Nghiên cứu về đặc điểm sinh học của nấm được thực hiện trong điều kiện in vitro như ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và pH đến sự phát triển của nấm gây bệnh.. Đã xác định đư
Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Bệnh thối gốc rễ, bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên và Miền Bắc
3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
- Giống chanh leo trồng phổ biến trong sản xuất, Phytophthora sp
- Dụng cụ trong phòng thí nghiệm gồm: Tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh, tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,
- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: Dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu,
- Môi trường nuôi cấy: WA, PGA, PCA, PSA (gồm nước cất vô trùng, agar, đường glucose, đường sucrose, khoai tây, cà rốt, đậu Hà Lan)
- Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR như đệm CTAB, cặp mồi chung ITS4 và ITS5,
- Một số thuốc trừ nấm và chế phẩm sinh học
3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
+ Một số tỉnh trồng chanh leo tại Tây Nguyên và phía Bắc (Gia Lai, Đắk Lắc, Lâm Đồng, Nghệ An, Sơn La, Hải Phòng)
+ Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh cây - khoa Nông học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam
-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2018 đến tháng 8/2019.
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra hiện trạng và mức độ bệnh chính hại trên chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên và Miền Bắc
- Điều tra mức độ bệnh thối gốc rễ, bệnh đốm nâu cây chanh leo tại một số tỉnh Tây Nguyên và Miền Bắc
- Phân lập, xác định và nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học của
Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ cây chanh leo
- Thử nghiệm hiệu lực ức chế của một số thuốc bảo vệ thực vật và chế phẩm sinh học đối với Phytophthora sp trong điều kiện in vitro.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ và diễn biến bệnh ngoài đồng ruộng
- Điều tra thành phần, mức độ phổ biến, diễn biến bệnh trên ruộng theo phương pháp điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng QCVN 01-38:2010/BNNPTNT
- Điều tra 5 điểm, mỗi điểm 50 cây theo đường chéo góc
- Đếm số cây chết, tổng số cây điều tra, tính tỷ lệ bệnh
- Thu thập mẫu lá, quả, thân, gốc, rễ có triệu chứng bệnh tại các vườn chanh leo ở các địa điểm đến điều tra
Mức độ phổ biến của bệnh hại được đánh giá:
(+) xuất hiện rất ít (tần suất bắt gặp < 5%);
(++) xuất hiện ít (tần suất bắt gặp < 5% - 10%);
(+++) xuất hiện thường xuyên (tần suất bắt gặp < 11% -50%); (++++) xuất hiện nhiều (tần suất bắt gặp > 50%)
+ Điều tra mức độ phổ biến của bệnh hại chanh leo tại các địa phương: không cố định thời gian điều tra
+ Điều tra diễn biến bệnh: tiến hành điều tra định kỳ 1 tháng/lần/khu ruộng
3.3.2 Phương pháp chẩn đoán bệnh
- Chẩn đoán bệnh ngoài đồng ruộng: Dựa vào triệu chứng biểu hiện bệnh bên ngoài điển hình Tiến hành thu thập mẫu bệnh
- Phân lập, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Kiểm tra bằng kính hiển vi và phân loại theo các tài liệu giám định bệnh
3.3.3 Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu chanh leo có triệu chứng bệnh được thu thập ở các điểm điều tra để tiến hành phân lập và xác định tác nhân gây bệnh Lấy mẫu lá có bề mặt khô ráo, nếu trong điều kiện mưa ẩm, bề mặt lá ướt thì có thể dùng giấy báo thấm khô trước khi kẹp mẫu giữa các lớp giấy báo hoặc các loại giấy thấm nước khác Khi lấy mẫu rễ hoặc mẫu quả, chọn những mẫu mới xuất hiện triệu chứng hoặc triệu chứng đang ở giai đoạn giữa của sự phát triển Gói mỗi quả bệnh vào một tờ giấy báo riêng rẽ Mỗi loại triệu chứng bệnh được cho vào bao giấy, dùng bút chì để ghi đầy đủ các chi tiết như: người thu mẫu, mã mẫu, địa điểm, thời gian thu mẫu, mức độ bệnh Bên ngoài túi mẫu ghi đầy đủ các thông tin theo nhãn mẫu
3.3.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 180°C trong 1 giờ
Cách làm: 200g khoai tây gọt sạch vỏ, cắt lát mỏng luộc nhừ với 1ít nước sau đó lọc qua 4 lớp vải màn lấy nước trong Cho nước khoai tây, đường Glucose, agar vào xong rồi quấy đều, Cho xoong lên bếp vừa đun vừa quấy đều tay cho sôi đều rồi đổ vào chai thủy tinh của hãng PYREX, hấp khử trùng ở
121 o C trong 15 phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đậy nắp lại, khi môi trường nguội thì cấy nấm vào môi trường, Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lạị bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2-3 ngày sau
* Môi trường PCA ( Potato Carot Agar)
+ Nước cất: 1000 ml + Khoai tây: 20 g + Cà rốt: 20 g + Agar: 20g
Cách làm: Giống như môi trường PDA
Cách làm : Cho 1000ml nước vào xoong, hoà Agar vào 1000ml nước, dùng đũa quấy cho agar tan đều, cho V8 - Juice, CaCO3, cho lên bếp, vừa đun vừa quấy đều tay sau khi sôi 2 phút, cho xoong ra khỏi bếp, đổ môi trường vào cho vào chai thủy tinh của hãng PYREX, vặn nắp vừa phải (không được văn chặt quá), ( hoặc bình tam giác loại 250 ml hoặc 500ml) cho vào nồi hấp, hấp khử trùng 15 phút (121 0 C, 1,5at) hấp xong lấy lọ môi trường ra khỏi nồi hấp, đổ môi trường vào các hộp lồng, đậy nắp lại, khi môi trường nguội, dùng cấy nấm Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2-3 ngày sau
Cách làm : Cho 125 g đậu Hà Lan và 1200 ml nước cất vào nồi sạch đun sôi, đun nhỏ lửa trong vòng 45 phút, lọc bằng vải lọc 4 lớp sau đó cho vào bình định mức 1 lít, hòa tan 15g agar vào bình và hấp khử trùng ở 121 o C, 1.5atm trong
30 phút, sau đó để ra ngoài môi trường đến 70 - 80 o C rồi đem đổ ra các đĩa petri được khử trùng để cấy nấm Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2
3.3.5 Phương pháp phân lập Phytophthora sp gây bệnh thối gốc rễ cây chanh leo Đối với Phytophthora sp lấy đất ở gốc cây bệnh và rễ cây bệnh hòa vào cốc nước, thả cánh hoa hồng sạch vào cốc nước, bẫy nấm bằng cánh hoa hồng, dùng môi trường PDA để phân lập nấm
Mẫu đất được lấy ở gốc của cây bị bệnh tại tầng đất mặt (từ 10 - 15cm tính từ mặt đất), sau đó cho khoảng 100g đất vào một cốc nhựa Đổ nước vô trùng hoặc nước cất vào cốc sao cho ngập đất khoảng 5-10cm, khuấy đều cho đất tan và để lắng, vớt sạch tàn dư, rác, rễ cỏ dại Thả cánh hoa hồng vào cốc sao cho không có nước đọng trên mặt cánh hoa Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 3-6 ngày ở nơi thoáng mát Che kín miệng cốc bằng báo hoặc giấy Theo dõi cánh hoa qua các ngày sau đó, nếu xuất hiện cánh hoa bị nhiễm Phytophthora, khêu bào tử ở phần cánh hoa hồng bị nhiễm bệnh soi trên kính hiển vi để thấy được bào tử của tác nhân gây bệnh, tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh sau đó cấy chuyển sang môi trường PDA để làm thuần tác nhân gây bệnh
- Kỹ thuật cấy chuyển: Khử trùng que cấy bằng cồn 95 trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy để nguội để cắt phần sợi Phytophthpra sp Đặt sang môi trường PDA đã chuẩn bị, hơi ấn nhẹ để sợi nấm tiếp xúc với môi trường
3.3.6 Xác định nấm gây bệnh tàn lụi bằng kĩ thuật PCR, giải trình tự vùng ITS của nấm và phân tích trình tự
Lấy mẫu nấm được cấy thuần sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 25-27°C Chiết DNA của nấm theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromide) của Doyle and Doyle (1987):
Thành phần đệm triết CTAB (100 ml):
+ Tris HCl 100mM (pH8): 10ml
Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB:
+ Ủ đệm CTAB ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút
+ Cạo sợi nấm cho vào tube 1.5ml, cho 200àl CTAB vào rồi nghiền nhuyễn, sau đú cho thờm 500àl CTAB
+ Đem ủ ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút sau đó để nguội, ly tâm trong 5 phút + Hỳt 700àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút
+ Hỳt 500 - 600àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút
+ Hỳt 400àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương isopeopanol vào tube, để lạnh ở -20°C ít nhất trong 30 phút
+ Lấy ra ly tâm 15 phút, bỏ dịch thu cặn
+ Rửa với cồn ethanol 70% 2 lần, spin và hút cồn ra
+ Để khô trong không khí hoặc tủ cấy trong 30 phút
+ Bổ sung 50àl đệm TE hũa tan tủa và giữ ở nhiệt độ -20°C
+ Kit 2x PCR Master mix (INtRON): 12,5 àl
+ Mồi ITS4 (White et al., 1990): 0,5 àl
+ Mồi ITS5 (White et al., 1990): 0,5 àl
+ Dựng pipet hỳt 0,5 àl DNA khuụn; 0,5 àl mồi ITS4; 0,5 àl mồi ITS5; 11 àl nước cất và 12,5 àl 2x PCR Master mix (INtRON) vào tube 0,5 ml; bỳng nhẹ vào ống để trộn đều đều hỗn hợp trên, cho vào máy ly tâm nhanh (5 giây) để hoà tan dung dịch và để dung dịch chảy xuống đáy ống
+ Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình: (94°C trong 5 phút) x 1 chu kỳ, (94°C trong 40 giây, 52°C trong 40 giây, 72°C trong 1 phút) x 35 chu kỳ, (72°C trong 5 phút) x 1 chu kỳ
+ Dừng phản ứng và để ống (tube) ở nhiệt độ phòng
+ Pha đệm điện di TAE 1x (gồm Tris base, Acetic acid, EDTA - Ethylene diamine tetra acetic acid) từ dung dịch gốc TAE 5x: lấy 100ml TAE 5x vào cốc đong, bổ sung 400ml nước cất, lắc đều
+ Bản gel: cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung thêm 100ml đệm TAE 1x, lắc đều, cho vào lò vi sóng trong 3 phút để hoà tan agarose Sau đó thêm vào 2,5 àl Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phũng Khi dung dịch nằm trong khoảng 50°C thì đổ vào khuôn đúc gel có đặt sẵn lược vào rãnh khía trên khuôn, rãnh lược cắm xuống, đổ gel dày 0,6cm Để khuôn gel ở nhiệt độ phòng cho đến khi gel đông lại (khoảng 10-15 phút)
Kết quả nghiên cứu
Kết quả điều tra thành phần bệnh, hiện trạng và diễn biến bệnh thối gốc rễ, đốm nâu lá chanh leo tại vùng Tây Nguyên, miền Trung và miền Bắc
4.1.1 Kết quả điều tra thành phần bệnh và diễn biến bệnh hại chanh leo tại vùng Tây Nguyên
Tây Nguyên (Lâm Đồng, Gia Lai, Đắk Lắc, Đắk Nông); Nghệ An (miền Trung) và một số tỉnh phía Bắc như Sơn La, Cao Bằng trong những năm gần đây đã và đang trồng cây chanh leo với diện tích rất lớn, có nhiều yếu tố làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây cũng như phát triển sản xuất, đặc biệt là bệnh hại Diễn biến phát sinh, phát triển của các loại bệnh trên đồng ruộng rất phức tạp, biến động theo thời tiết, việc điều tra thành phần bệnh hại, mức độ gây hại có ý nghĩa rất quan trọng là cơ sở khoa học để có biện pháp chăm sóc và phòng trừ bệnh đạt hiệu quả
Bảng 4.1 Tình hình bệnh hại chanh leo tại các tỉnh Tây Nguyên Địa điểm Tên bệnh Tên khoa học Bộ phận bị hại
Khảm lá Potyvirus Lá ++ Đốm lá Alternaria sp Lá +
Ghẻ quả Cladiosporum sp quả +
Ghẻ quả Cladiosporum sp quả ++
Thối gốc rễ, quả Phytophthora sp gốc rễ, quả +
Lai Khảm lá Potyvirus Lá +
Ghẻ quả Cladiosporum sp quả +
Thối rễ, quả Phytophthora sp gốc rễ, quả +++ Đắk R’Lấp, Đắk Nông
Khảm lá Potyvirus Lá ++ Đốm lá Alternaria sp Lá +
Ghẻ quả Cladiosporum sp quả +++
Kon Tum Khảm lá Potyvirus Lá ++ Đốm lá Alternaria sp Lá +
Ghẻ quả Cladiosporum sp quả +
Thối gốc rễ Phytophthora sp rễ ++
Ghi chú: +: xuất hiện rất ít tần xuất bắt gặp < 5%; ++: xuất hiện ít tần xuất bắt gặp < 5% - 10%; +++: xuất hiện thường xuyên tần xuất bắt gặp từ < 11% -50%
Trong thời gian từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 7 năm 2019, tôi tiến hành điều tra thành phần bệnh hại trên chanh leo tại các tỉnh Tây Nguyên như: Lâm Đồng, Đắk Lắc, Đắk Nông, Gia Lai, Kon Tum Điều tra, thu thập và lấy mẫu bệnh trên đồng ruộng chuyển về phòng thí nghiệm của Bộ môn Bệnh cây khoa Nông học để phân tích giám định Kết quả điều tra thành phần tại bảng 4.1 a) b) c) d) e) f)
Hình 4.1 Một số hình ảnh bệnh hại chanh leo tại Tây Nguyên a-b) Bệnh khảm lá chanh leo tại Cư M’gar, Đắk Lắk và Đơn Dương, Lâm Đồng c) Triệu chứng ghẻ quả chanh leo tại Lâm Hà, Lâm Đồng d) Bệnh đốm nâu chanh leo tại huyện Đắk R’Lấp, Đắk Nông e) Triệu chứng thối gốc rễ, chết héo tại huyện La Grai, Gia Lai và f) Triệu chứng thối quả tại Cư M’gar, Đắk Lắk.
Qua số liệu bảng 4.1 cho thấy: Tại các tỉnh Tây Nguyên, do thời gian điều tra trùng vào cuối mùa mưa và đầu mùa khô nên thành phần bệnh trên cây chanh leo tương đối ít, cụ thể như sau:
Tại Lâm Hà (Lâm Đồng), chúng tôi phát hiện 3 loại bệnh trên cây chanh leo đó là: khảm lá do Potyvirus, tuy nhiên bệnh xuất hiện ít, tần xuất bắt gặp qua các kỳ điều tra chỉ từ 5-10%, bệnh đốm lá do Alternaria sp và bệnh ghẻ quả do
Cladiosporum sp xuất hiện rất ít, tần xuất bắt gặp chỉ dưới 5%
Tại huyện Cư M’gar (Đắk Lắk), qua điều tra chúng tôi phát hiện 3 loại bệnh hại: bệnh khảm lá do Potyvirus tuy nhiên bệnh xuất hiện ít, tần xuất bắt gặp qua các kỳ điều tra chỉ từ 5-10% và bệnh thối gốc rễ do Phytophthora sp có bắt gặp nhưng tần xuất bắt gặp rất thấp (dưới 5%)
Tại huyện Đắk R’Lấp (Đắk Nông) chúng tôi phát hiện 3 loại bệnh trên cây chanh leo đó là: khảm lá do Potyvirus, bệnh xuất hiện ít, tần xuất bắt gặp qua các kỳ điều tra chỉ từ 5-10%,rất ít khi bắt gặp bệnh đốm lá do Alternaria sp., tuy nhiên chúng tôi thường xuyên bắt gặp bệnh bệnh ghẻ quả do Cladiosporum sp tần xuất bắt gặp qua các kỳ điều tra từ 11 đến 50% Các loại bệnh này ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng và mẫu mã quả, nhất là bệnh ghẻ quả, thương lái và các nhà máy đều không thu mua các quả bị bệnh này
Tại Ngọc Hồi (Kon Tum) chỉ phát hiện ba loại bệnh do nấm hại: đốm lá do
Alternaria sp., bệnh ghẻ quả do Cladiosporum sp bệnh xuất hiện rất ít, tần xuất bắt gặp