Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS). Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số sản phẩm dinh dưỡng. Mời các bạn cùng tham khảo!

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Hường

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƯỠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

Trần Thị Hường

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƯỠNG

BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội - 2020

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, và cô PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình

hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Trung tâm kiểm soát Bệnh tật tỉnh Nam Định đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS.Vũ Thị Trang và ThS Lê Thị Thúy cùng

các đồng nghiệp tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, các đồng nghiệp tại labo Hóa – Trung tâm kiểm soát Bệnh tật tỉnh Nam Định đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia

sẻ mọi khó khăn cùng tôi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về chất bảo quản 3

1.1.1 Định nghĩa chất bảo quản 3

1.1.2 Phân loại chất bảo quản 3

1.2 Giới thiệu về chất bảo quản nhóm Nisin (E234) 3

1.2.1 Lịch sử phát hiện 3

1.2.2 Giới thiệu Nisin 4

1.2.3 Tính chất của Nisin 8

1.2.4 Phân loại Nisin 9

1.2.5 Cơ chế hoạt động của Nisin 10

1.2.6 Độc tính và những ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm 12

1.2.7 Giới hạn cho phép của Nisin trong thực phẩm 14

1.3 Các phương pháp xác định Nisin A và Nisin Z 16

1.3.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 16

1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng kết nối với detector UV 18

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản 19

1.3.4 Phương pháp sắc kí lỏng với detector khối phổ LC – MS/MS 20

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS 26

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26

2.2.3 Thẩm định phương pháp 27

2.3 Thiết bị, dụng cụ 27

2.3.1 Thiết bị 27

2.3.2 Dụng cụ 28

2.4 Hóa chất, chất chuẩn 29

2.4.1 Chất chuẩn 29

2.4.2 Các loại hóa chất, dung môi khác 30

2.5 Phương pháp nghiên cứu 30

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 30

2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu 3031

2.5.3 Phương pháp phân tích 32

2.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

2.5.5 Phương pháp thẩm định: theo quy định của ISO 17025, AOAC 34

2.5.6 Phương pháp định lượng 3738

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS 39

3.1.1 Tối ưu các thông số của detector (MS/MS) 39

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng 40

3.2 Khảo sát quá trình xử lý mẫu 46

3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch amoni acetate - NaCl trong dung môi chiết 47

3.2.2 Lựa chọn pH trong dung dịch đệm 48

3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 49

3.2.4 Khảo sát thời gian rung siêu âm 50

3.2.5 Khảo sát số lần chiết mẫu 51

3.2.6 Tối ưu hóa quy trình làm sạch mẫu 52

3.2.7 Khảo sát tốc độ rửa giải qua cột chiết pha rắn 53

3.3.1 Độ đặc hiệu của phương pháp 56

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn 5758

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 59

3.3.4 Độ lặp lại 5960

3.3.5 Độ đúng (độ thu hồi) 61

3.4 Phân tích mẫu thực tế 6364

KẾT LUẬN 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

TIẾNG VIỆT 67

TIẾNG ANH 6768

PHỤ LỤC 74

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

AOAC Association of Official

Analytical Chemmist

Hiệp hội các nhà phân tích chính

thức

CE Collision energy Năng lượng va chạm ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử

IP Identification point Điểm nhận dạng

IUPAC International Union of Pure

and Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học cơ

bản và ứng dụng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa

UHPLC Ultra high performance

liquid chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TFA Acid Triflouroacetic Acid Triflouroacetic

UHPLC-MS/MS

Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ hai lần

Hình 1.1 Cấu tạo chung Nisin 5

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Nisin A 6

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử Nisin Z 6

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động Nisin lên tế bào chất 12

Hình 2.1 Hệ thống thiết bị UPLC – MS/MS 28

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến để xác định Nisin A và Nisin Z 32

Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ acid formic 43

Hình 3.2 Sắc đồ chương trình gradient 1 45

Hình 3.3 Sắc đồ chương trình gradient 2 45

Hình 3.4 Sắc đồ chương trình gradient 3 45

Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chiết mẫu 47

Hình 3.6 Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm 48

Hình 3.7 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung dịch đệm và MeOH 4950

Hình 3.8 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết 5051

Hình 3.9 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 5152

Hình 3.10 Ảnh hưởng của quy trình làm sạch 5253

Hình 3.11 Ảnh hưởng của tốc độ rửa giải 5354

Hình 3.12 Đồ thị khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 5455

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình tối ưu phân tích Nisin 5556

Hình 3.14 Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu trắng 5657

Hình 3.15 Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu chuẩn 5657

Hình 3.16 Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu trắng thêm chuẩn 5657

Hình 3.17 Đường chuẩn Nisin A 58

Hình 3.18 Đường chuẩn Nisin Z 5859

Bảng 1.1 Giới hạn tối đa cho phép đối với Nisin trong thực phẩm 15

Bảng 1.2 Bảng tóm tắt một số nghiên cứu xác định Nisin A và Nisin Z bằng các phương pháp khác nhau 23

Bảng 2.1 Yêu cầu về số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau 35

Bảng 3.1 Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 40

Bảng 3.2 Chương trình gradient được lựa chọn 42

Bảng 3.3 Chương trình rửa giải gradient 44

Bảng 3.4 Điều kiện tách, định lượng Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS 45

Bảng 3.5 Số điểm IP của Nisin A và Nisin Z 5657

Bảng 3.6 Phương trình đường chuẩn của Nisin A và Nisin Z 5758

Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Nisin A và Nisin Z 59

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 60

Bảng 3.9 Độ thu hồi của Nisin A trên các nền mẫu khác nhau 61

Bảng 3.10 Độ thu hồi của phương pháp với Nisin Z trên các nền mẫu khác nhau 62

Bảng 3.11 Kết quả phân tích 64

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được

sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng để tạo ra những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các nhóm chất bảo quản để tăng giá trị thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm Trên thị trường hiện nay,

có rất nhiều loại chất bảo quản dùng để kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm, nhưng đa

số các chất này được tổng hợp nhân tạo đã gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn do khó bị phân huỷ, để lại dư lượng trong thực phẩm Gây ngộ độc cấp tính nếu liều lượng dùng quá giới hạn cho phép, gây ngộ độc mãn tính nếu dùng với thời gian kéo dài, liên tục, nguy cơ gây hình thành khối u, đột biến gen… [21, 22, 62] Do đó, các nhà nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất ngày càng có xu hướng sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tự nhiên để dần thay thế chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, mà vẫn đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm an toàn, đảm bảo chất lượng, kéo dài được thời gian sử dụng Việc sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacteriocin, đặc biệt là Nisin A và Nisin Z trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều Ngoài khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng hoá chất, nhiệt độ, chiếu xạ, Nisin còn có nhiều ưu điểm khác như phạm vi ứng dụng rộng, giảm thời gian và nhiệt độ thanh trùng của sản phẩm, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm

Mặc dù nhóm chất bảo quản Nisin được coi là khá an toàn đối với sức khỏe con người và không gây ảnh hưởng đến môi trường, nhưng cần tuân thủ theo các quy định khác nhau của mỗi quốc gia về mức cho phép Nisin trong thực phẩm Hiện nay trên thế

giới và trong nước đã có một số nghiên cứu được công bố về phương pháp xác định riêng rẽ hoặc đồng thời Nisin A và Nisin Z bao gồm: phương pháp sinh học [48] [63], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV-Vis [41], điện di mao quản (CE) [58] [59], sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [3] [25] [38] [57] Tuy nhiên, phương pháp HPLC, CE hay sinh học thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu cũng như kích thước lớn của phân tử Nisin Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm phân tích nhanh, tiết kiệm thời gian và dung môi, độ nhạy cao và nhận diện được đồng thời các hợp chất có tính chất và cấu trúc tương đồng nhau nên đã được lựa chọn

để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong nghiên cứu này Trên cơ sở đó, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z

trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)”

với các mục tiêu như sau:

 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)

 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số sản phẩm dinh dưỡng

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về chất bảo quản

1.1.1 Định nghĩa chất bảo quản

Chất bảo quản là các hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào sản phẩm như thực phẩm, dược phẩm, sơn, các mẫu phẩm sinh học v.v để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học Chúng có thể được sử dụng như là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác

1.1.2 Phân loại chất bảo quản

Theo mục đích của quá trình, có thể phân loại chất bảo quản thành hai nhóm:

- Nhóm chất bảo quản (preservative) thường được gọi là chất bảo quản: Ngăn ngừa

vi sinh vật, nấm nem, nấm mốc phát triển

- Các chất kháng sinh: Steptomixin, các loại penixilin

- Nhóm chất ngăn chặn quá trình oxi hóa các thành phần dinh dưỡng của sản phẩm, thường được gọi là chất chống oxi-hóa (antioxidant): acid scorbic, acid citric, acid tactric, dẫn xuất tocopherol… Có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu của thực phẩm

Theo nguồn gốc của chất bảo quản có thể chia chúng thành:

- Chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên: Là những chất chiết xuất từ tự nhiên, có khả năng kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm

- Chất bảo quản tổng hợp: Được tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp hóa học

1.2 Giới thiệu về chất bảo quản nhóm Nisin (E234)

1.2.1 Lịch sử phát hiện

Nisin được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 từ hiện tượng Streptococcus lactis gây ức chế Lactobacillus bulgaricus [51]

Năm 1985, theo khoá phân loại của Schleifert và cộng sự, phân loại chủng sinh

tổng hợp Nisin thuộc loài Lactococcus lactis [56]

Năm 1947, Mattick và Hirsch đã nghiên cứu thành công đặc tính của phân tử và tên thuật ngữ đầu tiên được đặt là “ chất ức chế Nisaplin” [42]

Năm 1951, Hirsch đã chứng minh việc sử dụng chủng vi khuẩn Lactococcus

Lactic sinh Nisin làm giống khởi động có thể ngăn chặn sự hư hỏng phomat gây ra

bởi Clostridium butulium [33]

Năm 1957, Apilin và Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại đầu tiên Dạng chế phẩm Nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường đó là NisaplinTM, với thành phần 2,5% Nisin

Năm 1959, Nisin được chấp thuận để sử dụng làm chất bảo quản ở Anh [65] Năm 1969, tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới (FAO/WHO) đã chính thức công nhận Nisin là an toàn và cho phép sử dụng như chất bảo quản thực phẩm với liều lượng 400IU/g [6] [16] [36] [37] [50] [54]

Năm 1971, Gross và Morell đưa ra cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử Nisin [27] Năm 1988, Nisin chính thức được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) công nhận là an toàn và coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học [36] [46] [50] [54]

Năm 1995, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã phê duyệt cho một

số sản phẩm thực phẩm với việc sử dụng Nisin (E234) làm chất bảo quản cho ngành công nghiệp theo Chỉ thị 95/2/EC [5]

Hiện nay, Nisin được sử dụng ở trên hơn 50 quốc gia bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi [4] [6] [16] [17] [35] [50]

1.2.2 Giới thiệu Nisin

Nisin là một bacteriocin, có bản chất là một peptid đa vòng có tính kháng khuẩn

mạnh, chứa 34 acid amin, được sản xuất bằng cách lên men sử dụng nhóm vi khuẩn

Gram (+) thuộc loài Lactococcus, Streptococcus [19] [39] Nó là bacteriocin duy nhất

đã được Tổ chức Y tế Thế giới cho phép sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm và nó được thương mại hóa dưới dạng bột cô đặc khô Hoạt chất này chứa các acid amin không

thông dụng như Lanthionin (Lan), Methyllanthionin (Melan), Didehydroalanin (Dha) và

Didehydroalaninbutyric (Dhb)

Cho tới nay, các nhà khoa học đã phát hiện được 6 biến thể Nisin khác nhau từ

A đến Z và U Trong khuôn khổ luận văn này chỉ nghiên cứu hai biến thể tự nhiên là Nisin A và Nisin Z

Công thức phân tử Nisin A: C143H230N42O37S7, khối lượng phân tử: 3358,53 (Da), pI 8,52

Công thức phân tử Nisin Z: C141H245N41O46S7, khối lượng phân tử: 3335,91 (Da), pI 8,51

Công thức cấu tạo chung của Nisin trong hình 1.1

Hình 1.1 Cấu tạo chung Nisin

Cấu trúc phân tử của Nisin A và Nisin Z được thể hiện trong hình 1.2 và 1.3

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Nisin A

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử Nisin Z

Cấu trúc của Nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971 [27] Hợp chất

Nisin là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn gọi là nhóm Lantibiotic trong hệ thống phân loại

4 nhóm Nisin được cấu tạo bởi 34 acid amin, trong đó có một số acid amin dị thường như:

sự khử nước ở acid amin serine và threonine tạo acid amin Dehydroalanine (Dha) và

Dehydrobutyrine (Dhb) Các acid amin liên kết nhau qua cầu nối lưu huỳnh tạo 5 vòng

cấu trúc đặc trưng A, B, C, D, E, (hình 1.2 và hình 1.3) [27] và được tổng hợp bởi một

số chủng thuộc dưới loài L.lactis subsp lactis, thường được viết là L Lactis [12] [34]

[64]

Nisin có cấu trúc xoắn α tương tự colixin, khoảng cách của cầu nối C – S là 1,83

A0 và góc C – S – C là 103 A0 Phân tử Nisin có gốc amin và cacboxyl ở cuối nhóm, năm vòng bên trong được tạo bởi liên kết thioether Vòng đầu tiên Ala-S-Ala là

Lanthionine, 4 vòng còn lại Abu-S-Ala là các β-methyllanthionine Ngoài cầu nối

disulfide giữa dạng Lanthionine với methyllanthionine, mạch peptide còn nối với nhau

bằng –NH− tạo ra dạng polymer hay nhiều monomer [34]

Nisin không hấp phụ ở bước sóng 260 nm hay 280 nm do trong cấu trúc phân tử của nó không chứa các acid amin thơm Các acid amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile), được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan Có thể vì các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo Nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích Cấu trúc gồm 5 vòng của Nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt

Nisin có thể tồn tại ở dạng monomer với khối lượng phân tử 3500 Da (3.5Kda)

Do các phân tử Nisin có thể tương tác liên kết với nhau thông qua các nhóm acid

Dehydroamin và các nhóm amin nên Nisin có thể tồn tại ở dạng dimer ổn định hơn hay

tetramer với khối lượng phân tử tương ứng là 7000Da và 14000 Da [7]

Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây chứng minh Nisin bao gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z Trong tự nhiên, một số loại Nisin đã được xác định Các biến thể chính được gọi là Nisin A, Z và Q với các hoạt tính sinh học khác nhau, tuy nhiên Nisin là A và Zlà hai biến thể được ứng dụng nhiều nhất Cấu tạo của Nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một acid amin ở vị trí thứ 27, histidine trong cấu trúc của Nisin A, trong khi asparagine ở

Nisin Z Các nghiên cứu cuối cùng đã chỉ ra rằng Nisin Z dễ hòa tan hơn Nisin A ở độ

pH gần trung tính vì asparagin có chuỗi bên phân cực nhiều hơn so với histidine Sự khác biệt về cấu trúc này không ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn nhưng nó làm thay đổi một số tính chất: Nisin Z dễ hòa tan hơn và sự phân bố của nó trong thực phẩm được chứng minh là cao hơn [9]

1.2.3 Tính chất của Nisin

Nisin là một bacteriocin tương đối bền nhiệt Hoạt tính kháng khuẩn của Nisin

được giữ lại hoàn toàn ở pH = 2,0 sau khi hấp tiệt trùng ở 121°C nhưng mất hoàn toàn sau 30 phút ở 63°C ở pH = 11[30] Độ bền nhiệt của Nisin phụ thuộc vào pH, pH càng

thấp thì độ bền nhiệt càng cao [52] So với các bacteriocin khác, Nisin có độ bền nhiệt

hơn hẳn

Nisin là một hợp chất tan trong nước và không tan được trong dung môi không phân cực Khả năng hoà tan của Nisin cũng phụ thuộc nhiều vào môi trường pH Nó hòa tan tốt nhất ở pH = 2,0, tại pH = 2,5 giảm xuống còn 60%, tại pH = 5,0 giảm xuống còn 4% và hầu như không tan ở pH trung tính và kiềm Nisin hòa tan ở pH = 2,0 nhiều hơn 228 lần so với ở pH = 8,0 [40] Khi hoà tan Nisin trong HCl pH = 2,5 (hoặc thấp hơn) tại nhiệt độ sôi mà không mất hoạt tính và thậm chí khi thanh trùng cũng không mất hoạt tính Nisin có độ hoà tan thấp ở pH trung tính [34] Khi pH >7 xảy ra hiện tượng mất hoạt tính không thể khắc phục kể cả ở nhiệt độ thường [34]

Nồng độ muối cũng ảnh hưởng đến độ bền của Nisin Hoạt tính Nisin tăng lên khi có mặt NaCl từ 0% đến 4% Trong dung dịch 4 – 10% NaCl, hoạt tính Nisin còn giữ được 80% [2] Tính chất này cho thấy tiềm năng áp dụng Nisin trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm có nồng độ muối cao

Theo Linda J Harris và cộng sự (1992) [31], H Chen và D.G Hoover năm

2003 [6] Nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin

Nisin bị phá huỷ bởi một số protease nhóm enzym thủy phân như

α-chymotripsin, proteinase K của Bacillus cereus, Nisin thường bị hạn chế bởi một số

protease đặc biệt là protease của dạ dày và của tuyến tuỵ Nisin không được tìm thấy trong nước bọt của con người sau hơn 10 phút ăn thực phẩm có chứa Nisin Đây là yếu

tố quan trọng giúp Nisin trở thành một trong những chất bảo quản thực phẩm an toàn đối với con người được tin tưởng sử dụng hiện nay

1.2.4 Phân loại Nisin

Có ít nhất 6 dạng Nisin đã được phát hiện, ký hiệu từ A, Z, Q, F, H, và U Nisin

A [27], Nisin Z [43], Nisin Q [68] và Nisin F [14] Nisin U [66], Nisin H [45] Nisin A

và Nisin Z khác nhau ở vị trí acid amin thứ 27 (Nisin A - histidin; Nisin Z –asparagin) Nisin A và Nisin F khác nhau ở 2 vị trí acid amin thứ 27 (Nisin A histidin; Nisin F- asparagin) và vị trí 30 (Nisin A- isoleucine và Nisin F- valine) Nisin Q khác biệt hơn

cả, khác Nisin A ở 4 acid amin (ở vị trí thứ tự 15, 21, 27 và 30) và khác Nisin Z ở 3 acid amin (ở vị trí thứ tự 15, 21 và 30) Cho đến nay, bốn biến thể Nisin tự nhiên đã được nghiên cứu đặc tính là Nisin A, Z, Q và Nisin U Trừ trường hợp Nisin U được

tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis, tất cả các biến thể Nisin khác đều do

Lactococcus lactis sản xuất

Nisin A, Z và Q bao gồm 34 acid amin, trong đó 8 acid được biến đổi sau chuyển

dịch Mỗi phân tử trưởng thành này chứa một Lanthionine, bốn Methyllanthionin, hai

Didehydroalanines và một Didehydrobutyrine [27] [43] [68] Các Lanthionine tạo thành

năm cấu trúc vòng (được ký hiệu là vòng A, B, C, D và E), và hai trong số các vòng này (D

và E) được hợp nhất với nhau để tạo ra cấu trúc vòng kép Cấu trúc của Nisin U về cơ bản

giống nhau, mặc dù nó được cấu tạo bởi 31 acid amin và chỉ có một Didehydroalanin thay vào đó là hai Didehydrobutyrines [66] Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi quan tâm

nghiên cứu đến hai chất là Nisin A và Nisin Z Vì Nisin A và Nisin Z khá bền vững, phần đặc tính tương tự như kháng sinh được sử dụng làm chất bảo quản trong thực phẩm

1.2.5 Cơ chế hoạt động của Nisin

Nisin thuộc bacteriocin nhóm I-, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B cereus,

Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L monocytogens, L innocua, L.grayi, L.ivanovii, L.murayi, L.seeligeri, L.welchimeri, Staphylococus spp Giá trị

quan trọng của Nisin đối với việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên

các vi khuẩn sinh bào tử như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và

Cl.Tyrobutiricum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus [12] [19] [20] [34] [49] Nisin có

khả năng ức chế sự nảy mầm của chúng Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, acid thì Nisin có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [8]

Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E coli bị ức chế khi có mặt của

EDTA Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-) đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng Điều này được giải thích là do sự khác nhau của thành

tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Bacteriocin chỉ tạo được lỗ thủng trên thành

tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-)[19]

Tác dụng của Nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình

 Kiểu tác dụng không đặc trưng:

Nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm của vi khuẩn mà không cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bào, tại các lỗ thủng làm mất áp suất thẩm thấu các ion di chuyển qua màng tế bào một cách tự do dẫn đến sự rối loạn trong việc vận chuyển các chất dinh dưỡng qua màng tế bào làm thất thoát các ion tự do như kali, magie ra ngoài, ảnh hưởng đến sự tổng hợp ATP dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [20] Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi bổ sung Nisin

vào các tế bào nhạy cảm (Staphylococcus cohnii, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus,

Streptococcus zymogenes) số lượng acid amin cũng như số lượng các ion RB+ và

K+ trong tế bảo giảm mạnh, ngăn cản việc hấp thu proline và glutamin của các túi màng ở các tế bào này Sự mất mát các ion này dẫn đến việc giảm nhanh chóng chênh lệch hiệu điện thế màng Δ Những ảnh hưởng của Nisin đến thành phần proton, Δ,

ΔpH, đã được kiểm chứng trên L.monocytogenes Ngoài ra, làm giảm lượng ATP dự

trữ của tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [20] Năm

1993 Garriga và cộng sự [26] cho rằng Nisin tạo thành lỗ hổng trên màng giống như các kênh ngăn chặn (barrel-stave ) theo 3 bước: (1) các monome Nisin tạo liên kết với một màng mục tiêu, (2) Nisin chèn vào màng, (3) các phân tử Nisin tổng hợp để tạo thành lỗ hỏng trên màng tế bào chất Các phân tử Nisin cũng có thể tổng hợp trước khi chèn vào màng tế bào

có hiệu quả Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà

chỉ cho phép các hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng Lớp ngoài cùng của màng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán kị nước [32] Chính nhờ lớp màng ngoài OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của các bacteriocin Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảm chức năng rào cản của lớp màng ngoài OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức

“càng” (chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốc thẩm thấu Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp với

bacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) EDTA là hợp chất được nghiên cứu

nhiều nhất về tác động kết hợp Nisin đối với vi khuẩn Gram (- )

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động Nisin lên tế bào chất

1.2.6 Độc tính và những ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm

Nghiên cứu độc tính được thực hiện ở động vật thí nghiệm với hàm lượng Nisin cao hơn nhiều so với mức hàm lượng thường được sử dụng trong thực phẩm, cho thấy Nisin không độc hại và không gây ung thư Nisin bị bất hoạt nhanh chóng trong ruột bởi các enzyme tiêu hóa và không thể được phát hiện trong nước bọt của con người 10 phút sau khi tiêu thụ chất lỏng chứa 5mg/L Nisin Không có bằng chứng về sự nhạy cảm (vấn đề dị ứng) và các nghiên cứu vi sinh học đã không cho thấy bất kỳ vấn đề phản kháng chéo nào có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của kháng sinh trị liệu

Năm 1969, theo tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới (FAO/WHO) đã xem xét dữ liệu độc tính của Nisin và khuyến nghị sử dụng nó như một chất bảo quản thực phẩm, với lượng tiêu thụ hàng ngày chấp nhận được (ADI) là 0,825 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày

Năm 1988, Cục Thuốc và Dược phẩm của Hoa Kỳ cho phép sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm, tại Hoa Kỳ trong bảo quản pho mát nhằm ngăn chặn sự bùng phát

của bào tử Clostridial và các loại sinh độc tố Nisin được sử dụng với liều lượng

10.000 IU/g cao gấp 25 lần liều dùng thông thường [6] [13] [17] [18]

Đến nay Nisin A đã được sử dụng rộng rãi ở trên 50 quốc gia Nisin được sản xuất dưới dạng sản phẩm thương mại và đã được sử dụng như là một chất bảo quản sinh học trong các sản phẩm như: sữa và thịt và các sản phẩm từ sữa và thịt, trong thủy sản, đồ uống lên men như nước ép trái cây, các loại nước sốt, các chế phẩm thức ăn nhanh và đồ đóng hộp…[29]

Sử dụng Nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên men acid lactic Bổ sung Nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài quá trình cất giữ bia Nisin còn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chế biến

từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói Để bảo quản thực phẩm, Nisin có thể bổ sung với hàm lượng 100mg/kg- 200mg/kg và tối đa là 500mg/kg Do đặc tính bền nhiệt, bền

vững trong điều kiện pH acid hoặc trung tính, bacteriocin là một giải pháp hay trong

bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men

Các bacterioxin từ vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng ở dạng tinh sạch hoặc

thô để bảo quản một số sản phẩm từ thịt, hoặc bổ sung bằng cách trực tiếp cấy vi khuẩn

lactic vào nguyên liệu ban đầu Do vậy giải pháp bacterioxin do giống khởi động hoặc

đồng giống khởi động sản xuất trực tiếp vào thực phẩm, được áp dụng cho các sản phẩm lên men từ thịt, rau, sữa như xúc xích lên men, rau quả lên men, phomat…[39]

Đối với các sản phẩm thực phẩm không lên men (thịt, cá, rau xanh…),

bacteriocin đóng vai trò là chất bảo quản, giữ cho thực phẩm được tươi lâu hơn do nó

ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây thối, vi sinh vật gây bệnh trong sản phẩm tự nhiên

Trên thế giới Nisin được sử dụng ở châu phi gồm Ai Cập, Mauritius, Tunisia và Nam Phi, mặc dù ở Nam Phi được phép dùng trong chế biến pho mát truyền thống, pho mát mềm và các sản phẩm làm từ pho mát Tiêu chuẩn Hoa Kỳ không cho phép có mặt

Listeria monocytogenes trong thực phẩm từ thịt, sữa Việc bổ sung Nisin từ 400- 800

IU/g kết hợp với 2% NaCl có tác dụng diệt L.monocytogenes trong thịt trâu băm [47] ngăn chặn sự phát triển của các bào tử Clostridium botulium và sự hình thành độc tố vi

khuẩn này trong quá trình lưu trữ phô mai, các loại trái cây, rau Nisin với nồng độ 100

IU/ml có khả năng ức chế L monocytogenes trong phomát thời gian 8 tuần [55] Nisin với nồng độ thấp (50IU/ml) kết hợp với các bacterioxin khác như curvatixin 13(160AU/ml) có tác dụng mạnh ức chế L.monocytogenes, hơn hẳn việc sử dụng từng loại bacterioxin riêng biệt [11]

Một số lĩnh vực chế biến thực phẩm ở Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu

sử dụng Nisin làm chất bảo quản Một số lĩnh vực chế biến thực phẩm ở Việt Nam như sản xuất nước mắm được thực hiện chủ yếu ở quy mô nhỏ, gặp nhiều khó khăn trong khâu ổn định chất lượng Nisin bền nhiệt, chịu được độ muối, ngăn chặn sự phát triển

của vi khuẩn, bào tử chịu nhiệt gây thối hỏng thực phẩm như Bacillus cereus và

Clostridium thermosaccharolyticum, do vậy rất có tiềm năng trong lĩnh vực này Nisin

có hoạt tính diệt khuẩn thích hợp cho các loại thực phẩm bảo quản ở nhiệt độ thấp và nhiệt độ phòng Như khi sử dụng Nisin để bảo quản bún, thời gian bảo quản kéo dài từ

1 ngày (không có Nisin) lên 2 ngày (có bổ sung Nisin) Ngoài ra Nisin còn ứng dụng trong việc chế tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn ứng dụng để bảo quản thực phẩm lên men như nem chua và bánh cốm

1.2.7 Giới hạn cho phép của Nisin trong thực phẩm

Hàm lượng của mỗi loại chất bảo quản cho phép sử dụng đối với từng loại thực phẩm được quy định rất khác nhau ở các nước, căn cứ vào đặc điểm sinh lý, sinh thái,

nhất là đặc điểm dinh dưỡng, thói quen ăn uống của người dân từng nước Trong thực phẩm, người ta thường sử dụng Nisin ở các nồng độ khác nhau, từ 1-25 mg/kg tùy thuộc vào loại thực phẩm Qua tham khảo tài liệu [44] và Thông tư 24/2019/TT-BYT, từng nước quy định giới hạn cho phép của Nisin được nêu trong bảng 1.1

Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHO Expert Committee on Food Additive) mức dung nạp hàng ngày có thể chấp nhận (ADI – Acceptable Daily Intake)

là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao, đến năm 1988 FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính toán đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1 người/ 1 ngày

Theo ủy ban khoa học về thực phẩm (SCF- Scientific committee for food), đưa

ra ADI là 0,13 mg/kg thể trọng, giá trị này được công bố từ năm 1990 và được ủy ban

an toàn thực phẩm Châu Âu xác nhận vào năm 2006

Bảng 1.1 Giới hạn tối đa cho phép đối với Nisin trong thực phẩm

mai

12

Australia và New Zealand Sản phẩm thịt chế biến và gia cầm 12,5

Nga Phô mai, rau đóng hộp, xúc xích 12,5

12,5

Đồ ăn tráng miệng làm từ ngũ cốc và

1.3 Các phương pháp xác định Nisin A và Nisin Z

Đã có rất nhiều phương pháp đã được nghiên cứu để định lượng nhóm chất bảo quản này trên các đối tượng như phô mai, sữa, và các sản phẩm của sữa… Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được sử dụng Trong nước, phương pháp sắc kí lỏng ghép nối khối phổ đã được ban hành thành tiêu chuẩn để xác định Nisin A trong phomat [3]

1.3.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA(Enzyme ImmunoAssay)

là một kỹ thuật sinh hóa dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Nisin chuẩn được cộng hợp với enzyme, tạo thành phức hợp Nisinenzyme và được sử dụng như một kháng nguyên ở nồng độ nhất định, cạnh tranh với Nisin có trong mẫu Kháng thể đặc hiệu với Nisin được gắn lên bề mặt giếng nhựa polystryren Dịch chiết mẫu trong 0,05% Tween 20 trong dung dịch muối đệm phosphat 0,01 M pH =7,2 được trộn cộng hợp với Nisin – enzyme và được cho vào giếng có phủ kháng thể, các Nisin có trong mẫu (nếu có) sẽ cạnh tranh với phức hợp Nisin- enzyme để gắn vào kháng thể cố định trên polystryren Sau đó rửa sạch các phức hợp thừa, cơ chất phản ứng với enzyme được đưa vào tạo màu Ủ một thời gian sau đó thêm vào dung dịch ngưng phát màu để tạo điều kiện đồng đều về thời gian cho mọi giếng Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu và dãy chuẩn bằng máy đo màu,

từ đó tính được nồng độ của Nisin có trong mẫu Màu càng đậm chứng tỏ cộng hợp Nisin – enzyme được giữ trong giếng càng nhiều, đồng nghĩa với nồng độ Nisin trong mẫu càng thấp Ngược lại, màu càng nhạt thì nồng độ Nisin càng cao

Tác giả Falahee; A Morris cùng cộng sự [23], sử dụng kháng huyết thanh đa dòng để xác định Nisin A Cân khoảng 25 ± 0,1g mẫu pho mat, hòa tan trong 10 ml dung dịch HCl 0,02 M Chỉnh pH 2,0 ± 0,1 Mẫu được gia nhiệt ở 98°C trong 5 phút Sau khi làm lạnh đến 20oC, đưa về thể tích 12,5ml bằng dung dịch HCl 0,02M và được

ly tâm 4000 vòng trong 20 phút ở 4°C Để ở 4 - 7°C trong 30 phút và lọc qua hai lần lớp giấy lọc Whatman để thu được dịch lọc trong Tiến hành phân tích trên ELISA Kết quả thu được so sánh với kết quả từ xét nghiệm sinh học Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 250µg/L, hiệu suất thu hồi đạt 85% và tương quan tốt với xét nghiệm sinh học

Bouksaim; E Simard cùng cộng sự [10], sử dụng kháng thể đa dòng Nisin cụ thể (PAb) được tạo ra ở thỏ để xác định Nisin Z Lấy khoảng 2-5mL sữa tươi hòa tan trong 10 ml dung dịch HCl 0,02M Điều chỉnh pH 2,0 ± 0,1 bằng acid HCl 6N Các mẫu được gia nhiệt đến 100°C trong 5 phút Sau khi làm lạnh đến 20°C, đưa về thể tích 12,5ml bằng dung dịch HCl 0,02M và được ly tâm 4000 vòng trong 20 phút ở 4°C Để

ở nhiệt độ 4 - 7°C trong 30 phút và được lọc qua bộ lọc vô trùng Sartorius MinisartR 0,22µm (Sartorius AG, Gottingen, Đức) để thu được dịch chiết trong Trước khi thử nghiệm ELISA, tất cả các mẫu được điều chỉnh về pH 6,0 bằng cách sử dụng NaOH 6N Các dung dịch chiết xuất từ sữa, không thêm Nisin Z, đã được chuẩn bị như trên và được sử dụng làm mẫu chứng không có Nisin trong thử nghiệm ELISA Các mẫu sữa được lọc trực tiếp qua bộ lọc Sartorius 0,22 µm, được điều chỉnh đến pH 6,0 và phân tích sau khi được bổ sung Nisin Z như trên Phương pháp này có giới hạn phát hiện là LOD 1,7µg/L, hiệu suất thu hồi đạt 50–63%

Suarez; AzconaOlivera cùng cộng sự [61] đã mô tả một thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết trực tiếp với enzym (CD - ELISA) cho Nisin A và Nisin Z trong pho

mát, sữa và váng sữa dựa trên các kháng thể đơn dòng của chuột với quy trình chiết mẫu thực hiện như mô tả của M.B.Falahee, A Morris cùng cộng sự [24] Giới hạn phát hiện 5–10 µg/L Hiệu suất thu hồi đạt 116,5% Phương pháp này đơn giản, tiết kiệm dung môi, nhạy hơn đáng kể so với phương pháp xét nghiệm sinh học nhưng nó không hoàn toàn đáng tin cậy do phản ứng chéo với Subtilin một chất có công cấu trúc gần giống với Nisin, gây ra hiện tượng âm tính và dương tính giả, mặt khác nó phát hiện cả Nisin có hoạt tính sinh học và các phân tử phân hủy không hoạt động của nó Do vậy, việc xác nhận các mẫu dương tính bằng phương pháp LC/MS-MS là rất cần thiết

1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng kết nối với detector UV

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất giữa hai pha luôn tiếp xúc với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao còn pha tĩnh là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 -

7 μm Một số loại detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (DAD), detector khối phổ (MS) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC với cột tách pha đảo đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất

Tác giả Delves-Broughton and Friis (1998) [15], Matusaki cùng cộng sự (1995)

[41] đã phát triển phương pháp HPLC với detector UV- Vis để xác định Nisin A Chuẩn bị dung dịch Nisin chuẩn từ Nisin (Sigma): từ dung dịch chuẩn (nồng độ Nisin 2,5 g/L Nisin); pha loãng bằng dung dịch HCl 0,02 N để có các nồng độ Nisin (µg/L):

0,05; 0,125; 0,25; 0,75; 1 Sử dụng cột C18 pha đảo (Inertsil ODS-2/4.6x250 mm) Pha

động gồm acetonitrile (dung dịch A) và acid TFA 0,1% (dung dịch B) tốc độ bơm 1mL/phút với chương trình rửa giải gradient : 0,01 phút - ACN 20% ; 10 phút - ACN 20%

; 30 phút - ACN 45% ; 50 phút - ACN 100% ; 55 phút - ACN 100% ; 60phút - ACN 20%

và 70 phút - ACN 20% Detector UV tại bước sóng 254nm Thời gian lưu của Nisin là

26,5 phút Giới hạn phát hiện LOD 0,25mg/kg Giới hạn định lượng LOQ 10mg/L Tuy nhiên ở phương pháp này chưa có một quy trình cụ thể nào để xác định Nisin A, Z trên mẫu thực tế

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Nguyên tắc của kỹ thuật điện di mao quản (CE) là dựa trên cơ sở tính chất điện

di (sự di chuyển) của các phân tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong ống mao quản (đường kính 30 - 200 μm) trên nền dung dịch chất điện ly và chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường xác định được cung cấp bởi một nguồn cao thế một chiều ( 10 – 50 KV) đặt vào hai đầu mao quản Phương pháp CE có ưu điểm là lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với

kỹ thuật phân tích HPLC

Tác giả Soliman and Donkor 2010 [58], đã phát triển phương pháp điện di mao quản và định lượng Nisin A trong các sản phẩm thực phẩm và đồ uống có cồn Tất cả các mẫu thực phẩm được làm tinh khiết bằng cách sử dụng các đơn vị ly tâm trọng lượng phân tử cụ thể tùy thuộc vào độ nhớt và độ phức tạp của chất nền Thời gian lọc khác nhau giữa các mẫu Thời gian lọc tối thiểu là khoảng 10 phút đối với các mẫu ít nhớt hơn như rượu vang đỏ và bia Sau đó được xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica (có chiều dài 50cm x 50µm ID), nhiệt độ không đổi ở 25oC, pha động: đệm natri phosphat 50mM, natri dodecyl sulphat (SDS) 80mM, pH 3,75; thế tách 20kV; detector UV 214 nm cho phép phát hiện thành công Nisin A trong vòng 6 phút Hiệu suất thu hồi từ 83% đến 104% Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) lần lượt nằm trong khoảng 0,3–0,8mg/L và 1,0–2,8mg/L

Standley et al 2009 và cộng sự [60], đã ứng dụng và phát triển phương pháp điện di mao quản để định lượng các chất phân tích như Nisin A, Gallidermin, Duramycin và Cinnamycin trong nền mẫu bia, sữa Tất cả các mẫu thực phẩm được làm tinh khiết bằng cách sử dụng các đơn vị ly tâm trọng lượng phân tử cụ thể tùy thuộc vào độ nhớt và độ phức tạp của chất nền Thời gian lọc khác nhau giữa các mẫu

Sau đó được xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica (có chiều dài hiệu dụng là 41 cm và tổng chiều dài 52 cm x 50 µm ID), pha động: đệm natri phosphat 50 mM, natri dodecyl sulphat (SDS) 80mM, pH 3,95; thế tách -15kV; detector UV 214nm cho phép phát hiện thành công Nisin A, Gallidermin, Duramycin

và Cinnamycin trong vòng 12 phút Giới hạn phát hiện (LOD) Gallidermin 61 ng/mL, Cinnamycin 57ng/mL, Duramycin 55ng/mL, Nisin A58 ng/mL Hiệu suất thu hồi từ 86,1% đến 99,6%

Mặc dù phương pháp này hiệu quả, nhạy và nhanh chóng, không cần chiết phức tạp tuy nhiên phương pháp này mới chỉ xác định được Nisin A mà chưa xác định được đồng thời cả Nisin Z Hệ thống thiết bị còn hạn chế tại các phòng thí nghiệm Việc xây dựng phương pháp xác định đồng thời cả Nisin A và Nisin Z là rất cần thiết

1.3.4 Phương pháp sắc kí lỏng với detector khối phổ LC – MS/MS

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây Về cơ bản, nó

là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ Sau khi qua cột tách các hợp chất hữu cơ trung hòa bị ion hóa thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion được đưa sang bộ phận tách khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân

tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hang dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính, định lượng chất phân tích một cách chính xác Phương pháp có này có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được

N Schneider, K Werkmeister, M Pischetsrieder 2011 [57], đã ứng dụng và phát triển phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để xác định Nisin A và Nisin Z trong phô mai chế biến Quá trình chuẩn bị mẫu gồm có việc chiết Nisin ra khỏi mẫu bằng sử dụng hỗn hợp acid formic 0,5% trong đó có 2 μg/mL of BSA và 20% acetonitrile trong

nước pH = 2,0, sau đó được điều chỉnh về pH = 4,6; lọc qua màng lọc và đem phân tích

LC – MS/MS Điều kiện chạy máy pha động kênh A là acid formic 0,1% (v/v), kênh B acetonitrile 100% Mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc của Nisin A và Nisin Z là mảnh m/z 671,7 và 667,2 tương ứng, mảnh dùng để định lượng là mảnh 810,9 đối với Nisin A; Nisin Z là mảnh m/z 804,9 Hiệu suất thu hồi từ 48 – 68% Phương pháp này xác định cả Nisin A và Nisin Z nhưng hiệu suất thu hồi thấp, quá trình xử lý mẫu phức tạp Nên việc áp dụng để xác định trong các mẫu thực phẩm còn hạn chế

Fabio Fuselli và cộng sự 2012 [25], đã ứng dụng và phát triển phương pháp để xác định đồng thời nhóm chất bảo quản bao gồm acid Benzoic, acid Citric, Hexamethylenetetramine, Lysozyme, Natamycin, Nisin và acid Sorbic trong phô mai Mẫu được chiết bằng hỗn hợp đệm gồm dung dịch NaCl 1M pha trong acid acetic 0,1M (pH

= 4,5): Methanol 100% với tỉ lệ (2/1 v/v) Mẫu được rung siêu âm 10 phút và li tâm ở tốc độ 4000rpm trong vòng 5 phút và lọc qua màng lọc cỡ 0,45µm Phương pháp tách được 7 chất bảo quản trên trong vòng 22 phút thông qua theo dõi nguồn ion hóa phun electron ESI+ Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu thực để loại trừ ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình ion hóa, phương pháp có hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,9909 – 0,999 và khoảng tuyến tính rộng từ 5 – 500mg/kg, độ thu hồi đạt từ 82 - 103% cho tất cả các chất bảo quản trên Trong phương pháp này tác giải đã khảo sát và lựa chọn cột C8 (150 mm × 4,6 mm i.d., 300 A˚, 5 µm) và cột bảo vệ (ODS, 4 mm × 2,1

mm i.d.) Hai kênh pha động sử dụng là kênh A 0,05% TFA trong acetonitrile (v/v) và kênh B acid TFA 0,05% (v/v) LOD < 1mg/kg, MDLNisin = 0,02 mg/kg, MQLNisin = 0,07mg/kg Kết quả phân tích một số mãu phô mai cho thấy hàm lượng của các chất bảo quản đều dưới nồng độ được ghi trên nhãn mác bao bì công bố của nhà sản xuất Riêng có một mẫu xác định Nisin có hàm lượng bất thường Tuy nhiên phương pháp này chỉ xác định được Nisin A mà chưa đưa ra được phương pháp tối ưu để xác định cả Nisin Z

Năm 2015 Kyung Yuk Ko, So Ra Park cùng cộng sự [38], đã nghiên cứu và đưa

ra phương pháp tối ưu để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sữa bò Mẫu được chiết bằng hỗn hợp dung dịch đệm bao gồm dung dịch amoni acetate 0,1M pha trong NaCl 1M (pH 2)/Methanol(1/1 v/v) Sau đó dung dịch được lọc qua màng lọc 0,20μm Trong phương pháp này tác giả đã sử dụng cột CW-C18 (50×2mm, 3 μm; t0¢ột

400C), pha động; kênh A acid formic 0,1% và acetonitrile 100% với chương trình rửa giải gradient Phương pháp có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính từ 12,5 đến 250 μg/kg Giới hạn phát hiện LOD Nisin A, Nisin Z tương ứng 4,3 và 3,6 μg/kg, giới hạn định lượng LOQ 12,9 and 10,9 μg/kg tương ứng Hiệu suất thu hồi 80 – 113% Ngoài định tính chất bằng thời gian lưu thì ưu điểm của phương pháp là xác nhận chính xác chất bằng sự phân mảnh phổ, mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc của Nisin A là mảnh m/z 810,9; Nisin Z là mảnh m/z 804,9 dùng để định lượng

Bộ Khoa học và công nghệ đã ban hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10137:2013 (ISO/TS 27106:2009)[3], xác định Nisin A trong phomat bằng phương pháp sắc ký lỏng – phổ khối lượng (LC-MS) và sắc ký lỏng – phổ khối lượng hai lần (LC-MS-MS) Nisin A trong mẫu phomat được chiết tách bằng dung dịch acid formic

ở 800C Protein gây nhiễu được tách ra bằng cách lọc qua màng siêu lọc UF Trong dịch chiết đã tinh sạch, Nisin A được tách bằng cách sử dụng pha tĩnh trùng hợp và dịch chiết được đưa vào hệ thống HPLC cột pha đảo PLRP – S(150mm x 2mm, 300A0, 3µm) Dung môi rửa giải theo chương trình gradient Phát hiện và định lượng bằng detector khối lượng với chế độ ion hóa ESI+ Giới hạn phát hiện của phương pháp chưa được quy định, nhưng theo kinh nghiệm giới hạn định lượng thấp nhất của Nisin

A là 1mg/kg Tuy nhiên phương pháp này chỉ có thể xác định được Nisin A mà không xác định được đồng thời Nisin A và Nisin Z, quy trình chiết mẫu phức tạp

Như vậy, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng để xác định Nisin

A và Nisin Z trong thực phẩm Dưới đây là một số kết quả xác định Nisin A và Nisin Z được trình bày tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Bảng tóm tắt một số nghiên cứu xác định Nisin A và Nisin Z bằng các

LOD/ LOQ

Cà chua đóng hộp, nước uống

có cồn

Điện di mao quản Nisin A 83-104

LOD

0,3-0,8 (mg /L)

LOQ

1,0-2,8 (mg /L)

Standley và

cộng sự (2009) Thực phẩm

Điện di mao quản

Gallidermin, Cinnamycin, 86–99,6

LOD

0,058

LC – MS/MS

Nisin A Nisin Z

Nisin A

48 – 61 Nisin Z

Nisin A 82-103

LOD 20µg/L LOQ

LOQ

Nisin A 12,9μg/kg

Nisin A Nisin Z

Nisin A

80 – 107 Nisin Z

83 – 113

LOQ

Nisin A 10,2μg/kg

Nisin Z

12,6μg/kg

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Chất phân tích: Nisin A và Nisin Z

 Đối tượng mẫu: một số sản phẩm dinh dưỡng dạng lỏng, dạng rắn (sữa bột, sữa lỏng, bơ, phomat )

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng ghép nối hai lần khối phổ (LC/MS-MS)

- Các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm:

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp(năng lượng bắn phá, thế ion hóa…)

- Khảo sát điều kiện tách sắc ký: Khảo sát loại pha động, thành phần pha động, chương trình gradient,… Ở đây loại cột và nhiệt độ buồng cột là không thay đổi (cột tách được giữ ở nhiệt độ phòng, bộ phận bơm mẫu tự động ở 100C)

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát nồng độ dung dịch đệm chiết CH3COONH4 – NaCl: (0,01 – 0,1M); (0,05 – 0,5M); (0,1 – 1M); (0,2 – 2M); (0,3 – 3M)

- Khảo sát pH dung dịch đệm chiết: pH = 2,0; pH = 2,5; pH = 3,0; pH = 4; pH= 5,0; pH = 6,6

- Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết: CH3COONH4 0,1M – NaCl 1M / MeOH (1/2; 1/1; 2/1)

- Khảo sát thời gian rung siêu âm : 5 phút; 10 phút; 20 phút; 30 phút

- Khảo sát số lần chiết mẫu: 1 lần; 2 lần; 3 lần

- Khảo sát quy trình làm sạch:

+ Quy trình 1: Lọc dung dịch chiết bằng giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,22 µm + Quy trình 2: Làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE C18

2.2.3 Thẩm định phương pháp:

- Độ đặc hiệu/độ chọn lọc

- Xây dựng đường chuẩn

- Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn định lượng (LOQ)

- Độ lặp lại

- Độ thu hồi

2.2.4 Phân tích hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng

- Lấy một số nhóm mẫu tại địa bàn Hà Nội như: sữa lỏng, sữa bột, bơ, phomat…

- Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả

2.3 Thiết bị, dụng cụ

2.3.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC –MS/MS được thể hiện ở hình 2.1 bao gồm: hệ thống sắc ký lỏng UHPLC và hệ thống khối phổ Xevo TQ - XS của hãng Waters, hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao có khả năng tăng áp suất tối đa 300psi, có buồng điều nhiệt cột lên tới 1000C, hệ thống bơm mẫu tự động với 2 khay đựng mẫu 60 vị trí, 2 bơm dung môi áp suất cao, tự động loại khí Hệ thống khối phổ sử dụng bộ ion hóa điện hóa, điện áp tối đa của bộ ion hóa +5kV - (-5kV), nhiệt độ tối đa buồng ion hóa 5000C, điện áp tối đa cho 2 tứ cực là 50V, điện áp tối đa cho bát cực bắn phá ion

là 300V Có khả năng phát hiện các mảnh khối (m/z) từ 2 - 2048 m/z, độ phân giải 1000u/giây Tốc độ quét 15.000 u/giây, thời gian quét đổi từ ion âm sang ion dương

là 15 ms

Hình 2.1 Hệ thống thiết bị UPLC – MS/MS

- Cột tách sắc ký: Sử dụng cột Acquity BEH C18 (100 x 2,1mm, 1,7 μm (Waters)

- Bộ chiết pha rắn SPE, Waters

- Cột chiết pha rắn SPE: Supelco DSC - C18

- Máy lắc vortex, VELP

- Máy xay Philip 600W

- Máy ly tâm MIKRO 22R

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200µL; 1000µL; 5mL… đầu côn (Đức)

- Đầu tip pipet các loại: 10, 100, 250, and 1000 µL (Đức)

- Dung dịch chuẩn gốc Nisin A 100mg/L: Cân 40mg Nisin A (2,5%) chính xác đến ±

0,01 mg trên cân phân tích, hòa tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile vào bình định mức10mL Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C

- Dung dịch chuẩn gốc Nisin Z 100 mg/L: Cân 1mg Nisin Z (99%) chính xác đến ± 0,01

mg trên cân phân tích, hòa tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile vào bình định mức10mL Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian ( 10 mg/L ): Hút chính xác 1mL từng dung dịch chuẩn gốc Nisin A và Nisin Z (100mg/L) vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung dịch acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile

- Dung dịch chuẩn làm việc ( 1000µg/L ) : Hút chính xác 1mL chuẩn trung gian (10mg/L)

vào bình định mức 10mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C

- Dung dịch chuẩn làm việc trong ngày: Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung

gian 1000µg/L trong hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile để thu được các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ: 5; 10; 20; 50; 100; 250, 500, 1000 µg/L

2.4.2 Các loại hóa chất, dung môi khác

- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitrile (Merck 99,9%), acid formic (Merck 99,9%), acid clohydric (Merck), isopropanol(Merck 99,9%), Acid Triflouroacetic …

- Chuẩn bị pha động để khảo sát là acid formic với các nồng độ là: 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,3% (v/v)

- Dung dịch HCl 3N: Dùng ống đong lấy khoảng 25mL HCl đậm đặc vào bình định mức 100ml có chứa 40ml nước cất 2 lần Định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều

- Dung dịch chiết mẫu: Dung dịch đệm acetate 0,1M – NaCl 1M (pH =2,0): Cân khoảng 15,42g CH3COONH4 và 117,0g NaCl chuyển vào cốc dung tích 2000mL có chứa khoảng 1500 mL nước cất Trộn đều trên máy khuấy từ cho đến khi tan được hòan tòan Điều chỉnh pH của dung dịch tới pH = 2,00 ± 0,02 bằng dung dịch acid HCl 3N Chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức 2000mL và định mức đến vạch bằng nước cất

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

- Thu thập một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường

- Số lượng mẫu: 25

- Địa điểm lấy mẫu: Hà Nội

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu

* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:

Đối với mẫu rắn như bơ, phomat… mỗi mẫu lấy tối thiểu 20 – 50 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu hoặc làm tan chảy ở nhiệt độ 60oC, mẫu lỏng lắc đều trước khi phân tích

Chuẩn bị mẫu:

+ Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu sau khi được đồng nhất, cân những lượng bằng nhau từ 2 - 5g mẫu vào ống fancol 50 mL, mỗi mẫu phân tích lặp lại 2 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn

+ Chuẩn bị mẫu trắng: Là mẫu giống như mẫu phân tích nhưng không có thành phần Nisin A và Nisin Z

+ Mẫu thêm chuẩn: Bổ sung dung dịch chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z vào mẫu phân tích Tiến hành như chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn

Quy trình 2: Tiến hành chiết như quy trình 1 nhưng dịch chiết mẫu sau khi làm

sạch qua màng lọc cỡ 0,22µm, tiếp tục được làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE-C18 Trước tiên cột được hoạt hoá lần lượt bằng 3mL MeOH loại tinh khiết phân tích, 3mL nước cất deion, sau đó nạp 6mL mẫu qua cột, tốc độ chảy không quá 2 mL/phút Khi toàn bộ lượng mẫu đã được nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 6mL Ethanol Hút khô 1 phút bằng máy hút chân không Cuối cùng rửa giải bằng 6mL hỗn hợp dung môi IPA –