Tuyển chọn chủng nấm men saccharomyces và tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

− Để tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men các nguồn dinh dưỡng và thành phần môi trường lên men bao gồm: + Nguồn cacbon là đường glucose với nồng độ 100g/l.. − Điều kiện tố

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Kim Oanh

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trungthực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Hồng Quang

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo Học Viện NôngNghiệp Việt Nam, các thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã trang bị cho tôi nhữngkiến thức cơ bản và cần thiết, là nền tảng quan trọng cho quá trình thực tập và hoànthành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Vũ Thị Kim Oanh giảng viên KhoaCông Nghệ Thực Phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã dành nhiều thời giantrực tiếp chỉ bảo hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh Đạo và các cô, chú, anh, chị cán bộ trong ViệnCông nghiệp thực phẩm Đặc biệt là các cô, chú, anh, chị Trung tâm Hoá sinh côngnghiệp và môi trường – Viện Công nghiệp thực phẩm và đề tài “Nghiên cứu ứng dụng

và phát triển công nghệ cấp quốc gia – ĐTĐL.CN-59/15” đã tạo điều kiện thuận lợi đểtôi được tiếp cận, giao lưu học hỏi và tăng cường nhận thức của mình về nghề nghiệp

và hoàn thành đề tài này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã động viên giúp đỡtôi về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Hồng Quang

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Vai trò, nhu cầu của vi chất kẽm 3

2.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm (Zn) 3

2.1.2 Nhu cầu bổ sung kẽm của cơ thể 5

2.1.3 Tình hình sử dụng kẽm hiện nay 6

2.1.4 Phương pháp bổ sung kẽm 8

2.2 Nấm men saccharomyces và nguyên tố vi lượng kẽm 9

2.2.1 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces 9

2.2.2 Khả năng hấp thụ kẽm của nấm men 10

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 12

2.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình chuyển hoá, tích luỹ kẽm 14

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Vật liệu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Hóa chất và vật liệu 16

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 16

3.2 Nội dung 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

3.3.2 Phương pháp phân tích 20

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 21

4.1 Kết quả tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao 21

4.2 Kết quả ảnh hưởng nguồn muối kẽm khác nhau đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm 22 4.3 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng cho quá lên men 25

4.3.1 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng 25

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại 29

4.4 Kết quả lựa chọn điều kiện lên men 32

4.4.1 Kết quả lựa chọn nhiệt độ 32

4.4.2 Kết quả lựa chọn pH 33

4.4.3 Kết quả lựa chọn chế độ lắc 35

4.4.4 Kết quả tối ưu hóa điều kiện lên men 35

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

Tài liệu tham khảo 41

Phụ lục 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nhu cầu kẽm đối với những đối tượng khác nhau theo độ tuổi và

giới tính 6Bảng 2.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng nội

bào kẽm 11

Bảng 2.3 Nhu cầu khoáng đối với nấm men 15

Bảng 4.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh khối của 15

chủng có khả năng tích lũy kẽm cao 22

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng bổ sung khoáng chất tới khối lượng sinh khối

khô và hàm lượng kẽm tích lũy30

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng

Bảng 4.9 Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy sau lên men ở

các điều kiện khác nhau 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới 7

Hình 2.2 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 10

Hình 2.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men 12

Hình 4.1 Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men được

sàng lọc 21

Hình 4.2 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới khối lượng sinh khối

khô và hàm lượng kẽm tích lũy24

Hình 4.3 Ảnh hưởng bởi nồng độ glucose tới khối lượng sinh khối khô và hàm

Hình 4.6 Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối (A), khối

lượng sinh khối (B) và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm 37

Hình 4.7 Điều kiện tối ưu và hiệu xuất dự kiến bởi phần mềm JMP 39

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lê Hồng Quang

Tên Luận văn: Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện

lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.

Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8 54 01 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt

Nam Mục đích nghiên cứu

- Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ kẽm

cao từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm

- Tối ưu hoá điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong

tế bào nấm men, sinh khối nấm men trên tất cả các thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Môi trường lên men có bổ sung muối Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l,

tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men thực hiện trong bình tam giác 250ml với thểtích môi trường lên men là 100ml Điều kiện lên men được tiến hành trong máy lắc

150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ

- Thí nghiệm 2: Các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2.Với các dải nồng độ: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên mencó: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết man, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose với tỷ lệtiếp giống là 10% Thí nghiệm tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về6,0; lên men ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút Sau đó khảo sát thời điểm

bổ sung muối kẽm tại 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất

- Thí nghiệm 3:

 Các nguồn cacbon khảo sát: Glucose, galactose, frutose, lactose, maltose,sucrose với nồng độ 10g/l được thêm vào môi trường có: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịchchiết man, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 với 10% tỷ lệ tiếp giống Tiếp đó khảo sátnồng độ cacbon thích hợp ở 10, 50, 100, 150g/l Quá trình lên men được tiến hành ở28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

 Nguồn nitơ khảo sát: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, 10g/lmỗi loại được bổ sung vào môi trường có: 3g/l dịch chiết man, 10g/l glucose, 1g/lZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10% Tiếp tục khảo sát nồng độ nitơ thích hợp với các mức5; 10; 15; 20g/l để xác định nồng độ phù hợp Quá trình lên men được tiến hành ở28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

+ Nguồn ion kim loại khảo sát là: MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 1,5 g/l; KH2PO4với nồng độ: 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l được bổ sungvào môi trường lên men có 1g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lênmen được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.

- Thí nghiệm 4: Sử dụng 100ml môi trường YM có bổ sung 1 g/l ZnSO 4 trong bình tam giác 250ml pH của dịch môi trường trước lên men được khảo sát tại: từ 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 hiệu chỉnh bằng dung dịch H 2 SO 4 0,1M hoặc NaOH 0,1M Các mức

nhiệt độ là 25, 28, 30, 35 oC Các chế độ lắc khảo sát là: 0, 50, 100, 150, 200

vòng/phút để tìm ra điều kiện thích hợp nhất

- Thí nghiệm 5: Sau khi nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môitrường, điều kiện lên men phù hợp tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấyvới 3 yếu tố ảnh hưởng nhiều Việc thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu cho quá trìnhtối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0

Phương pháp phân tích: Phân tích hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấm men bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ở bước sóng 213,9 nm

Kết quả chính và kết luận

− Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces, chủng S.cerevisiae CNTP 4087

được sàng lọc có khả năng tích luỹ kẽm cao trong sinh khối đạt 8,91 mg/g sinh khốikhô

− Nguồn muối kẽm sử dụng cho quá trình lên men là muối ZnSO4 với nồng độ 1g/l được bổ sung vào thời điểm 9h tính từ lúc bắt đầu quá trình lên men

− Để tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men các nguồn dinh dưỡng và thành phần môi trường lên men bao gồm:

+ Nguồn cacbon là đường glucose với nồng độ 100g/l.

+ Nguồn nitơ là cao nấm men với nồng độ 10g/l.

+ Ion kim loại được bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao gồm: MgSO 4 với nồng độ 0,5g/l, KH 2 PO 4 với nồng độ 3g/l và Fe 2 (SO 4 ) 3 với nồng độ 0,5g/l.

− Điều kiện lên men gồm: Nhiệt độ lên men là 30oC, pH môi trường là 6,5 và chế độ lắc là 150 vòng/phút

− Điều kiện tối ưu quá trình lên men cho hàm lượng kẽm trong sinh khối khô đạt

12 mg/g và lượng sinh khối nấm men thu được là cao nhất bao gồm: Nồng độ kẽmtrong môi trường nuôi cấy: 1,5 g/l, nồng độ glucose: 100 g/l và cao nấm men: 5g/l

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Le Hong Quang

Thesis title: Screening of Saccharomyces yeast strain and optimize fermentation

conditions to receive zinc – enriched yeast biomass

Major: Faculty of food science and technology Code: 8 54 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA) Research Objectives

- Screening of zinc – enriched Saccharomyces yeast strain with high zinc

accumulates ability from the collection of Food Industry Research Institute

- To optimize fermentation conditions to receive zinc – enriched yeast biomass

Materials and Methods

Research method: Parameter interested: Zn2+ concentration was accumulated

in the yeast cell and biomass in all experiments

- Experiment 1: Stock cultures were maintained on YM mediumcontaining (g/l) Zn(NO3)2 (1), 10% transplanting rate with 100ml culturemedia in 250ml erlenmeyer flask and the procedures were allowed to proceed

at 28ºC for 72 hours on a rotary shaker at 150 rpm

- Experiment 2: Zinc sources were investigated: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2

at concentration of 0; 0.25; 0.5; 0.75; 1; 2g/l were added into fermentationmedium containing (g/l) yeast extract (3), malt extract (3), bacto peptone (5),glucose (10), 10% transplanting rate pH of environmental was adjusted to 6.0;Fermentation medium was shaken on a rotary shaker at 150 rpm and 28°C for72hours After that, we investigated time points to added zinc salts at 0, 9, 18,

27 hours so that we determined the best condition

- Experiment 3:

 Carbon sources were investigated: Glucose, galactose, fructose, lactose,maltose, sucrose with concentration at 10 g/l were added to culture mediacontaining (g/l) yeast extract (3), malt extract (3), bacto peptone (5), ZnSO4(1), 10% transplanting rate Next, we investigated suitable carbonconcentration at 10, 50, 100, 150 g/l The procedures were allowed to proceed

at 28ºC for 72 hours in a rotary shaker at 150 rpm

 Nitrogen sources were investigated: yeast extract, tryptone, peptone, beefextract, casein, with concentration at 10 g/l were added to culture mediacontaining (g/l) malt extract (3), glucose (10), ZnSO4 (1), 10% transplantingrate Then, We investigated suitable nitrogen concentration at 5, 10, 15, 20 g/l.Fermentation medium was shaken on a rotary shaker at 150 rpm and 28°C for

 Ion metal sources were investigated: MgSO4 with concentration 0; 0.5;1.5 g/l, KH2PO4 with concentration 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l and Fe2(SO4)3 withconcentration 0; 0.5; 1; 2 g/l They were added into culture media containingZnSO4 (1) and 10% transplanting rate The procedures were allowed toproceed at 28ºC for 72 hours in a rotary shaker at 150 rpm

- Experiment 4: Using 100ml YM culture media in 250ml erlenmeyer flaskcontaining 1 g/l ZnSO4, pH of culture media before fermentation wasinvestigated: 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7, adjusted by H2SO4 0,1M or NaOH 0,1Msolution The range of temperature was investigated: 25, 28, 30, 35 oC Theinvestigated shaker modes were: 0, 50, 100, 150, 200 rpm to determine the bestcondition

- Experiment 5: After the research of selecting nutrition resources, nutritional ingredients, suitable fermentation conditions, as for the optimization of the culture conditions, the experiment was arranged based on with 3 factors affect The

optimal condition was treated by JMP 10.0 statistics software

Analysis method: Analysing total zinc content in a yeast cell by Atomic

Absorption Spectrophotometric (AAS) at wavelength 213,9 nm

Main findings and conclusions

- The S.cerevisiae CNTP 4087 strain was selected for its high zinc

accumulation in biomass of 8.91 mg / g dry biomass from 96 yeast strains of Saccharomyces

- The source of zinc salts used for fermentation was ZnSO4 salt with a concentration of 1 g / l added at 9 hours from the beginning of fermentation

- The source of sources and nutritional ingredients included:

 Carbon source was glucose at a concentration of 100 g/l

 Nitrogen source was yeast extract at a concentration of 10 g/l

 Ions metal were added into medium included (g/l): MgSO4 (0.5),

KH2PO4 (3), Fe2(SO4)3 (0.5)

- The fermentation conditions were determined: the temperature at 30oC,

pH of a medium at 6.5 and shake mode at 150 rpm

The optimal conditions for fermentation were determined: Zinc concentration inculture medium: 1.5 g / l, glucose concentration: 100 g / l and yeast: 5 g / l, withzinc content in dry biomass of 12 mg / g and The biomass obtained was the highest

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cơ thể người kẽm là một trong những khoáng chất quan trọng nhất,xuất hiện trong mọi tế bào trong cơ thể với nhiều nhiệm vụ quan trọng Thiếu kẽm

sẽ làm tổn thương chức năng miễn dịch, làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễmkhuẩn Đặc biệt kẽm đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong sự phát triểnchiều cao, cơ bắp và miễn dịch của trẻ những năm đầu đời (Nguyễn Xuân Ninh,1999) Kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng, tác động chọn lọc lên quá trình tổnghợp, phân giải axit nucleic và protein – những thành phần quan trọng nhất của sựsống sống Vì vậy các cơ quan như hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da,niêm mạc, hệ tiêu hoá và hệ tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm (Prasad,2012)

Trong những năm gần đây tình trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổbiến trong cộng đồng, khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm và một tỷ lệ lớn trẻ

em dưới 5 tuổi ở các nước đang phát triển bị thiếu kẽm Các nghiên cứu chỉ rarằng, tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em Việt Nam khá cao: 25 – 40% tuỳ từng địa phương,nhóm tuổi và khoảng 33% nam giới bị thiếu kẽm Phụ nữ mang thai và cho con bú,người cao tuổi cũng nằm trong đối tượng có nguy cơ thiếu kẽm cao (Nguyễn ThịLâm, 2012) Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộngđồng là hết sức cần thiết Tuy nhiên, kẽm không dễ dàng được hấp thụ vào cơ thể ởdạng tự nhiên mà chúng phải được gắn vào các chất mang khác, với các hợp chấthữu cơ, amino axit hoặc được đồng hoá trong tế bào vi sinh vật (Lê Bạch Mai,2007)

Nấm men từ lâu đã được xem là một trong các đối tượng nghiên cứu chínhcủa ngành Công nghiệp thực phẩm Nhờ vào khả năng hấp thu và đồng hóa một sốkim loại một trong số đó là nguyên tố vi lượng kẽm để tạo ra dòng sản phẩm nấmmen giàu kẽm sẽ là nguồn thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, đảmbảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm”.

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện lên

men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ kẽm cao

từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm;

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn muối kẽm và các ion kim loại khác nhau đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm;

- Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường, điều kiện lên men phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm;

- Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 VAI TRÒ, NHU CẦU CỦA VI CHẤT KẼM

2.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm (Zn)

- Kẽm (Zn) từ lâu đã được biết đến là một trong những yếu tố quan trọng đốivới con người Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào, tác động đến hầu hếtcác quá trình sinh học trong cơ thể Ngoài ra, kẽm có vai trò quan trọng trong hệmiễn dịch, trong sự hình thành xương, sự tăng trưởng các mô, sự phát triển của

thai nhi và trẻ nhỏ (Barbarot et al., 2010) Kẽm cũng góp phần không nhỏ vào sự hình thành tinh trùng cũng như quá trình vận động của cơ thể (Henkel et al., 1999; Henkel et al., 2003) Như vậy, chức năng của kẽm trong cơ thể con người có thể chia thành 3 nhóm: Vai trò xúc tác, tham gia vào cấu trúc và điều tiết (Tuerk et al., 2009; Yoshihisa et al., 2012).

 Trong vai trò xúc tác, kẽm là thành phần của ít nhất 200 loại enzym khácnhau, đặc biệt có trong hệ thống enzym vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tácphản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử AND, xúc tác phản ứng oxy hóa cung

cấp năng lượng (Stephan et al., 2004; Park et al., 2009; Yamaoka et al., 2000).

 Trong vai trò cấu trúc, kẽm tham gia vào các trình tự mã hoá protein(domains protein) nhất định tạo thành cấu trúc kẽm-protein Những cấu trúc này cóvai trò quan trọng trong các hoạt động sống của tế bào Một trong những cấu trúckẽm-protein quan trọng được biết đến là protein Zac1 có chức năng như là một gen

ức chế những khối u tiềm ẩn (Tsuda et al., 2004) Ngoài ra, gen Zac1 còn được biết

đến như là một gen điều hoà (Tseng, 1998) Bên cạnh đó, Basonuclin lại là một cấutrúc protein-kẽm khác được tìm thấy trong các biểu mô khác nhau ở lớp biểu bì, ởthực quản, giác mạc, tinh trùng, noãn, đây là protein đóng vai trò trong quá trìnhsinh sản của tế bào thể hiện rõ ở sự hình thành tinh trùng, tế bào trứng và cả sự

hình thành và phát triển ban đầu của phôi thai (Mahoney et al., 1998).

 Trong vai trò điều tiết, kẽm rất cần thiết cho một số quá trình sinh học như

là điều chỉnh gen (Yoshihisa et al., 2012) Ví dụ như MMP-19 là một trong những

thành viên của nhóm enzym phân giải protein phụ thuộc vào kẽm và

nhóm enzym này tác động trực tiếp đến sự phát triển của các khối u (Impola et al.,

2003)

- Thông qua 3 vai trò kể trên, kẽm có vai trò quan trọng trong hoạt động sống của hầu kết các cơ quan ở cơ thể con người như là:

 Kẽm có vai trò điều hòa chuyển hóa lipit và ngăn ngừa mỡ hóa gan;

 Kẽm tham gia vào chức năng tạo máu Vai trò của kẽm trong cơ thể không kém vai trò của sắt;

 Kẽm cần thiết cho sự biệt hóa tế bào và sự ổn định màng;

 Kẽm ảnh hưởng đến tốc độ hấp thu các axit amin Kẽm cần thiết cho tổng hợp tryptophan;

 Ảnh hưởng của kẽm đối với hoạt động các hocmon tuyến yên, thượng thận

và thận đã được thừa nhận Theo Scott và Fisher, tác dụng giảm đường huyết củainsulin phụ thuộc vào kẽm có trong insulin;

 Kẽm có vai trò trong hệ miễn dịch Nó kích thích sự phát triển và biệt hóa

tế bào lympho Nó đẩy mạnh sự xuất tiết các cytokin (nhất là interleukin 2) để đápứng lại các kích thích kháng nguyên

- Ngoài ra, các công trình nghiên cứu còn cho thấy kẽm có vai trò làm giảmđộc tính của các kim loại độc như nhôm (Al), asen (As), cadimi (Cd) góp phầnvào quá trình giảm lão hóa, thông qua việc ức chế sự ôxy hóa và ổn định màng tếbào Khả năng miễn dịch của cơ thể được tăng cường nhờ kẽm, bởi nó hoạt hóa hệthống này thông qua cơ chế kích thích các đại thực bào, tăng các limpho T Vì vậy,khi thiếu kẽm, nguy cơ nhiễm khuẩn ở bệnh nhân sẽ tăng lên

- Vai trò của kẽm cực kỳ quan trọng tương đương với vai trò của sắt đối với

cơ thể đặc biệt là đối với trẻ em Từ năm 2004, Tổ chức Y tế Thế giới đã khuyếncáo sử dụng kẽm trong điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em Nhiều nghiên cứu khoa học

đã chứng minh bổ sung kẽm cho trẻ suy dinh dưỡng, trẻ tiêu chảy đã rút ngắn sốngày bị bệnh, giảm số lần tiêu chảy, cải thiện tình trạng suy dinh dưỡng của trẻ.Kẽm là một chất xúc tác không thể thiếu được của ARN- polymerase có vai tròquan trọng trong nhân bản ADN và tổng hợp protein, kẽm tham gia điều hoà vàtổng hợp hocmon tăng trưởng, kích thích sự tăng trưởng của trẻ Cho đến nay, đã

có nhiều nghiên cứu về tác dụng của bổ sung kẽm đối với tăng trưởng của trẻ em,đặc biệt là cải thiện chiều cao của những trẻ thấp còi

2.1.2 Nhu cầu bổ sung kẽm của cơ thể

Ở người trưởng thành, cơ thể chứa khoảng 2g kẽm, trong đó có 20% nằm

ởda và ở tóc (Anavekar et al., 2007) Kẽm được dung nạp vào cơ thể con người

chủ yếu qua đường tiêu hoá Phần lớn kẽm được hấp thụ ở ruột non, chủ yếu tại tá

và hỗng tràng, một ít tại hồi tràng (Bagherani et al., 2011) Chính axit dạ dày làm

tăng cường khả năng hấp thu kẽm trong hệ tiêu hoá Trong điều kiện chuẩn, nồng

độ kẽm tối đa đạt được sau 2-3 giờ kẽm đưa vào cơ thể (Stephan et al., 2004).

Chúng ta đều cần phải bổ sung một lượng kẽm nhất định hàng ngày Đốivới trẻ em, kẽm cần thiết cho sự phát triển, đối với người trưởng thành, kẽm đảmbảo cho quá trình duy trì sức khỏe Nhưng với mỗi đối tượng khác nhau tùy vào độtuổi và trạng thái sinh lý thì nhu cầu kẽm hàng ngày hoàn toàn khác nhau

Kể từ những năm 1990, Tổ chức Lương thực thế giới (WHO), Tổ chứcLương thực và Nông nghiệp, Hiệp hội Thực phẩm và Dinh dưỡng (FNB) đã triệutập các chuyên gia để nghiên cứu, ước tính về nhu cầu kẽm của con người ở cácnhóm tuổi khác nhau (WHO, 2002; Press National Academy, 2002) Các phươngpháp ước tính yêu cầu về lượng kẽm trung bình được xác định sau khi đã ước tính

cả lượng kẽm đã bị mất khi đi qua đường ruột Đối với trẻ em đang lớn và phụ nữmang thai, lượng kẽm nhu cầu được tính bao gồm cả lượng kẽm tích luỹ

ởcác mô Đối với phụ nữ cho con bú lượng kẽm cần bổ sung được tính cả lượngkẽm tiết ra trong sữa Kết quả nghiên cứu điều tra cho thấy với mỗi cá thể thì khảnăng hấp thụ kẽm là khác nhau Theo tính toán thì có khoảng 25-33% lượng kẽmđưa vào được hấp thu, lượng kẽm còn lại bị thất thoát trong đường tiêu hoá hoặc bị

thải ra ngoài (Brown et al., 2001) Nhu cầu bổ sung kẽm theo đường tiêu hoá được ước tính và đưa ra trong bảng 2.1 (Roohani et al., 2013).

Trên thực tế trẻ em vẫn là nhóm đối tượng có nguy cơ cao bị thiếu hụt kẽmtrong quá trình phát triển Trẻ em được bú sữa mẹ hoàn toàn có đủ lượng kẽm cho

cơ thể trong thời gian từ 5-6 tháng đầu đời (Brown et al., 2004), sau đó tuỳ theo

nhu cầu của từng lứa tuổi cần có chế độ dinh dưỡng và biện pháp bổ sung kẽm phùhợp Riêng đối với trẻ em suy dinh dưỡng, nhu cầu kẽm cần bổ sung cao hơn sovới trẻ phát triển bình thường, nó được ước tính là từ 2-4mg/kg thể trọng (Muller

et al., 2001).

Bảng 2.1 Nhu cầu kẽm đối với những đối tượng khác nhau theo độ tuổi

Nguồn: Roohani et al (2013)

Đối với phụ nữ mang thai và cho con bú thì hàm lượng kẽm cần bổ sungtăng vọt Chính vì vậy, bên cạnh việc bổ sung đầy đủ dinh dưỡng thì giai đoạn nàycũng cần đặc biệt quan tâm tới việc bổ sung các chất vi lượng cần thiết đặc biệt là

sắt và kẽm (King, 2000; Obrien et al., 2000).

2.1.3 Tình hình sử dụng kẽm hiện nay

Thiếu kẽm sẽ gây ra những ảnh hưởng đến sức khỏe như mất cân bằnglượng đường trong máu, tỷ lệ trao đổi chất chậm, quá trình phân chia tế bào và

tổng hợp DNA cũng sẽ bị thay đổi (Henkel et al., 2003) Quá trình cơ thể thiếu

kẽm lâu ngày sẽ dẫn đến tổn thương chức năng miễn dịch, làm tăng nguy cơ mắccác bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm virus từ đó làm giảm tăng trưởng, phát triển của trẻ,

làm tăng nguy cơ bị suy dinh dưỡng (Mocchegiani et al., 2005; Coelho et al., 2006; Kuramoto et al., 1991).

Những biểu hiện thường gặp khi trẻ bị thiếu kẽm: Trẻ thường biếng ăn, rốiloạn giấc ngủ: ngủ không ngon giấc, khóc đêm, hay bị mắc các bệnh nhiễm trùngđường hô hấp và tiêu hoá, chậm phát triển chiều cao

Hình 2.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới

Nguồn: Andrew Green (2013)

Báo cáo đánh giá sự thiếu hụt kẽm ở Trung Quốc và Ấn độ đã cảnh báo, vấn

đề thiếu kẽm đang là một vấn đề trên toàn cầu Theo thống kê của nhóm tác giảcho thấy: 2 tỷ người trên toàn thế giới bị thiếu kẽm; 1,5 triệu trẻ em chết mỗi năm

vì tiêu chảy; 800.000 người trong đó có 450000 trẻ em có nguy cơ tử vong mỗinăm do thiếu kẽm (Andrew Green, 2013)

Người ta ước tıı́nh rằng 35% tửvong ởtrẻem cóthể gây ra do suy dinh dưỡng –làm tăng nguy cơvàmức độnặng của những bệnh nhiễm trùng như bệnh tiêu chảy, viêm phổi vàsốt rét Thiếu huṭkemm̃ làmột thành phần phổbiến của suy dinh dưỡng vàcóliên hệvới ngưng phát triển chiều cao, vàtıı̉lệnhiễm trùng đường hôhấp dưới vàtiêu chảy cao, đặc biệt ởtrẻdưới 5 tuổi Trên toàn cầu, sư ̣thiếu huṭkemm̃ chiụtrách nhiệm cho khoảng 176000 ca tử vong liên quan đến bệnh tiêu chảy, và406000 ca tửvong liên quan đến viêm phổi ởtrẻdưới năm tuổi, cũng nhưkhoảng 4% gánh nặng

tửvong vàbệnh tật toàn cầu ở trẻnhỏ (Hess et al., 2009; Fischer walker et al., 2010).

Tại Việt Nam, một nghiên cứu trên học sinh (11-17 tuổi) tại vùng nông thôntỉnh Hà Nam, kết quả cho thấy có khoảng 26,5% trẻ có mức Kẽm huyết thanhthấp Nhiều nghiên cứu trên trẻ em bị suy dinh dưỡng và tiêu chảy kéo dài vàoviện tại Hà Nội và Tp Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ thiếu kẽm huyết thanh còn rấtcao, vào khoảng 50%-90% tùy theo mức độ Điều tra về tình hình thiếu vi chấtnăm 2010 trên 586 trẻ 6 tháng đến 75 tháng tại Việt Nam, kết quả cũng cho

thấy tỷ lệ thiếu kẽm là 51,9% Nhóm trẻ nhỏ nhất (6-17 tháng) có nguy cơ bị thiếukẽm cao nhất khi so sánh với các nhóm tuổi khác (Cao Thị Thu Hương và cs.,2004).

Kết quả từ cuộc điều tra dinh dưỡng quốc gia năm 2010 cho thấy tỷ lệ thiếumáu dinh dưỡng ở trẻ em dưới 5 tuổi là 29%, tỷ lệ thiếu vitamin A tiền lâm sàng là14% và 51% trẻ thiếu kẽm (Khuất Thị Tuyết Tường và cs., 2013)

Việt Nam có dân số khoảng 90 triệu người và ước tính trong số đó cókhoảng 7,1 triệu trẻ em ở độ tuổi dưới 5 tuổi Điều đáng lo lắng hiện nay là nghiêncứu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia năm 2012 cho thấy chế độ ăn điển hình của trẻ

sơ sinh và trẻ nhỏ không cung cấp đủ năng lượng, chất dinh dưỡng và vi chất dinhdưỡng cho trẻ em để có sự tăng trưởng và phát triển tối ưu (Khuất Thị TuyếtTường và cs., 2013)

Lê Danh Tuyên (2014) - Viện trưởng Viện Dinh dưỡng phân tích, việc thiếu

vi chất dinh dưỡng có ảnh hưởng không tốt đến sự tăng trưởng và phát triển ở trẻ

em Ở Việt Nam, tỷ lệ suy dinh dưỡng thể thấp còi ở trẻ em dưới 5 tuổi là gần26% Như vậy, cứ 4 bé thì có hơn một bé bị suy dinh dưỡng thấp còi, do vậy trẻkhông thể đạt mức phát triển tối đa Theo Lê Danh Tuyên (2014), kẽm ảnh hưởngrất rõ đến sự phát triển chiều cao của trẻ Tỷ lệ trẻ em Việt Nam thiếu dinh dưỡngdẫn tới việc thấp hơn so với lứa tuổi còn ở mức rất cao, chính vì vậy, việc bổ sungthêm kẽm cũng là một giải pháp để hỗ trợ tăng thêm chiều cao của trẻ em

2.1.4 Phương pháp bổ sung kẽm

Đa dạng hóa khẩu phần dinh dưỡng: Đa dạng hoá bữa ăn là sự kết hợp các

loại thực phẩm khác nhau làm cho bữa ăn cân đối hơn về giá trị dinh dưỡng, vichất dinh dưỡng, đồng thời làm tăng hấp thu các chất dinh dưỡng Trong một sốgiai đoạn sinh lý của cơ thể (trẻ em trong giai đoạn đang phát triển, phụ nữ có thai)nhu cầu của một số vi chất dinh dưỡng như kẽm, sắt, iốt và kể cả vitamin A là rấtcao, và không thể được đáp ứng chỉ bằng khẩu phần ăn từ các thực phẩm tự nhiênsẵn có, bắt buộc phải đưa thêm qua đường bổ sung bằng đường uống hoặc đưa vichất vào thực phẩm Để bổ sung thêm kẽm cho cơ thể dưới dạng các thực phẩm ta

có thể lựa chọn một số loại thực phẩm có hàm lượng kẽm cao như: sò huyết, ngao,hàu, thịt đỏ, ngũ cốc,…

Bổ sung vi chất dinh dưỡng: Đây là giải pháp bổ sung kẽm dưới dạng dược

phẩm hoặc thực phẩm chức năng Bổ sung vi chất dinh dưỡng là biện pháp có hiệuquả khắc phục nhanh chóng tình trạng thiếu các vi chất dinh dưỡng đang lưu hànhcũng như dự phòng cho các quần thể dân cư có nguy cơ cao Kẽm có thể được bổsung dạng viên uống kẽm vô cơ hoặc kẽm gluconat

2.2 NẤM MEN SACCHAROMYCES VÀ NGUYÊN TỐ VI LƯỢNG KẼM 2.2.1 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces

Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes, ngành nấm Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năng sinh sản

nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Sinh khối của chúng rất giàuprotein, vitamin và lipit Tế bào nấm men thuộc loại Eukaryota (nhân thật), có khảnăng hô hấp yếm khí tuỳ tiện

Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nóiđất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rấtnhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác

Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điềukiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào Vìthế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuấtrượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinhkhối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… (Lê Văn Việt Mẫn và cs., 2006;Lao Thị Nga, 1987; Lương Đức Phẩm, 2009; Đặng Trung Trụ, 2001)

Đa số nấm men Saccharomyces có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii.

So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kíchthước tương đối lớn Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩmthường có kích thước khoảng 3 – 5 × 5 – 10µm (Đặng Trung Trụ, 2001) Kíchthước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,…

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồivẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi

Hình 2.2 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hiện nay trong công nghệ thực phẩm đang sử dụng hai loại nấm men bia,

đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước 2,5-10 µm chiều

rộng và 4,5-21 µm chiều dài

2.2.2 Khả năng hấp thụ kẽm của nấm men

Cơ chế vận chuyển kẽm vào tế bào nấm men

Ion kẽm khi tồn tại trong dung dịch là một ion có điện tích cao, không thểvận chuyển qua màng sinh học (màng tế bào) bằng sự khuếch tán thụ động và do

đó chúng phải được vận chuyển bởi các protein vận chuyển (Guerinot et al., 1999) Nấm men S.cerevisiae được chứng minh có một lượng lớn gen có chức năng vận

chuyển ion kim loại Nồng độ kẽm được duy trì cân bằng nội môi thông qua hoạtđộng điều hòa các protein vận chuyển được tìm thấy trên màng các bào quan vàmàng tế bào Quá trình điều hòa này được tiến hành trung gian qua cả 2 cấp độphiên mã và sau dịch mã để đáp ứng với những thay đổi về nồng độ kẽm trong tếbào (Eide, 2003) Hệ thống phiên mã hoạt động ở mức kẽm nội bào vừa phải, giữa0,01 và 0,07 nmol Zn/triệu tế bào, và mức sau dịch mã hoạt động khi mức kẽm nội

bào ở trên 0,07 nmol Zn/triệu tế bào (Zhao et al., 1998; Gitan et al., 1998) Ở giai

đoạn phiên mã, ít nhất 3 hệ thống hấp thu được biết đến để kiểm soát sự hấp thụkẽm trong đó bao gồm:

- Hệ thống có ái lực cao (Kd = 10 nmol/l) hoạt động trong các tế bào có nhucầu về kẽm hạn chế Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là Zrt1 (Zhao

et al., 1996a).

- Hệ thống có ái lực thấp hơn (Kd = 100 nmol/l) hoạt động trong các tế bào

có khả năng sử dụng kẽm lớn Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là

Zrt2 (Zhao et al., 1996b).

- Hệ thống protein vận chuyển Fet4

Trong những hệ thống vận chuyển kẽm này có 2 hệ thống đầu hoạt độngtheo ái lực đối với kẽm thì hoạt động rất nghiêm ngặt chỉ tham gia vào quá trìnhhấp thụ kẽm và không tham gia vào quá trình hấp thụ các kim loại khác Mỗiprotein vận chuyển sẽ hoạt động cho 1 trong 2 hệ thống: Zrt1 chỉ cho hệ thống áilực cao và Zrt2 chỉ cho hệ thống ái lực thấp (Eide, 2003) Còn đối với hệ thống thứ

ba, protein Fet4 không chỉ tham gia và sự hấp thụ kẽm mà còn tham gia vào sự hấp

thụ sắt và đồng (Waters et al., 2002).

Protein Zrt1, Zrt2 và Fet4 thuộc họ ZIP (ZIP lấy tên từ những chữ cái đầutiên được viết tắt Zinc Iron-regulated transporter Protein) ZRT1 và ZRT2 là cácgen mã hóa cho Zrt1 và Zrt2, tương ứng như vậy FET4 mã hóa cho Fet4 Cácprotein vận chuyển ion kẽm được tổng hợp trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng nội

bào kẽm STT

123

4

5

6

78

Nguồn: Satyanarayana et al (2009)

Cơ chế vận chuyển và tích lũy ion kẽm trong nội bào, tế bào nấm men được

mô tả trong hình 2.3 Khi kẽm được đưa vào tế bào, kim loại này được sử dụng

11

bao gồm ti thể và lưới nội chất Nếu kẽm vượt quá các yêu cầu cần thiết của tế bàonấm men, một số cơ chế có thể được kích hoạt để lưu trữ kẽm cho đến khi nó cóthể được yêu cầu Không bào men được biết có chức năng tích lũy một số cationhóa trị hai, chẳng hạn như Zn2+, Ca2+, Fe2+… và các các cation hoá trị một như là:

K+, Li+, Cs+ (White et al., 1987).

Hình 2.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men

Nguồn: Li et al (1998); Miyable et al (2001); Macdiarmid et al (2002); Huang et al.

(2005)

Sự vận chuyển kẽm vào không bào được kiểm soát bởi 3 protein vậnchuyển: Zrc1, Cot1, Zrt3 Trong khi vai trò của Zrc1 và Cot1 ngăn không cho đưakẽm vào bởi endocystosis, thì Zrt3 có vai trò huy động kẽm tại các “kho” tích trữ

kẽm ở không bào khi tế bào tiếp xúc với điều kiện hạn chế kẽm (Li et al., 1998; Miyable et al., 2001; Huang et al., 2005) Một protein vận chuyển thứ tư được biết

đến là Msc2 có ảnh hưởng đến sự cân bằng kẽm nội bào (Li and Kaplan, 2001), nóphân bố ở mạng lưới nội chất và có chức năng điều hoà việc cung cấp kẽm chochính mạng lưới nội chất này (Ellis, 2004) Ngoài ra còn có protein vận chuyểnZip7 có vai trò vận chuyển kẽm từ tế bào chất tới bộ máy Golgi khi tế bào nấmmen được nuôi trong môi trường cạn kiệt kẽm (Huang, 2005)

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men

2.2.3.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống vi sinh vật Mỗi loài vi sinh

vật chỉ có khả năng hoạt động sống trong một giới hạn nhiệt độ nhất định Giới hạnnày chia làm 3 điểm: nhiệt độ cực đại, cực tiểu và tối thích Quan hệ với nhiệt độcủa vi sinh vật cũng chia thành 3 nhóm: vi sinh vật ưa lạnh, vi sinh vật ưa ấm và visinh vật ưa nóng.

Trong công nghiệp vi sinh vật, người ta sử dụng các giống ưu ẩm là chủ yếutrong lên men Đối với sinh trưởng của đa số nấm men nhiệt độ tối thích vàokhoảng 28 - 32°C, nhưng với lên men thì lại không hoàn toàn trùng với khoảngnhiệt độ này Đối với lên men rượu etylic để sản xuất rượu trắng (cồn thực phẩm,rượu Vodka, các rượu trắng truyền thống) nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 35°C, vớilên men rượu vang là 20 - 25°C, lên men bia là 6 - 10°C hoặc 8 - 12°C …

2.2.3.2 pH

pH môi trường: pH môi trường ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của

vi sinh vật, làm thay đổi diện tích của màng tế bào chất, dẫn đến thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào

Mỗi loài vi sinh vật có pH tối thích, cực tiểu, cực đại riêng Đại thể là vikhuẩn và xạ khuẩn thích hợp với pH ở vùng trung tính và kiềm (trừ các vi khuẩnsinh các axit hữu cơ) Vi khuẩn gây thối phát triển tốt ở môi trường kiềm, trong cácmôi trường axit, chúng bị ức chế hoặc có thể bị chết Ở nhóm nấm men, với các

giống nấm men rượu Saccharomyces cũng có những pH tối thích khác nhau Đối

với nấm men rượu và men bia pH ban đầu thích hợp cho lên men là khoảng 5,5.Trong quá trình lên men pH giảm xuống 4,4 - 4,5 rồi lại tăng dần lên Nguyênnhân giảm pH hay tăng độ chua của môi trường được giải thích bằng sự tạo thành

CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình

2.2.3.3 Oxy hoà tan – độ hiếu khí

Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxy (O2) hoà tan trong môi trường,đơn vị tính là mg O2/ 1lít môi trường Cần chú ý một điều là nhiệt độ càng caolượng oxy hoà tan trong dịch càng thấp

Oxy hoà tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinhsản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp Trong trường môitrường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn

Do đó, tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn.Bình thường oxy hoà tan tối đa trong nước đến 9 mg/l Nồng độ giảm xuống còn 1mg/l nấm men sẽ ngừng sinh sản

2.2.3.4 Thành phần môi trường

Thành phần môi trường lên men có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của nấmmen và trao đổi chất trong tế bào, đặc biệt là có thể quyết định cả hiệu suất lênmen hoặc chuyển hướng lên men từ sản phẩm này sang sản phẩm khác

Trong môi trường có thể chia thành 4 nhóm thành phần là:

- Nguồn cacbon dinh dưỡng, chủ yếu là các loại đường có thể lên men;

- Nguồn nitơ dinh dưỡng;

- Các nguồn chất khoáng đa lượng, trung lượng và vi lượng;

- Nguồn các chất sinh trưởng gồm các vitamin, các axit amin, peptit,

nucleotit, nuclezit (Lương Đức Phẩm, 2009)

2.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình chuyển hoá, tích luỹ kẽm

2.2.4.1 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm bổ sung tới quá trình tích luỹ kẽm

Với công nghệ lên men truyền thống kết hợp với các phương pháp công nghệhiện đại, để tăng hàm lượng kẽm vào sinh khối nấm men các nhà khoa học hiệnnay đã tiến hành bổ sung các loại muối kẽm vô cơ có tính tan tốt như là: kẽmnitorat, kẽm sunphat, kẽm clorua… vào môi trường nuôi cấy với nồng độ thíchhợp Đây là 3 loại muối kẽm vô cơ phổ biến nhất được sử dụng để bổ sung vàomôi trường nuôi cấy nhằm thu được sinh khối nấm men giàu kẽm Các nguồnmuối kẽm vô cơ khác có tính tan kém hoặc không tan trong nước hầu như khôngđược sử dụng trong các nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

Sillerova et al (2012) đã nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng

việc sử dụng các nguồn muối kẽm khác nhau như: kẽm nitorat, kẽm sunphat, kẽmclorua ở dải nồng độ từ 250 mg/l đến 3000 mg/l Đồng thời, so sánh hiệu quả tíchlũy kẽm lên các chủng nấm men được khảo sát Kết quả cho thấy, ở cùng một nồng

độ muối kẽm xác định thì các loại muối khác nhau cho hiệu quả tích lũy kẽm trênchủng nấm men nghiên cứu và tác dụng độc hại của nó lên tế bào là khác nhau

(Sillerova et al., 2012).

2.2.4.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình trích luỹ kẽm.

Để tạo nấm men giàu kẽm điều cần thiết là phải lựa chọn môi trường nuôicấy phù hợp để nấm men có thể sinh trưởng phát triển tốt từ đó làm tăng khả

năng đề kháng với kẽm Khi sử dụng môi trường nuôi cấy tổng hợp ngoài việccung cấp nguồn cacbon và nitơ đầy đủ thì việc cung cấp các nguyên tố khoáng vilượng với tỉ lệ thích hợp là hết sức cần thiết để duy trì tốt sự sinh trưởng và pháttriển của nấm men Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với tuỳloài, tuỳ giai đoạn sinh trưởng và phát triển Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết

về các muối khoáng đối với nấm men thường thay đổi trong các phạm vi sau đây:

Bảng 2.3 Nhu cầu khoáng đối với nấm men Muối khoáng

Nguồn: Nguyễn Lân Dũng và cs (2002)

Có thể nhận thấy các nguyên tố khoáng vi lượng là một trong các bộ phậncấu thành nên cấu trúc của tế bào, có vai trò quan trọng trong hoạt động của cácenzym tham gia vào các quá trình chuyển hóa Mặt khác, khả năng tích lũy kẽm cóliên quan mật thiết đến hoạt động của các enzym chuyển hóa xúc tác các phản ứngtrong tế bào Chính vì vậy, việc nghiên cứu bổ sung các nguyên tố vi lượng vànghiên cứu các tác động qua lại của các ion kim loại tới quá trình tích lũy kẽm làhết sức cần thiết (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

− 96 chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces bao gồm các loài S cerevisiae, S carlsbergensis, S bruxellensis, S checvalieri,… đã được phân lập từ

các mẫu lấy ở các tỉnh thành trong nước và các chủng được lấy từ các nguồn nướcngoài như là: Thuỵ Điển, Pháp, Đức, Thái Lan,… (danh sách được thể hiện

ở phụ lục) Các chủng này đang được lưu giữ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm Việt Nam

− Môi trường dùng trong nghiên cứu: Môi trường lên men vi sinh vật YM(3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l pepton, 10g/l glucose, 1000ml nướccất)

- Box cấy (Bioblock Scientific-Pháp);

- Cân điện tử (Precisa, Thụy Điển);

- Kính hiển vi quang học (Lieca DM2700M);

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc);

- Máy đo pH HANNA 98107(Rumani);

- Máy lắc ổn nhiệt GYROMAX 373R (Hàn Quốc);

- Máy ly tâm cao tốc (Heraeus, Sepatech);

- Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật Bản);

- Thiết bị lên lên men, nhân giống Genenis 20L (Solaris Biotechnology,Italia);

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-6800 Shimadzu (Nhật Bản);

- Tủ sấy MEMMERT (Nhật Bản);

- Tủ lạnh SANYO (Nhật Bản);

- Máy ly tâm MIKRO 220R (Đức);

- Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản): Vô khuẩn có đèn UV;

- Các dụng cụ khác: Pipet Nichipet EX (Nhật Bản), đầu típ, nồi, đĩa peptri, ống nghiệm, bình tam giác, ống falcon,…

3.2 NỘI DUNG

Nội dung 1: Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích

luỹ kẽm cao từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm

Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn muối kẽm đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 3: Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện lên men phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàukẽm

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích luỹ kẽm cao

− Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ 96 chủng

nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công

nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men YM có bổ sung muối

vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l, tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men thu sinhkhối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường

lên men là 100ml Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc

150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

Thí nghiệm 2: Lựa chọn, xác định nồng độ và thời điểm bổ sung muối

kẽm

− Để lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàukẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2 Với các dảinồng độ: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa:3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose với tỷ lệtiếp giống là 10% Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệuchỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M Quá trình lên men được tiến hành ở 28°Ctrong 72 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút

− Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hànhlên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiệnphù hợp nhất

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

Thí nghiệm 3: Lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường lên men

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình tích lũy kẽm

+ Lựa nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm đượcthực hiện trên môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt,5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 với 10% tỷ lệ tiếp giống, có bổ sung thêm 10g/l vớimột trong các nguồn cacbon cần khảo sát chọn lựa sau: Glucose, galactose,frutose, lactose, maltose, sucrose Sau khi đã lựa chọn được nguồn cacbon phùhợp, tiến hành khảo sát nồng độ cacbon ở 10, 50, 100, 150g/l để xác định đượcnồng độ thích hợp cho quá trình tích lũy kẽm Quá trình lên men được tiến hành ở28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

+ Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein,10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l dịch chiết malt,

10g/l glucose, 1g/l ZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10% Khảo sát ảnh hưởng bởi cácnguồn nitơ tới quá trình tích lũy kẽm Tiếp tục thí nghiệm khảo sát nồng độ nitơthích hợp với các mức 5; 10; 15; 20g/l để xác định nồng độ phù hợp Quá trình lênmen được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinhkhối nấm men

- Nghiên cứu lựa chọn ion kim loại bổ sung

Để lựa chọn ion kim loại phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men các loạiion kim loại được khảo sát là MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 1,5 g/l; KH2PO4 vớinồng độ: 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l được bổ sungvào môi trường YM để tiến hành lên men có 1g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ tiếp giống10% Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc150vòng/phút

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinhkhối nấm men

Thí nghiệm 4: Lựa chọn điều kiện cho quá trình lên men

Khảo sát điều kiện pH, nhiệt độ, chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm

Sử dụng môi trường YM có bổ sung 1 g/l ZnSO4 trong nghiên cứu Thínghiệm được tiến hành trên bình tam giác 250ml trong đó có chứa 100ml dungdịch môi trường lên men pH của dịch môi trường trước lên men được khảo sát tạicác giá trị: từ 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 hiệu chỉnh bằng dung dịch H2SO4 0,1M hoặcNaOH 0,1M Các mức nhiệt độ được khảo sát là: 25, 28, 30, 35 oC Các chế độ lắcđược khảo sát là 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút để tìm ra điều kiện thích hợp nhất

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinhkhối nấm men

Thí nghiệm 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

Sau khi nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường,điều kiện lên men phù hợp tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy với

3 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp leo dốcứng với 3 yếu tố ảnh hưởng được khảo sát: x1, x2, x3 Hàm mục tiêu (y) là hàmlượng kẽm trong sinh khối Phương trình hồi quy có dạng:

y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 Với: b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 là các hệ số của phương trình hồi quy Việcthiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinh

khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0

3.3.2 Phương pháp phân tích

− Phương pháp xử lý mẫu sinh khối nấm men giầu kẽm: Sinh khối nấm menthu được mang đi rửa với nước khử ion với tỉ lệ 1:5, rửa 3 lần Sử dụng máy li tâmvới tốc độ 6000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút để thu sinh khối sau khi

rửa Tiến hành làm khô sinh khối nấm men ở 60oC trong 2h, sau đó kết thúc quá trình sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi

− Phương pháp phân tích AAS: Hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấmmen được xác định bằng quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS) Cân 50 mg mẫunấm men khô chuyển vào bình phá mẫu, thêm vào 2 ml HNO3 đặc và ngâm quađêm, thêm 1 ml H2O2 đặc và tiến hành phá mẫu bằng lò vi sóng Mẫu sau khi đểnguội được định mức thành 10 ml, lấy 1 ml pha loãng thành 10 ml bằng dung dịchHNO3 2% Mẫu sau khi xử lí được đưa vào hệ thống máy đo quang phổ hấp phụ

nguyên tử và tiến hành phân tích hàm lượng kẽm ở bước sóng 213,9 nm (Shet et al., 2011).

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý trên Excel, minitab 16, thuật toán thống kê studentT’test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (oneway ANOVA) Nếu p < 0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu p > 0,05 sự saikhác là không có ý nghĩ thống kê Xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinhkhối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY KẼM CAO

Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi

sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men YM có

bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l Quá trình lên men thu sinh khốiđược thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là100ml, pH của môi trường được điều chỉnh tới 4,5 bằng HCl 0,1M Điều kiện choquá trình lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt

Hình 4.1 Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men

được sàng lọc

Kết quả cho thấy, trong tổng số 96 chủng nấm men được nghiên cứu có 39chủng thể hiện khả năng tích kẽm thấp, dưới 1 mg/g sinh khối khô chiếm tỷ lệ40,62%; 42 chủng tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ

43,75% và 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm với hàm lượng trên 3 mg/g sinhkhối, chiếm tỷ lệ 15,63% được thể hiện qua bảng dưới đây:

Bảng 4.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh

khối của 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm cao STT

123456789101112131415

Kết quả trên cho thấy, sau khi được bổ sung nồng độ muối kẽm ở nồng độ 1g/l vào môi trường cơ bản thì hàm lượng muối kẽm thu được trong sinh khối khô

nấm men tăng mạnh, điển hình là lên tới 8,91mg/g ở chủng S.cerevisiae CNTP

4087 Điều này kiểm chứng thêm một lần nữa về khả năng tích lũy các nguyên tố

vi lượng trong đó có kẽm của S.cerevisiae Chính vì vậy chủng nấm men S.cerevisiae CNTP 4087 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.2 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG NGUỒN MUỐI KẼM KHÁC NHAU ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU KẼM

Để lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu

kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2, 3 loại muốikẽm này là các muối thường được sử dụng cho các nghiên cứu tích lũy kẽm trong

tế bào nấm men Với các dải nồng độ: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vàomôi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bactopepton, 10g/l glucose Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH đượchiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M Quá trình lên men được tiến hành ở28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lênmen bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phùhợp nhất

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và

hàm lượng kẽm tích lũy

Nồng độ muối kẽm (g/l)

00,250,50,7512( A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô

và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nồng độ muối

kẽm.

a, b, c, d là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các

loại muối kẽm ở cùng nồng độ.

Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05

Qua bảng 4.2 kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm mentrên 3 loại muối kẽm nitorat, kẽm sunphat và kẽm clorua hoàn toàn có sự sai khác,mức sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Kết quả này cho thấy, khả

năng chuyển hóa nguồn muối kẽm tích lũy kẽm trong tế bào nấm men S.cerevisiae CNTP 4087 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau Việc sử dụng muối

23

thu được khối lượng sinh khối khô sau lên men cao hơn hai muối còn lại ở tất cảcác nồng độ nghiên cứu Chính vì vậy, muối kẽm sunphat được lựa chọn làmnguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp sau.

Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy cómối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Nồng độ muốikẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn Tuynhiên, tác dụng độc hại của kim loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lạirất rõ rệt khi tăng dần nồng độ muối kẽm Điển hình là khi bổ sung ở nồng độ 0,25g/l kẽm sunphat khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối chỉ đạt 2,48 mg/g, nồng độnày chưa ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Khi nồng độ bổsung muối kẽm sunphat lên tới 1 và 2 g/l thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinhkhối có sự gia tăng mạnh tới 9,15 mg/g và 11,96 mg/g nhưng ở nồng độ 2g/l thìnấm men bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn Chính vì vậy, với mục tiêu thu nhậnđược lượng lớn sinh khối nấm men giàu kẽm thì chỉ nên lựa chọn nồng độ muốikẽm 1g/l ZnSO4 cho quá trình lên men

Sau khi đã lựa chọn được nguồn muối kẽm phù hợp, thí nghiệm được tiếp tụctiến hành và khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm sao cho lượng kẽm tích lũytrong sinh khối khô đạt hiệu quả cao nhất Theo đó, chủng nấm men được tiếnhành lên men trong môi trường YM có bổ sung kẽm sunphat nồng độ 0,5 g/l tạicác thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, các kếtquả cụ thể được trình bày ở hình 4.2

24