Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng parvovirus gây bệnh trên chó tại hà nội

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Pha ̣m Hồng Ngo ̣c Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của mô ̣t số chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nộ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG NGỌC

“NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA MỘT SỐ CHỦNG PARVOVIRUS GÂY BỆNH TRÊN CHÓ

TẠI HÀ NỘI”

Ngành:

Mã số:

Người hướng dẫn khoa ho ̣c:

Công nghê ̣ sinh ho ̣c

60 42 02 01

TS Nguyễn Hữu Đức

TS Đoàn Thi ̣ Thanh Hương

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả

nêu trong luâ ̣n văn này là trung thực và chưa từng dùng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin được trích dẫn trong luâ ̣n văn này đều được

chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS Đoàn Thị Thanh Hương – Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học và TS Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh ho ̣c Động Vâ ̣t, Khoa Công nghê ̣ sinh ho ̣c, Học viện Nông nghiệp Việt Nam là những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện luâ ̣n văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các cô chú, anh chi ̣ cán bộ phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học đã luôn tận tình chỉ bảo, động viên và cho tôi những lời khuyên quý báu trong công việc cũng như cuộc sống

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi cũng xin được cảm ơn sự tài trợ của quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) cho đề tài mã số 106.02-2017.10 do TS Đoàn Thị Thanh Hương làm chủ nhiệm đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ và toàn thể những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mu ̣c bảng v

Danh mu ̣c hı̀nh vi

Danh mu ̣c chữ viết tắt vii

Trı́ch yếu luâ ̣n văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Mục tiêu 2

1.2 Nội dung 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu về canine parvovirus 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 4

2.2 Đặc điểm sinh học của parvovirus 4

2.2.1 Cấu tạo chung 4

2.2.2 Vị trí xếp loại 6

2.2.3 Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2 6

2.2.4 Con đường xâm nhập và cách lây lan 8

2.2.5 Cơ chế gây bệnh 8

2.2.6 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 9

2.2.7 Các phương pháp chẩn đoán 10

2.2.8 Vaccine phòng bệnh 11

Phần 3 Vật liệu và phương pháp 12

3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 12

3.2 Vật liệu nghiên cứu 12

3.2.1 Nguyên liệu 12

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 12

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu 14

3.3.2 Phương pháp tách chiết dna tổng số 14

3.3.3 Phương pháp PCR 16

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 17

3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 18

3.3.6 Phân tích và xử lý số liệu 18

Phần 4 Kết quả và thảo luận 20

4.1 Kết quả thu nhâ ̣n dna tổng số 20

4.2 Kết quả thu nhâ ̣n chuỗi gen VP2 20

4.3 Kết quả giải trı̀nh tự và truy câ ̣p ngân hàng gen xác đi ̣nh chủng CPV 21

4.3.1 Trı̀nh tự chuỗi gen Vp2 của mẫu TH1-VN 21

4.3.2 Trı̀nh tự chuỗi gen VP2 của mẫu TH2-VN 24

4.3.3 Trı̀nh tự chuỗi gen VP2 của mẫu HN-VN 27

4.4 Phân tı́ch mức đô ̣ đồng nhất về nucleotide giữa các mẫu CPV hà nô ̣i so với các chủng trên thế giới 30

Phần 5 Kết luận và kiến nghi ̣ 42

5.1 Kết luâ ̣n 42

5.2 Kiến nghi ̣ 42

Tài liệu tham khảo 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu thâ ̣p được 12

Bảng 3.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số 15

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR 17

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 17

Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 18

Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sử du ̣ng trong nghiên cứu 19

Bảng 4.1 Nồng đô ̣ DNA của các chủng nghiên cứu 20

Bảng 4.2 Bảng so sánh tỷ lê ̣ đồng nhất nucleotide và tỷ lê ̣ tương đồng amino acid của các chủng CPV 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc capsid của CPV 5

Hình 2.2 Một số quá trình tiến hoá của CPV-2 ở chó 7

Hı̀nh 2.3 Vi ̣ trı́ Parvovirus tấn công trên các nhung mao ruô ̣t gây xuất huyết niêm ma ̣c ruô ̣t 9

Hình 2.4 Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó 10

Hı̀nh 3.1 Mô ̣t sô trang thiết bi ̣ trong phòng thı́ nghiê ̣m 13

Hı̀nh 3.2 Sơ đồ quy trı̀nh thı́ nghiê ̣m 17

Hı̀nh 4.1 Kết quả điê ̣n di sản phẩm PCR thu nhận vùng gen VP2 20

Hı̀nh 4.2 Kết quả BLAST mẫu TH1-VN 23

Hı̀nh 4.3 Kết quả BLAST của mẫu TH2-VN 26

Hı̀nh 4.4 Kết quả BLAST của mẫu HN-VN 29

Hình 4.5 So sánh trình tự chuỗi nucleotide của gen VP2 các mẫu CPV phân lập tại Hà Nô ̣i – Việt Nam với các chủng trên thế giới 35

Hình 4.6 So sánh trình tự chuỗi amino acid của gen VP2 các mẫu CPV phân lập tại Hà Nô ̣i – Việt Nam với các chủng trên thế giới 38

Hình 4.7 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài và genotype giữa các chủng CPV nghiên cứu và các chủng CPV khác 38

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Pha ̣m Hồng Ngo ̣c

Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của mô ̣t số

chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Giải mã toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội

Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưu hành

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 03 nô ̣i dung là giải mã gen kháng nguyên VP2, xác đi ̣nh kiểu gen và mối quan hê ̣ di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội Vâ ̣t liệu nghiên cứu là phân của chó nghi nhiễm Parvovirus được thu nhâ ̣n tại các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nô ̣i Nghiên cứu sử du ̣ng các phương pháp sinh học phân tử bao gồm tách chiết DNA tổng số, PCR, điê ̣n di, giải trı̀nh tự trực tiếp, so sánh trı̀nh tự nucleotide với các chủng của thế giới và xây dựng cây phân loa ̣i bằng các phần mềm tin sinh ho ̣c

Kết quả chính và kết luận

Thu nhâ ̣n và giải trı̀nh tự toàn bô ̣ chuỗi gen VP2 (gồm 1755 bp, mã hóa cho 584 amino acid) của ba mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội Xác đi ̣nh được kiểu gen của ba mẫu trong nghiên cứu là CPV-2c và có tỷ lệ đồng nhất cao về nucleotide (từ 98% đến 100%) so với các chủng trên thế giới Xây dựng được cây phả hê ̣ nguồn gốc của ba mẫu CPV thu nhận ta ̣i Hà Nô ̣i với 30 chủng CPV trên thế giới Từ đó, xác đi ̣nh ba mẫu trong nghiên cứu có sự tương đồng cao với các chủng CPV Trung Quốc về mă ̣t di truyền

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Hong Ngoc

Thesis title: Molecular characterization and phylogenic analysis of Canine Parvovirus

strains collected from Hanoi

Materials and Methods

The study includes 3 contents: sequencing antigen VP2, identifying genotypes and genetic relationships of some CPV strains in Ha Noi Research materials are the faecal samples from parvovirus suspected dogs collected in Hanoi The study uses molecular biological methods including total DNA extraction, PCR, electrophoresis, sequencing, comparing nucleotide sequences and phylogenetic analysis base on using bioinformatic software

Main findings and conclusions

Collecting and sequencing the entire VP2 gene (including 1755 bp, encoded for

584 amino acids) of the three CPV samples collected in Hanoi The gene of the three samples was identified as CPV-2c and had a high similarity (from 98% to 100%) compared to the orther strains in the world Phylogenetic analysis was built with three CPV samples collected in Hanoi and 30 CPV strains in the world Three samples in the study were identified to has a high similarity to the genetically Chinese CPV strains

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Bệnh Parvo là một bệnh truyền nhiễm rất nghiêm trọng và nguy hiểm, có tỷ

lệ tử vong cao ở chó Nguyên nhân của bệnh do Canine Parvovirus type 2 2) gây ra với đặc trưng là các dấu hiệu sốt, biếng ăn, giảm căn, viêm dạ dày, ruột Triệu chứng lâm sàng rõ ràng nhất ở chó con là nôn mửa, tiêu chảy

Bệnh xuất hiện lần đầu tiên vào những năm 1970, lây nhiễm cho những con chó nuôi trong nhà và nhanh chóng lan rộng trên toàn thế giới, và được xác định là do CPV type 2 (CPV-2) gây ra Tuy nhiên, cuối những năm 1980, genotype CPV-2 đã hoàn toàn bị thay thế bởi một loại biến thể kháng nguyên mới, được gọi là CPV-2a Các tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở

protein VP2 giữa các chủng CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al., 1991)

Tiếp theo, trong khoảng thời gian từ năm 1984 đến năm 2000, trên thế giới, đã xuất hiện thêm các biến thể mới bao gồm CPV-2b và CPV-2c Trong đó CPV-2b

lần đầu tiên được phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al.,, 1991) và CPV-2c lần đầu tiên được phát hiện năm 2000 tại Italia (Buonavoglia et al., 2001) Ở

Châu Á, các công bố về CPV vẫn còn hạn chế Các công bố gần đây cho thấy

CPV-2a và CPV-2b đã có mặt tại Trung Quốc (Zhong et al., 2014), CPV-2b có mặt ở Hàn Quốc (Park et al., 2012) và CPV-2c có mặt ở Đài Loan (Chiang et al.,

2016) Tại Việt Nam, cho đến nay, các nghiên cứu về canine parvovirus chưa có nhiều, và mới chỉ tập trung ở các nghiên cứu về bệnh lý và triệu chứng lâm sàng (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao KEONAM, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010) Nghiên cứu về sinh học phân tử của CPV-2 được Nakamura và cộng sự tiến hành từ 2004 trên

các mẫu bệnh phẩm của chó và mèo tại thành phố Hồ Chí Minh (Nakamura et al.,

2004) Nghiên cứu này chỉ phát hiện có sự lưu hành của duy nhất biến thể 2b và cho rằng đây là loại virus phổ biến tại Việt Nam Cũng tại thành phố Hồ Chí Minh, công bố năm 2018 của Nguyễn Văn Dũng và cộng sự đã xác định các chủng CPV đang lưu hành thuộc CPV-2c Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về CPV tại các địa phương khác của Việt Nam ngoài thành phố

CPV-Hồ Chí Minh

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc tính phân

tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng Parvovirus gây bệnh trên

chó tại Hà Nội” nhằm xác định các genotype CPV gây bệnh trên chó đang lưu

hành tại Hà Nội

1.1 MỤC TIÊU

Giải mã toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại

Hà Nội Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưu hành

1.2 NỘI DUNG

- Giải mã gen kháng nguyên VP2 của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội

- Xác định kiểu gen của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội

- Xác định mối quan hệ di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại

Hà Nội với các chủng CPV trên thế giới

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ CANINE PARVOVIRUS

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong những năm 1970, CPV-2 xuất hiện như một loại virus mới đối với chó nuôi trong nhà, và lan rộng sang châu Á, Úc, New Zealand, châu Mỹ và châu Âu vào

đầu năm 1978 (Parrish et al., 1988, 1999) Loại virus này được xác định là CPV-2 để

phân biệt nó với virus nguyên thủy (MVC) hay còn được gọi là CPV type 1 (CPV-1)

(Carmichael et al., 1994) Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài cho thấy CPV-2 có

khả năng xuất hiện vài năm trước khi lan rộng toàn cầu trên chó vào năm 1978 và

1979 (Parrish et al., 1988; Shackelton et al., 2005; Hoelzer et al., 2008b) Kết quả

kiểm tra kháng thể cho thấy có sự xuất hiện của CPV-2 ở Hy Lạp và Bỉ từ năm 1974

đến năm 1976 (Schwers et al., 1979; Koptoulos et al., 1986), trong khi lần đầu phát

hiện CPV-2 ở Mỹ, Nhật Bản và Úc vào đầu năm 1978 (Parrish, 1999) Kể từ đấy, virus đã phổ biến trên chó trên toàn cầu (Parrish, 1999) Năm 1979, những con sói

hoang dã ở Mỹ cũng bị lây nhiễm nặng (Thomas et al., 1984)

Tuy nhiên, chỉ sau khi xuất hiện từ 2-3 năm, CPV-2a đã thay thế toàn bộ

CPV-2 ở các nước này cũng như ở Pháp và Đan Mạch (Parrish et al., 1988) Các

tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa các chủng

CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al., 1991)

Ngoài loại kháng nguyên CPV-2a, còn có hai loại biến thể kháng nguyên khác là CPV-2b (hoặc VP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu) CPV-2b lần

đầu tiên được phát hiện năm1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được nhận dạng năm 2000 tại Ý (Buonavoglia et al., 2001) Tuy nhiên, theo nghiên cứu

của Decaro và cs năm 2007 cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm 1996 Đây là bằng chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 năm trước khi được phát hiện lần đầu tiên ở Ý

Kiểm tra huyết thanh thu được từ chó sói hoang dã (Canis latrans) giữa

năm 1979 và 1984 tại Mỹ cũng chỉ ra rằng chúng ban đầu đã bị nhiễm CPV-2

(Thomas et al., 1984), nhưng sau năm 1980 chó sói con đã bị nhiễm với CPV-2a

và CPV-2b (Parrish et al.,1988)

Các kiểu gen khác nhau của CPV-2 được xác định ở một số vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên VP2 Cụ thể như sau: giữa CPV-2a và CPV-2 được

phân biệt ở bốn vị trí Leu 87 Met, Thr 101 Ile, Gly 300 Ala và Tyr 305 Asp Giữa các genotype CPV-2a, 2b và 2c được xác định ở vị trí 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c), là vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên

VP2 của parvovirus (Martella et al., 2006; Miranda and Thompson, 2016) Mặc

dù các triệu chứng lâm sàng của chó nhiễm CPV-2c cũng tương tự như với chó nhiễm CVP-2a và CPV-2b bao gồm chán ăn, nôn mửa, viêm dạ dày, ruột cấp tính, tiêu chảy, đi ngoài ra máu nhưng mức độ bệnh nặng hơn và nguy hiểm hơn

(Aldaz et al., 2013; Decaro et al.,, 2008)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Cho đến hiện nay, đã có một số nghiên cứu về bệnh Parvo trên chó, tuy nhiên các nghiên cứu này mới chủ yếu tập trung vào khảo sát tỉ lệ nhiễm bệnh ở

một số tỉnh và khu vực (Trần Ngọc Bích et al., 2013; Nguyễn Thị Yến Mai et al.,

2018) Những nghiên cứu về virus gây bệnh, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh học phân tử chưa có nhiều

Nakamura et al., 2004 đã công bố một nghiên cứu trên các mẫu CPV của

chó và mèo Nghiên cứu này đã cho thấy có sự xuất hiện của chủng CPV-2b xuất hiện ở Việt Nam Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thể sẽ có sự tiến hóa của chủng CPV tại Việt Nam Khảo sát mới nhất trên chó ta ̣i thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 2 chủng CPV-2a và CPV-2c đang lưu hành trong đó CPV-2c có xu hướng vượt trội (Nguyễn Văn Dũng, 2017; Nguyễn Văn Dũng và cs., 2018) Nghiên cứu gần đây của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự đã phát hiê ̣n chủng Parvovirus type 2c đang lưu hành ta ̣i Hà Nội (Đoàn Thi ̣ Thanh Hương và cs., 2018)

2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS

2.2.1 Cấu tạo chung

Canine Parvovirus có đường kính nhỏ (~25 nm), không có vỏ bao

phủ Cấu trúc ba chiều của CPV-2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao et

al., 1991; Xie and Chapman, 1996) Loại virus này có bộ gen DNA thẳng, sợi

đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF) Một trong số

đó mã hóa các protein không cấu trúc NS1NS2 và một khung khác mã hóa hai protein cấu trúc khác VP1 và VP2 Ở hai đầu của hệ gen, cấu trúc kẹp tóc đọc xuôi ngược giống nhau có 150 base được sử dụng cho việc tái bản DNA virus

(Reed et al., 1988; Parrish, 1999)

Capsid chứa 60 tiểu đơn vị protein của VP1 (5-6 bản) và VP2 (54-55 bản), những protein khác có chung cấu trúc Các vùng mã hóa cho VP1 (727 amino acid) và VP2 (584 amino acid) chồng lên nhau, trừ một vùng đầu N duy nhất có

143 amino acid ở VP1 (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993) Hai protein cấu trúc được tạo ra bằng cách nối tiếp các mRNA của virus (Reedet et al., 1988; Wang et al., 1998; Parrish and Kawaoka, 2005) Protein VP2 có thể được cắt gần

đầu N của nó bằng các proteaza của vật chủ để tạo ra một protein cấu trúc khác, VP3, chỉ xuất hiện trong các virion hoàn chỉnh (chứa DNA)

Các protein capsid có một lõi trung tâm gồm tám đoạn xoắn, β-barrel không song song với vòng linh hoạt giữa các sợi β tương tác để tạo thành hầu hết các capsid bề mặt Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhọn dài 22 Å trên trục gấp ba lần, một trũng sâu 15 Å (hẻm núi) xung quanh cấu trúc hình trụ ở trục gấp năm lần và một trũng sâu 15 Å (chỗ trũng) ở trục gấp hai lần Ngoài ra, trục gấp ba lần là vùng kháng nguyên nhất của capsid và hoạt động như một mục tiêu để

trung hòa các kháng thể (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993)

Hình 2.1 Cấu trúc capsid của CPV (Xie Q và Chapman, 1996)

Nguồn: http://www.virology.wisc.edu/virusworld/images/cpv-pymol_surf01.jpg

2.2.2 Vị trí xếp loại

CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, đã được đưa vào trong loài Carnivore protoparvovirus 1 theo Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (Tijssen et

al., 2011)

2.2.3 Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2

Mối quan hệ phát sinh loài giữa các CPV-2 phân lập từ chó và các virus từ mèo (FPV), chồn (MEV), chó gấu mèo (RDPV) và cáo xanh (BFPV) cho thấy rằng tất cả các chủng CPV xuất phát từ một tổ tiên chung và các chủng này rất giống với

virus từ các động vật hoang dã bao gồm gấu mèo và cáo (Allison et al., 2012, 2013)

CPV-2 có khả năng xuất hiện khi có đột biến cho phép liên kết với thụ thể

transferrin của chó (TfR) type 1 (Truyen et al., 1996a; Shackelton et al., 2005; Allison et al., 2012) Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng TfR đóng vai trò quan trọng trong tính nhạy cảm của các tế bào nhiễm virus này (Hueffer et al., 2003; Palemo et al., 2006)

CPV-2 và FPV giống nhau 98% trình tự DNA, nhưng có các vật chủ riêng, tính kháng nguyên và haemagglutination (HA) được kiểm soát bởi capsid protein

(Chang et al., 1992; Truyen et al., 1995; Shackelton et al., 2005) Việc trao đổi

chéo thành công và thích nghi với vật chủ mới có liên quan đến sự thay đổi một

vài amino acid (Truyen et al.,1995) Sự thay đổi về gen này đã đủ để CPV-2 có được vật chủ chó, nhưng lại mất khả năng tái bản trên mèo (Chang et al., 1992;

Truyen and Parrish, 1992) Ba sự khác biệt ở VP2 amino acid 93 (Lys sang Asn),

103 (Val sang Ala), 323 (Asp sang Asn) giữa FPV và CPV-2 bắt đầu cho sự thay đổi vật chủ sang chó Sự thay đổi của VP2 amino acid 80 (Lys sang Arg), 564 (Asn sang Ser) và 568 (Ala sang Gly) liên quan đến việc mất khả năng tái bản

trên mèo (Truyen et al., 1994) và được thể hiện ở Hình 2.2 Tuy nhiên, amino

acid 232 (Val sang Ile) và 375 (Asp sang Asn) cũng thay đổi giữa các trình tự của FPV và CPV-2 Biến thể amino acid 375 chỉ tìm được một số dòng phân lập ban đầu của CPV-2 và các biến thể sau của CPV lại quay về Asp, có thể thấy 375Asn không quan tro ̣ng trong viê ̣c thay đổi vâ ̣t chủ từ mèo sang chó của CPV trong tự nhiên Mă ̣t khác, amino acid VP2 375 cùng với VP2 323 xác định độ pH

của HA (Parrish, 1991a,b; Chang et al., 1992)

Sự tiến hóa toàn cầu trong tự nhiên của CPV-2 bằng CPV-2a trong thời gian

2-3 năm cho thấy CPV-2a có lợi thế dịch tễ học mạnh mẽ hơn CPV-2 (Parrish et al.,

1988) CPV-2a trở thành dòng chủ yếu mới và trải qua quá trình tiến hóa xa hơn

nữa, tăng số đột biến điểm trong nhiều dòng khác Một vài đột biến đã làm thay đổi

tính kháng nguyên của capsid và có tần số cao trong quần thể virus (Maya et al.,

2013) Chủng CPV-2a xuất hiện năm 1979 chỉ khác năm hoặc sáu amino acid so với

CPV-2 (Parrish et al., 1991b) Sự thay đổi amino acid 87 (Met sang Leu), 300 (Ala

sang Gly) và 305 (Asp sang Tyr) cho phép CPV-2a tái bản được trên mèo (hình 2.2) Các thay đổi khác cũng xảy ra trong gene protein capsid giữa CPV-2 gốc và CPV-

2a, amino acid 101 (Ile sang Thr), 297 (Ser sang Ala) và 555 (Val sang Ile) (Tsao et

al., 1991; Agbandje et al., 1993; Truyen et al.,1996a)

Hình 2.2 Một số quá trình tiến hoá của CPV-2 ở chó

Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27389721

Chú thích: Các số trên hình là vị trí amino acid của CPV và FPV

Ngoài CPV-2a, còn có hai loại biến thể kháng nguyên khác là CPV-2b (hoặc VP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu) CPV-2b lần đầu tiên được

phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được phát hiện tại

Ý năm 2000 (Buonavoglia et al., 2001) Tuy nhiên, nghiên cứu của Decaro và cs

cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm 1996, do đó cung cấp bằng chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 năm trước khi được phát

hiện ở Ý (Decaro et al., 2007)

Sự khác biệt giữa ba loại biến thể kháng nguyên có liên quan sự thay đổi tại vị trí amino acid 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c) Sự đột biến này ảnh hưởng đến vùng kháng nguyên chính (nhân tố quyết định kháng nguyên A), nằm trong protein VP2

Từ phân tích trình tự DNA của CPV-2a và CPV-2b, đã cho thấy biến thể thứ hai khác biệt chỉ có hai amino acid so với biến thể đầu tiên trong protein VP2 Hai thay đổi cụ thể của CPV-2b đã dẫn đến sự khác biệt ở VP2 426 và 555 trong vùng VP2 (Hình 2.2) Tuy nhiên, chỉ có sự khác biệt ở amino acid 426

đươ ̣c công nhận là nhân tố quyết định kháng nguyên cho CPV-2b (Parrish et al.,

1991b) Vì CPV-2b và CPV-2c khác với CPV-2a chỉ ở một vị trí duy nhất (VP2 426), hiện nay một số tác giả chỉ coi chúng là các biến thể của CPV-2a thay cho

các dòng phụ (Organtini et al., 2015)

2.2.4 Con đường xâm nhập và cách lây lan

Canine Parvovirus lây lan qua tiếp xúc miệng với phân bị nhiễm hoặc bề mặt

bị ô nhiễm (ví dụ: đất, giày, đồ chơi cho chó, v.v.) Nguồn nhiễm trùng CPV là chất thải phân của chó bị nhiễm bệnh CPV có thể được tìm thấy ở những nơi có chó xuất hiện như: chuồng nuôi, cửa hàng vật nuôi, nơi trú ẩn, công viên và sân chơi (Black

et al., 1979) Chó bị nhốt trong nhà và không tiếp xúc với những con chó khác có ít

cơ hội tiếp xúc với CPV hơn Nó dễ dàng truyền qua lông hoặc bàn chân của những con chó bị nhiễm bệnh và các vật thể bị ô nhiễm như lồng hoặc giày

CPV có thể tồn tại trong đất 5 tháng hoặc hơn nếu điều kiện thuận lợi Phân của những con chó bị nhiễm bệnh làm ô nhiễm những nơi như bệnh viện thú y, cửa hàng thú cưng, chuồng trại và các cơ sở sản xuất giống thương mại Những

cơ sở bị ô nhiễm này là nguồn lây nhiễm thứ cấp cho những chú chó nhạy cảm

(Jacob et al., 1980)

2.2.5 Cơ chế gây bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua miệng khi chó con ăn thức ăn nhiễm nguồn bệnh hoặc tiếp xúc với các bề mặt đã từng tiếp xúc với nguồn bệnh Thời gian ủ bệnh trong 3–7 ngày trước khi biểu hiện ra bên ngoài

Khi xâm nhập vào cơ thể, virus tái bản với số lượng lớn trong các hạch

bạch huyết (Stann et al., 1984) Sau vài ngày, lượng virus đáng kể đã được giải

phóng vào máu Trong 3–4 ngày tiếp theo, các virus này đi đến các cơ quan có chứa các tế bào phân chia nhanh chóng như tủy xương và các tế bào đường ruột

nhạy bén và tạo thành các cơ quan bao gồm bạch cầu hạt nhân eosinophilic lớn Trong tủy xương, virus phá hủy các tế bào mới của hệ thống miễn dịch và sau đó loại bỏ cơ chế bảo vệ tốt nhất của cơ thể

Hı̀nh 2.3 Vi ̣ trı́ Parvovirus tấn công trên các nhung mao ruô ̣t

gây xuất huyết niêm ma ̣c ruô ̣t

Nguồn: Canine Parvovirus Infection and Other Viral Enteritides Virus gây ra nhiều tổn hại nhất ở đường tiêu hóa Trong thành ruột chứa nhiều nhung mao và vi nhung mao, giúp tăng diện tích tiếp xúc và dễ dàng hấp thu các chất dinh dưỡng Virus tấn công các hốc Lieberkuhn (Hı̀nh 2.3), gây hoại

tử biểu mô ruột và bào mòn các nhung mao không thể hấp thu các chất dinh dưỡng và gây ra hiện tượng tiêu chảy (McCandlish, 1981) Khi hàng rào ngăn cách vi khuẩn tiêu hóa bị phá vỡ, sẽ xuất hiện hiện tượng tiêu chảy có máu và vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể gây nhiễm trùng lan rộng CPV gây tiêu chảy

và nôn mửa dẫn đến mất nước nghiêm trọng và tử vong

2.2.6 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

Triệu chứng lâm sàng ở những con chó mắc bệnh Parvo là trầm cảm, chán

ăn, nôn mửa, sốt cao và tiêu chảy (Kramer et al.,, 1980) Phân lỏng, hoặc bị chảy

nước hoặc có máu trong các trường hợp bị nhiễm nặng Chó tiếp tục nôn mửa và tiêu chảy, dẫn đến tình trang nhanh chóng và tử vong Thời gian phát bệnh tùy thuộc vào lượng virus nhiễm

Các dấu hiệu lâm sàng thường xuất hiện từ 3 đến 5 ngày sau khi bị nhiễm

virus và thường kéo dài từ 5 đến 7 ngày (Fletcher et al., 1979) Tỷ lệ mắc bệnh và

tử vong thay đổi tùy theo độ tuổi của chó bị nhiễm bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh

Viêm cơ tim cũng được quan sát thấy ở các chó con mới sinh đã có các dấu

hiệu lâm sàng sau khi bị nhiễm trùng vài tuần (Meunier et al., 1984; Sime et al.,

năm 2015) Tuy nhiên, triê ̣u chứng này hiện nay khá hiếm

Hình 2.4 Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó

Nguồn: http://www.vetshop.com.vn/2013/03/benh-parvo-virus-o-cho.html

2.2.7 Các phương pháp chẩn đoán

a Chẩn đoán huyết thanh học

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Các xét nghiệm ELISA nhanh chóng, tương đối rẻ và có thể được thực hiện trong bất kỳ phòng khám thú y nên đã trở thành xét nghiê ̣m phổ biến nhất để

xác đi ̣nh parvovirus ở chó con (Waner et al., 2003)

Ngoài ELISA, xét nghiê ̣m ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination – HA) cũng là mô ̣t xét nghiê ̣m đơn giản và nhanh chóng để phát hiện CPV trong phân

(Carmichael et al., 1980)

b Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử

Gần đây, kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng như một công cụ để chẩn đoán nhiễm trùng parvovirus trên chó Phương pháp này cho chẩn đoán nhanh chóng và chính xác Ngoài ra, PCR còn có thể được xác đi ̣nh được kiểu gen của chủng virus gây bê ̣nh bằng viê ̣c sử du ̣ng các că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u

Các sản phẩm PCR còn được sử du ̣ng để giải trı̀nh tự trực tiếp cho kết quả là các trı̀nh tự nucleotide Cùng với viê ̣c sử du ̣ng các phần mềm sinh ho ̣c, có thể xác đi ̣nh được tỷ lê ̣ tương đồng và phân tı́ch nguồn gốc phả hê ̣ của các chủng CPV-2 từ các khu vực đi ̣a lý khác nhau trên thế giới Từ đó cũng có thể xác đi ̣nh đươ ̣c đường hướng tiến hóa của virus

2.2.8 Vaccine phòng bệnh

Phương pháp chính để kiểm soát bệnh ở vật nuôi trong nhà là tiêm chủng Sau khi xuất hiện bệnh, vaccine dựa trên virus sống đã sớm phát triển, loại vaccine CPV đầu tiên có mặt vào năm 1979

Các loại vaccine này có vẻ an toàn và mang lại khả năng miễn dịch bảo vệ và kiểm soát được bệnh Tuy nhiên, virus vẫn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và nếu những con chó con không được tiêm chủng và hoặc do kháng thể của mẹ can thiệp vào tiêm chủng thì chúng trở thành nhiễm bệnh tự nhiên (Parrish, 1999) Nghiên cứu thực nghiê ̣m năm 2014 của Wilson cho thấy tiêm vaccine chủng CPV-2b sẽ bảo vệ chéo chống la ̣i cả chủng CPV-2a và CPV-2c, thậm chı́

là cả chủng CPV-2 hiê ̣n đã không còn xuất hiê ̣n nhiều (Wilson et al., 2014)

Đô ̣ tuổi khuyến cáo nên tiêm chủng vaccine phòng ngừa CPV là từ 10 – 12

tuần tuổi, muô ̣n nhất là 16 tuần tuổi đối với tất cả các vaccine CPV (Alman et al.,

2017) Ngoài ra, trong nghiên cứu mới đây nhất của Jin và cs cho thấy vi ̣ trı́ tiêm

vaccine ta ̣i huyê ̣t houhai tăng khả năng miễn di ̣ch ở chó (Jin et al., 2019)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2018 – 05/2019

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nguyên liệu

Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng khám thú y Hà Nội

Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng

trong nghiên cứu giải mã gen

STT Kí hiệu Giống Tuổi Triệu chứng

điển hình

Mẫu bệnh phẩm

Tiêm chủng

1 TH1-VN Fox 3 tháng Tiêu chảy, phân lẫn máu Phân và nước phân

Không

chảy

Phân và nước phân

- Máy ly tâm Centrifuge 5415D (Eppendorf, Đức)

- Máy PCR GeneAtlas 322 (Astec, Nhâ ̣t Bản);

- Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Bio-Rad, Mỹ);

- Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ);

- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy Votex VM-10 (Daihan, Hàn Quốc)

- Máy vi tı́nh (HP, Mỹ)

- Lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc)

Hı̀nh 3.1 Mô ̣t sô trang thiết bi ̣ trong phòng thı́ nghiê ̣m

- Bộ Kit Dream Taq PCR master mix của hãng Thermo (Mỹ)

- Bộ Kit tinh sạch GeneJET PCR purification Kit và GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo (Mỹ)

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hı̀nh 3.2 Sơ đồ quy trı̀nh thı́ nghiê ̣m 3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễm Parvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội

Các mẫu này đã được chấn đoán sơ bộ bằng quan sát triệu chứng lâm sàng

và kiểm tra bệnh tích Tiếp đó được xác định dương tính với CPV bằng bộ kit chẩn đoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit Blot Test (BINOTE) tại phòng khám thú y

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -200C

3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Toàn bộ DNA tổng số được thu nhận bao gồm DNA của nhân tế bào chủ và DNA của hệ gen virus bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết DNA tổng số theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước)

Phương pháp tiến hành theo thứ tự:

1 Bổ sung 150 µl H2O vào ống eppendorf chứa tăm bông có mẫu bệnh

phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37 o C qua đêm

2 Bỏ tăm bông (vắt kiệt nước nhất có thể), bổ sung 180 µl Digest solution

và 20 µl Protease K, vortex

3 Ủ 56 o C, vortex liên tục 10 phút/lần cho đến khi dung dịch đồng nhất

4 Bổ sung 20 µl enzyme RNase A, vortex, để ở nhiệt độ phòng 10 phút

5 Bổ sung 200 µl Lysis solution, vortex cho đến khi dung dịch đồng nhất

6 Bổ sung 400 µl Ethanol 50%, vortex

7 Chuyển dịch lên cột lọc, li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

phía dưới ống hứng

8 Bổ sung 500 µl WB1, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phı́a

dưới ống hứng

9 Bổ sung 500 µl WB2, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Biến tính 94oC trong 5 phút Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp

- Giai đoạn 2: Gắn mồi 50 – 65oC trong 1 – 2 phút (tùy thuộc vào đoạn mồi) Giai đoạn này để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA khuôn

- Giai đoạn 3: Tổng hợp 68 – 72oC trong 30 giây – 2 phút Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại Quá trình này thực hiện từ 30 – 40 chu kì Sau chu kì cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72oC trong 5 – 10 phút để các sợi đơn DNA đóng xoắn lại thành mạch đôi Kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên thạch agarose 0,8 – 1% và băng DNA sẽ được nhìn thấy rõ dưới tia cực tím sau khi được nhuộm Ethidium Bromide

Cách tiến hành

Cặp mồi sử du ̣ng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên so sánh trı̀nh tự tương đồng chuỗi nucleotide của tất cả các chủng CPV-2 hiện có trên Ngân hàng gen theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương và cs., 2018

Trình tự của că ̣p mồi như sau:

Mồi xuôi CPVF2b: 5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG- 3’ (vi ̣ trı́ 2160 –

2179 của hê ̣ gen)

Mồi ngược CPVR4: 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG -3’ (vi ̣ trı́ 5023 –

5042 của hê ̣ gen)

Că ̣p mồi trên đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i vùng gen có kı́ch thước 2,9 kb chứa toàn bô ̣ gen VP2 gồm 1755 nucleotide

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3:

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel Agarose

Nguyên lý của phương pháp là: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do có các gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi, các phân tử di chuyển

từ cực âm sang cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điẹn đặc trưng của mỗi loại phân tử acid nucleic Các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím

Có hai loại gel sử dụng trong kĩ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA

Một trong các chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực

khuẩn thể Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII thành 8

phân đoạn có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,125kb Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu

1 Bổ sung dung dịch Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet

2 Chuyển dịch lên cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới

3 Bổ sung dung dịch 700 µl Wash Buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới

4 Ly tâm làm khô 13000 vòng/phút trong 2 phút

5

Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5ml để thu DNA, bổ sung 50 µl dung dịch Elution Buffer, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ cột lọc

KB and Nicholas HB, 1999)

Phân tích phả hệ nguồn gốc bằng chương trình MEGA6.06 sử dụng phương pháp “kết nối liền kề” (neighbor-joining, NJ) với hệ số tin cậy 1000 bootstrap

(Tamura et al., 2013)

Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sử du ̣ng trong nghiên cứu