Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng parvovirus gây bệnh trên chó tại hà nội

TRÍCH YẾU LUÂṆ VĂN Tên tác giả: Pham Hồng NgocC Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của môṭsố chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội Tên c

Vật liệu và phương pháp

Vật liệu nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng khám thú y Hà Nội.

Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu giải mã gen

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị a Thiếtbi c

- Tủ lạnh thường; tủ lạnh âm sâu -80 o C (Sanyo, Nhật Bản);

- Máy ly tâm Centrifuge 5415D (Eppendorf, Đức)

- Máy PCR GeneAtlas 322 (Astec, NhâṭBản);

- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy Votex VM-10 (Daihan, Hàn Quốc)

- Máy vi tınh (HP, Mỹ)

- Lòvi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc)

Hınhh̀ 3.1 Môtsô trang thiết bi trong̣ phòng thı́nghiêm b Dungc cu c

- Bộ pipetman (10àl, 20àl, 100àl, 200àl, 1000àl và 5000 àl).

- Bộ Kit tách chiết GeneJET genomic DNA purification Kit của hãng Thermo (Mỹ).

- Bộ Kit Dream Taq PCR master mix của hãng Thermo (Mỹ).

- Bộ Kit tinh sạch GeneJET PCR purification Kit và GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo (Mỹ).

Phương pháp nghiên cứu

Hınhh̀ 3.2 Sơ đồquy trınhh̀ thı́nghiêm 3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễm Parvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội.

Các mẫu này đã được chấn đoán sơ bộ bằng quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích Tiếp đó được xác định dương tính với CPV bằng bộ kit chẩn đoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit Blot Test (BINOTE) tại phòng khám thú y.

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20 0 C.

3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Toàn bộ DNA tổng số được thu nhận bao gồm DNA của nhân tế bào chủ và DNA của hệ gen virus bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết DNA tổng số theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).

Phương pháp tiến hành theo thứ tự:

- Phá vỡ màng tế bào, màng nhân.

Sau công đoạn tách chiết, DNA tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn Ly tâm cho phép thu nhận DNA dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa tan lại trong nước theo nồng độ mong muốn.

Tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn của Thermo Scientific GeneJET

Genomic DNA Purification Kit Các bước cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1 như sau:

Bảng 3.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số

1 Bổ sung 150 àl H2O vào ụ́ng eppendorf chứa tăm bụng cú mõ̃u bệnh phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37 o C qua đêm.

2 Bỏ tăm bụng (vắt kiệt nước nhất cú thể), bổ sung 180 àl Digest solution và 20 àl Protease K, vortex.

3 Ủ 56 o C, vortex liên tục 10 phút/lần cho đến khi dung dịch đồng nhất

4 Bổ sung 20 àl enzyme RNase A, vortex, để ở nhiệt độ phũng 10 phỳt.

5 Bổ sung 200 àl Lysis solution, vortex cho đến khi dung dịch đồng nhất.

6 Bổ sung 400 àl Ethanol 50%, vortex.

7 Chuyển dịch lên cột lọc, li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.

Bổ sung 500 àl WB1, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phıa

9 Bổ sung 500 àl WB2, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phía dưới ống hứng.

10 Li tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.

12 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20 o C.

Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng.

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng mồi đặc hiệu với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lí Mồi tác động trên mạch DNA 5’ – 3’ còn được gọi là mồi xuôi (Forward primer), thường kí hiệu là F Mồi tác động trên mạch DNA 3’ – 5’ còn được gọi là mồi ngược (Reverse primer), thường kí hiệu là R Khi các mồi kết hợp với sợi DNA bổ sung của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại theo phản ứng dây chuyền với enzyme polymerase.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Biến tính 94 o C trong 5 phút Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp.

- Giai đoạn 2: Gắn mồi 50 – 65 o C trong 1 – 2 phút (tùy thuộc vào đoạn mồi) Giai đoạn này để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA khuôn.

- Giai đoạn 3: Tổng hợp 68 – 72 o C trong 30 giây – 2 phút Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại

Quá trình này thực hiện từ 30 – 40 chu kì Sau chu kì cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72 o C trong 5 – 10 phút để các sợi đơn DNA đóng xoắn lại thành mạch đôi. Kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên thạch agarose 0,8 – 1% và băng DNA sẽ được nhìn thấy rõ dưới tia cực tím sau khi được nhuộm Ethidium Bromide.

Cặp mồi sửdungC trong nghiên cứu được thiếtkếdưạtrên so sánh trı̀nh tư C tương đồng chuỗi nucleotide của tất cảcác chủng CPV-2 hiện cótrên Ngân hàng gen theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương vàcs., 2018.

Trình tự của căpCmồi như sau:

Mồi xuôi CPVF2b: 5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG- 3’ (vi Ctrı2160 –

Mồi ngược CPVR4: 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG -3’ (vi Ctrı5023 –

CăpCmồi trên đươcCsửdungC đểkhuếch đaịvùng gen cókı ch thước 2,9 kb chứa toàn bô Cgen VP2 gồm 1755 nucleotide.

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3:

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR Thành phần

DreamTaq TM PCR Master Mix (2X)

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Giai đoan

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel Agarose

Nguyên lý của phương pháp là: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do có các gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi, các phân tử di chuyển từ cực âm sang cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điẹn đặc trưng của mỗi loại phân tử acid nucleic Các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím.

Có hai loại gel sử dụng trong kĩ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA.

Một trong các chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực khuẩn thể Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII thành 8 phân đoạn có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,125kb Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.

3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm sau PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch theo hướng dẫn của kit GeneJET PCR Purification (Thermo, Mỹ).

Các bước cụ thể được trình bày ở bảng 3.4 như sau:

Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR

1 Bổ sung dung dịch Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ

1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet.

2 Chuyển dịch lên cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới.

3 Bổ sung dung dịch 700 àl Wash Buffer, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới

4 Ly tâm làm khô 13000 vòng/phút trong 2 phút.

Chuyển cột lọc sang ụ́ng eppendorf 1.5ml để thu DNA, bổ sung 50 àl

5 dung dịch Elution Buffer, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ cột lọc

3.3.6 Phân tích và xử lý số liệu

Sản phẩm PCR được tinh sacḥ bằng bô Csinh phẩm GeneJET PCR Purification kit

(Thermo, Mỹ)và gửi đi giải trình tự trực tiếp tại Macrogen (Hàn Quốc).

Các trình tự gen VP2 của các chủng CPV đăng ký trên Ngân hàng gen và trên các tạp chí quốc tế được sử dụng để so sánh đối chiếu với các chuỗi VP2 trong nghiên cứu này (Bảng 3.6) bằng chương trình GENEDOC2.7 (Nicholas KB and

Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sửdung̣ trong nghiên cứu

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

DNA tổng số đươcCtách chiếttừmẫu bệnh phẩm của chónghi nhiễm CPV trên đi

Ca bàn HàNội sử dụng bộ GeneJET genomic DNA purification Kit của hãng Thermo (Mỹ) theo quy trình đã được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu Mẫu DNA tổng số lần lươṭđươcCkı hiêụlà: TH1-VN, TH2-VN, HN-VN.

DNA tổng số của ba mẫu được kiểm tra nồng độ DNA và độ ta Cp nhiễm protein bằng máy NanoDrop 8000 UV – Vis (Thermo, Mỹ) Kếtquảđược trı̀nh bày ởbảng 4.1.

Bảng 4.1 Nồng đô ̣DNA của các chủng nghiên cứu

Nồng đô CDNA vàtỉ lê CA260/280 đảm bảo đủnồng đô CđểthưcChiêṇcác phản ứng

Sau khi tách chiếtDNA tổng số, chúng tôi tiến hành thu nhâṇchuỗi gen có kích thước khoảng 2,9 kb, bao trọn toàn bộ gen kháng nguyên VP2 (kích thước 1755 bp) bằng căpC mồi CPVF2b – CPVR4 với thành phần vàchu trı̀nh nhiêṭ đươcCthểhiện qua bảng 3.3 và3.4.

Hınhh̀ 4.1 Kết quảđiện di sản phẩm PCR thu nhận vùng gen VP2 của 03 mẫu CPV nghiên cứu trên thacḥ agarose 1%.

Chúthıch: M: chỉ thị phân tử DNA của thưcC khuẩn thểLamda đươcCcắt bằng HindIII; giếng 1: mẫu TH1-

VN; giếng 2: mẫu TH2-VN; giếng 3: HN-VN.