al., 2012) đã phát hiện trên cây rau Bina ở Ả Rập Saudi có tỷ lệ

chết do bệnh đốm vòng là 20 - 80% Bệnh bắt đầu vào tháng 10, phát triển mạnh

từ tháng 11 đến tháng 1, giảm rõ rệt vào tháng 3 và kết thúc vào tháng 4 Nguyên

nhân được xác định là do nấm A alternata (Maraky et al., 2012).

Bệnh cháy lá gây ra bởi A brassicae (Berk.) Sacc là một bệnh phá hoại

quan trọng và phổ biến trên cây cải dầu, làm giảm đáng kể số lượng và chấtlượng của các sản phẩm cải dầu thu hoạch Tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọngcủa nó ở Ấn Độ, tổn thất năng suất đối với mức độ 70% đã được báo cáo

(Kumari et al., 2016).

Độc tố của nấm Alternaria:

Các loài Alternaria chủ yếu là nấm hoại sinh, nhưng một số loài có khả

năng gây bệnh cho cây trên phạm vi ký chủ rộng Các độc tố chọn lọc ký chủ

(HST) do mầm bệnh Alternaria tạo ra thường là các chất chuyển hóa thứ cấp có

trọng lượng phân tử thấp với một loạt các cấu trúc có chức năng như tác nhânkiểm soát mầm bệnh hoặc độc lực trong một số tương tác mầm bệnh của cây Chi

Alternaria bao gồm nhiều loài bán hoại sinh Nó được mô tả lần đầu bởi Nees vào năm 1.816 với A tenuis là loài duy nhất, sau này được đổi tên thành A alternata Chi Alternaria bao gồm cả các loài không gây bệnh và gây bệnh trên

các cây quan trọng về nông học bao gồm ngũ cốc, cây cảnh, cây dầu, rau và trái

cây (Meena et al., 2010).

Ram et al., (1977), cho rằng có 9 loài Alternaria gây hại trên cây chanh leo, nhưng phổ biến nhất nhất là hai loài A passiflorae và A alternata, đây là hai loài

nấm gây hại nguy hiểm và cũng là một trong những bệnh quang trọng gây thiệt

hại năng suất rất lớn A passiflorae và A Alternata là những tác nhân gây bệnh đốm nâu trên cây chanh leo A passiflorae gây ra những đốm nâu đỏ trên lá Bệnh đốm nâu do nấm A passiflorae có thể phát triển trên cả lá và quả.

Trên lá vết bệnh bắt đầu như những đốm đỏ nhỏ có đường kính từ 1/16-7/8 inch.Vết bệnh trên quả là vùng hoại tử chìm, màu đỏ và đường kính từ 0,5-2 cm Nấmphát tán nhờ gió và mưa, phát triển mạnh trong điều kiện thời tiết ẩm ướt (Garyand Simone, 2000)

Ellis and Holliday (1970), mô tả triệu chứng bệnh trên lá, một đốm hoại tử nhỏ

mở rộng đến hơn 1 cm Các vết bệnh có màu nhạt hơn ở trung tâm và có thể trònhoặc góc Sự sinh bào tử xảy ra chủ yếu ở bề mặt dưới và tiếp tục sau khi lá rụng Lá

bị bệnh thường gây ra rụng lá Trên quả, các đốm xuất hiện sau khi chúng đã trưởngthành một nửa, các vết bệnh màu nâu lên đến 2 cm và rìa vết bệnh màu xanh đậm;chúng trở nên nhăn nheo và trái cây co lại trong một mục nát

Theo Tofoli et al (2003), thuốc diệt nấm mancozeb + cymoxanil là sản phẩm ức chế sự phát triển sợi nấm nhất của A tomatophila Cymoxanil + mancozeb chỉ được khuyến cáo cho các tác nhân gây bệnh như Phytophthora infestans và nấm mốc Đồng oxychloride với liều 100% hoạt chất đã ức chế sự

tăng trưởng 83%, trong khi phân bón sinh học kém hiệu quả chỉ ức chế 8% sự

tăng trưởng sợi nấm của A tomatophila ở nồng độ cao hơn.

2.1.2.5 Nghiên cứu về bệnh do

Phytophthora a, Triệu chứng và tác hại

Phytophthora (Gr Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại), được đặt tên bởi Bary (1876) Phytophthora là loại nấm khá phổ biến của lớp Oomycetes thuộc họ Pythiacea, bộ Pernoporales; Nhiều loài Phytophthora là các tác nhân gây bệnh

cây trồng lây truyền qua đất và nước có khả năng gây tổn thất kinh tế rất lớn trêntoàn thế giới, cũng như thiệt hại về môi trường trong các hệ sinh thái tự nhiên

Phytophthora các loài khác nhau có phạm vi ký chủ rộng P cinnamomi được ghi nhận gây hại trên 900 loài thực vật thân gỗ và thân thảo và P nicotianae được phát hiện trên 250 loài Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới điển hình

như bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở

Châu Âu những năm 1840, nguyên nhân do nấm P infestans (Bourke, 1964) Năm 1970, bệnh thối do P cinnamomi gây hại cây chanh leo quả tím được trồng ở Fiji P cinnamomi var parasitica gây bệnh cháy lá, bệnh nặng làm thân

cây mục nát, thối quả và chết cây trong điều kiện khí hậu ẩm ướt của mùa hè và

mùa thu tại Queensland và Nam Phi P cinnamomi và P nicotianae là tác nhân

gây bệnh thối gốc ở New Zealand và Tây Úc Ngoài ra hai nấm này còn gây bệnhhéo, cháy lá cả hai giống chanh leo quả tím và chanh leo quả vàng tại Nam Phi,

Sarawak và Ấn Độ (Akamine et al., 1974).

Theo Reeksting et al (2014), P cinnamomi hiện diện phổ biến trong vùng đất trồng bơ và là đối tượng gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất P cinnamomi có phổ ký chủ rất rộng và là một trong những loài phân bố rộng rãi nhất trong Phytophthora Zentmyer (1983), đã nêu gần 1.000 loài cây ký chủ, nhưng một nghiên cứu sau đó ở Úc (McDougall et al., 2001) đã báo cáo hơn

2.000 loài cây bản địa mẫn cảm với loài này ở bang Tây Úc

Hiện nay, có trên 80 loài khác nhau trong chi Phytophthora đã được xác

định và phần lớn trong số này là tác nhân gây bệnh trên rất nhiều loài cây trồngnhư: Bơ, Óc chó, Ca cao và Mâm xôi (Matheron và Mircetich, 1985) Ngoài ra,

các loài nấm thuộc chi Phytophthora còn gây bệnh phổ biến trước và sau thu

hoạch cho các loài cây trồng: gây bệnh mốc sương trên khoai tây, thối nâu camquýt và biến màu trên cây Ca cao (Cohen and Coffey, 1986)

Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu sâu tại Châu Âu Tuy nhiên, bệnh

khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiềuloại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét

thân, tàn lụi lá và thối trái Phytophthora sp., có thể tấn công riêng lẻ nhưng đa số

có sự kết hợp với các nấm khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia Theo Gary and Simone (2000), cây bị bệnh do Phytophthora sp sẽ héo và chết do hệ

thống rễ bị phá hủy bởi tác nhân gây bệnh Bệnh thối rễ có thể sẽ nghiêm trọnghơn khi kết hợp với tuyến trùng ký sinh rễ

Phytophthora sp là một loại nấm rễ gây bệnh tắc mạch dẫn và gây chết đối

với nhiều loài thực vật Bệnh phát triển mạnh trong môi trường ẩm và ký sinhtrên rễ và mô thân gần gốc Bệnh làm suy yếu hoặc giết chết cây vì gây cản trởviệc vận chuyển nước và dinh dưỡng trong cây Trên cây trưởng thành xuất hiệncác triệu chứng cháy lá Lá chuyển sang màu xanh nhạt rồi chuyển sang màuđồng Trên quả xuất hiện các vết bệnh lớn, màu xám Hoa và quả xanh của cây

bệnh rất dễ bị rụng (Nguyen et al., 2010).

Theo Cole et al (1992), bệnh chết héo cây chanh leo đang lan rộng ở Zimbabwe Trong đó có vai trò của Phytophthora nicotianae var Tác nhân gây bệnh được nghiên cứu, những cây bị nhiễm F solani từ từ bị héo, trong khi những cây bị nhiễm hỗn hợp F solani và P nicotianae v Parasitica hoặc P nicotianae v Parasitica thường chết nhanh chóng.

Tại quận Auckland của New Zealand, bệnh héo chết cây chanh leo

(Passiflora edulis Sims.) đã được chứng minh là do P cinnamomi Rands Cây bị nhiễm bệnh do P cinnamomi ngục xuống đột ngột đặc biệt là trong thời tiết ấm

áp vào cuối mùa xuân Vỏ của thân cây của những cây này đã được tìm thấy bịthối rữa hoàn toàn trên mặt đất mức độ, và sợi nấm đã lan xuống dưới, biến màu

mô của rễ chính (Young, 1970)

Trên thế giới đã ghi nhận P palmivora, P capsici, Phytophthora megakarya,

Phytophthora citropthora là tác nhân gây bệnh thối trái ca cao hiện nay.

Triệu chứng bệnh: Các triệu chứng quan sát được là héo cây, rụng lá, thối rễ

và cổ, làm lộ mô vỏ thực vật và chết Tác nhân Các mầm bệnh sau đây được xác

định là tác nhân căn nguyên của bệnh thối rữa: Phytophthora cinnamomi ở Úc và New Zealand và Phytophthora nicotianae (đồng bộ: P parasitica), ở Zimbabwe, Nam Phi, Malaysia, Đài Loan, Úc, Venezuela và Brazil Phytophthora nicotianae

trong điều kiện độ ẩm tương đối cao cũng có thể lây nhiễm vào phần trên mặt đất

của cây (Ivan et al., 2008).

b, Sinh sản của Phytophthora sp.

Wu et al (2013), cho rằng hình thức sinh sản hữu tính rất quan trọng trong chu kỳ sống của Phytophthora, đặc biệt ở trường hợp của những loài Phytophthora mang tính dị bản (heterothalic) Cấu trúc hữu tính, noãn bào tử có

thể tồn tại trong một thời gian dài không có sự hiện diện của cây ký chủ và có thểduy trì sự xâm nhiễm vào mô cây trong điều kiện thời tiết bất lợi

Có thể nói Phytophthora là loài có mặt khắp mọi nơi trên thế giới, gây bệnh trên 1.000 loài cây ký chủ Một vài loài của Phytophthora đã trở thành thảm họa gây hại cho sản xuất nông nghiệp Trong khi P cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P palmivora, P paracitica (P nicotianae) và P citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P infestans, P syringae và P fragariae

xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới (Gregory, 1983)

c, Nghiên cứu về biện pháp phòng chống

* Biện pháp hóa học:

Sử dụng Boócdo có khả năng phòng trừ bệnh sương mai cà chua, khoai tây

do P infestans Nhóm hoạt chất gồm có Furalaxyl (fongarid), Metalaxyl

(Ridomil) và benalaxyl (Galben) có khả năng diệt được các loại nấm thuộc Bộ

Peronosporales trong đó có Phytophthora, tuy nhiên hoạt chất Metalaxyl được sử

dụng phổ biến nhất (Erwin and Ribeiro, 1996)

* Biện pháp canh tác:

(Wangungu et al., 2010), đã tiến hành thử nghiệm để xác định hiệu quả của

việc cắt tỉa, kết hợp với việc sử dụng các loại thuốc diệt nấm khác nhau bao gồm cảBavariaistin (carbendazim), Cotaf (hexaconazole), Topsin (thiophanate methyl),

Ridomil (metalaxyl) Trichoderma harzianum và T asperellum) đối với các bệnh do

Phytophthora sp và Fusarium sp Kết quả cho thấy sử dụng Carbendazim,

hexaconazole và T harzianum là phương pháp điều trị hiệu quả nhất.

Vệ sinh sạch sẽ tại các khu vườn là yếu tố cơ bản trong phòng chống bệnhhiệu quả Lối đi và các trang thiết bị phải được giữ gìn sạch sẽ Các khu vườncũng cần được làm sạch không còn những tàn dư cây trồng bị thối nát, đó là

những vật dễ mang mầm bệnh Phytophthora (Broadley, 1992) Cắt tỉa những

cành, nhánh hồ tiêu ở dưới thấp, đặc biệt trong mùa mưa để làm giảm độ ẩm ở

phần gốc và ngăn cản những lá ở dưới thấp tiếp xúc nguồn bệnh Phytophthora ở trong đất (Manohara et al., 2004).

* Biện pháp sinh học

Nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ sinh học bằng Trichoderma đối với Phytophthora, Adams (1990), cho rằng đó là hiện tượng “giao thao sợi nấm” Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh sợi Phytophthora, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm, cuối cùng mới thấy nấm xuyên qua sợi nấm Phytophthora làm thủng màng ngoài của chúng, gây nên sự phân

hủy các nguyên sinh chất trong sợi nấm Những nghiên cứu chi tiết gần đầy bằngkính hiển vi điện tử về vùng “giao thoa sợi nấm” cho thấy cơ chế chính của hiện

tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà sợi nấm Trichoderma xâm nhập vào vào bên trong

sợi nấm vật chủ (Dubey and Suresh (2007)

Theo Chet and Baker (1981), Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống

chế ngăn ngừa các loại nấm bệnh hại cây trồng gây bệnh xì mủ, vàng lá thối rễ,

chết yểu, héo rũ như: Rhizoctonia solani, Fusarium, Pythium, Phytophthora sp., Sclerotium rolfsii,… Ngoài hiệu quả trừ nấm gây bệnh, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh, chế phẩm từ nấm Trichoderma còn có tác dụng tốt đối với cây trồng Dùng chế phẩm nấm Trichoderma làm cho cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh

vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng cây trồng

Theo Inbar et al (1995), điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các codini của nấm Trichoderma sau khi nảy mầm tạo

thành sợi nấm phải được tiếp xúc với nấm vật chủ và phải hình thành giác bám Thểgiác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ Tỷ

lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc với nấm vật chủ

Cơ chế tác động chính của nấm Trichoderma là ký sinh và tiết ra các kháng

sinh trên các loài nấm gây bệnh Ngoài hiệu quả trực tiếp trên các tác nhân gây

bệnh cây, nhiều loài Trichoderma còn bám ở bề mặt rễ cây giúp thay đổi khả

năng biến dưỡng của cây, nhiều dòng nấm đã kích thích sự tăng trưởng của cây,gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng

được bệnh (Hartmann et al., 2004).

Các nghiên cứu cấu trúc siêu vi (ultrastructural) và mô hóa học

(histochemical) đã chứng minh rằng các enzyme của Trichoderma gây ra sự phân

giải vách tế bào nấm ký chủ tại vị trí tiếp xúc giữa sinh vật đối kháng và ký chủ

Sự hiện diện của chitin và/hoặc các sợi β-glucan, gắn chặt trong chất nền protein,trong vách các tế bào nấm bệnh đề xuất rằng sự phân giải hệ sợi nấm của chúngtrong quá trình ký sinh có thể được thực hiện nhờ β-glucanase, chitinase vàprotease (Peberdy, 1990)

Theo Aryantha et al (2000) tất cả các phân hữu cơ đều làm tăng chất hữu

cơ ở trong đất, kích thích hoạt động sinh học và làm gia tăng số lượng các xạkhuẩn đối kháng, vi khuẩn huỳnh quang và nấm đối kháng Các chất hữu cơ phânhuỷ giải phóng ra amoniac và các axit hữu cơ dễ bay hơi có thể diệt bệnh

Phytophthora và chất hữu cơ còn lại kích thích sự phát triển của các vi sinh vật

cạnh tranh đối kháng trong đất

Rất nhiều vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) đã được nghiên cứu

nhằm tạo các chế phẩm sinh học phòng chống Phytophthora trên thế giới Các loài nấm đối kháng mạnh với Phytophthora đã được công bố bao gồm Chaetomium, Gliocladium và đặc biệt là Trichoderma Nhiều sản phẩm thương mại trên thế giới đều có thành phần chính là Trichoderma Ví dụ, tại Mỹ, các chế phẩm như PlantshieldTM và RootshieldTM (T harzianum chủng T22), Promote Plus (T koningii và T harzianum) đã được khuyến cáo để phòng trừ một số bệnh

do Phytophthora, Pythium, Fusarium trên cây trồng Trong số các vi khuẩn đối kháng, các chủng Bacillus và Pseudomonas đã chứng tỏ có tiềm năng nhất trong phòng chống sinh học Phytophthora (Lim et al., 2010).

Nhóm vi khuẩn đối kháng với các tác nhân gây bệnh cây trồng rất đa dạng,

bao gồm hàng loạt các loài thuộc các vi khuẩn như Agrobacterium, Baccilus, Streptomyces, Burkhoderia, Pseudomonas, Alcaligenes, Paenibaccillus, và Serratia Các vi sinh vật đối kháng có thể ngăn chặn nguồn bệnh thông qua một

hoặc nhiều cơ chế khác nhau Vi sinh vật đối kháng ức chế nguồn bệnh thông quaviệc cạnh tranh về nơi cư trú, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng các bon, nitơ vàsắt, hoặc sản sinh ra các chất kháng sinh, các enzym thủy phân, các hợp chất bayhơi, lipopeptit, màng sinh học (biofilm) hoặc sản phẩm HCN và siderophore để

ức chế sự phát triển nguồn bệnh (Benizri et al., 2001), hoặc kí sinh vi sinh vật

gây bệnh Ngoài ra, các vi sinh vật đối kháng còn có khả năng kích thích sinhtrưởng cho cây trồng thông qua các sản phẩm được chúng sản xuất ra như IAA,

cytokinin và gibberellins (Glick, 1995).

Vi sinh vật đối kháng có thể được trộn với phân để bón cho cây kí chủ hoặc

có thể lên men để tách chiết các hợp chất đối kháng hoặc sử dụng trực tiếp đểphun như một chế phẩm sinh học Nhiều nghiên cứu còn cho thấy, chế phẩm sinh

học có thể sử dụng thay thế được cho thuốc hóa học (Karasuda et al., 2003) Hiện nay, loài vi khuẩn đối kháng B subtilis được sử dụng nhiều trong phồng chống bệnh hại cây trồng nói chung và phòng chống Phytophthora nói riêng Vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong nhiều điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên Bacillus là vi khuẩn gram dương có thể tạo ra nội bào tử để

chống chịu với nhiệt độ, sự khô hạn, tia U.V, các bức xạ hoặc các dung môi hữu

cơ (Romero et al., 2007) Do vậy, chúng có tiềm năng rất lớn để ứng dựng vào

việc tạo ra các sản phẩm dạng hạt hoặc bột khô, hoặc ứng dụng trong tự nhiên màvẫn đảm bảo sức sống của chúng

Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình

dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt

buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao.

Bacillus được coi là vi khuẩn an toàn, chúng sản xuất và tổng hợp ra nhiều các chất

đã được ứng dụng thành công trong nông nghiệp và công nghiệp (Stein, 2005)

Béahdy (1974) đã báo cáo các loài vi khuẩn Bacillus có thể sản xuất ra 167 chất kháng sinh khác nhau Kim et al (2010) đã báo cáo chủng Bacillus subtilis

CMB32 sản xuất ra đồng thời các lipopeptit có hoạt tính sinh học bề mặt nhưiturin A, Fangycin, surfactin A và chúng có tác dụng ức chế nguồn nấm bệnh

Colletotrichum gloeosporioides.

Asaka and Shoda (1996) cũng đã báo cáo chủng B subtilis sản xuất ra iturin

A và surfactin, và hai chất này có hiệu quả trong việc kiểm soát nấm Rhizoctonia solani gây bệnh chết rạp cây con cà chua Xu ZH (2013) đã báo cáo chủng B velezensis SQR9 đã sản xuất ra bacillomycin D có hoạt tính ức chế nấm Fusarium oxysporum.

Tuy nhiên, các chất polipeptit được sản xuất bới các chủng vi khuẩn có cácđặc điểm và tính chuyên hóa khác nhau Trong khi fengycin có tác dụng ức chế

sự phát triển của nấm sợi thì surfactin lại chỉ có tác dụng ức chế sự phát triển của

vi khuẩn và virus, không hoặc gần như không có khả năng ức chế nấm sợi

(Meena and Kanwar, 2015)

Ở một nghiên cứu khác về khả năng bảo vệ cây của vi khuẩn, Bais

et al.

(2004) đã cho biết B subtilis cũng có khả năng ức chế sự nhiễm bệnh do vi khuẩn Pseudomonas Syringae pv Tomato DC3000 gây ra ở rễ cây Arabidopis

nhờ khả năng tạo thành màng sinh học (biofilm) và sản xuất ra surfactin

Một cơ chế đối kháng với các tác nhân gây bệnh khác của vi khuẩn đó là

thông qua các hợp chất hữu cơ bay hơi được sản xuất bởi chúng Gao et al (2017) đã phân lập được chủng Ba velezensis ZSY-1 nội sinh từ lá cây đinh tán

và ZSY-1 đã ức chế hiệu quả sự phát triển của một số nấm, gồm Alternaria solani, Bo Cinerea, Valsa mali, Monilinia fructicola, F oxysporum f sp capsicum, và C lundemuthianum nhờ các hợp chất hữu cơ bay hơi được sản xuất

bởi chúng mà trong đó chủ yếu là 2-tridecanone, pyrazine (2,5-dimethy),benzothiazole, và phenol (4-chloro-3-methyl)

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Theo Đào Quang Hưng (2010), trên lá đầu tiên xuất hiện những đốm màunâu nhỏ, sau lan rộng thành những lớn có tâm màu sáng và có hình dạng bất định.Trên thân, vết bệnh có hình thon dài với màu nâu đen, thường xuất hiện ở gầnnách lá hoặc gân lá (do bị tổn thương cơ giới, cây bị chảy nhựa) Khi vết bệnhbao quanh thân cây thì chồi non sẽ bị héo, quả bị teo lại và rụng sớm Trên quả,vết bệnh đầu tiên chỉ nhỏ như mũi kim sau lan rộng thành những vòng tròn lớnvới vết nâu lõm có tâm màu nâu Dần dần phần vỏ qua xung quanh vết bệnh bịnhăn nheo và quả bị rụng

Nhiều loài Alternaria ký sinh trên thực vật, triệu chứng sớm của bệnh là

những đốm nhỏ màu vàng nâu trên lá, sau đó lan rộng tạo thành những vết hìnhtròn đồng tâm, toàn bộ phiến lá, cuốn lá, gân lá, thậm chí cả hệ thống mạch dẫn

cũng tổn thương đứt gãy do bị nhiễm nấm (Nguyễn Văn Bá và cs., 2005).

Có tới 71 mẫu nấm Alternaria đã được phân lập tại Đăk Nông và Lâm

Đồng (Phan Thị Thu Hiền và cs.) Vết bệnh điển hình trên lá là những tròn màunâu đỏ, viền vết bệnh có màu nâu sậm, có vòng tròn đồng tâm kích thước vếtbệnh khoảng từ 1-5mm Trên quả triệu chứng bệnh là những đốm tròn màu nâu

đỏ, vết bệnh lõm xuống, kích thước vết bệnh từ 1-20mm, nhiều đốm liên kết vớinhau làm cho vết bệnh có kích thước rất lớn, quan sát phần trung tâm vết bệnh ởgiai đoạn già có nhiều sợi nấm màu đen phát triển, thỉnh thoảng có những mẫuquả bệnh bị nhăn nheo, teo tóp lại

Nghiên cứu về đặc điểm hình thái của Alternaria pasiflorae trên môi trường

PCA, Phan Thị Thu Hiền và cs (2015), cho rằng tản nấm phát triển tương đối sátmặt môi trường PCA, màu đen hơi rêu, mép tròn đều và có màu xám trắng, có 3vòng đồng tâm rõ nét, đường kính tản nấm đạt 78,30mm, sau 10 ngày nuôi cấymặt sau tản nấm có màu đen Trên môi trường V-8juice, cành bào tử tương đốilớn, thô và có nhiều sắc tố Hầu hết cành bào tử xuất hiện trực tiếp trên trên bềmặt môi trường Đa số cành bào tử có dạng đơn lẻ và dài khoảng 96,19 - 176,97 x5,46 - 5,92µm và tạo thành những đoạn cong gập, thỉnh thoảng có những nhánhthứ cấp ngắn và có 4 – 5 điểm sinh bào tử Bào tử non có hình trứng, bắt đầu pháttriển và sinh ra cổ bào tử có kích thước hẹp ở giai đoạn bào tử non Bào tử trưởngthành thường có hình elip hẹp hoặc có hình trứng dài hoặc dạng hình chùy hẹp.Mỗi bào tử sinh ra ít nhất một cổ bào tử thon nhỏ

Đặc điểm sợi nấm: màu nâu sáng, mảnh, phân nhánh mạnh, sợi nấm trướchết là gian bào, sau đó có thể trở thành nội bào Mỗi tế bào thường có nhiều nhân(Nguyễn Văn Bá và cs., 2005)

Đặc điểm sinh sản: chi Alternaria chủ yếu sinh sản bằng cách tạo bào tử đính Kiểu đặc trưng sinh sản bào tử của nấm Alternaria gốm có cuống bào tử đơn và trên

đỉnh cuống bào tử đính những nhánh bào tử dạng chuỗi với những bào tử nhỏ thứcấp trên những cành bào tử ngắn riêng lẻ (Nguyễn Văn Bá và cs., 2005)

Kết quả thí nghiệm 6 loại thuốc khảo nghiệm đối với bệnh đốm vòng,

Alternaria sp hại hành tím tại huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng thì thuốc

Dithane M - 45 80WP có hiệu lực khá tốt đối với bệnh đốm vòng trên hành tím.Chỉ 3 ngày sau khi phun (NSP) thuốc Dithane M - 45 80WP đã khống chế đượcbệnh và vào 7 NSP thuốc lần 1, 7 NSP thuốc lần 2 và 14 NSP lần 2 thì tỷ lệ bệnh

ở nghiệm thức thuốc Dithane M - 45 80WP thấp hơn một cách có ý nghĩa thống

kê so với tỷ lệ bệnh đốm vòng các nghiệm thức khác (Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn, 2012)

2.2.2 Bệnh do Phytophthora

Kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật năm 1977 - 1978 đã được công

bố trong danh mục các bệnh hại cây trồng ở Miền Nam Việt Nam và kết quả điềutra bệnh hại cây ăn quả vào năm 1977 - 1978 được xuất bản vào năm 1999 (Đặng

Vũ Thanh và cs., 1999) Kết quả điều tra đã xác định được 13 loài Phytophthora

ở Việt Nam

Theo Mai Văn Trị và cs (2016), Bệnh thối rễ và loét thân gây bởi

Phytophthora là dịch hại quan trọng của cây bơ (Persea americana Miller) và là

yếu tố giới hạn sản xuất đối với nhiều vùng trồng bơ trên thế giới Nghiên cứu

này nhằm xác định loài Phytophthora gây bệnh thối rễ và loét thân trên cây bơ ở

một số khu vực trồng ở miền Đông Nam bộ Cây bị nhiễm bệnh bao gồm cácgiống địa phương và nhập nội 48 mẫu bệnh, trong đó có 15 mẫu rễ và 33 mẫu vỏthân cây, được thu thập và phân lập trên môi trường chọn lọc BNPRAH Từ các

mẫu phân lập, một loài Phytophthora được xác định là Phytophthora cinnamomi

Rands dựa trên hình thái học, trắc nghiệm khả năng lây nhiễm theo quy tắc Koch

và phân tích DNA

Theo Phạm Quang Thu (2016), Ở Việt Nam, chi Phytophthora đã gây ra

thiệt hại kinh tế trên nhiều loài cây trồng, làm giảm năng suất trầm trọng và làm

giảm nguồn thu nhập của người nông dân Những bệnh do Phytophthora gây ra

đã tấn công nhiều loài cây trồng ở Việt Nam bao gồm: dứa, cây ăn quả có múi,cây cao su, hồ tiêu, cà chua và khoai tây Ở khu vực miền Nam Việt Nam, bệnh

thối nõn dứa do P cinnamomi và P nicotianae gây ra đã làm giảm sản lượng đến 60% Trên cây ăn quả có múi, P citrophthora xâm nhiễm trên thân và quả gây ra

bệnh chảy nhựa và thối quả làm giảm năng suất đến 30% Bệnh chết nhanh hại hồ

tiêu do P capsici có thể làm giảm trên 70% năng suất.

Một số loài nấm thuộc chủng Phytophthora gây thiệt hại ngày càng lớn trên

một số cây trồng ở Việt Nam, bao gồm cây ăn quả, rau, cây gia vị, và các cây

công nghiệp Mười ba loài Phytophthora đã được định danh ở nước ta, trong đó

có hai loài gây thiệt hại nặng là P infestans trên cây cà chua và P capsici trên hồ

tiêu (Đặng Vũ Thị Thanh, 2004)

Kết quả điều tra giám định một số sâu bệnh hại chính trên cây tiêu tại PhúQuốc từ năm 1997 - 1999 của Chi cục BVTV tỉnh Kiên Giang đó xác định được

9 tác nhân gây hại trên tiêu, trong đó có 3 tác nhân gây hại trầm trọng, đó là

Phytophthora parasitica, Fusarium solani và Collectotrichum gloeosporioides Nguyễn Tăng Tôn (2005) cho rằng bệnh chết nhanh do Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam Ngoài ra một

số nấm gây bệnh khác như Fusarium spp., Pythium sp., Rhizoctonia solani cũng

là các tác nhân quan trọng

Nghiên cứu về bệnh thối nõn dứa do nhóm Phytophthora spp gây ra, Ngô

Vĩnh Viễn và cs (2003) thấy rằng độ pH của đất có ảnh hưởng nhiều đến sự pháttriển của nấm bệnh, đất có độ pH cao bệnh phát triển nặng hơn so với đất có độ

pH thấp Vì vậy, trong phòng trừ bệnh trên cây tiêu, cần chú ý đến ảnh hưởng của

độ pH đất đến sự phát triển của bệnh

Bênh thối rễ do P cinnamomi thường hoạt động vào mùa hè và mùa thu và

P megasperma thường hoạt động mùa xuân Cả 2 loại nấm này đều tấn công trên

cây trưởng thành ngoài vườn lẫn trong vườn ươm gây chết cây, nhưng tác hại

chính của chúng là nguyên nhân mở đường cho sự tấn công của nấm Fusarium và chết cây do thối ngọn P cinnamomi là một loại nấm rễ gây bệnh tắc mạch dẫn

và gây chết đối với nhiều loài thực vật Bệnh phát triển mạnh trong môi trường

ẩm và ký sinh trên rễ và mô thân gần gốc Bệnh làm suy yếu hoặc giết chết cây vìgây cản trở việc vận chuyển nước và dinh dưỡng trong cây Trên cây trưởngthành xuất hiện các triệu chứng cháy lá Lá chuyển sang màu xanh nhạt rồichuyển sang màu đồng Trên trái xuất hiện các vết bệnh lớn, màu xám Hoa vàtrái xanh của cây bệnh rất dễ bị rụng (Nguyễn Văn Hòa và cs., 2012)

2.2.3 Nghiên cứu về các biện pháp sinh học trong phòng trừ Phytophthora

Ở Việt Nam, tháng mùa mưa liên tục khả năng ứ đọng nước trong vườn rấtcao, cần bố trí trồng tiêu trên đất thoát nước, tạo rãnh thoát nước trong mùa mưa

là biện pháp quan trọng để hạn chế bệnh do Phytophthora gây nên (Lê Đức

Niệm, 2001)

Lê Đình Đôn và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về loài của

nấm Trichoderma tại một số vùng sinh thái khác nhau ở phía nam cho thấy chỉ có

10 - 20% số mẫu có sự hiện diện của chủng vi nấm này Kết quả định danh bằng

sinh học phân tử xác định có ít nhất 15 loài Trichoderma (trong tổng số 187

chủng khác nhau về hình thái) hiện diện Trong đó Trichoderma asperellum

chiếm 25% tổng số mẫu

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu

thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại

cây trồng trong đó có chế phẩm sinh học đa chức năng SH1 của Viện Bảo vệ thực

vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do Phytophthora sp., chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh thối quả ca cao do P palmivora của Viện

Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên (Trần Kim Loang và cs., 2008)

Lê Quang Luân và cs (2014), cho rằng các chế phẩm nano bạc-chitosan chếtạo bằng phương pháp chiếu xạ đã có tác dụng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc

P capsici Hiệu lực ức chế nấm P capsici của chế phẩm có kích thước hạt nano

là 5 nm đạt 100% ở tại nồng độ 40 ppm và của chế phẩm có kích thước hạt 10

nm đạt 92,9% tại nồng độ 100 ppm

Theo Nguyễn Đức Huy và cs (2017), Nấm Trichoderma spp có nhiều trong đất tự nhiên, trong đó nhiều loài như T viride , T harzianum, T aperellum , có khả năng đối kháng lại các tác nhân gây bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất như nấm Sclerotium rolfsii, R solani, F solani, F oxysporum, Pythium sp., P nicotiana.

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Ngọc Dung và cs (2012) đã phân lập

được 18 nguồn Trichoderma tại các vùng trồng tiêu, ca cao, cà phê khác nhau của

ba tỉnh Bình Phước, Đắk Lắk và Quảng Trị Trong đó có sự hiện diện của nấm T asperellum Nấm T asperellum có khả năng ức chế cao đối với sự phát triển của sợi Phytophthora spp., bằng cách ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất kháng sinh

bay hơi

Võ Thị Thu Oanh và cs (2017) đã phân lập được 8 dòng Trichoderma từ

đất ở các địa phương khác nhau, trong đó 7 dòng có khả năng ức chế sự phát triển

của sợi Phytopythium helicoides và cho hiệu suất đối kháng cao từ 59% - 69% ở

48 giờ sau cấy

Bacillus velezensis là một loài thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis Do sở hữu

nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng, loài vi khuẩn này đang nhận được nhiềuquan tâm nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây và tăng năng xuất

cây trồng 15 chủng B velezensis phân lập được phát hiện có hoạt tính kháng các loại nấm hại cây là F oxysporum, S hydrophilum, R solani, P capsici và vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzae (Trịnh Thành Trung và cs., 2017).

Trịnh Thành Trung và cộng sự (2017) đã phân lập được 14 chủng B.

velezensis Trong số 14 chủng B velezensis, 3 chủng phân lập được ở Cúc

Phương, 3 chủng phân lập được ở Bạch Mã, 5 chủng phân lập được ở Chư Yang

Sin và 3 chủng phân lập được ở Côn Đảo; 14 chủng B velezensis trong nghiên cứu này đều sinh chất kháng nấm gây bệnh cây là F oxysporum, S hydrophilum,

R solani và P capsici.

Đinh Hồng Thái và Lê Minh Tường (2016) đã phân lập được 93 chủng xạkhuẩn từ đất trồng sen ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Qua đánh giá sơkhởi đã chọn được 30 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với nấm gâybệnh cháy lá - thối thân trên cây sen, trong đó 5 chủng xạ khuẩn CM18, HG3,HG4, TG1 và BL6 luôn thể hiện khả năng đối kháng cao và bền với

Phytophthora sp Trong đó, chủng CM18 thể hiện khả năng đối kháng cao nhất

với bán kính vòng vô khuẩn là 16,75 mm và hiệu suất đối kháng là 89,89% ở thờiđiểm 60 giờ sau khi cấy

Nguyễn Thị Kim Cúc và cs (2014) đã phân lập được 37 chủng vi khuẩn và

10 chủng xạ khuẩn từ đất và rễ tiêu bị bệnh ở Quảng Trị và được đánh giá hoạttính ức chế sinh trưởng một số nguồn bệnh nấm thực vật bằng phương phápkhuếch tán đĩa thạch Kết quả nhận được cho thấy 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng

xạ khuẩn phân lập đối kháng nấm F oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn ức chế sinh trưởng của F sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng

xạ khuẩn đối kháng với Phytophthora sp.

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh thối gốc rễ, bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên

và Miền Bắc

3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

- Giống chanh leo trồng phổ biến trong sản xuất, Phytophthora sp.

- Dụng cụ trong phòng thí nghiệm gồm: Tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh,

tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm, dao mổ,que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,

- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: Dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu,

- Môi trường nuôi cấy: WA, PGA, PCA, PSA (gồm nước cất vô trùng, agar, đường glucose, đường sucrose, khoai tây, cà rốt, đậu Hà Lan)

- Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho chiết DNA và thực hiện phản ứng PCRnhư đệm CTAB, cặp mồi chung ITS4 và ITS5,

- Một số thuốc trừ nấm và chế phẩm sinh học

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Một số tỉnh trồng chanh leo tại Tây Nguyên và phía Bắc (Gia Lai, Đắk Lắc, Lâm Đồng, Nghệ An, Sơn La, Hải Phòng)

+ Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh cây - khoa Nông học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2018 đến tháng 8/2019

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Điều tra hiện trạng và mức độ bệnh chính hại trên chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên và Miền Bắc

- Điều tra mức độ bệnh thối gốc rễ, bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một sốtỉnh Tây Nguyên và Miền Bắc

- Phân lập, xác định và nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học của

Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ cây chanh leo.

- Thử nghiệm hiệu lực ức chế của một số thuốc bảo vệ thực vật và chế

phẩm sinh học đối với Phytophthora sp trong điều kiện in vitro.

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ và diễn biến bệnh ngoài đồng ruộng

- Điều tra thành phần, mức độ phổ biến, diễn biến bệnh trên ruộng theophương pháp điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều traphát hiện dịch hại cây trồng QCVN 01-38:2010/BNNPTNT

- Điều tra 5 điểm, mỗi điểm 50 cây theo đường chéo góc

- Đếm số cây chết, tổng số cây điều tra, tính tỷ lệ bệnh

- Thu thập mẫu lá, quả, thân, gốc, rễ có triệu chứng bệnh tại các vườn chanhleo ở các địa điểm đến điều tra

Mức độ phổ biến của bệnh hại được đánh

giá: Ghi chú:

( xuất hiện rất ít (tần suất bắt gặp < 5%);

(++) xuất hiện ít (tần suất bắt gặp < 5% - 10%);

(+++) xuất hiện thường xuyên (tần suất bắt gặp < 11% -50%);

(++++) xuất hiện nhiều (tần suất bắt gặp > 50%)

Thời điểm điều tra

+ Điều tra mức độ phổ biến của bệnh hại chanh leo tại các địa phương: không cố định thời gian điều tra

+ Điều tra diễn biến bệnh: tiến hành điều tra định kỳ 1

3.3.3 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu chanh leo có triệu chứng bệnh được thu thập ở các điểm điều tra đểtiến hành phân lập và xác định tác nhân gây bệnh Lấy mẫu lá có bề mặt khô ráo,nếu trong điều kiện mưa ẩm, bề mặt lá ướt thì có thể dùng giấy báo thấm khôtrước khi kẹp mẫu giữa các lớp giấy báo hoặc các loại giấy thấm nước khác Khi

lấy mẫu rễ hoặc mẫu quả, chọn những mẫu mới xuất hiện triệu chứng hoặc triệuchứng đang ở giai đoạn giữa của sự phát triển Gói mỗi quả bệnh vào một tờ giấybáo riêng rẽ Mỗi loại triệu chứng bệnh được cho vào bao giấy, dùng bút chì đểghi đầy đủ các chi tiết như: người thu mẫu, mã mẫu, địa điểm, thời gian thu mẫu,mức độ bệnh Bên ngoài túi mẫu ghi đầy đủ các thông tin theo nhãn mẫu.

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

* Dụng cụ

- Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 180°C trong 1 giờ

* Môi trường PDA

+ Khoai tây: 200 gram

+ Đường glucose: 20 gram+ Nước cất:

Cách làm: 200g khoai tây gọt sạch vỏ, cắt lát mỏng luộc nhừ với 1ít nước

sau đó lọc qua 4 lớp vải màn lấy nước trong Cho nước khoai tây, đường Glucose,agar vào xong rồi quấy đều, Cho xoong lên bếp vừa đun vừa quấy đều tay cho sôiđều rồi đổ vào chai thủy tinh của hãng PYREX, hấp khử trùng ở 121oC trong 15phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đậy nắp lại, khi môi trường nguộithì cấy nấm vào môi trường, Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, chocác hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lạị bằng dây chun để chốngnhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2-

Cách làm: Giống như môi trường PDA

* Môi trường V8 – Juice

+ V8 – Juice: 200 ml

+ Agar: 15g.

+ CaCO3: 3g

Cách làm: Cho 1000ml nước vào xoong, hoà Agar vào 1000ml nước, dùng

đũa quấy cho agar tan đều, cho V8 - Juice, CaCO3, cho lên bếp, vừa đun vừaquấy đều tay sau khi sôi 2 phút, cho xoong ra khỏi bếp, đổ môi trường vào chovào chai thủy tinh của hãng PYREX, vặn nắp vừa phải (không được văn chặtquá), ( hoặc bình tam giác loại 250 ml hoặc 500ml) cho vào nồi hấp, hấp khử

trùng 15 phút (1210C, 1,5at) hấp xong lấy lọ môi trường ra khỏi nồi hấp, đổ môi

trường vào các hộp lồng, đậy nắp lại, khi môi trường nguội, dùng cấy nấm Nếuchưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sửdụng dần trong 2-3 ngày sau

* Môi trường Pea-agar

+ Đậu Hà Lan: 125g

+ Agar: 15g

+ nước cất: 1200 ml

Cách làm: Cho 125 g đậu Hà Lan và 1200 ml nước cất vào nồi sạch đun

sôi, đun nhỏ lửa trong vòng 45 phút, lọc bằng vải lọc 4 lớp sau đó cho vào bìnhđịnh mức 1 lít, hòa tan 15g agar vào bình và hấp khử trùng ở 121oC, 1.5atm trong

30 phút, sau đó để ra ngoài môi trường đến 70 - 80oC rồi đem đổ ra các đĩa petriđược khử trùng để cấy nấm Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, chocác hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun để chốngnhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2

- 3 ngày sau

3.3.5 Phương pháp phân lập Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ cây

chanh leo

Đối với Phytophthora sp lấy đất ở gốc cây bệnh và rễ cây bệnh hòa vào cốc

nước, thả cánh hoa hồng sạch vào cốc nước, bẫy nấm bằng cánh hoa hồng, dùngmôi trường PDA để phân lập nấm

Mẫu đất được lấy ở gốc của cây bị bệnh tại tầng đất mặt (từ 10 - 15cm tính

từ mặt đất), sau đó cho khoảng 100g đất vào một cốc nhựa Đổ nước vô trùnghoặc nước cất vào cốc sao cho ngập đất khoảng 5-10cm, khuấy đều cho đất tan

và để lắng, vớt sạch tàn dư, rác, rễ cỏ dại Thả cánh hoa hồng vào cốc sao cho

không có nước đọng trên mặt cánh hoa Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 3-6ngày ở nơi thoáng mát Che kín miệng cốc bằng báo hoặc giấy Theo dõi cánh

hoa qua các ngày sau đó, nếu xuất hiện cánh hoa bị nhiễm Phytophthora, khêu

bào tử ở phần cánh hoa hồng bị nhiễm bệnh soi trên kính hiển vi để thấy đượcbào tử của tác nhân gây bệnh, tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh sau đó cấychuyển sang môi trường PDA để làm thuần tác nhân gây bệnh

- Kỹ thuật cấy chuyển: Khử trùng que cấy bằng cồn 95 trên ngọn lửa đèn

cồn, dùng que cấy để nguội để cắt phần sợi Phytophthpra sp Đặt sang môi

trường PDA đã chuẩn bị, hơi ấn nhẹ để sợi nấm tiếp xúc với môi trường

3.3.6 Xác định nấm gây bệnh tàn lụi bằng kĩ thuật PCR, giải trình tự vùng ITS của nấm và phân tích trình tự

3.3.6.1 Chiết DNA mẫu nấm

Lấy mẫu nấm được cấy thuần sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA ởnhiệt độ phòng thí nghiệm 25-27°C Chiết DNA của nấm theo phương phápCTAB (Cetyltrimethylammoniumbromide) của Doyle and Doyle (1987):

Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB:

+ Ủ đệm CTAB ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút

+ Cạo sợi nấm cho vào tube 1.5ml, cho 200µl CTAB vào rồi nghiền

nhuyễn, sau đó cho thêm 500µl CTAB

+ Đem ủ ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút sau đó để nguội, ly tâm trong 5phút

+ Hút 700µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương

Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút

+ Hút 500 - 600µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút

+ Hút 400µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương