Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Khảo sát nguồn nguyên liệu, nghiên cứu nâng cao hiệu suất tách chiết và chất lượng rutin từ nụ hoa hoè Việt Nam

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm khắc phục tình trạng chưa có phương thức khai thác hiệu quả cũng như góp phần sản xuất ra rutin phục vụ cho nhu cầu làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu. Mời các bạn cùng tham khảo!

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

KHẢO SÁT NGUỒN NGUYÊN LIỆU, NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT VÀ CHẤT LƯỢNG RUTIN TỪ

NỤ HOA HOÈ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

HÀ NỘI 2010

2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

KHẢO SÁT NGUỒN NGUYÊN LIỆU, NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT VÀ CHẤT LƯỢNG RUTIN TỪ

NỤ HOA HOÈ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Quá trình và Thiết bị Công nghệ Hóa học

Mã số: 62.52.77.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS PHẠM VĂN THIÊM

2 GS.TSKH PHAN ĐÌNH CHÂU

HÀ NỘI 2010

3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2010

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Huyền

4

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, động viên và giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Tôi xin bày tỏ lời chân thành cảm ơn tới GS.TS Phạm Văn Thiêm và GS.TSKH

Phan Đình Châu, những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Quá trình Thiết bị & Công nghệ hoá học; Bộ môn Hóa dược & Bảo vệ Thực vật; Viện Đào tạo sau Đại học của Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ cũng như đóng góp ý kiến giúp tôi hoàn thành luận án

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại Trung tâm Giáo dục và Phát triển Sắc ký; Trung tâm Công nghệ Vật liệu và Môi trường - Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành xuất sắc nhiệm vụ được giao.

Cảm ơn sự phối hợp và giúp đỡ của PTN Vilas 335, PTN Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Môi trường - Viện khoa học và Công nghệ Môi trường (ĐH Bách Khoa Hà Nội), PTN Hóa vật liệu (ĐH Khoa học tự nhiên), Phòng nghiên cứu cấu trúc (Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã giúp tôi đo một số phổ và đánh giá kết quả nghiên cứu của luận án

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả các em sinh viên đã cùng tôi làm việc trong thời gian qua Sự quan tâm của các em là nguồn động lực lớn lao giúp tôi vượt qua mọi khó khăn và luôn hướng về phía trước

Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2010

NGƯỜI CẢM ƠN

Nguyễn Thị Thu Huyền

KLK Khối lượng khô

KLT Khối lượng tươi

TCDĐ Tiêu chuẩn dược điển

HIV Virut suy giảm miễn dịch ở người, gây bệnh AIDS

ADP Ađenôzin điphosphat

ddA, ddA1, ddA2,

ddB1, ddG, ddG1

Các dung dịch A, B, G (chỉ số 1,2 chỉ cấp độ pha loãng)

Speak Diện tích peak rutin thu được từ phân tích HPLC SSmax Sai số lớn nhất

6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TOÁN HỌC

q1, q0 Lượng rutin phân hủy, lượng rutin thô trích ly được, kg

qlt, qtn Lượng rutin trích ly được tính theo lý thuyết, thực nghiệm, kg

F Bề mặt tiếp xúc pha, m2

R, NA Hằng số khí (0,0821 atm/mol.độ), số Avogadro (6,023.1023)

η Độ nhớt của dung môi

r Bán kính tiêu chuẩn khuếch tán

β Hệ số cấp khối từ pha rắn vào pha lỏng

2l Bề dày tiểu phân vật liệu

Dn, D Hệ số khuếch tán nội, khuếch tán phân tử, m2/h

δ Chiều dày lớp biên khuếch tán

n Số phương sai

m Số lần lặp

yu Giá trị đo được tại lần lặp thứ u

s2i Phương sai chung

s2ts Phương sai tái sinh chung

fi Số bậc tự do của mẫu

fts Số bậc do của phương sai chung

sts Sai số thí nghiệm (sai số tái sinh)

yi Giá trị thực nghiệm

∧

i

y Giá trị tính từ hàm hồi quy lý thuyết

t(p,f2) Tiêu chuẩn Student tra bảng ở mức có nghĩa p và bậc tự do lặp f2

Sb Độ lệch chuẩn của phân bố b

m Số thực nghiệm lặp tại tâm

7

lặp f2 = m-1)

l Số hệ số có nghĩa trong mô tả thống kê

T Thời gian cần trích ly được 63,212% lượng rutin tối đa

Ktl Hằng số tốc độ quá trình trích ly, kg/m2phút

Kph Hằng số tốc độ quá trình phân hủy, kg/m2phút

K Lượng rutin tối đa trích ly được, kg

Kv Tỷ lệ dung môi/pha rắn, kg/kg hoặc ml/g

K1 Hàm lượng rutin ban đầu trong nụ hòe, %

K2 Diện tích bề mặt riêng pha trắn, m2.kg-1

Kcb Hằng số cân bằng, kg hạt hòe xay (hoặc nghiền)/kg dung môi

m Khối lượng hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg

Q Tổng lượng rutin chứa trong hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg

τ, t Thời gian trích ly (phút), thời gian bảo quản (năm)

X1 Thành phần tạp chất trong nụ nguyên liệu, %

X2 Thành phần nụ hòe không đạt quy cách, %

A Thành phần ẩm trong hòe xay (nghiền), %

σi Phân bố theo kích thước của tập hợp hạt, %

ρh Khối lượng riêng của hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg/m3 Cpha, Ctính Nồng độ rutin pha và nồng độ tính được qua phân tích HPLC

d Đường kính hạt hòe xay (hoặc nghiền), cm

p Khối lượng quercetin thu được (g)

M1 Khối lượng mẫu cực đại

8

Speak Diện tích peak

mcắn Khối lượng cắn chiết khô, g

mQ Khối lượng quercetin tạo thành, g

m0kh Khối lượng bột nụ khô tuyệt đối, g

mtcrut Khối lượng rutin thu được sau tinh chế, g

mdm Khối lượng dung môi, kg

Vdm Thể tích dung môi, ml

A362,5 Độ hấp thụ của rutin tại bước sóng 362nm

Speak Diện tích peak thu được qua phân tích HPLC

^

Y Hàm mục tiêu (hiệu suất trích ly rutin)

z1 Biến thực của thời gian trích ly rutin (phút)

z2 Biến thực, biến mã của tỷ lệ lỏng/rắn (ml/g)

z3 Biến thực, biến mã của vận tốc khuấy (vòng/phút)

Z1, Z2 Độ trở kháng âm môi trường 1,2

x1 Biến mã của thời gian trích ly rutin

x2 Biến mã của tỷ lệ lỏng/rắn

x3 Biến mã của vận tốc khuấy

Htn (Hlt) Hiệu suất trích ly rutin từ thực nghiệm (tính theo lý thuyết), % Htd Hiệu suất trích ly rutin tối đa

HTC Hiệu suất tinh chế rutin, %

HLth (HLt) Hàm lượng rutin thô (tinh), %

Vr Thể tích thiết bị phản ứng, m3

N Năng suất thiết bị trong 24h, m3

∆t Độ chênh lệch thời gian, năm

∆HTC Độ chênh lệch hiệu suất tinh chế

R Hệ số phản xạ của sóng siêu âm

9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tiêu chuẩn dược điển rutin của Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam 45

Bảng 3.1: Thành phần tạp và độ ẩm trong các mẫu hòe 60

Bảng 3.2: Phân bố dạng nụ trong mỗi mẫu nghiên cứu 60

Bảng 3.3: Phân bố kích thước trong mỗi tập hợp hạt hoè xay1,2 (nghiền) 61

Bảng 3.4: Khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt 62

Bảng 3.5: Các cấu tử định tính được trong phần chiết clorofoc 64

Bảng 3.6: Các cấu tử định tính được trong phần chiết n-hexan 64

Bảng 3.7: Các cấu tử định tính được trong phần chiết metanol 65

Bảng 3.8: Các nhóm chất đã phát hiện trong nụ hòe khô 66

Bảng 3.9: Thành phần tinh dầu nụ và hoa hòe 68

Bảng 3.10: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP TL) 72

Bảng 3.11: Độ hấp thụ của dung dịch rutin chuẩn 74

Bảng 3.12: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP UV-VIS) 76

Bảng 3.13: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP HPLC) 77

Bảng 3.14: Tổng kết thành phần rutin trong nụ hoè theo ba phương pháp 79

Bảng 3.15: Phương sai theo kết quả phân tích trọng lượng* 81

Bảng 3.16: Phương sai theo kết quả phân tích UV-VIS* 82

Bảng 3.17: Phương sai theo kết quả phân tích HPLC* 83

Bảng 3.18: Thành phần rutin trong các dạng nụ hoè 84

Bảng 3.19: Độ giảm rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản 85

Bảng 3.20: Điều kiện khảo sát quá trình trích ly rutin bằng nước 87

Bảng 3.21: Kết quả ảnh hưởng của Kv, τ và T0 đến quá trình trích ly 87

Bảng 3.22: Kết quả trích ly rutin bằng nước và dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) 90

Bảng 3.23: Kết quả trích ly rutin dưới tác động của sóng vi ba và siêu âm 91

Bảng 3.24: Khảo sát ảnh hưởng của CNaOH, τngâm, pH đến quá trình trích ly 93

Bảng 3.25: Kết quả trích ly rutin bằng NaOH tại điều kiện tối ưu 97

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ borax đến quá trình trích ly rutin 97

Bảng 3.27: Kết quả xác định pH cho dung môi và pha trích 99

10

Bảng 3.28: Ảnh hưởng pH đến lượng rutin kết tủa 101

Bảng 3.29: Ảnh hưởng thời gian trích ly đến lượng rutin 101

Bảng 3.30 Kết quả phân tích kim loại xác định Na, B, Ca trong rutin 103

Bảng 3.31: Kết quả trích ly rutin trong cồn (có/không siêu âm) 104

Bảng 3.32: Kết quả trích ly trong các dung môi dùng siêu âm 106

Bảng 3.33: Kết quả tổng kết các quá trình trích ly rutin (Kv = 20) 108

Bảng 3.34: Kế hoạch thực nghiệm bậc một hai mức tối ưu 109

Bảng 3.35: Kết quả quy hoạch thực nghiệm trích ly rutin có khuấy trộn 110

Bảng 3.36: Kết quả trích ly rutin sử dụng siêu âm và khuấy trộn 112

Bảng 3.37: Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến quá trình trích ly rutin 113

Bảng 3.38 Kết quả tính toán Kv (với mHòe = 0,01kg) 114

Bảng 3.39: Kết quả trích ly rutin khi Kv thay đổi 114

Bảng 3.40: Hiệu suất trích ly và hàm lượng rutin ở tần số 25kHz và 30kHz 115

Bảng 3.41: Kết quả quá trình trích ly rutin ở Kv=15,836kg/kg 117

Bảng 3.42: Kết quả kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877kg/kg 118

Bảng 3.43: Diện tích bề mặt riêng của tập hợp hạt theo phân bố (i=1÷6) 119

Bảng 3.44: Ảnh hưởng của Kv đến quá trình trích ly rutin ở 30kHz 120

Bảng 3.45: Lượng rutin trích ly theo thực nghiệm và mô hình 122

Bảng 3.46: KX và TX của mô hình trích ly hạt xay2 ở 35Hz, 30kHz, 25kHz 122

Bảng 3.47: Các thông số và mô hình trích ly siêu âm hạt hòe xay2 123

Bảng 3.48: Các thông số và mô hình trích ly hạt nghiền, xay1,2 ở 25kHz 125

Bảng 3.49: Các thông số mô hình trích ly rutin khuấy trộn và trong lò vi sóng 128

Bảng 3.50: Kế hoạch nghiên cứu tinh chế rutin theo mục tiêu 130

Bảng 3.51: Kết quả tinh chế rutin trong các dung môi 130

Bảng 3.52: Kết quả tinh chế rutin trong hệ các dung môi 131

Bảng 3.53: Kết quả phân tích các dung môi sau rửa giải trên cột 133

Bảng 3.54: Kết quả tinh chế rutin trên sắc ký cột 133

Bảng 3.55: Kết quả cắt phân đoạn theo peak rutin 137

Bảng 3.56: Hàm lượng rutin ở các phân đoạn sau cắt peak 137

11

Bảng 3.57: Kết quả điều chế rutin phân đoạn thứ 3 138

Bảng 3.58: Một số thông số của rutin sản phẩm trước và sau tinh chế 139

Bảng 3.59: Kết quả giải phổ 1H-NRM ( MeOD, 500MHz) của rutin 140

Bảng 3.60: Kết quả giải phổ 13C-NRM, 2D-HMQC, 2D-HMBC của rutin 141

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Sophora japonica L 18

Hình 1.2: Phân bố nồng độ trong các pha của quá trình chuyển khối rắn- lỏng 30

Hình 1.3: Sự thay đổi nồng độ rutin gần bề mặt hạt 31

Hình 1.4: Xác định tốc độ quá trình trích ly rắn - lỏng 31

Hình 1.5: Sự thay đổi tốc độ kết tinh (m) theo thời gian (t) 34

Hình 1.6: Độ hoà tan tương đối của rutin trong nước 38

Hình 1.7: Độ hoà tan tương đối của rutin trong dung dịch etanol 38

Hình 3.1: Phổ UV-VIS cắn Soxhlet (ở trên) và phổ rutin chuẩn (0,075mg/ml) 73

Hình 3.2: Phổ 3D của dung dịch rutin chuẩn (HPLC) 73

Hình 3.3: Đường chuẩn rutin trên máy UV-VIS 74

Hình 3.4: Đường chuẩn và số liệu đường chuẩn rutin phân tích trên HPLC 75

Hình 3.5: Quan hệ giữa Kv và lượng rutin thu được 88

Hình 3.6: Quan hệ giữa thời gian trích ly và lượng rutin 88

Hình 3.7: Quan hệ giữa nhiệt độ trích ly và lượng rutin 89

Hình 3.8: Hiệu suất trích ly rutin bằng nước và kiềm (NaOH, pH = 8) ở 1260C 90

Hình 3.9: Ảnh hưởng của sóng siêu âm và sóng vi ba đến qtn 92

Hình 3.10: Ảnh hưởng của τ ngâm trích đến lượng rutin trích ly 94

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến lượng rutin trích ly 94

Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến lượng rutin trích ly 95

Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH (1÷6) đến hàm lượng rutin thô 95

Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ borax đến lượng rutin trích ly 98

Hình 3.15: Ảnh hưởng thời gian trích đến lượng rutin trích ly 102

Hình 3.16: Kết quả trích ly rutin bằng cồn (không/ có siêu âm) 105

12

Hình 3.17: Thời gian và lượng rutin trích ly (không/có siêu âm) 105

Hình 3.18: Trích ly siêu âm rutin trong một số dung môi 106

Hình 3.19: Ảnh hưởng của siêu âm và khuấy trộn đến quá trình trích ly 113

Hình 3.20: Đồ thị qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 30kHz (SSmax = 8,3%) 117

Hình 3.21: Kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877 kg/kg, 30kHz ( SSmax = 4,4%) 118

Hình 3.22: Ảnh hưởng của Kv đến quá trình trích ly siêu âm ở 30kHz 120

Hình 3.23: Đồ thị của qtn và qlt theo thời gian ở các Kv (30kHz) 120

Hình 3.24: Đồ thị q = f(ln(t)) ở Kv=15,836 (kg/kg) tại 35kHz, 25kHz, 30kHz 121

Hình 3.25: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 35kHz (SSmax = 4,5%) 124

Hình 3.26: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 25kHz (SSmax = 6,7%) 124

Hình 3.27: Sắc ký đồ rutin trước (a) và sau (b) đánh dấu cắt phân đoạn 136

Hình 3.28: Sắc ký đồ của rutin sau tinh chế trên pre-HPLC lần thứ 1 138

Hình 3.29: Sắc ký đồ của rutin sau tinh chế trên pre-HPLC lần thứ 2 138

Hình 3.30: Công thức cấu tạo của rutin sản phẩm theo kết quả giải phổ 142

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Quy trình nghiên cứu chung 57

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ công nghệ trích ly rutin bằng nước vôi - borax 102

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ khối tính toán tối ưu quá trình trích ly rutin 109

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ công nghệ tinh chế rutin 131

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục A: Phổ và kết quả định lượng rutin trong nụ hoè 155

Phụ lục B: Phổ GC-MS phân tích thành phần nụ hòe 163

Phụ lục C: Phổ và đồ thị phần trích ly rutin 165

Phụ lục D: Phần mềm quy hoạch thực nghiệm 168

Phụ lục E: Phần tinh chế rutin 178

Phụ lục F: Phổ phân tích cấu trúc và kim loại của rutin 183

Phụ lục G: Thiết bị sử dụng, nguyên liệu và sản phẩm 199

13

MỤC LỤC

KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TOÁN HỌC 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 9

DANH MỤC CÁC HÌNH 11

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 12

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 12

MỤC LỤC 13

MỞ ĐẦU 17

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 18

1.1 Nụ hòe, rutin trong khoa học và đời sống 18

1.1.1 Cây hòe ở Việt Nam và trên thế giới 18

1.1.1.1 Thành phần và ứng dụng của cây hòe trong đời sống con người 20

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng nụ hòe 21

1.1.2 Rutin và các nghiên cứu đánh giá 24

1.1.2.1 Giới thiệu chung về rutin 24

1.1.2.2 Tầm quan trọng của rutin trong nền y dược cổ truyền và hiện đại 26

1.1.2.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất rutin 28

1.2 Trích ly, tinh chế và thực trạng sản xuất rutin 30

1.2.1 Cơ chế quá trình trích ly và tinh chế rutin 30

1.2.1.1 Trích ly rutin khỏi nguyên liệu 30

1.2.1.2 Tách rutin khỏi pha trích 34

1.2.1.3 Tinh chế rutin 34

1.2.2 Tổng kết các quá trình trích ly, tinh chế rutin cơ bản 35

1.2.2.1 Sơ lược kết quả của các nghiên cứu 35

1.2.2.2 Các phương pháp trích ly rutin 37

1.2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ rutin ở Việt Nam 39

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất rutin 39

1.2.3.2 Tình hình tinh chế và tiêu thụ rutin 41

14

1.2.3.3 Nhận định chung về thực trạng sản xuất rutin ở Việt Nam 43

1.3 Yêu cầu chất lượng và phương pháp đánh giá rutin 43

1.3.1 Tiêu chuẩn dược điển quy định cho rutin 43

1.3.2 Các phương pháp định tính, định lượng rutin 46

1.3.2.1 Đinh tính rutin 46

1.3.2.2 Định lượng rutin 46

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.1 Nguyên vật liệu, dụng cụ 49

2.1.1 Vật liệu, dung môi, hóa chất chính sử dụng 49

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ chính 49

2.1.3 Thu thập nguyên liệu nghiên cứu 50

2.2 Phương pháp nghiên cứu 51

2.2.1 Đánh giá nụ hòe nguyên liệu 51

2.2.2 Nghiên cứu quá trình trích ly rutin 52

2.2.3 Nghiên quá trình tinh chế rutin chất lượng cao 56

2.2.4 Đánh giá chất lượng rutin sản phẩm 56

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57

3.1 Đánh giá trữ lượng và chất lượng nụ hòe Việt Nam 58

3.1.1 Điều tra cơ bản về trữ lượng nụ hòe 58

3.1.2 Đánh giá một số thông số chính của hệ mẫu nghiên cứu 59

3.1.2.1 Xác định tạp chất, độ ẩm và nụ không đạt quy cách 59

3.1.2.2 Xác định phân bố của tập hợp hạt hoè sau xay, nghiền 60

3.1.2.3 Xác định khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt 61

3.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học nụ hòe Việt Nam 62

3.1.3.1 Định tính một số nhóm chất trong nụ hoè khô 62

3.1.3.2 Xác định thành phần tinh dầu nụ và hoa hoè 67

3.1.4 Đánh giá thành phần rutin trong nụ hòe Việt Nam 71

3.1.4.1 Định lượng rutin trong nụ hòe ở các vùng trồng chính 71

15

3.1.4.2 Đánh giá các phương pháp phân tích hàm lượng rutin 81

3.1.4.3 Định lượng rutin trong một số dạng nụ 84

3.1.4.4 Định lượng rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản 85

3.2 Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin chất lượng cao 85

3.2.1 Nghiên cứu khảo sát các dung môi trích ly rutin 86

3.2.1.1 Trích ly rutin bằng dung môi nước 86

3.2.1.2 Trích ly rutin bằng dung dịch NaOH ở nhiệt độ thường 92

3.2.1.3 Trích ly rutin dùng nước vôi trong kết hợp với Borax 97

3.2.1.4 Nghiên cứu quá trình trích ly rutin trong dung môi etanol 104

3.2.1.5 So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm trong các dung môi 105

3.2.2 Lựa chọn dung môi và công nghệ trích ly 107

3.2.3 Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp khuấy trộn 108

3.2.3.1 Tối ưu hóa quá trình trích ly rutin 108

3.2.3.2 Áp dụng tìm điều kiện tối ưu quá trình trích ly rutin có khuấy trộn 110 3.2.4 Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp siêu âm 111

3.2.4.1 So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm và khuấy trộn 112

3.2.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly siêu âm 113

3.2.5 Xây dựng mô hình động học và xác định các thông số của mô hình cho quá trình trích ly rutin 116

3.2.5.1 Mô hình động học của quá trình trích ly siêu âm rutin 116

3.2.5.2 Mô hình động học quá trình trích ly rutin có trợ giúp của sóng vi ba (lò vi sóng) và khuấy trộn 126

3.3 Nghiên cứu công nghệ tinh chế rutin 128

3.3.1 Nghiên cứu tinh chế rutin bằng phương pháp kết tinh lại 130

3.3.2 Tinh chế bằng sắc ký cột 132

3.3.3 Tinh chế rutin bằng sắc ký lỏng điều chế 134

3.3.3.1 Tính toán thông số quá trình điều chế 134

3.3.3.2 Xác định điều kiện điều chế trên thiết bị Pre-HPLC 1100 135

3.3.3.3 Kết quả điều chế rutin trên hệ thống điều chế Pre-HPLC 1100 136

16

3.3.4 Đánh giá chất lượng rutin sau các quá trình tinh chế 139

3.3.4.1 Đánh giá nguyên liệu và các sản phẩm 139

3.3.4.2 Phân tích cấu trúc rutin sản phẩm 139

KẾT LUẬN 143

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 144

TÀI LIỆU THAM KHẢO 146

PHỤ LỤC 155

17

MỞ ĐẦU

Rutin là một dược chất có giá trị được sử dụng rộng rãi trong y học Ngoài khả năng phục hồi sự vỡ mao mạch tới 88%, rutin còn là một chất chống oxy hóa hiệu quả được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh như bệnh tế bào hình liềm, viêm khớp,

xơ gan, u hắc tố, [64, 69] Do có nhiều ứng dụng nên rutin không những được quan tâm nghiên cứu sản xuất mà còn được nghiên cứu chuyển hóa thành nhiều dược phẩm giá trị khác như polyrutin, troxerutin, quercetin, melin sulfat, phức rutin-kim loại, Từ năm 1947 đến 1950, rutin đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp ở nhiều quốc gia như Nhật, Mỹ, Úc, từ các nguồn thực vật chính là nụ hòe, kiều mạch, lá bạch đàn Australia, lá chè xanh, [9] Sở hữu một hàm lượng rutin (34 - 44%) [7], nụ hòe Việt Nam là một trong những nguồn nguyên liệu giá trị nhất trên thế giới Tuy nhiên do hạn chế về công nghệ và ý thức về nguồn tài nguyên còn chậm, từ năm 1962 vấn đề trích ly rutin trong nụ hòe mới được quan tâm đến nhưng kết quả đạt được còn chưa rõ ràng [2, 3, 4] Đến năm 1995 đã có dự

án sản xuất rutin và từ năm 2004 công nghệ sản xuất rutin đã được chào bán trên mạng internet [15, 41, 44] Cho đến nay, nhiều doanh nghiệp đã công bố sản xuất và bán rutin như BV Pharma, Vimedimex, Đạt Doan, Quế Hòe, Nhật Cường (Thái Bình), [10] Tuy nhiên thực tế cho thấy rutin sản xuất trong nước hầu như chỉ đạt chất lượng thô (< 95%), phần lớn cả nụ hòe và rutin thô được đưa sang Trung Quốc qua các con đường tiểu ngạch với giá thành rẻ Như vậy từ một nguồn tài nguyên sẵn có nhưng chưa có phương thức khai thác hiệu quả dẫn đến hiệu quả kinh tế rất thấp Thực trạng đó là ở vấn đề công nghệ hay chính sách? Do những hiệu quả kinh

tế mang lại nên từ năm 2006 cây hòe cũng như rutin đã được Đảng và nhà nước quan tâm thích đáng Vì thế vấn đề mà nhiều nhà sản xuất rutin Việt Nam đang

vướng mắc chính là công nghệ Nhằm khắc phục tình trạng trên cũng như góp phần

sản xuất ra rutin phục vụ cho nhu cầu làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất

khẩu, luận án đặt vấn đề "Khảo sát nguồn nguyên liệu, nghiên cứu nâng cao hiệu

suất tách chiết và chất lượng rutin từ nụ hoa hoè Việt Nam"

18

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nụ hòe, rutin trong khoa học và đời sống

1.1.1 Cây hòe ở Việt Nam và trên thế giới

Cây hòe thuộc thực vật họ đậu Fabaceae (Papilionceae) Hòe có nguồn gốc từ

Trung Quốc, Triều Tiên và phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới như Đông Á, Đông

Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên,

Việt Nam); Trung Á (Capcadơ, bán đảo Crưm)

và một số nước châu Âu (Anh, Hungary,…) Ở

Việt Nam, chi Sophora L có ba loài chủ yếu là:

hòe lông (Sophora tomentosa L (Silverbrush))

có hoa màu vàng xám, phân bố rộng rãi ở các

vùng ven bờ biển (trên bãi cát các đảo từ

Quảng Ninh đến tận Côn Đảo - Vũng Tàu và

Phú Quốc - Kiên Giang; hòe Bắc Việt Nam (Sophora tonkinensis Gagnep.) có lá và

thân mang lông mềm, tràng hoa màu vàng, thường mọc trong các núi đá vôi và trên sườn đồi phía Bắc (phân bố từ Quảng Ninh, Ninh Bình tới Quảng Nam, Đà Nẵng)

[8, 9, 11, 39] và loài có giá trị kinh tế nhất là hòe (Sophora japonica L.) có nụ hoa

màu trắng hay vàng xanh nhạt, thuộc loại lưỡng tính phân bố ở Bắc, Trung Bộ và

Tây Nguyên (hình 1.1) [35, 51]

Hòe là thực vật rễ cọc có khả năng thích nghi mạnh, ưa đất sâu mát, thành phần

cơ giới trung bình, ít chua, thoát nước; mọc tốt trên đất phù sa, đất bazan, đất bồi tụ chân đồi, đất pha cát, đất thịt (trừ đất cát ven biển miền Trung và đất chua mặn); thích hợp khí hậu nhiều vùng nhất là từ Nam Tây Nguyên tới vùng núi phía Bắc [11, 38, 49] Ở nước ta cây hòe mọc hoang hay được trồng (trong vườn, trên bờ ruộng cao, bờ mương máng, bờ sông) để làm thuốc, làm cảnh từ lâu đời ở các tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Ninh Bình, Hà Nam, Nam Định, Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Phú Thọ,

Hình 1.1: Cây Sophora japonica

19

Vĩnh Phúc [11, 35, 51] Từ năm 1976 việc trồng hoè được triển khai vào các tỉnh miền Trung (Thanh Hoá, Nghệ An) và Tây Nguyên (Đắk lắk, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đồng Nai, Đắk Nông, Bình Phước,…) Ở Tây Nguyên, trước đây cây hòe chỉ được trồng ngoài bờ lô chắn gió nhưng hiệu quả của việc trồng xen lẫn với

cà phê khiến cho mô hình này đang phát triển mạnh [38, 51] Ở Nghệ An, hòe là cây xoá đói giảm nghèo, phát triển mạnh trong 10 năm gần đây nhưng không thuộc loại cây chủ lực, chủ yếu được trồng tự phát Ở Quỳnh Lưu, dọc theo quốc lộ 1A (từ khu công nghiệp Hoàng Mai trở vào), từ xã Mai Hùng, Quỳnh Lộc, Quỳnh Lập, Quỳnh Dị, đến cả trại phong Quỳnh Lập đâu đâu cũng rợp bóng cây hòe [24] Hiện nay hoè là một trong 14 loài cây lâm nghiệp được ưu tiên phát triển ở 10 tỉnh Đồng Bằng Sông Hồng, là một trong 21 cây bản địa chủ yếu được dùng làm cây che bóng trong trồng rừng theo phương thức nông lâm kết hợp

Hòe được trồng và nhân giống bằng cách gieo hạt ươm cây con (cây con rễ trần hoặc có bầu), ghép mắt, chiết cành hay tách rễ từ cây mẹ Phương pháp ghép mắt được đánh giá tốt nhất vì hệ số nhân giống cao [49] Hiện nay số lượng hòe được trồng trên toàn quốc tương đối lớn nhưng cây con vẫn chỉ được ươm chủ yếu ở vườn ươm Cúc Phương (500cây/năm), Thanh Hoá (50000cây/năm) với nguồn cung cấp hạt từ một số gia đình ở Phú Thọ, Hà Nội, Thanh Hoá, Ninh Bình, Nghệ An, Nam Định và một số tỉnh khác [35]

Có hai loại hoè với sản lượng nụ và hàm lượng rutin khác nhau Hòe tẻ (hòe đực)

là loại cây cao, mọc thẳng đứng, phân ít cành, nụ bé, sản lượng thấp, hoa ra ít, màu sẫm hơn, cuống dài, bông nhỏ, thưa thớt không đều, nở thành nhiều đợt Hòe nếp (hòe cái) là loại cây phát triển nhanh, phân nhiều cành vít ngang, quả mập, cho sản lượng nụ cao, hoa to, nhiều, đều, có màu nhạt, cuống ngắn, nở rộ, tập trung vào tháng 6-7-8 Hòe nếp cho năng suất cao gấp ba lần hòe tẻ với thành phần rutin chiếm 44% KLK trong khi hòe tẻ chỉ có 40,6% KLK [7, 35, 51] Việc tuyển chọn

và nhân giống ảnh hưởng lớn đến chất lượng cây (ra ít hay nhiều nụ, nụ đều hay không đều) Theo kinh nghiệm, nên chọn giống hòe thấp cây, sinh trưởng khỏe, chùm nụ gọn, ngắn, chẽ đều và ra tập trung vào hai vụ chính: vụ xuân (ra nụ tháng

20

3, thu hái vào tháng 5), vụ thu (ra tháng 8, thu hái trong tháng 10) [11, 35]

1.1.1.1 Thành phần và ứng dụng của cây hòe trong đời sống con người

Hòe là một trong ba loài của chi Sophora L ở Châu Á được dùng làm thuốc trị

bệnh theo dược học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam và Nhật Bản; được sử dụng làm phẩm màu để nhuộm tơ; làm thuốc điều hoà sinh trưởng Lacasoto 4SP cho lúa, ngô, khoai, sắn, [35] Từ đời Lê, Kim, Minh, Thanh, Đường, Tống, hòe luôn là một trong những vị thuốc không thể thiếu được trong các bài thuốc y học cổ truyền Tuy nhiên việc sử dụng hòe để điều trị chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học trong từng bộ phận cây hòe gần đây mới giải

thích được các nguồn gốc dược học này [11]

- Lá hoè bao gồm 19% protein, 3,5% lipit, alcaloit cytisin, được dùng để trị tà khí,

động kinh, bệnh kinh sự của trẻ em, bệnh ghẻ ngứa mụn nhọt, phát ban do máu nóng, bệnh răng, khó đẻ, trị nghiện nặng

- Vỏ quả chứa 10-10,5% flavonoit [85], được dùng để hoàn trị năm bệnh trĩ nặng, hoàn phong đại tiện ra máu

- Hạt hoè gồm có flavonoit (1,75%), alkaloit loại quinolizidin (0,04%), protein (17,2-23%), dầu béo (6,9-12,1%), khoáng chất (Ca, P, K), axit linoleic, chất nhầy và một loại tinh bột có thể ăn được Hạt hoè được dùng trị bệnh mắt nóng mờ tối, trị nóng cao tâm phiền, dùng trong nghi thức tôn giáo của thổ dân (tạo ảo giác do chứa cytosin) [8, 11, 85]

- Nhựa hoè dùng để trị các loại phong hoá sinh ra đờm rãi, tạng can bị phong, gân mạch co rút, cấm khẩu, trị phong nhiệt gây điếc

- Gỗ hoè có 8 isoflavonoit và nhiều thành phần khác [82, 84] Cành hoè được dùng

chữa ngứa, đại phong, liệt, thấp khớp, vết thương bọ cạp cắn, bệnh mắt đỏ, lậu, trĩ

- Vỏ cây hoè chứa lectin (1% KLT) với nhóm con là glycoprotein và peptit chính là

glycopeptit [43] Rễ hoè chứa các flavonoit, (D,L)-maackian, anhydropisatin,

pterocarpan, sophoja ponicin, Vỏ cây, vỏ rễ hoè được dùng để chữa lở loét, nứt rữa, chữa phong cam trĩ, đại tiện ra máu, phá huyết Tác dụng chống co thắt của hòe

bì tố gấp năm lần rutin, được dùng trị xơ mỡ động mạch, giảm colesterol trong

Ngày nay, do sự phát triển của y dược học cổ truyền cũng như hiện đại, nhiều loại dược liệu với các tính năng công dụng ưu việt mới đã được tìm thấy Đi đôi với

nó là thói quen sử dụng các dạng thuốc bào chế đặc trị Giá trị dược học của các bộ phận cây hòe bị rơi vào quên lãng, chỉ có nụ hòe được nhắc tới và sử dụng

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng nụ hòe

Trong số các bộ phận của cây hòe, nụ là bộ phận có giá trị kinh tế nhất Giá trị

22

kinh tế cũng như dược học của nụ hòe là nhờ chứa rutin với hàm lượng từ 34 - 44% KLK [11, 13, 14, 15, 35]

* Thu hoạch, sơ chế và bảo quản: hòe trồng sau 2-3 năm đầu thì cho nụ bói, từ

năm thứ 4 -5 trở đi thì cho nụ thương phẩm với khối lượng khoảng 8 -10kg nụ khô/cây Năng suất thu hoạch nụ tăng dần theo độ tuổi, cao nhất khi cây ở độ tuổi 10-25 rồi giảm dần sau đó [38] Tần suất thu hoạch nụ từ 7-10 ngày/lần, chủ yếu từ tháng 5-9 âm lịch, rộ nhất vào tháng 7-8 Có nơi hòe được thu hái theo vụ: vụ mùa vào tháng 4-9 (năng suất cao nhưng hàm lượng rutin thấp); vụ chiêm vào tháng 10-1 (năng suất thấp nhưng hàm lượng rutin cao hơn vụ mùa) [11, 35] Tỷ lệ tươi/khô trung bình sau khi thu hoạch trung bình đối với ngày nắng là 3/1 và ngày mưa là 3,2/1 [38] Thời điểm thu hoạch rất quan trọng: thu hoạch sớm nụ hòe nhỏ sẽ ảnh hưởng đến năng suất; thu hoạch muộn quá (nụ nở thành hoa) lượng rutin giảm [9, 14] Theo các tài liệu, cần thu hoạch khi nụ to đều, chùm có một vài nụ nở, chuyển

từ màu xanh sang màu nõn chuối [49] hay khi tỷ lệ nở khoảng 5% [7, 38] Khi đó

nụ đồng đều và hàm lượng rutin đạt cao nhất Sau khi thu hoạch, nụ hòe được vò, loại bỏ lá, cuống và làm khô (phơi, sấy sao) Để đảm bảo nụ hòe đạt TCDĐ cũng như làm nguyên liệu trích ly rutin, khâu sơ chế rất quan trọng [8] Nếu thu hoạch gặp trời mưa, nụ dễ bị thiu nhớt, phải rửa sạch để ráo nước, san mỏng và sấy Khi sao nụ hòe phải dùng chảo hoặc chậu nhôm, đảo đều đến khi kiểm tra nụ bằng tay thấy nóng rát thì sao tiếp 8-10 phút, sau đó ủ 2-3h mới đem phơi Phương pháp này

nụ mau khô và có màu sắc đẹp Kiểm tra nụ hòe khô bằng cách miết nụ trên hai đầu ngón tay, vỡ vụn là được Nhìn chung nụ hòe phải đảm bảo khô, có mùi thơm, màu vàng chanh, không ẩm mốc, không bị cháy, không lẫn lộn cuống lá, tạp chất, độ ẩm tối đa 11-12% [49] Theo TC DĐVN III, nụ hòe khô (600C, 6h) phải có hàm lượng rutin ≥ 20%, tỷ lệ hoa đã nở ≤ 10%, hoa sẫm màu ≤ 1%, các bộ phận khác của cây ≤ 2%, độ ẩm ≤ 12%, tạp chất ≤ 1%, tro toàn phần ≤ 10%, không nấm mốc [8]

Các phương pháp sơ chế và bảo quản có ảnh hưởng đến thành phần hóa học nụ hòe và do đó ảnh hưởng đến chất lượng cũng như công dụng của nó Kết quả nghiên cứu của Viện Dược liệu Trung Hoa Bắc Kinh đã chỉ ra: nụ hòe dạng tươi, sao và

23

thiêu thành than đều có tác dụng tăng cường lượng fibrinogen; dạng chiết giúp tăng

số đếm tiểu cầu; dạng sao vàng có hoạt tính cầm máu mạnh nhất Do đó nụ hòe thường được bào chế theo phương pháp hỏa chế thành các dạng khô giòn, xém hoặc cháy thành than cho các mục đích trị bệnh trong đông y Nhiệt độ sấy từ 80-1200C hàm lượng rutin tăng nhanh, quercetin ít biến đổi; từ 140-1800C rutin giảm nhẹ, quercetin tăng nhẹ; từ 200-2200C rutin giảm mạnh, quercetin tăng mạnh [5] Hàm lượng rutin qua chế biến thay đổi rất lớn: dạng sống đạt khoảng 34,7%, dạng sao vàng đạt 28,9%, dạng sao cháy đạt 18,5% [31] Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi màu, hàm lượng quercetin, rutin và tỷ lệ phần trăm khô/tươi cũng như sự phụ thuộc của độ bền rutin vào nhiệt độ, pH cũng được xem xét cụ thể [5, 28, 31, 45] Theo thời gian bảo quản, nụ hòe được chế biến ở điều kiện tự nhiên sẽ giảm 6-11% rutin, quercetin tăng xấp xỉ 0,1% (sau 2 năm) [30] Một số nghiên cứu gần đây đã đi vào nghiên cứu tốc độ giảm chất lượng, cách sơ chế cũng như tác dụng của nhiệt đến sự biến đổi flavonoit trong nụ hoè [5, 30, 31, 45] Phương pháp sơ chế được đánh giá có độ giảm hàm lượng rutin thấp là ngâm nụ hòe tươi trong muối ăn 7,5% trong 15 - 20 phút, rửa sạch, vẩy ly tâm rồi sao vàng [30, 31]

* Sự khác nhau về thành phần: Do ứng dụng rất lớn trong y học, một số nghiên

cứu đã đi vào nghiên cứu thành phần hóa học nụ hoè nhằm làm rõ nguồn gốc dược học cũng như tìm ra các hoạt chất có giá trị Nhiều hợp chất đã được phát hiện, phân lập và xác định cấu trúc [11] Theo nhiều nghiên cứu khác nhau, một số thành phần

hóa học của nụ hòe đã được tìm thấy (xem mục 1.1.1.1) Theo các tài liệu khác

nhau, mức độ giảm của rutin từ dạng nụ sang hoa cũng không thống nhất Nếu như hàm lượng rutin trong nụ là 34 - 44% KLK và trong hoa là 3,6% KLK [13, 14] thì

độ giảm rutin từ trạng thái nụ sang hoa xấp xỉ 89,41 - 91,82% Tuy nhiên theo tài liệu [7] thì mức độ giảm hàm lượng rutin công bố là 40%.Nhìn chung, cho đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào mang tính chất hệ thống về thành phần hóa học

cũng như mức độ giảm của rutin trong nụ hòe Việt Nam

* Khai thác và sử dụng: nguồn gốc dược học của nụ hòe được giải thích chủ yếu

dựa vào rutin và do đó các ứng dụng của nó cũng trên cơ sở dược tính của hoạt chất

24

này Ngày nay, nụ hòe không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền (thuốc bắc)

mà còn được sử dụng chế biến thành trà (Trà hoa Hòe - rutin Vĩnh Tiến), làm phẩm màu thực phẩm, làm mỹ phẩm, [74] Tuy nhiên lượng sử dụng cho mục đích này không đáng kể so với việc sử dụng làm nguyên liệu trích ly rutin Xuất phát từ lợi nhuận do rutin mang lại, việc trồng hòe ở Việt Nam đang được khôi phục và phát triển để thu hoạch nụ sản xuất rutin [14]

1.1.2 Rutin và các nghiên cứu đánh giá

1.1.2.1 Giới thiệu chung về rutin

Rutin là một dược chất, một euflavonoit thuộc

nhóm flavon được Veyss phân lập đầu tiên từ cây

cửu lý hương (Ruta graveolen) vào năm 1842

[9] Năm 1904 được Schnidt xác định công thức

hóa học, năm 1944 được phân lập từ kiều mạch,

năm 1953 được tìm thấy trong gần 150 cây và

cho đến năm 1962 rutin mới được tổng hợp [7]

Rutin có tên khoa học là 3,3’,4’,5,7-pentahyroxyflavon-3-rutinosit ngoài ra còn

nhiều tên khác như eldrin, oxerutin, rhamnoglucosit, rutosit, rutosis, sclerutin, sophorin, quecetin-3-O-β-rutinosit Cấu tạo phân tử rutin gồm hai phần, phần aglycon là quercetin (quercetol) thuộc nhóm flavonol và

quercetin-3-phần đường là rutinosit (6-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosit) [7, 8]

Công thức phân tử là C27H30O16 [8]

* Tính chất vật lý: Rutin có dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt hay vàng hơi

lục, để ra ánh sáng chuyển thành màu sẫm, không mùi Rutin rất dễ hydrat hóa, tinh thể ngậm 3 phân tử nước có điểm chảy là 177-1780C [51] và trở thành dạng khan sau 12h sấy ở 1100C (áp suất 10mm Hg) [63] Rutin khan hút ẩm rất mạnh, chuyển sang màu nâu tại 1250C với αD23 = +13,820 (etanol) và αD23 = -39,430 (pyridin)

Độ tan của rutin trong các dung môi rất khác nhau: 1g rutin hòa tan trong khoảng 10.000ml nước lạnh, 100ml nước sôi, 7ml metanol sôi, 650ml etanol lạnh và 60ml

OH OH O

O O

O

HO

OH OH O

O

OH HO

3 10 6 7 8

25

etanol nóng [17] Rutin không tan trong clorofoc, cacbon disulfit, cacbon tetraclorua, ete, benzen, ete dầu hỏa; dễ tan trong etyl axeton; tan nhiều trong pyridin, dung dịch kiềm; tan ít trong rượu, axeton và etyl axetat Dung dịch rutin trong etanol (96%) có hai cực đại hấp thụ trong vùng tử ngoại ở 362,7 và 257,7mµ với mật độ quang tương ứng E1%1cm là 345 và 265 [8, 7, 20, 51, 57]

* Tính chất hóa học: Sự có mặt các nhóm hydroxyl của phenolic, nhóm cacbonyl

và vòng benzen làm rutin khá hoạt động Tính chất hóa học của rutin phụ thuộc vào

vị trí các nhóm hydroxyl và hệ nối đôi liên hợp trong phân tử [2]

+ Tính chất axit: rutin là một flavonoit có tính axit yếu (pKa = 9,98) nên dễ phản

ứng với dung dịch kiềm tạo muối tan trong nước, dung dịch có màu vàng thêm axit vào có thể kết tủa [14] Trong dung dịch kiềm rutin rất ít bị ảnh hưởng nhưng khi kiềm đặc, nhiệt độ cao, cấu trúc rutin bị phá vỡ (vòng cromon bị phá), tùy theo mức

độ mà có thể tạo thành dẫn chất axit thơm và dẫn chất phenol

+ Phản ứng của nhóm hydroxyl: do có nhóm -OH của phenolic và -OH của ancol

trong phần đường nên rutin dễ dàng tham gia phản ứng axyl hóa Rutin trong dung dịch kiềm có mặt Na2SO2O4 sẽ chuyển thành luteolin [63]

+ Phản ứng mở vòng của furanol: Sự có mặt nhiều nhóm -OH trong phân tử làm

rutin trở nên nhạy cảm hơn với các phản ứng oxy hóa và bẻ gãy vòng

+ Phản ứng vòng thơm: rutin và flavonoit nói chung thường có phản ứng với các

hợp chất diazo tạo các sản phẩm có màu đặc trưng Phản ứng này được sử dụng để phát hiện flavonoit trên sắc ký, thuốc thử thường là amin thơm như p-nitroamin, benzidin, axit sulfanilic

+ Phản ứng của nhóm cacbonyl: rutin và một số flavonoit khác có nhóm cacbonyl

ở vị trí C4 và có nối đôi C2 = C3 nên có phản ứng Shinoda (xianidin) Đây là phản ứng khử có sự tham gia của kim loại như sắt, kẽm, magie và axit clohydric cho sản phẩm có màu đặc trưng: với magie cho dung dịch có màu đỏ, với dung dịch sắt (III) clorua sẽ xuất hiện màu nâu hơi lục [8]

26

+ Phản ứng thủy phân: rutin là một flavonol glycosit có glycon là quercetin, phần

đường là α-D-gluco và L-rhamno nên có tính chất của disacarit Khi rutin thủy phân

tạo thành quercetin và hai phân tử đường monosacarit - phản ứng (1) [7, 14]

1.1.2.2 Tầm quan trọng của rutin trong nền y dược cổ truyền và hiện đại

Tại một cuộc họp của Tổ chức y tế xã hội Mỹ ở Chicago vào năm 1950, nếu như công bố về sự phát tia bức xạ của bom nguyên tử với khả năng hủy diệt hàng loạt đã mang đến bóng đêm của nỗi sợ hãi thì công bố về khả năng phục hồi sự vỡ mao mạch trong cơ thể người đạt tới 88% của rutin lại đem đến niềm hy vọng cho sự sống Cho đến ngày nay, trải qua 6 thập kỷ- vai trò dược học của rutin ngày càng sáng tỏ và được ứng dụng trên rất nhiều phương diện Rutin được biết đến là một loại dược chất (vitamin P) có tác dụng:

- Giảm sự phá huỷ của adrenalin trong cơ thể, tăng khả năng đàn hồi, giảm chứng giòn, tính thấm của mao mạch, ngăn protein của máu thấm qua mô mao mạch

- Ngăn ngừa sự chảy máu có định kỳ, ngăn cản sự đông máu bất thường qua ức chế enzym photphodieteraza

- Hỗ trợ dinh dưỡng tới những mao quản trong mắt, giảm áp lực nội nhãn bệnh nhân glaucoma bằng cách tăng cường toàn vẹn cấu trúc collagen của mắt (60mg/ngày)

- Chống dị ứng bằng cách ngăn cản sự giải phóng của histamin từ các dưỡng bào (là các tế bào lớn trong mô liên kết có nhiều hạt bào tương thô chứa nhiều chất như: histamin, heparin (các chất được giải phóng khi bị viêm hay dị ứng)

- Làm mất tác dụng của chất độc trong các vết thương nên được dùng để giảm tính nhạy cảm, đau nhức của vết thương; ngăn cản sự viêm nhiễm và thúc đẩy sự lành

O O OH

HO

C6H10O4-O-C6H11O4

O

OH OH

- Trị bệnh sốt mùa hè, bệnh trĩ, giãn tĩnh mạch, bệnh mụn rộp miệng, bệnh xơ gan,

sự căng thẳng, can xi huyết thanh thấp, bệnh rối loạn vận động,…

Ngày nay, y học hiện đại đã xác định gốc tự do là nguyên nhân gây nên 90% các loại bệnh của con người Chúng được sinh ra trong tế bào (cạnh axit đêoxiribônuclêic) và gây ra những ảnh hưởng nguy hại như biến dị, hủy hoại tế bào, thúc đẩy ung thư, tăng nhanh lão hóa Rutin là một chất có khả năng chống oxy hóa,

có nhóm OH ở vị trí octo nên dễ bị oxy hóa thành các semiquinon dưới tác dụng của enzym polyphenoloxidaza và preroxidaza trong tế bào Semiquinon (rutin dạng oxy hóa) là các gốc tự do bền vững có thể nhận điện tử hoặc proton từ những chất cho khác để trở lại dạng hydroquinon (rutin dạng khử) Các dạng này có khả năng phản ứng với gốc tự do hoạt động để triệt tiêu chúng hoặc để tạo ra các gốc tự do

(2)

polyphenoloxidaza (hoặc peroxidaza)

28

hình liềm trong người [40, 64, 69]

Đa phần rutin được bào chế ở dạng viên nén (0,02g) theo TCDĐ năm 2006 [8] hay viên bao phim dạng đơn hoặc phối hợp như: phối hợp với vitamin C (làm tăng cường tác dụng của vitamin C); với vincamin (chữa chứng rối loạn tâm thần, cải thiện trí nhớ, thần kinh giác quan ở người già); với axit ascorbic tạo viên bao đường, với cevit rutin (trị trĩ, viêm -giãn tĩnh mạch); với nicotinamit (trị thực tổn suy tĩnh - bạch mạch, trĩ); với trypsin, bromelain (trị sưng xương khớp)

Dù mang hoạt tính rất có giá trị nhưng ứng dụng của rutin bị hạn chế vì rutin tan rất kém trong nước lạnh Do vậy rutin còn được sử dụng như một sản phẩm trung gian để điều chế ra nhiều loại dược chất có độ tan tốt hơn cũng như nhiều tính năng

ưu việt hơn như quercetin có tác dụng ức chế các chất xúc tiến u và sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư như ung thư dạ dày, ung thư máu, ung thư bọng đái, ung thư vú và hai dòng tế bào ung thư mạnh dễ di căn và kháng thuốc ( HT-1080 - một loại tế bào u xơ ác tính trên mô liên kết và 26-L5 – một loại tế bào ung thư ruột kết) [21, 32, 33, 40]; polyrutin có khối lượng phân tử vài nghìn nhưng hòa tan dễ dàng trong nước, có khả năng dọn gốc tự do và ức chế quá trình oxy hoá tốt hơn rutin [68]; troxerutin tan tốt trong nước được dùng để trị hội chứng giãn viêm loét tĩnh mạch; trị đau cơ và chứng phù; natri rutin sulfat có hoạt tính chống lại một số

HIV-1 [61]; rutin poly(H-) sulfate có hoạt tính ức chế hoạt động phần bù trong

huyết thanh máu; melin sulfat có tác dụng trị HIV và nhiều loại phức rutin-kim loại, phức quercetin-kim loại có khả năng chống oxy hóa cao [62, 83],

1.1.2.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất rutin

Xuất phát từ các ứng dụng rất giá trị của rutin trong y học, rutin đã được tìm kiếm trong thực vật và nghiên cứu tổng hợp Kết quả của các nghiên cứu cho thấy rutin có mặt trong gần 150 cây (từ 77 loài của 34 họ thực vật và 70 loài khác của 28

họ thực vật ở dạng vết) như quả mơ, hạt lúa mạch đen, anh đào, vỏ táo, vỏ quả và quả (cam, chanh, quít, bưởi chùm, vôi), lõi hạt tiêu xanh, chè đen, cà chua, lá chè, thuốc lá; các sản phẩm từ ong như ong phấn hoa; các đồ uống như rượu vang đỏ; các loại ngũ cốc nghiền như kiều mạch, mạch ba góc; các loại rau củ như thì là, tỏi

29

củ; trong một số cây thuốc (loại cỏ dại có hoa trắng nhỏ), cây táo gai, cây mận, bạch đàn, cây bạc hà, củ mài, cây thuốc lá, [42, 51] Ở Việt Nam rutin còn được phát hiện từ cây ngưu tất (1995) [47], cây hy thiêm (2002) [42], cây ban (2006) [48]

và vỏ thân cây vọng cách (2008) [26]

Mặc dù tồn tại rất nhiều trong các nguồn thức ăn hàng ngày nhưng để đáp ứng nhu cầu bào chế thuốc, rutin cần phải được sản xuất với khối lượng lớn Ở Pháp mỗi năm sản xuất khoảng 10 tấn rutin vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu [7] Ở Hungari yêu cầu của nhà máy Alkaloida khoảng 3 tấn rutin/năm để sản xuất viên rutin C Gần đây nhu cầu sử dụng rutin ngày càng tăng theo nhu cầu về dược phẩm, đặc biệt khi một số dược phẩm quan trọng chữa bệnh phổ biến hiện nay lại được điều chế từ rutin như quercetin, troxerutin, các dạng phối hợp của rutin với vitamin C (hay

vincamin, axit ascorbic, nicotinamit, trypsin, bromelain) [21, 56, 72]

Do có hàm lượng tương đối cao trong một số thực vật nên vấn đề tổng hợp rutin

được xem nhẹ, rutin chủ yếu được trích ly từ các thực vật và mang nguồn gốc tự nhiên Tùy theo hệ thực vật ở mỗi quốc gia, nguyên liệu trích ly rutin rất khác nhau:

đi từ lá chè xanh, nụ hòe (Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp, Hungari), kiều mạch (Nhật) [66], hạt kiều mạch nảy mầm (Hàn Quốc) [67, 71]; bạch đàn (Anh, Pháp, Mỹ); mạch ba góc (Anh, Nhật, Pháp, Nga, Ba lan) [7] Với hàm lượng rutin: cây hy thiêm (0,0185%) [42], nụ hoè Việt Nam (34-44%) [13, 14, 15], hòe Hungari (12%) [14], mạch ba góc châu Âu (2-3%), lúa mạch ba góc Việt Nam (5-8%) [7] hay 6%, lá cây táo ta (1,5%) [7], lá chè xanh (1%), cửu lý hương (Ruta graveolens

L.) (2%), kiều mạch (5-8,5%) [42] (kiều mạch thường (Fagopyrum esculentum Moench.) (4%); kiều mạch đỏ tartary (Fagopyrum tataricum L.) (6%)), bạch đàn (3-

4%) [51] (bạch đàn Australia (Eucalyptus macrorrhyncha F Muell.)) (10-19%)

[7],… thì nụ hòe, kiều mạch, bạch đàn là ba nguồn nguyên liệu chính được sử dụng

để trích ly rutin Trong cây hòe Việt Nam, rutin có ở hầu hết các bộ phận: nụ chưa

nở (44%), nụ vừa nở (34%), hoa đã nở (14,2%), lá cây (3,6-4,4%), vỏ quả 4,3%), hạt (0,5%) [7,14,51] Do chứa hàm lượng rutin cao nhất, nụ hòe Việt Nam là một trong những nguồn nguyên liệu để trích ly rutin tốt nhất thế giới

(3,3-30

1.2 Trích ly, tinh chế và thực trạng sản xuất rutin

1.2.1 Cơ chế quá trình trích ly và tinh chế rutin

Nụ hòe được chia nhỏ bằng các phương pháp (nghiền, xay, ) Tương ứng với

mỗi phương pháp chia nhỏ sẽ có các tập hợp hạt hòe xay, tập hợp hạt hòe nghiền,

và trong mỗi tập hợp hạt đó sẽ có vô số các hạt hòe

1.2.1.1 Trích ly rutin khỏi nguyên liệu

Đây là một quá trình chuyển khối rắn lỏng (hình 1.2) Trong giai đoạn này, dung

môi tiếp xúc với nguyên liệu, hòa tan và vận chuyển rutin vào dung môi Do sự có mặt của màng tế bào, màng nguyên sinh chất và nhiều thành phần khác nên khi hạt hòe tiếp xúc với dung môi thường có hiện tượng hòa tan, khuếch tán, thẩm thấu và thẩm tích Dung môi thâm nhập vào

trong tế bào nguyên liệu qua các mao

quản (thời gian thấm phụ thuộc vào

đường kính, chiều dài mao quản, áp

lực không khí, dung môi); hòa tan rutin

(rutin được thấm ướt và hoà tan, có thể

tác động nhờ một số yếu tố như nhiệt

độ, pH, ); khuếch tán rutin từ hạt hòe

vào dung môi, gồm: khuếch tán nội

(chuyển rutin trong hạt hòe ra lớp dịch

chiết ở mặt ngoài hạt), khuếch tán chất

tan từ bề mặt hạt đến các lớp tiếp theo xa hơn (chủ yếu là khuếch tán phân tử), khuếch tán đối lưu chuyển rutin theo dòng chuyển động của dịch chiết (điều kiện thủy động là yếu tố quan trọng nhất)

Động lực quá trình trích ly rutin là sự chênh lệch nồng độ rutin trên bề mặt hạt

hòe với nồng độ trung bình của nó trong dịch chiết C 0 Thông thường sự cân bằng đạt được rất nhanh gần bề mặt hạt tức là thế hoá của rutin trong dung dịch bằng thế hoá của rutin ở trong hạt hòe Nồng độ trên bề mặt giới hạn rắn - lỏng có thể coi là

Hình 1.2: Phân bố nồng độ trong các pha

của quá trình chuyển khối rắn- lỏng [4]

Hình 1.3 phản ánh sự thay đổi nồng độ rutin lớn nhất là ở lớp giới hạn khuếch

tán (gần bề mặt hạt hòe) có chiều dày δ, là khu vực khuếch tán phân tử

δ

C C DF d

dq = bh − (1.2)

Từ công thức (1.1 và 1.2) ta có

δ

β = D (1.3)

Hệ số cấp khối β tỷ lệ nghịch với chiều dày của lớp biên khuếch tán (δ), giá trị δ

phụ thuộc vào chế độ thuỷ động ở khu vực bao quanh hạt hòe Như vậy, sự chuyển

động tương đối của dung môi so với hạt hòe càng tăng thì δ càng bé, β càng lớn,

lượng rutin trích ly được càng nhiều Ngoài ta khi nhiệt độ tăng thì tốc độ của quá

trình hoà tan rutin trong một số dung môi cũng tăng do C bh tăng, độ nhớt của dung

dịch giảm, D tăng, lượng rutin trích ly được càng nhiều

Khác với quá trình hòa tan thông thường, quá trình trích ly rutin thực hiện trong

các mao quản của hạt hòe nên bề mặt tiếp xúc pha chuyển dần vào trong, vận tốc

trích ly sẽ giảm nhanh, đến một lúc nào đó khuấy trộn thường không có ảnh hưởng

đến tốc độ của toàn bộ quá trình (hình 1.4): ( )

(1.4)

Tổng lượng rutin trích ly được là q = K tl F(C bh −C0)t (1.5)

Hệ số Ktl trong trường hợp chung: ⎥

=

β

δ l D nD

l K

n tl

2 :

1 (1.6)

32

Trong một số trường hợp điển hình:

- Dung môi di chuyển với tốc độ nhỏ: hiệu suất trích ly chịu tác động của cả ba giai đoạn (biểu thức Ktl có mẫu số 3 số hạng)

- Dung môi di chuyển với tốc độ lớn (khuấy trộn mức độ cao như siêu âm): sự chuyển chất coi như tức thời, hệ số khuếch tán đối lưu β rất lớn, bề dày lớp khuếch

tán trên bề mặt hạt rất nhỏ (bỏ qua hai số hạng sau của mẫu số trong (1.6)) Ktl sẽ do

các yếu tố thuộc về khuếch tán trong lỗ xốp hạt quyết định:

* Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly rutin

Theo [4, 9], tốc độ của quá trình trích ly phụ thuộc nhiều yếu tố như hình dạng, kích thước, thành phần, cấu trúc dược liệu (mao quản), tính chất hoá lý, chế độ thuỷ động dung môi, kiểu thiết bị, phương pháp chiết, tỷ lệ rắn/lỏng,

- Đặc điểm nguyên liệu và rutin: Trong thực vật, rutin được phân bố trong cấu trúc

tế vi tế bào, ở thành mao quản hoặc phân tán trên các bề mặt hay trong dạng liên kết với thành phần khác trong tế bào Do cấu trúc và thành phần hóa học tế bào thực vật phức tạp (gồm có màng tế bào, màng nguyên sinh chất, các nhóm chất như (alkaloit, glycosit, vitamin), tinh dầu nhựa, chất béo, pectin, chất nhầy, tinh bột, các chất màu,….nên quá trình trích ly rutin cũng bị cản trở Để loại bỏ bớt các ảnh hưởng, cần phải xử lý nguyên liệu trước khi trích ly (dùng HCl loãng)

- Độ mịn nguyên liệu: nụ hòe cần được xay hoặc nghiền để đưa về kích thước nhỏ

hơn (các hạt hòe) Nếu kích thước nguyên liệu càng giảm, tốc độ quá trình trích ly

càng tăng do tăng bề mặt tiếp xúc pha và giảm đoạn đường khuyếch tán bên trong nguyên liệu (hệ số khuếch tán tăng) Tuy nhiên khi nguyên liệu quá nhỏ thì tế bào (có tính thẩm tích) bị dập nát, tạo điều kiện cho tạp chất hòa tan vào dung môi

- Dung môi trích ly: chọn dung môi (nồng độ dung môi) là yếu tố then chốt trong

trích ly rutin bởi nó không chỉ ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế, hiệu quả kỹ thuật

33

của quá trình mà còn ảnh hưởng đến đặc tính của tạp chất, phương pháp tinh chế cũng như ảnh hưởng tới môi trường, sức khỏe con người Cần chọn dung môi có độ nhớt thấp, hòa tan chọn lọc rutin, trơ về mặt hóa học, nhiệt độ sôi thấp, không gây cháy nổ, rẻ tiền, ít độc hại Nếu trích ly rutin bằng dung môi kiềm, ngoài nồng độ kiềm thì độ pH của quá trình axit hóa sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan, phân hủy hay kết tủa rutin

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (K v ): có ảnh hưởng lớn đến tốc độ khuếch tán cũng

như mức tan của rutin Trong một khoảng nào đó, Kv tăng sẽ làm tăng tốc độ khuếch tán và khả năng hòa tan rutin nhưng lại làm tăng tạp chất, do đó làm tăng chi phí tách rutin khỏi pha trích

- Nhiệt độ: với một số dung môi trích ly, nhiệt độ tăng làm cho độ nhớt của dung

môi giảm, tạo sự khuếch tán đối lưu liên tục và tăng khả năng tan của rutin Tuy nhiên tác động của nhiệt độ chỉ được sử dụng trong một giới hạn nhất định vì khi tăng nhiệt sẽ dẫn đến sự phân hủy của rutin hay một số tạp chất, tăng mức độ hòa tan của tạp chất, tăng chi phí năng lượng và đặc biệt sẽ rất nguy hiểm với dung môi trích ly dễ bay hơi, dễ cháy nổ Nếu trích ly rutin bằng nước thì yếu tố nhiệt độ rất quan trọng

- Thời gian trích ly: cần phù hợp, kéo dài sẽ tạo điều kiện tạp chất khuếch tán vào

pha trích nhiều hơn Thời gian trích ly phụ thuộc vào độ mịn nguyên liệu, dung môi, nhiệt độ và phương pháp, công nghệ trích ly

- Điều kiện thủy động của dung môi: công thức (1.4) cho thấy chế độ thủy động của

dung môi đặc biệt quan trọng Sự chênh lệch nồng độ là động lực chính của quá trình khuếch tán nên phải di chuyển hỗn hợp trích ly để tạo ra sự chênh lệch nồng

độ ở bề mặt phân cách pha Một số tác động có thể sử dụng như dùng áp suất cao, khuấy trộn, sóng siêu âm, sóng viba hay sử dụng thiết bị có dao động mạch nhịp

+ Khuấy trộn: làm tăng động lực khuếch tán Tuỳ theo giai đoạn trích ly mà

khuấy trộn ảnh hưởng khác nhau đến quá trình khuếch tán trong của nguyên liệu

+ Sóng viba (bước sóng khoảng 30cm (tần số 1GHz) - 1cm (tần số 30GHz)):

34

Sóng viba được ứng dụng trong lò vi sóng với các dao động của trường điện từ tần

số 2450 MHz Tần số này có thể làm nóng hiệu quả nước lỏng (nấu chín thức ăn từ bên trong) nhưng không hiệu quả với chất béo, đường và nước đá Có thể dùng lò vi sóng làm thiết bị trích ly với dung môi phù hợp là nước

+ Sóng siêu âm (tần số 16kHz -10MHz): có khả năng tạo ra các tác động hóa lý

thông qua các hiện tượng sủi bong bóng Sử dụng sóng siêu âm trong trích ly không những rút ngắn được thời gian mà còn làm tăng hiệu suất trích ly [70]

1.2.1.2 Tách rutin khỏi pha trích

Phương pháp tách rutin khỏi pha trích chủ yếu dựa trên các hiện tượng kết tinh, kết tủa rutin, đưa rutin từ dạng hòa tan về trạng thái rắn rồi thực hiện tách pha Dựa vào đặc tính của rutin và dung môi trích ly có thể tiến hành theo các cách sau:

- Với dung môi trích ly là nước ở nhiệt độ cao (≥ 1000C): pha trích được làm lạnh

và rutin sẽ kết tủa nằm dưới đáy thiết bị chứa nên chỉ cần lọc thu rutin thô

- Với dung môi trích ly là etanol lạnh: có thể nâng nhiệt độ pha trích (vì rutin tan tốt trong etanol lạnh nhưng tan kém trong etanol nóng) Tuy nhiên phương pháp thường được dùng để tách rutin hòa tan trong các dung môi nhóm rượu (metanol, etanol, ) là cho bay hơi dung môi (cất dung môi) Trong quá trình cất dung môi, khi dung môi bay hơi một phần thì dung dịch

dễ đạt trạng thái quá bão hòa nên hiện tượng

kết tinh rutin sẽ xảy ra

- Với dung môi trích ly là kiềm (natrihydroxyt,

nước vôi, ): do rutin tan trong môi trường

kiềm và kết tủa trong môi trường axit nên thay

đổi pH pha trích sẽ làm rutin kết tủa (axit hóa

pha trích)

1.2.1.3 Tinh chế rutin

Tinh chế rutin được thực hiện theo nhiều

phương pháp khác nhau Phương pháp truyền

35

thống được thực hiện chủ yếu là hòa tan và kết tinh lại rutin nhiều lần trong nhiều loại dung môi khác nhau Trong các quá trình kết tinh này, vận tốc kết tinh đầu tiên bằng 0 (giai đoạn tạo mầm) sau đó đạt cực đại trong thời gian ngắn rồi lại giảm dần

đến 0 (hình 1.5) Dung môi thích hợp được lựa chọn là các dung môi có độ hoà tan

rutin tăng khá nhanh theo nhiệt độ hoặc có khả năng hoà tan nhiều tạp chất để quá trình tinh chế hiệu quả Ngoài ra còn có thể dùng phương pháp chiết lại trong dung môi hữu cơ hay dùng chất hấp phụ trơ có bộ khung xốp bề mặt riêng lớn như silicagel, nhôm hoạt tính, đất chiết, celit, cacbon hoạt tính để hấp phụ các chất màu

và loại những tạp chất có cấu trúc cồng kềnh hơn rutin

1.2.2 Tổng kết các quá trình trích ly, tinh chế rutin cơ bản

1.2.2.1 Sơ lược kết quả của các nghiên cứu

Do phát hiện được khả năng phục hồi thành mạch đặc biệt của rutin, nghiên cứu trích ly rutin (từ kiều mạch) đã trở thành một cơn sốt trong giới khoa học Châu Âu

mà kết quả của nó là hoàng loạt các Patent sáng chế về công nghệ trích ly rutin [56,

79, 86], lọc rutin và tinh chế rutin từ kiều mạch đã ra đời, tập trung nhiều nhất vào những năm 1946-1953 [79] Trong các nghiên cứu này, cải tiến công nghệ thường tập trung vào loại nhựa, chất béo khỏi dịch chiết ngay từ giai đoạn trích ly

* Về trích ly rutin: Các dung môi được sử dụng chủ yếu là nước sôi, etanol,

propanol, axeton, metyl etyl xeton, hay hỗn hợp các dung môi Thí dụ như trích ly rutin từ hạt kiều mạch nảy mầm có thể dùng etanol (30-80%), axit acetic (3-15%) (hoặc hỗn hợp của chúng) với tỷ lệ lỏng/rắn = 5/10, ở 50-800C trong 1-3h; từ lá kiều mạch dùng nước sôi; từ lá, thân mạch ba góc dùng etanol 70% ở 800C [7] Rutin trong pha trích được tách ra bằng cách cất dung môi hoặc kết tủa rutin Etanol 95%

có thể thêm vào khi cất chân không để protein và chất keo đông tụ, lọc bỏ phần đông tụ, hóa hơi dịch lọc để loại cồn sau đó Sản phẩm thô có thể được hòa tan và kết tinh lại trong cồn, ethyl benzol, Silicagel có thể được dùng như chất trợ lọc để loại nhựa và chất béo hay hấp phụ sắc tố màu đỏ fagopyrin (fagopyrin có trong rutin thô trích ly từ mạch ba góc) [7] Tạp chất trước khi trích ly có thể loại bằng

* Về tinh chế rutin: quá trình tinh chế rutin được nhiều nhà khoa học quan tâm Từ

năm 1947-1955 đã có trên 10 patent (chủ yếu ở châu Âu) công bố bản quyền phương pháp tinh chế rutin Với đặc thù nguyên liệu chính là kiều mạch nên các công trình này chỉ tập trung vào tinh chế rutin thô trích ly từ kiều mạch Ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào vấn đề chiết xuất rutin từ nụ hòe, phần tinh chế rutin chỉ được đề cập đến Phương pháp hòa tan và kết tinh lại trong nước và một số dung môi như etanol, metanol, diclometan, nước sôi, clorofoc, axeton thường được sử dụng, thí dụ như hòa tan rutin trong metanol sôi và kết tủa bằng dung dịch kiềm, [14] Theo tài liệu [23] thì kết tinh lại rutin trong etanol 80% có thể đạt hiệu suất tinh chế tới 76,63%

Tùy thuộc vào nguyên liệu và dung môi trích ly mà rutin thô có những tạp chất khác nhau, quá trình tinh chế do đó cũng khác nhau

+ Ảnh hưởng của nguyên liệu: Chất lượng của nguyên liệu không những ảnh hưởng

đến thành phần của dịch chiết mà còn ảnh hưởng đến hàm lượng rutin Do sự khác nhau về thành phần hóa học của nguyên liệu nên đi từ mỗi nguyên liệu khác nhau, rutin thô sẽ có thành phần tạp khác nhau cả về lượng lẫn chất Để đưa ra phương pháp tinh chế rutin phù hợp, phải dựa vào đặc điểm của tạp chất trong các sản phẩm này Thí dụ trong kiều mạch, ngoài rutin còn có 12-15% protein, amino axit, chất

37

béo, khoáng (sắt, phốt pho, đồng, kẽm), vitamin B1, B2, do đó rutin thô trích ly từ kiều mạch sẽ mang các tạp chất trên Trong số các tạp chất đó thì sắt, phức sắt và phức đồng là những chất khó tách nhất, không thể loại được bằng các quá trình vật

lý, chiết, dùng chất hấp phụ hay kết tinh Để xử lý chúng phải hòa tan rutin trong nước sôi rồi làm lạnh đến 700C, axit hóa dung dịch tới pH = 2,6 và duy trì ở 700C trong 1giờ sau đó mới làm lạnh, lọc thu rutin tinh hơn Đối với rutin chiết từ nụ hòe,

do thành phần hóa học nụ hòe rất phức tạp bao gồm các flavonoit, các chất béo, clorophyl, axit béo, diệp lục, kim loại nặng, … nên tạp chất trong rutin thô cũng rất

đa dạng (xem mục 1.1.1.1) Đặc biệt là các flavonoit như quercetin, isoquercetin,

kaemperol 3- rutinosit, là các chất có lợi trong dược phẩm nhưng chúng lại là những tạp chất rất khó tách khỏi rutin thô do sự tương đồng về cấu trúc, tính chất hóa lý với rutin

+ Ảnh hưởng của dung môi trích ly rutin: do khả năng hòa tan chọn lọc của mỗi

dung môi trích ly khác nhau mà rutin thô cũng mang những tạp chất khác nhau Từ nguyên liệu nụ hòe, rutin thô chiết bằng nước sẽ lẫn nhiều chất như pectin, pectat

do đó bị xạm, keo dính và hàm lượng thấp, sản phẩm có màu xanh lục Nếu dùng dung môi trích ly là kiềm, rutin thô sẽ lẫn nhiều tạp chất mang tính bazơ, sản phẩm

có màu vàng sậm Nếu dùng dung môi trích ly là các dung môi hữu cơ, rutin thô lẫn nhiều clorophyl, sắc tố, chất béo Như vậy, để khắc phục clorophyl trong rutin thô,

có thể dùng tetracloruacacbon; để loại diệp lục và chất béo hoà tan khi chiết bằng cồn, rutin thường được tinh chế bằng ete và kết tinh lại trong nước [7]

1.2.2.2 Các phương pháp trích ly rutin

Rutin là một hoạt chất có khung flavol, phân tử lượng lớn nên quá trình trích ly

thường sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan, tách rutin ra khỏi nguyên liệu Khả

năng tan của rutin trong dung môi là vấn đề then chốt của quá trình trích ly rutin và tách rutin ra khỏi pha trích Mức tan của rutin trong dung môi nước và etanol theo

nhiệt độ đã được tìm thấy (hình 1.6 và hình 1.7)

Ba loại dung môi chiết chính đã được đề xuất và lựa chọn để trích ly rutin là

38

Hình 1.6: Độ hoà tan tương đối của

rutin trong nước [17]

Hình 1.7: Độ hoà tan tương đối của

rutin trong dung dịch etanol [17] nước, kiềm và rượu Dựa vào dung môi, quá trình trích rutin từ nụ Hòe có thể

tạm thời phân ra làm ba phương pháp chính sau:

* Phương pháp nước: dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước theo nhiệt độ

(hình 1.6): tan nhiều trong nước ≥ 1000C và ít tan trong nước lạnh nên nước được

dùng làm dung môi trích ly cũng như tinh chế rutin

+ Ưu điểm: Dung môi là nước nên không độc, rẻ tiền, an toàn, không gây cháy nổ;

sản phẩm không bị lẫn diệp lục, tỷ lệ clorophyl tan lẫn ít (< 0,004 %) [14]

+ Nhược điểm: đòi hỏi lượng nước sôi lớn, đun nấu trên thiết bị cồng kềnh; hiệu suất

trích ly thấp; rutin lẫn nhiều chất khác như pectin, pectat [14] do đó bị xạm, keo dính, màu xanh lục và chỉ đạt chất lượng thô

Phương pháp này được sử dụng phổ biến ở Anh, Mỹ, Úc Nguyễn Văn Đàn và cộng sự dùng phương pháp này để trích rutin từ mạch ba góc năm 1989 [7] Trong báo cáo dự án sản xuất rutin năm 1995 cũng sử dụng nước quá nhiệt để trích ly rutin

từ nụ hoè [7, 17, 75]

* Phương pháp kiềm: rutin là một glucozit có các nhóm – OH tự do của phenolic

(đặc biệt là nhóm OH ở vị trí 7) nên dễ tan trong môi trường kiềm Các loại dung dịch kiềm sử dụng để trích ly rutin là natrihydroxit, amoniac, natri cacbonat, nước vôi, Pha trích có thể được axit hoá bằng axit để rutin thô kết tủa hoặc tách ra bằng dung môi hữu cơ ở môi trường axit [7]

ở nhiệt độ sôi

ở nhiệt độ thường

39

+ Ưu điểm: Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền; tiết kiệm nhiên liệu, năng lượng; trang thiết

bị đơn giản

+ Nhược điểm: Với dung dịch kiềm rutin rất ít bị ảnh hưởng nhưng ở điều kiện

dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc rutin dễ bị phá vỡ Quá trình axit hoá cho rutin kết tủa phải khống chế độ pH thích hợp để tránh phân huỷ rutin thành quercetin và rutin chưa kết tủa hết trong pha trích

Phương pháp này được áp dụng ở Rumani, Hungari Bộ môn Công nghiệp Dược

- ĐH Dược Hà Nội cũng sử dụng phương pháp này trong nghiên cứu trích ly rutin ở quy mô PTN [7, 39]

* Phương pháp dùng dung môi hữu cơ khác: theo tài liệu [23], dung dịch axit

axetic 1% trong nước trích ly được rutin với hiệu suất 25,4% Hầu hết các dung môi hữu cơ có khả năng hoà tan rutin như axeton, etyl axeton, pyridin,… đặc biệt là nhóm rượu như etanol, metanol, iso-propanol đã được sử dụng để trích ly rutin

Rutin tan trong metanol và etanol theo nhiệt độ (hình 1.7) nên hai dung môi này

được sử dụng làm dung môi trích ly chính [7, 17, 39, 63]

+ Ưu điểm: dung môi có tính chọn lọc nên hàm lượng rutin sản phẩm và hiệu suất

trích ly cao

+ Nhược điểm: dung môi đắt tiền và độc hại; nếu dùng metanol, etanol, propanol thì

tốn kém thêm trong công đoạn cất dung môi Sản phẩm thô lẫn nhiều clorophyl, sắc

tố và chất béo [14]

Ở Đức, Mỹ, Việt Nam thường sử dụng etanol để trích ly rutin [27, 39]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ rutin ở Việt Nam

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất rutin

Do nụ hòe có từ lâu đời và sẵn có ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu trích ly rutin được tiến hành trên cơ sở nụ hoè, các nghiên cứu từ nguyên liệu khác chỉ mang tính chất công bố phát hiện [16, 42, 47, 48] Năm 1962, xí nghiệp dược phẩm TW 2

đã đưa quy trình trích ly rutin vào sản xuất công nghiệp nhưng rutin chỉ được sử dụng trong nước làm thuốc chữa bệnh và làm phẩm màu cao viên Trong giai đoạn

40

1965-1975, rutin sản phẩm của Viện dược liệu đã được sử dụng làm thuốc tim mạch;

đã có quy trình trích ly rutin từ nụ hoè đạt TCDĐ Đức (DAB7) (hiệu suất 24%) được chuyển giao trong nước Đến năm 1989, nghiên cứu trích ly rutin vẫn tiến hành ở nhiều nơi như trường ĐH dược Hà Nội, Viện dược liệu, xí nghiệp Hoá dược Một vài

cơ sở công bố đã sản xuất rutin là xí nghiệp dược phẩm TW2, xí nghiệp liên hợp dược Thái Bình, Xí nghiệp hoá dược, Viện khoa học Việt Nam, Công ty dược liệu

TW 1 Đề tài “Nghiên cứu phương pháp chiết xuất rutin đạt tiêu chuẩn xuất khẩu từ hoa hoè” cũng đã được triển khai [39] Phương pháp trích ly rutin được đề cập trong

thời gian này vẫn là dùng nước sôi, kiềm và cồn (dùng etanol, metanol) Theo kết quả công bố thì dùng etanol 95% trong 15 phút chiết được trên 65% rutin và sau 1h

chiết được 85-95% rutin [7] Cho đến năm 1995, dự án “Nghiên cứu triển khai công nghệ sản xuất thử rutin chất lượng cao” đã nghiên cứu trích ly rutin bằng nước qua

xử lý Dây chuyền sản xuất rutin chất lượng cao (ở nhiệt độ >1000C, áp suất 1-5at) quy mô pilot 3000kg rutin/năm đã được lắp đặt với hiệu suất trích ly công bố là > 80%, rutin đạt 95% (quercetin < 2%) với chất lượng tương đương TCDĐ Hà Lan NF

XI, Đức DAB VII và Nhật JP VII [17, 75]

Từ năm 1997-2003, vấn đề lựa chọn dung môi trích ly vẫn được quan tâm nhiều hơn là nghiên cứu tìm các giải pháp công nghệ [39] Dường như mong muốn tìm ra một hệ dung môi tốt hơn cho quá trình trích ly rutin từ nụ hòe của các nhà khoa học Việt Nam vẫn không dừng lại Các nghiên cứu khảo sát trên nhiều hệ dung môi như etanol (60%, 95%), amonihydroxit (20%), natrihydroxit (0,15÷30%), nước (1000C,

1200C), dung dịch natricacbonat 1%, axit axetic, metanol (50%, 70%, 80%, 90%) và etanol (50%, 70%, 80%, 90%) vẫn được công bố [13, 14, 27] Nhận định chung vẫn vẫn là: etanol, metanol trích ly rutin tốt nhất (etanol 80% cho hiệu suất trích ly 29-29,5% [27]); natrihydroxit 20% là dung môi tốt hơn các kiềm khác [13, 14];

Trong những năm gần đây, qua các phương tiện truyền thông, nhiều doanh nghiệp công bố chính thức sản xuất rutin như BV Pharma có công suất chiết 20 tấn rutin/năm (hàm lượng 98,0%), có cả công nghệ bào chế viên rutin bao đường (GMP); vimedimex có khả năng cung cấp rutin > 50 tấn/năm Bên cạnh các doanh