T Ổ NG QUAN V ẤN ĐỀ NGHIÊN C Ứ U
Điể m sinh h ọc loài Gõ đỏ
1.1.1 Đặc điể m hình thái và v ậ t h ậ u
Gõ đỏ, còn được biết đến với tên gọi Cà te hay Hổ bì, có tên khoa học là Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib, theo Sách đỏ Việt Nam Tại Lào, cây này được gọi là Teakha Nhiều tác giả, bao gồm Trần Hợp (2002) và các nghiên cứu từ Bộ KHCN và MT (1996, 2007) cũng xác nhận tên khoa học này cho loài Gõ.
Họ (Familia): Fabaceae Phân h ọ (Subfamilia): Caesalpinioideae Chi (Genus): Afzelia
Hình 1.1 Hình thái cây và các bộ phận của loài Gõ đỏ
Nguồn: https://www.linkedin.com/authwall
Gõ đỏ (Afzelia) là cây gỗ rụng lá thuộc họ phụ vang (Caesalpinioideae), cao từ 30 đến 40 m với cành nhiều và rườm rà Thân cây có vỏ màu xám xanh, nứt vảy không đều và dày từ 8 đến 10 mm, có bướu Cành non có lông mỏng, sau đó trở nên nhẵn và có lỗ bì Lá cây là dạng kép lông chim một lần chẵn, cuống chung dài từ 10 đến 15 cm, mang từ 2 đến 5 đôi lá nhỏ mọc đối, có hình trái xoan hoặc trứng, với gốc lá tròn và đầu tù, dài từ 5 đến 6 cm và rộng từ 4 đến 5 cm, có 9 đến 7 đôi gân bên và 2 lá kèm.
Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa và Trần Văn Tiến, (2002), Nguyễn Hoàng Nghĩa, (2004) và theo báo cáo của Bộ KHCN và MT Việt Nam, (1996),
Hoa của cây Gõ đỏ có dạng chùm, dài từ 10 đến 12 cm, với màu trắng xám Thời gian ra hoa thường rơi vào tháng 3 đến tháng 4, trong khi quả chín từ tháng 9 đến tháng 11 Quả của cây có hình trái xoan, kích thước dài từ 15 đến 20 cm, rộng từ 6 đến 9 cm, và dày từ 2 đến 3 cm Hạt của cây có hình dạng trụ, bầu dục hoặc hơi tròn, với vỏ cứng màu đen và tử y cứng màu trắng.
Gõ đỏ (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2004) phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào, Thái Lan và Mianma Tại Việt Nam, loài cây này thường mọc rải rác trong các rừng kín thường xanh ẩm nhiệt đới và rừng nửa rụng lá, ở những vùng có lượng mưa từ 1500 - 2500 mm/năm và nhiệt độ trung bình tháng lạnh khoảng 15°C, tháng nóng nhất từ 26 - 29°C Ở miền Đông Nam Bộ, Gõ đỏ phát triển tốt trên đất feralit đỏ vàng từ đá phiến thạch sét, đất xám trên granít và đất nâu đỏ trên đá bazan, với thành phần cơ giới từ cát pha đến thịt nhẹ Loài cây này có khả năng tái sinh tốt thông qua hạt và chồi dưới tán rừng.
Gỗ Gõ đỏ có giác màu xám trắng và lõi từ đỏ nhạt đến đỏ xẫm, với những vân đen giống da hổ Loại gỗ này nặng, cứng, dễ chế biến và ít cong vênh, không bị mối mọt nhưng dễ nứt Gỗ Gõ đỏ nổi bật với độ bền, tính thẩm mỹ cao và khả năng chịu đựng tốt trong môi trường khắc nghiệt Nó được sử dụng phổ biến trong xây dựng công trình lớn, đóng tàu thuyền, làm đồ dùng nội thất, đồ mỹ nghệ và đồ mộc cao cấp Bên cạnh đó, Gõ đỏ còn được chọn để trồng trong các dự án cải tạo rừng và vườn rừng.
Nghiên cứu về cầu trúc và tái sinh rừng
Cấu trúc rừng phản ánh mối quan hệ tương tác giữa các loài thực vật và môi trường sống của chúng Việc nghiên cứu cấu trúc rừng giúp hiểu rõ các mối quan hệ sinh thái trong quần xã, từ đó đề xuất các biện pháp kỹ thuật tác động phù hợp, rất cần thiết cho việc bảo tồn và phát triển bền vững rừng.
Baur G.N (1962) đã nghiên cứu sâu về cơ sở sinh thái học, đặc biệt trong lĩnh vực kinh doanh rừng mưa, tập trung vào các yếu tố cấu trúc rừng và các phương pháp xử lý lâm sinh cho rừng mưa tự nhiên Ông chỉ ra rằng các phương thức xử lý này đều hướng tới hai mục tiêu rõ ràng.
Mục tiêu đầu tiên là cải thiện rừng nguyên sinh, vốn thường có sự đa dạng loài và độ tuổi không đồng đều, bằng cách loại bỏ những cây đã quá thành thục và không còn giá trị, nhằm tạo ra không gian thuận lợi cho sự phát triển của các cây còn lại.
Mục tiêu thứ hai là thúc đẩy quá trình tái sinh rừng thông qua việc thực hiện tái sinh nhân tạo và giải phóng lớp cây tái sinh tự nhiên đang trong trạng thái ngủ Điều này nhằm thay thế cho những cây đã bị khai thác hoặc trong quá trình chăm sóc, nuôi dưỡng rừng sau đó.
Ông đã tổng kết các nguyên lý xử lý lâm sinh nhằm tạo ra rừng đồng tuổi, rừng không đồng tuổi và cải thiện chất lượng rừng mưa.
Catinot (1965) đã nghiên cứu cấu trúc hình thái rừng thông qua việc biểu diễn các phẫu đồ rừng và phân tích các nhân tố cấu trúc sinh thái Ông mô tả phân loại theo các khái niệm dạng sống và tầng phiến, góp phần làm rõ đặc điểm sinh thái của rừng thông.
Odum E.P (1971) đã phát triển học thuyết về hệ sinh thái dựa trên thuật ngữ "hệ sinh thái" do Tansley A.P (1935) đưa ra Khái niệm này giúp làm rõ các yếu tố cấu trúc từ góc độ sinh thái học, tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về hệ sinh thái.
Nghiên cứu của Eshetu Yirdaw và cộng sự (2019) cho thấy trong rừng tự nhiên nhiệt đới thành thục có từ 70 đến 100 loài cây gỗ trên mỗi hectare, tuy nhiên rất ít loài chiếm tỷ lệ vượt quá 10% trong tổng số loài.
Richards P W (1952), qua bản dịch của Vương Tấn Nhị, đã nghiên cứu cấu trúc rừng mưa nhiệt đới về mặt hình thái, nhấn mạnh rằng hầu hết thực vật trong rừng này đều là thân gỗ Rừng mưa thường có ba tầng chính, cùng với tầng cây bụi và tầng cây thân cỏ Ngoài cây gỗ lớn, rừng còn có nhiều loài cây leo và thực vật phụ sinh Rừng mưa được coi là một quần xã sinh thái phức tạp và đa dạng nhất về loài cây Nhiều tác giả có ý kiến khác nhau về việc xác định số tầng trong rừng tự nhiên nhiệt đới, với một số cho rằng chỉ có một tầng cây gỗ Richards phân loại rừng ở Nigeria thành 6 tầng dựa trên chiều cao từ 6 đến 42 m, nhưng thực chất đây chỉ là các lớp chiều cao.
Odum E.P (1971), nghi ngờ sự phân tầng rừng rậm nơi có độ cao dưới
600 m ở Puecto - Rico và cho rằng không có sự tập trung khối tán ở một tầng riêng biệt nào cả
Hầu hết các tác giả nghiên cứu về tầng thứ trong rừng tự nhiên nhiệt đới thường đưa ra những nhận xét định tính, trong khi việc phân chia tầng thứ theo chiều cao mang tính cơ giới và chưa phản ánh đầy đủ sự phức tạp của hệ sinh thái này.
Khi chuyển từ nghiên cứu định tính sang định lượng về cấu trúc rừng, nhiều tác giả đã áp dụng các công thức và hàm toán học để mô hình hóa cấu trúc rừng và xác định mối quan hệ giữa các yếu tố cấu trúc.
Raunkiaer (1934) đã phát triển công thức xác định phổ dạng sống chuẩn cho hàng nghìn loài cây, dựa trên tỷ lệ phần trăm giữa số lượng cá thể của từng dạng sống so với tổng số cá thể trong một khu vực Để đánh giá tính đa dạng loài, các tác giả như Simpson (1949) đã xây dựng chỉ số đa dạng nhằm phân tích mức độ phân tán hoặc tập trung của các loài, đặc biệt trong lớp thảm tươi Ngoài ra, Drude đã giới thiệu khái niệm độ nhiều và phương pháp xác định, góp phần vào những nghiên cứu định lượng có giá trị sinh thái.
Nghiên cứu định lượng cấu trúc rừng đã phát triển mạnh mẽ nhờ vào việc áp dụng các hàm toán học để mô phỏng quy luật kết cấu lâm phần Các mối quan hệ giữa chiều cao và đường kính cây đã được biểu diễn qua các hàm hồi quy, trong khi phân bố đường kính ngang ngực và đường kính tán được mô hình hóa bằng các dạng phân bố xác suất, chẳng hạn như hàm Weibull cho cây Thông Tuy nhiên, các hàm toán học không thể phản ánh đầy đủ mối quan hệ sinh thái giữa các cây và môi trường xung quanh, do đó, các phương pháp nghiên cứu cấu trúc rừng theo hướng này không được áp dụng trong đề tài.
Trên toàn cầu, nghiên cứu về cấu trúc rừng, đặc biệt là rừng nhiệt đới, rất phong phú và đa dạng, với nhiều công trình nghiên cứu sâu sắc mang lại hiệu quả cao trong kinh doanh rừng Tuy nhiên, do sự phong phú và đa dạng của rừng tự nhiên, các nghiên cứu này không thể bao quát hết mọi khu rừng.
Trần Ngũ Phương (2000), Lê Sáu (1996) và Nguyễn Văn Sinh (2007) đã chỉ ra các đặc điểm cấu trúc của thảm thực vật dựa trên kết quả điều tra rừng Nhân tố cấu trúc đầu tiên được nghiên cứu là tổ thành, từ đó phát hiện và ứng dụng một số quy luật của hệ sinh thái rừng vào sản xuất Đông Sĩ Hiền (1974) và Trần Ngũ Phương (2000) đã thực hiện nghiên cứu định lượng về cấu trúc rừng, sử dụng hàm Meyer và hệ thống đường cong Pearson để phân tích phân bố số cây theo kích thước đường kính, làm cơ sở cho việc lập biểu độ thon cây đứng ở Việt Nam.
Nghiên cứu cơ sở dữ liệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ở thực vật 21 1.4 Nghiên c ứ u v ề k ỹ thu ậ t nhân gi ống và chăm sóc cây con ở vườn ươm
Hiện nay, nhiều locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN cho thực vật, với hy vọng rằng trình tự mã vạch được nhân bản từ ADN của bố mẹ sẽ cung cấp thông tin phong phú hơn về các loài cần xác định Tuy nhiên, việc khuếch đại PCR từ gen nhân gặp khó khăn do gen nhân thường là đơn gen hoặc có số lượng bản sao gen thấp.
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa RNA ribosome, với các gen DNA ribosome mang trình tự vừa bảo thủ vừa đa dạng, giúp phân biệt các loài gần gũi Hiện nay, vùng nrITS của gen nhân được coi là một trong những công cụ quan trọng nhất để đánh giá phát sinh loài ở thực vật và động vật, nhờ vào tính phổ biến trong tự nhiên, khả năng di truyền từ bố mẹ và mức độ biến đổi cao do ít bị hạn chế chức năng.
Các nhà khoa học đang ngày càng chú trọng đến việc sử dụng kết quả phân tích hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật, do hệ gen này có tính bảo thủ cao và đặc trưng cho từng loài.
M et al, 2009; Vijayan K and Tsou C H, 2010; Yu J et al, 2011)
Các gen lạp thể, đặc biệt là trình tự ITS1, đã được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật, với hơn 10.000 trình tự ITS1 có trong GenBank CBOL đã công nhận ITS1 là một trong những trình tự gen tiềm năng cho nghiên cứu mã vạch ADN ở thực vật nhờ vào khả năng khuếch đại PCR dễ dàng ở nhiều nhóm thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài còn hạn chế, nhiều nhóm nghiên cứu khuyến nghị nên kết hợp ITS1 với các chỉ thị barcode khác để nâng cao hiệu quả phân loại.
MatK, được tìm thấy ở hầu hết các loài thực vật, đã trở thành một chỉ thị quan trọng trong nghiên cứu mối quan hệ và phát sinh loài thực vật CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và phát hiện rằng 90% mẫu thực vật hạt kín có thể dễ dàng khuếch đại trình tự bằng một cặp mồi đơn Do đó, matK được đề xuất là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật.
Gen rpoB, rpoC1, và rpoC2 mã hóa ba trong bốn tiểu đơn vị của ARN polymerase lục lạp Nghiên cứu của Dipterocarpaceae và Tsumura (1996) đã chỉ ra rằng gen rpoB rất phù hợp để nghiên cứu phát sinh loài Hiện nay, rpoB là một trong những gen phổ biến được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là trong các nghiên cứu về các chủng có quan hệ gần gũi (Wu F et al, 2006; Vijayan K và Tsou C.H, 2010).
Gen ycf5 mã hóa một protein với 330 amino acids và được bảo tồn trên toàn bộ các vùng thực vật Gen này đã được kiểm nghiệm phù hợp với DNA barcode của một số nhóm, nhưng vẫn chưa được công nhận và sử dụng rộng rãi trong vai trò của một DNA barcode.
C M et al, 2009; Vijayan K and Tsou C.H, 2010) Đoạn gen trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị mã vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị mã vạch bổ sung (Taberlet P, 2007; Vijayan K and Tsou C.H, 2010)
Nghiên cứu của Taberlet (2007) nhằm xác định xem intron trnL (UAA) có thể được sử dụng làm vùng DNA barcode đã được thực hiện trên 100 loài thực vật Kết quả cho thấy intron trnL có khả năng trở thành một barcode hiệu quả cho thực vật.
K and Tsou C.H, 2010; Yao H et al, 2010)
Kết quả nghiên cứu các locus trong hệ gen lục lạp và hệ gen nhân hiện còn hạn chế trong việc sử dụng làm chỉ thị cho ADN mã vạch Do đó, việc kết hợp các locus để bổ sung cho nhau là cần thiết, nhằm nâng cao hiệu quả trong đánh giá và phân loại các loài thực vật (Vijayan K và Tsou C.H, 2010).
Việc sử dụng hệ thống ADN mã vạch để xác định loài thực vật đang mở ra triển vọng mới cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học Các gen lạp thể, đặc biệt là ITS1, đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật, với hơn 10.000 trình tự ITS1 có sẵn trong GenBank CBOL đã công nhận ITS1 là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho nghiên cứu mã vạch ADN ở thực vật nhờ vào khả năng khuếch đại PCR dễ dàng trong một số nhóm thực vật Tuy nhiên, tại CHDCNHD Lào, các công trình công bố về mã vạch ADN còn rất hiếm, trong khi ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu đáng chú ý trong lĩnh vực này.
Nghiên cứu phân loại các họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và Trúc đào (Apocynaceae) ở Việt Nam được thực hiện bằng cách kết hợp phương pháp sinh học phân tử và hình thái Dự án này được thực hiện bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật trong giai đoạn 2009-2010.
Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN (DNA barcode) phục vụ cho việc định danh sâm Ngọc Linh và cây Bá bệnh (Nguyễn Thị Thu Hiền, 2012; Đinh
Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã thực hiện nghiên cứu về đa dạng di truyền của một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) thông qua phương pháp ADN mã vạch Nghiên cứu này nhằm đánh giá sự phong phú và khác biệt di truyền giữa các loài cây, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý giá của Việt Nam.
Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự (2012), đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó
Bầu (Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh, kết quả nghiên cứu đã tách chiết và tinh sạch được ADN tổng số của 18 mẫu Dó bầu (3 loài của CHDCND Lào;
Các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc nhân bản các đoạn gen trnH–psbA, ITS1, rpoB, và ITS từ ADN tổng số của 18 mẫu Dó Bầu, bao gồm 11 mẫu từ Hà Tĩnh và 4 mẫu từ Phú Quốc, thông qua phương pháp PCR.
Nghiên cứu dựa trên gen matK của loài Trà vàng pêtêlô (Mã số KJ806276.1) đã thiết kế một cặp mồi đặc hiệu, áp dụng cho ADN tổng số của 5 mẫu cây Trà hoa vàng Tam Đảo (TĐ1, TĐ2, TĐ3, TĐ4, TĐ5) và 5 mẫu Trà vàng lá dày (LD1, LD2, LD3, LD4, LD5) (Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Phong, 2015).
Nghiên cứu trên cây Mỡ Phú Thọ của tác giả Ha Van Huan et al
(2018), cho thấy đoạn ITS2 có khả năng sử dụng tốt nhất để phân biệt loài này (Ha Van Huan et al, 2018)
1.4 Nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống và chăm sóc cây conởvườn ươm
N ỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỊA ĐIỂ M NGHIÊN C Ứ U
N ộ i dung nghiên c ứ u c ủa đề tài
2.1.1 Nghiên c ứu đặc điể m sinh h ọ c loài Gõ đỏ
- Đặc điểm hình thái và vật hậu
- Đặc điểm giải phẫu sinh lý
- Đặc điể m mã v ạ ch ADN c ủ a ngu ồn gen Gõ đỏ t ạ i Ho ạ i Nhang
2.1.2 Nghiên c ứu đặc điể m lâm h ọ c c ủ a lâm ph ần nơi có Gõ đỏ phân b ố
- Đặc điểm nơi mọc của Gõ đỏ
- Đặc trưng cấu trúc quần xã thực vật rừng
- Đặc điểm tái sinh tự nhiên của quần xã thực vật rừng
2.1.3 Nghiên c ứ u k ỹ thu ậ t nhân gi ố ng Gõ đỏ
- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Gõ đỏ từ hạt
- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Gõ đỏ bằng hom
2.1.4 Đề xu ấ t m ộ t s ố gi ả i pháp b ả o t ồ n và phát tri ể n loài Gõ đỏ
- Giải pháp bảo tồn loài Gõ đỏ
- Giải pháp kỹ thuật nhân giống và gây trồng loài Gõ đỏ.
Vật liệu nghiên cứu
Cây Gõ đỏ phát triển tự nhiên trong các ô tiêu chuẩn điều tra, được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh thái và xác định đặc điểm mã vạch AND.
- Lá cây con ở giai đoạn vườn ươm được thu thập để nghiên cứu đặc điểm sinh lý, giải phẫu của cây Gõ đỏ.
- Quả, hạt và cành non được thu hái từ các cây trưởng thành ừ rừng tự nhiên được sử dụng để làm vật liệu nhân giống.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu hệ sinh thái tập trung vào mối quan hệ giữa các thành phần trong hệ thống, do đó, nhiều học giả cho rằng việc nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái của một loài sinh vật hay cây cối cần áp dụng một số phương pháp tiếp cận chủ yếu như: phương pháp tiếp cận hệ thống, phương pháp tiếp cận theo cấp bậc tầng thứ và phương pháp nghiên cứu sinh thái thực nghiệm Dựa trên quan điểm này, phương pháp tiếp cận nghiên cứu của đề tài được thể hiện qua sơ đồ minh họa.
Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát tiến trình nghiên cứu
2.3.2 Phương pháp kế th ừa tư liệ u
Kế thừa kết quả của các nghiên cứu khoa học, các công trình nghiên cứu, bài báo và các thông tin có liên quan tới loài cây Gõ đỏ
Kế thừa tài liệu về khí hậu, thổ nhưỡng, khí tượng, thuỷ văn, và bản đồ rừng hiện trạng, cùng với các tài liệu liên quan đến khu vực nghiên cứu, chúng tôi đề xuất các giải pháp hiệu quả.
Xác đị nh v ấn đề nghiên cứu Điều tra sơ bộ thực đị a
Thu thập tài liệu th ứ c ấ p
Thu th ậ p s ố li ệ u ngoài hi ện trườ ng Bố trí thí nghiệm trong phòng
X ử lý s ố li ệ u và phân tích kết quả
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điể m sinh h ọ c c ủ a Gõ đỏ
(i) Nghiên cứu đặc điểm hình thái và vật hậu:
Nghiên cứu đặc điểm hình thái và vật hậu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Hoại Nhang, thủ đô Viêng Chăn, Lào được thực hiện bằng phương pháp chuyên gia và phân tích tài liệu liên quan Phương pháp này kết hợp với quan sát mô tả và lấy tiêu bản từ các cây mẫu trong rừng tự nhiên.
- Tiêu chuẩn cây mẫu: Cây được lựa chọn là cây sinh trưởng tốt, thân thẳng, không cong queo, sâu bệnh, đã cho quảổn định ít nhất 3 năm.
Để lấy mẫu, tại mỗi địa điểm, chọn 3 cây và từ mỗi cây, lấy 4 cành theo các hướng Đông, Tây, Nam, Bắc Mục tiêu là theo dõi các chỉ tiêu như thời kỳ rụng lá, ra chồi, ra hoa, nở hoa, kết quả, cũng như thời kỳ quả chín và rơi rụng.
(ii) Nghiên cứu tách chiết ADN tổng số
Chúng tôi đã thu thập 09 mẫu lá tươi từ 03 cá thể loài Gõ đỏ tại Khu bảo tồn thiên nhiên Hoại Nhang Các mẫu lá được đánh dấu với các ký hiệu AxL11, AxL12.
Các mẫu lá AxL13, AxL21, AxL22, AxL23, AxL31, AxL32 và AxL33 được thu thập từ nguồn tự nhiên và đã được định danh, cùng với các tiêu bản mẫu cây chuẩn hóa Sau khi thu thập, mẫu lá tươi được cho vào túi Ziplock chứa silica gel và được vận chuyển về Phòng thí nghiệm, nơi chúng được lưu trữ ở nhiệt độ -80°C cho đến khi ADN được tách chiết.
- Tách chiết ADN hệ gen: ADN hệ gen được tách chiết theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) của Saghai Maroof et al.,
Năm 1984, một phương pháp mới được áp dụng với sự điều chỉnh nhỏ, trong đó khoảng 100mg mô lá được nghiền bằng chày sứ trong 600 ml đệm CTAB Công thức đệm bao gồm 4% CTAB, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-mercaptoethanol, và 100 mM Tris-HCl với pH 8.0.
Mẫu được chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ ở 65 độ C trong 30 phút, sau đó chiết xuất bằng chloroform với thể tích tương đương Các mẫu được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút, sau đó dung dịch được chuyển sang ống ly tâm mới ADN được tủa bằng cách thêm 500 μl isopropanol lạnh và ly tâm ở 10.000 vòng/phút Sau khi tủa, ADN được rửa sạch bằng cồn 70%, sau đó làm khô và hòa tan trong 100 μl đệm TE.
(iii) Nghiên cứu khuếch đại PCR, đọc trình tự gen và phân tích dữ liệu ADN mã vạch
Chuỗi mã vạch ADN matK, rbcL và psbA-trnH được khuyếch đại bằng máy PCR 9700 Thermal Cycler của Applied Biosystems (Mỹ) Hỗn hợp phản ứng PCR có tổng thể tích 25µl, bao gồm: 2,5 µl đệm 10X Taq, 2,0 µl hỗn hợp dNTP (2,0 mM), 1,0 µl cho mỗi cặp mồi (10 µM), 0,5 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl), 1 µl ADN khuôn (50 ng/µl) và H2O Chu kỳ nhiệt cho PCR được thiết lập như sau: 95°C trong 3 phút, sau đó lặp lại 40 chu kỳ với 95°C trong 30 giây, 57-62°C trong 30 giây, và 72°C trong 1 phút, kết thúc với 72°C trong 7 phút và bảo quản sản phẩm PCR ở 4°C Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,2%.
Trình tự nucleotide của mồi cho ba vùng ADN được trình bày trong bảng 2.1 Sản phẩm PCR đã được tinh sạch bằng bộ Kít Norgen biotek từ Canada Việc đọc trình tự nucleotide được thực hiện trên máy phân tích DNA ABI PRISM®3730xl.
Bảng 2.1 Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi
Kích thướ c theo lý thuy ế t
Tham kh ả o matK Mồi xuôi: 5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’
Mồi ngược: 5’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3’ rbcL M ồi xuôi: 5’ -GTAAAATCAAGTCCACCACG- 3’
M ồi ngược: 5’ -GTAAAATCAAGTCCACCGCG- 3’ psbA- trnH
(iv) Xử lý, phân tích dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode)
The obtained sequences were processed using Bioedit version 7.2.5, Clustal X 1.83, and the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) available on the NCBI (National Center for Biotechnology Information) website at https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
(v) Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, sinh lý giai đoạn vườn ươm
Ba mẫu lá bánh tẻ từ các cá thể khác nhau trong một công thức thí nghiệm được chọn ngẫu nhiên Trên mỗi phiến lá, ba vị trí của phần thịt lá được giải phẫu để nghiên cứu Giải phẫu mặt dưới của lá giúp đếm số lượng khí khổng, trong khi độ dày lá được đo để xác định độ dày các mô trong phần thịt lá Các mẫu giải phẫu được chụp ảnh và các thông số được đo đếm bằng kính hiển vi OPTIKA M.
699 có gắn Optikam PRO 3 Digital Camera
- Xác định hàm lượng và tỷ lệ diệp lục a và b
Sử dụng phương pháp so màu của Benz et al (1980) Xác định cường độ thoát hơi nước theo phương pháp cân nhanh của L A Ivanov et al (1950)
- Xác định sức hút nước của mô thực vật:
Phương pháp so sánh tỷ trọng của Shacdacov được thực hiện bằng cách chuẩn bị hai dãy ống nghiệm: dãy thí nghiệm (1) và dãy đối chứng (2) với nồng độ NaCl từ 0,1 M đến 1 M Mỗi ống nghiệm trong dãy 2 nhận 3 ml NaCl, trong khi dãy 1 nhận 2 ml NaCl tương ứng Sau khi thêm 5 mảnh lá vào mỗi ống nghiệm của dãy 1 và ngâm trong 30 phút, thêm một giọt xanh metylen vào mỗi ống thí nghiệm Sử dụng pipet để hút dung dịch màu xanh và thả vào dung dịch đối chứng, quan sát sự di chuyển của dòng dung dịch cho đến khi nó đứng yên, chỉ ra rằng nồng độ dịch bào và nồng độ dung dịch muối bằng nhau (Ctb = Cdd) Khi đó, sức hút nước của tế bào và dung dịch đẳng trương cũng bằng nhau (Stb = Sdd = R.T.Ci).
Trong đó: S tb : Sức hút nước của tế bào; S dd : Sức hút nước của dung dịch;
R = 0,0821 = hằng số khí; C: Nồng độ dịch bào; i: Hằng số đẳng trương; i =
1 + α (n-1); α: Bậc điện ly; n: Hệ số ion khi điện ly
- Xác định sức chịu nóng của lá:
Phương pháp Maxcop được thực hiện bằng cách đun sôi nước và pha vào cốc sứ với các nhiệt độ 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C và 60°C Lá được ngâm trong các cốc nước nóng trong 30 phút, sau đó vớt ra và cho vào cốc nước ở nhiệt độ thường Tiếp theo, thay nước trong cốc bằng dung dịch HCl 0,2 N và sau 20 phút, vớt lá ra để tính diện tích lá bị tổn thương (%) Kết quả cho thấy diện tích tổn thương càng lớn thì khả năng chịu nóng của lá càng kém và ngược lại.
2.3.4 Nghiên c ứu đặc điể m lâm h ọ c
2.3.4.1 Nghiên cứu đặc trưng cấu trúc rừng nơi Gõ đỏ phân bố
Theo Luật Lâm nghiệp Lào 2019, có hiệu lực từ ngày 1 tháng 1 năm 2019, việc xác định kiểu rừng được thực hiện dựa trên hệ thống phân loại quy định Cụ thể, Điều 16, khoản 7, điểm a, b, c, d nêu rõ rằng kiểu rừng được phân loại dựa trên 4 yếu tố chính.
Đặc điểm điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội khu BTTN Hoại Nhang 50
Khu Bảo tồn Huại Nhang, với diện tích 808 ha, tọa lạc tại huyện Xay Tha Ny, thủ đô Viêng Chăn, Lào Nơi đây cách trung tâm thủ đô Viêng Chăn khoảng 10 km về phía Đông Bắc.
Hình 2.3 Bản đồ ranh giới khu
Hình 2.4 Hình dạng khu BTTN
Ranh giới khu bảo tồn
+ Phía Đông xuất phát từ bản Đông Mác Khai giáp huyện Pác Ngưm; + Phía Tây giáp với đường số 10 Viêng Chăn - Tha Ngon giáp huyện Naxaythong – Sang Thong;
+ Phía Nam giáp với bản Đon Tịu (huyện Chanthabury - Sikhottabong); + Phía Bắc giáp với bản Lạt Khoai và bản Nôn Tẻ.
Khu bảo tồn Hoại Nhang chủ yếu là rừng nguyên sinh, chiếm khoảng 47% diện tích, với tài nguyên rừng phân bố đồng đều ở độ cao trung bình từ 174 đến 189m so với mực nước biển Địa hình khu vực khá bằng phẳng, mang đặc trưng của vùng đồng bằng trung tâm Lào, và có cấu trúc địa thế dạng bậc thang, tạo nên nét đặc sắc cho khu bảo tồn này.
Khí hậu: Hàng năm ở đây có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa bắt đầu từ đầu tháng
4 và kéo đài đến hết tháng 10 Mùa mưa thường tập trung vào tháng 8 và tháng 9 Mùa khô kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 3 năm sau.
Khu vực này có hai mùa rõ rệt với nhiệt độ trung bình năm từ 27 đến 29 °C Mùa mưa có nhiệt độ nóng cao, trong khi mùa lạnh kéo dài từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, với nhiệt độ thấp nhất vào tháng 1 và nhiệt độ trung bình trong mùa đông từ 22 đến 25 °C.
Khu bảo tồn có lượng mưa trung bình hàng năm đạt 1936 mm, với biến động từ 1700 đến 2100 mm Khoảng 80-90% tổng lượng mưa rơi vào mùa mưa, trong đó tháng 8 là tháng có lượng mưa nhiều nhất, còn tháng 12 là tháng có lượng mưa ít nhất Độ ẩm tương đối biến động theo mùa, mùa mưa đạt 75-85%, trong khi mùa khô, do ảnh hưởng của gió mùa, độ ẩm giảm xuống còn 64-69% Giá trị bình quân độ ẩm trong năm là 73%.
Theo số liệu từ trạm theo dõi khí hậu thủy văn A-Kạt, lượng nước bốc hơi trung bình hàng năm dao động từ 52 đến 74 mm Trong đó, trong mùa mưa, lượng bốc hơi trung bình đạt khoảng 68 đến 74 mm.
Khu vực nghiên cứu có hai mùa gió chính: Gió Tây Nam từ tháng 4 đến tháng 10, trùng với mùa mưa, và Gió Đông Bắc từ cuối tháng 11 đến tháng 3 năm sau, tương ứng với mùa khô Đặc biệt, gió mùa Đông Bắc khi đi qua Việt Nam trở nên khô hanh hơn, góp phần làm gia tăng tình trạng khô hạn trong khu vực này.
2.4 2 Đa dạ ng sinh h ọ c c ủ a khu b ả o t ồ n Hu ạ i Nhang
2.4.2.1 Hệ sinh thái rừng và tài nguyên thực vật
KBTHN sở hữu hệ sinh thái rừng nguyên sinh độc đáo với cảnh quan địa lý đa dạng và sự phong phú về thành phần loài thực vật Khoảng 80% diện tích rừng ẩm nhiệt đới tại đây vẫn còn trong tình trạng nguyên sinh hoặc gần như nguyên sinh, bao gồm hai hệ sinh thái rừng chính.
Hệ sinh thái rừng hỗn giao cận nhiệt đới bao gồm các loài cây lá rộng và cây lá kim, nổi bật với những cây như Pơ mu và Sa mu cùng nhiều loài khác.
Hệ sinh thái rừng kín thường xanh mưa ẩm nhiệt đới sở hữu thành phần loài phong phú, bao gồm các loại gỗ quý như Gõ đỏ, Lát hoa, và Lim xanh với trữ lượng lớn Trong hệ sinh thái này, có các kiểu rừng chính như rừng hỗn giao nguyên sinh, rừng lá rộng thường xanh nửa rụng lá, rừng khộp, rừng tre nứa, và đồng cỏ, cùng với nương rẫy chiếm khoảng 6%.
Rừng thường xanh trong khu bảo tồn chủ yếu nằm dọc các con suối, với sự đa dạng về loài và họ cây Các loài cây phổ biến bao gồm Dipterocarpus và Shorea, trong khi rừng hỗn giao thường phát triển trên đất xốp và nông Ngoài ra, khu vực phía Tây khu bảo tồn có sự hiện diện của các khu rừng cây tùng bách, thường xuất hiện trên đất cát nghèo dinh dưỡng, tạo nên cảnh quan độc đáo với những cánh đồng cỏ.
Trong bối cảnh bảo tồn và phát triển du lịch sinh thái, cây Pơ mu (Fokiena hodgonsii) xuất hiện tại hai vị trí trong khu bảo tồn: phía Tây và phía Bắc, gần đầu nguồn Huai Xay, gần Phau Palok Ẹn Về mặt sinh vật học, loài cây đặc biệt này thường mọc trên các sườn dốc có đá trầm tích.
Về tài nguyên thực vật cho lâm sản ngoài gỗ
Theo báo cáo của Cục Lâm nghiệp – Bộ Nông Lâm nghiệp Lào (MAF, 2018), tài nguyên thực vật lâm sản ngoài gỗ bao gồm 165 loài thuộc 61 họ và 3 ngành, trong đó ngành hạt kín chiếm 91,8% về số lượng loài và họ Điều này cho thấy sự đa dạng và phong phú của lâm sản ngoài gỗ, với những loài cây chủ yếu như Sa nhân, Thiên niên kiện, Ngũ gia bì, Đẳng sâm và Hà thủ ô.
Khu bảo tồn là nơi tập trung của trên 180 loài thú, 200 loài chim và gần
Khu vực này sở hữu 26 loài bò sát và 122 loài cá, bao gồm nhiều loài quý hiếm có giá trị cho phát triển du lịch sinh thái và nghiên cứu khoa học như voọc xám, vượn đen, khỉ mặt đỏ, khỉ đuôi lớn, báo gấm, gấu ngựa, sói đỏ và sóc bay.
Chỉ có một số khiêm tốn động vật có vú được liệt kê vào danh sách trong khu khu bảo tồn
Bản báo cáo về loài hổ Panthera tiger cho thấy chúng được phát hiện tại vùng lòng chảo am Leuk và gần Ban Phou Phadang, mặc dù số lượng khá thấp Khu bảo tồn còn có nhiều loài động vật khác như Tê tê (Sunda ngolin), Tê tê java (Manis javanica), và Nhím Đông Á (Porcupine Hystrix malayanus) Ngoài ra, các loài động vật như Sambar (Cervus unicolor), Nai Barking (Muntiacus isntiak), và Nai chuột nhỏ (Tragulus javanicus) cũng là nguồn thực phẩm chính của người dân địa phương Một khảo sát năm 1998 cho thấy khu bảo tồn có sự đa dạng sinh học cao với 22 loài dơi được phát hiện.
Rhinol phusmarshelii, R.Coelophyllus mới được biết đến trong giới các nhà khoa học
Số lượng loài chim Green Peafowl Pavo tại khu vực Ban Nakhay có giá trị lớn về bảo tồn, đóng vai trò quan trọng trong dự án bảo tồn kéo dài 2 năm với sự hỗ trợ của quỹ Canada Dự án này tập trung vào việc bảo tồn các hoạt động nông, lâm nghiệp và ảnh hưởng của chúng đến các cộng đồng xung quanh Khu vực này, nơi có loài chim này xuất hiện, cũng được công nhận là khu bảo tồn động vật quý hiếm và áp dụng các chế độ bảo vệ đặc biệt Ngoài Green Peafowl, nhiều loài động vật khác có nguy cơ tuyệt chủng cũng được bảo vệ trong khu vực này, với khoảng 200 loài chim hiện đang sinh sống trong khu bảo tồn.
- Loài bò sát và động vật lưỡng cư
Trong khu vực khu bảo tồn có khoảng 26 loài động vật lưỡng cư, bao gồm
3 loài ếch, 5 loài rùa, 9 loài thằn lằn và 9 loài rắn