Vai trò của hla dr trên bạch cầu đơn nhân ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn

Giai đoạn CARS này liên quan với tình trạng ức chế miễn dịch của cơ thể, đặc trưng bởi giảm chức năng tế bào bạch cầu đơn nhânBCĐoN, sản sinh các yếu tố trung gian kháng viêm và giảm đáp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

THÁI MINH CẢNH

MỤC LỤC

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 NHIỄM KHUẨN HUYẾT 4

1.1.1 Định nghĩa 4

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 8

1.2 HLA-DR TRÊN BẠCH CẦU ĐƠN NHÂN 14

1.2.1 Kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen - HLA) 14

1.2.2 Nghiên cứu về HLA-DR trên bạch cầu đơn nhân 16

1.3 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO THEO DÒNG CHẢY (FLOW CYTOMETRY) 18

1.3.1 Cấu tạo của Flow Cytometry 19

1.3.2 Cơ chế huỳnh quang 22

1.3.3 Phân tích dữ liệu 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 25

2.1.3 Cỡ mẫu 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 25

2.2.3 Phương pháp thu thập số liệu 25

2.2.4 Phương tiện nghiên cứu 28

2.2.5 Biến số nghiên cứu 30

2.2.6 Xử lý số liệu 31

2.2.7 Y đức nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 ĐẶC ĐIỂM DÂN SỐ NGHIÊN CỨU 35

3.1.1 Giới tính 35

3.1.2 Tuổi 35

3.1.3 Bệnh nền 36

3.1.4 Độ nặng của bệnh 37

3.1.5 Ngõ vào nhiễm khuẩn 37

3.1.6 Kết quả vi sinh 38

3.1.7 Kháng sinh sử dụng 39

3.1.8 Giá trị HLA-DR và các thông số xét nghiệm 40

3.1.9 Kết cục điều trị 41

3.2 GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG MỨC ĐỘ NẶNG CỦA HLA-DR TRÊN BẠCH CẦU ĐƠN NHÂN TRONG NHIỄM KHUẨN HUYẾT 42

3.2.1 Tương quan giữa HLA-DR với PCT, bạch cầu và lactate 42

3.2.2 Tương quan giữa HLA-DR với điểm APACHE II và SOFA 43

3.2.3 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian thở máy 44

3.2.4 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian nằm Hồi sức 45

3.2.5 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian nằm viện 45

3.3 GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG TỬ VONG CỦA HLA-DR TRÊN BẠCH CẦU ĐƠN NHÂN TRONG NHIỄM KHUẨN HUYẾT 46

3.3.1 Đặc điểm của nhóm sống và nhóm tử vong 46

3.3.2 Giá trị HLA-DR, PCT, bạch cầu, lactate ở nhóm sống và tử vong 47

3.3.3 Giá trị tiên lượng tử vong của HLA-DR 49

3.3.4 Tiên lượng tử vong của HLA-DR T48 với các thông số khác 50

3.3.5 Tiên lượng tử vong của ∆HLA-DR với ∆SOFA, ∆PCT và ∆Lactate 52

3.3.6 Phân tích hồi quy logistic đơn biến các yếu tố ảnh hưởng tử vong 53

3.3.7 Phân tích hồi quy logistic đa biến các yếu tố ảnh hưởng tử vong 54

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 55

4.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA DÂN SỐ NGHIÊN CỨU 55

4.1.1 Tuổi 55

4.1.2 Giới tính 56

4.1.3 Bệnh nền 56

4.1.4 Độ nặng của bệnh 57

4.1.5 Ngõ vào nhiễm khuẩn, đặc điểm vi sinh và kháng sinh sử dụng 58

4.1.6 Kết cục điều trị 60

4.2 BIỂU HIỆN CỦA HLA-DR TRÊN BẠCH CẨU ĐƠN NHÂN Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN HUYẾT 61

4.3 GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG CỦA HLA-DR TRÊN BẠCH CẦU ĐƠN NHÂN TRONG NHIỄM KHUẨN HUYẾT 62

4.3.1 Tương quan của HLA-DR với mức độ nặng nhiễm khuẩn huyết 62

4.3.2 Giá trị tiên lượng của HLA-DR trên bạch cầu đơn nhân trong nhiễm khuẩn huyết 63

KẾT LUẬN 74

HẠN CHẾ 76

KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTTIẾNG VIỆT

TIẾNG ANH

ACCP American College of Chest Physicians Hội bác sĩ lồng ngực

Hoa KìSCCM Society of Critical Care Medicine Hội Hồi sức Hoa Kì

ESICM European Society of Intensive Care

APACHE II Acute Physiology, Age, and Chronic

CARS Compensatory Anti-inflammatory

FC Flow Cytometry Kỹ thuật phân tích tế bào

theo dòng chảy

ROC Receiver Operating Characteristic

SOFA Sequential Organ Failure Assessment

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về vai trò của HLA-DR trên BCĐoN 18

Bảng 2.1 Kháng thể đơn dòng sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 3.1 Điểm APACHE II và SOFA của dân số nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Kết quả cấy bệnh phẩm 38

Bảng 3.3 Giá trị HLA-DR, PCT, WBC và Lactate tại thời điểm nhập Hồi sức 40

Bảng 3.4 Giá trị HLA-DR, PCT, WBC và Lactate sau 48 giờ 40

Bảng 3.5 Kết cục của dân số nghiên cứu 41

Bảng 3.6 Tương quan giữa HLA-DR với PCT, bạch cầu và lactate 42

Bảng 3.7 Tương quan giữa HLA-DR với điểm APACHE II, SOFA tại thời điểm nhập Hồi sức 43

Bảng 3.8 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian thở máy 44

Bảng 3.9 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian nằm Hồi sức 45

Bảng 3.10 Tương quan giữa HLA-DR với thời gian nằm viện 45

Bảng 3.11 Đặc điểm chung của nhóm sống và nhóm tử vong 46

Bảng 3.12 Giá trị HLA-DR, PCT, WBC, Lactate ở nhóm sống và tử vong 47

Bảng 3.13 Giá trị tiên lượng tử vong của HLA-DR 49

Bảng 3.14 Giá trị tiên lượng tử vong của HLA-DR T48, SOFA T48, PCT T48

và Lactate T48 50Bảng 3.15 Giá trị tiên lượng tử vong của ∆HLA-DR, ∆SOFA, ∆PCT và ∆Lactate 52Bảng 3.16 Phân tích hồi quy logistic đơn biến các yếu tố ảnh hưởng tử vong 53Bảng 3.17 Phân tích hồi quy logistic đa biến các yếu tố ảnh hưởng tử vong tạithời điểm nhập Hồi sức 54Bảng 3.18 Phân tích hồi quy logistic đa biến các yếu tố ảnh hưởng tử vong sau

48 giờ nằm Hồi sức 54Bảng 4.1 Tuổi trung bình của dân số nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện Chợ Rẫy 55Bảng 4.2 Điểm SOFA và APACHE II qua các nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết tạibệnh viện Chợ Rẫy 57Bảng 4.3 Thời gian nằm hồi sức trong các nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết tạibệnh viện Chợ Rẫy 60

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 27

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ kết quả nghiên cứu 34

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố nhóm tuổi 35

Biểu đồ 3.2 Bệnh nền của dân số nghiên cứu 36

Biểu đồ 3.3 Ngõ vào nhiễm khuẩn 37

Biểu đồ 3.4 Đặc điểm vi sinh của mẫu nghiên cứu 39

Biểu đồ 3.5 Kháng sinh sử dụng trong 48 giờ đầu nằm Hồi sức 39

Biểu đồ 3.6 Thời gian thở máy (a), thời gian nằm ICU (b) của 2 nhóm sống và tử vong 41

Biểu đồ 3.7 Mối tương quan giữa HLA-DR T48 với SOFA T48 43

Biểu đồ 3.8 Mối tương quan giữa ∆HLA-DR với ∆SOFA 44

Biểu đồ 3.9 Giá trị HLA-DR T0 (a), HLA-DR T48 (b) và ∆HLA-DR (c) của nhóm sống và nhóm tử vong 48

Biểu đồ 3.10 Đường cong ROC của HLA-DR T0, HLA-DR T48 và ∆HLA-DR trong tiên lượng tử vong 49

Biểu đồ 3.11 Đường cong ROC của HLA-DR T48, SOFA T48, PCT T48 và Lactate T48 trong tiên lượng tử vong 51

Biểu đồ 3.12 Đường cong ROC của ∆HLA-DR, ∆SOFA, ∆PCT và ∆Lactate trong tiên lượng tử vong 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm khuẩn huyết 9

Hình 1.2 Phức hợp phù hợp mô chính trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 15 Hình 1.3 Cấu tạo của HLA lớp II 16

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của Flow Cytometry 21

Hình 1.5 Ánh sáng tán xạ 21

Hình 1.6 Tiếp nhận và xử lý tín hiệu 22

Hình 1.7 Đồ thị phân tích tế bào đơn nhân trong máu ngoại biên sử dụng đồ thị SSC/FSC 23

Hình 2.1 Hệ thống máy Flow Cytometry BD FACSCanto II 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu

ở bệnh nhân điều trị tại khoa Hồi sức, mặc dù cơ chế bệnh sinh ngày càng được hiểu rõ

và đã có nhiều tiến bộ trong việc chẩn đoán, điều trị Chậm trễ chẩn đoán làm tổnthương đa cơ quan, dẫn đến kết cục xấu và tăng chi phí điều trị Ở Hoa Kì, NKH lànguyên nhân của hơn 50% trường hợp tử vong trong bệnh viện và tỷ lệ tử vong nàytăng tương quan với mức độ nặng: 10 - 20% trong NKH và 40 - 80% trong sốc nhiễmkhuẩn (SNK) [57] Thời gian nằm viện trung bình của bệnh nhân NKH cao hơn 75% sovới các nhóm bệnh nhân khác [40] Tuy nhiên, việc chẩn đoán và tiên lượng NKH cònđứng trước nhiều thách thức Bởi lẽ, tiêu chuẩn chẩn đoán dựa trên hội chứng đáp ứngviêm hệ thống (SIRS) hay gần đây theo tiêu chuẩn SCCM năm 2016 dựa trên điểmSOFA cũng thường gặp trong nhiều bệnh lý khác như chấn thương, bỏng, viêm tuỵcấp… Trong khi đó, cấy bệnh phẩm được xem là tiêu chuẩn vàng nhưng lại tốn thờigian đợi kết quả và tỷ lệ cấy dương tính không cao Mặc dù, protein phản ứng C (CRP)[70], Pro-Calcitonin (PCT) [80], angiopoietin [73] và nhiều chỉ dấu khác [9],[31],[59]

đã được sử dụng để chẩn đoán và tiên lượng NKH, nhưng hầu hết những chỉ dấu nàykém đặc hiệu [12] Do vậy, cần có một chỉ dấu sinh học khác có độ nhạy, độ đặc hiệucao và khả năng cho kết quả nhanh để giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh chính xác

Trước đây, NKH được xem là một đáp ứng viêm quá mức, kéo dài của cơ thểđối với tình trạng nhiễm khuẩn Tuy nhiên, sự hiểu biết rõ hơn về cơ chế bệnh sinh chothấy NKH không phải là một quá trình đồng nhất, mà là chuỗi các quá trình liên tiếpnhau, khởi đầu là giai đoạn SIRS (đáp ứng viêm hệ thống), tiếp sau đó là giai đoạnCARS (đáp ứng kháng viêm bù trừ) [16] Giai đoạn CARS này liên quan với tình trạng

ức chế miễn dịch của cơ thể, đặc trưng bởi giảm chức năng tế bào bạch cầu đơn nhân(BCĐoN), sản sinh các yếu tố trung gian kháng viêm và giảm đáp ứng viêm Giảm

chức năng tế bào BCĐoN biểu hiện bằng giảm phóng thích các chất oxy hóa, giảmhoạt hóa và trình diện kháng nguyên, giảm biểu hiện của HLA-DR (Human LeukocyteAntigen DR isotype – Kháng nguyên bạch cầu người phân nhóm DR) trong máu ngoạivi.

Biểu hiện của HLA-DR trên BCĐoN trong máu ngoại vi rất cần thiết cho quátrình xử lý và trình diện các chuỗi peptide từ những vi sinh vật bị thực bào Chức năngcủa nó là trình diện kháng nguyên đã được xử lý cho tế bào T CD4 để khởi động đápứng miễn dịch đặc hiệu giúp đào thải các tác nhân gây bệnh Ở người khoẻ mạnh,BCĐoN trong máu ngoại vi biểu hiện > 90% HLA-DR Ở bệnh nhân NKH, BCĐoNtrong máu ngoại vi giảm biểu hiện HLA-DR cho thấy quá trình rối loạn miễn dịch với

ức chế miễn dịch kéo dài mà cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ, hậu quả làm tăng tổnthương các cơ quan, tăng tỷ lệ nhiễm khuẩn thứ phát dẫn đến kéo dài thời gian nằmHồi sức, kéo dài thời gian nằm viện và tăng tỷ lệ tử vong Từ những năm 80, HLA-DRtrên BCĐoN được sử dụng như một thông số tiên lượng cho NKH và giảm biểu hiệnHLA-DR trên BCĐoN thường đi kèm với biến chứng nhiễm khuẩn ở những bệnh nhânchấn thương nặng Nghiên cứu của tác giả Jia Wang (2018) [87] cho thấy biểu hiện củaHLA-DR trên BCĐoN ở bệnh nhân NKH thấp hơn nhiều so với người bình thường và

ở nhóm tử vong thấp hơn nhóm sống, đường cong ROC cho thấy HLA-DR có độ nhạy

và độ đặc hiệu cao cho tiên lượng tử vong NKH Nhiều công trình nghiên cứu về vaitrò của HLA-DR trên BCĐoN trong máu ngoại vi ở bệnh nhân NKH đã được công bố,tuy nhiên, kết luận còn trái chiều [79]

Cho đến thời điểm hiện tại, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nàokhảo sát biểu hiện cũng như đánh giá vai trò tiên lượng của HLA-DR trên BCĐoNtrong máu ngoại vi ở bệnh nhân NKH Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Vai tròcủa HLA-DR trên bạch cầu đơn nhân ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễmkhuẩn”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Khảo sát biểu hiện của HLA-DR trên BCĐoN trong máu ngoại vi ởbệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn

2 Xác định mối tương quan của HLA-DR trên BCĐoN trong máu ngoại

vi với mức độ nặng ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn

3 Xác định khả năng tiên lượng của HLA-DR trên BCĐoN trong máungoại vi ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NHIỄM KHUẨN HUYẾT 1.1.1 Định nghĩa

NKH là một tình trạng cấp cứu nội khoa, trong đó những thay đổi đáp ứng miễndịch của cơ thể trong quá trình nhiễm khuẩn có thể dẫn đến rối loạn chức năng cơ quan

và tử vong Mặc dù cơ chế bệnh sinh ngày càng được hiểu rõ, có nhiều tiến bộ trongviệc chẩn đoán, theo dõi và điều trị, tuy nhiên, NKH vẫn là một trong những nguyênnhân tử vong hàng đầu ở bệnh nhân Hồi sức

Sự phức tạp trong cơ chế bệnh sinh của NKH ngày càng được làm sáng tỏ, dẫnđến sự ra đời các định nghĩa, các tiêu chuẩn chẩn đoán Thuật ngữ “sepsis” bắt nguồn

từ tiếng Hy Lạp với ý nghĩa ban đầu ám chỉ sự phân rã và nó được ghi nhận trong cácbài thơ cổ của tác giả Homer cách đây 2700 năm Trong vài thế kỷ sau, nó được mô tảtrong các công trình của Hippocrates và Galen [34] Vào thế kỷ 18, người ta bắt đầuphát hiện ra các tác nhân vi sinh gây bệnh là nguyên nhân của NKH Định nghĩa hiệnđại đầu tiên được mô tả bởi tác giả Hugo Schottmuller, theo đó NKH xuất hiện khi cáctác nhân gây bệnh xâm nhập vào máu và gây ra các triệu chứng lâm sàng Trong suốtthế kỷ 20, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh vai trò của đáp ứng miễn dịchtrong sinh lý bệnh NKH Tuy nhiên, do tính chất bệnh lý phức tạp khiến cho việc pháthiện, chẩn đoán và nghiên cứu về NKH còn gặp nhiều thách thức [35] Trong tình hình

đó, tại Hội nghị đồng thuận SCCM và ACCP năm 1991, Roger Bone và cộng sự đã nêu

ra định nghĩa đồng thuận đầu tiên cho NKH [14]

Nhiễm khuẩn: hiện tượng vi sinh đặc trưng bởi đáp ứng viêm đối với sự hiện

diện hoặc xâm nhập của các tác nhân vi sinh vào mô, cơ quan vô khuẩn của cơ thể

Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống (SIRS): một đáp ứng viêm hệ thống gây ra

bởi nhiều nguyên nhân khác nhau và thỏa tiêu chuẩn chẩn đoán khi xuất hiện ít nhất 2trong 4 biểu hiện sau:

 Nhiệt độ cơ thể > 38°C hoặc < 36°C

 Tần số tim > 90 lần/phút

 Tăng thông khí (tần số thở > 20 lần/phút hoặc PaCO2 < 32 mmHg)

 Số lượng bạch cầu trong máu ngoại biên > 12000 bạch cầu/mm3 hoặc

< 4000 bạch cầu/mm3 hoặc bạch cầu non chiếm > 10%

Nhiễm khuẩn huyết: tình trạng đáp ứng viêm hệ thống của cơ thể gây ra do

nhiễm khuẩn, nghĩa là chẩn đoán NKH khi có ổ nhiễm kèm theo ít nhất 2 trong 4 tiêuchuẩn của SIRS

Nhiễm khuẩn huyết nặng: tình trạng NKH kèm theo rối loạn chức năng đa cơ

quan

Sốc nhiễm khuẩn: tình trạng NKH kèm theo tụt huyết áp và rối loạn tưới máu

mô mặc dù đã được bù đủ dịch Chẩn đoán tụt huyết áp do NKH khi huyết áp tâm thu

< 90 mmHg hoặc giảm ≥ 40 mmHg so với huyết áp nền và tình trạng tụt huyết áp nàykhông do các nguyên nhân khác gây ra

Hội chứng rối loạn chứng năng cơ quan (MODS): sự thay đổi, rối loạn chức

năng cơ quan ở những bệnh nhân cấp tính mà tình trạng rối loạn cân bằng nội môi nàycần phải được can thiệp

Khái niệm SIRS dần được chấp nhận trên toàn thế giới Đồng thời, định nghĩaNKH của Hội nghị đồng thuận năm 1991 cũng được ứng dụng rộng rãi trên thực hànhlâm sàng và là tiêu chuẩn chẩn đoán cho hàng loạt công trình nghiên cứu Tuy nhiên,

dữ liệu từ những thử nghiệm về các biện pháp can thiệp điều trị sau đó đã đặt ra nhucầu cần phải đánh giá và hiệu chỉnh các định nghĩa đồng thuận năm 1991, nhằm phảnánh chính xác hơn sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh NKH lúc bấy giờ Bên cạnh đó,

nhiều tác giả nghĩ rằng Hội nghị đồng thuận năm 1991 đã đưa ra định nghĩa NKH chưathật sự rõ ràng Một cuộc khảo sát quốc tế của tác giả Poeze [68] phỏng vấn 1058 bác

sĩ (gồm 529 bác sĩ ICU) ghi nhận khoảng 2/3 các bác sĩ nhận thấy chưa có một địnhnghĩa chung, chính xác nhất về NKH và 83% ý kiến cho rằng chẩn đoán NKH còn bị

Nhiễm khuẩn huyết: khi có ổ nhiễm/ ngõ vào (nghi ngờ hoặc xác định) kèm

theo ít nhất 2 trong 5 nhóm triệu chứng sau

Phù hoặc cân bằng dịch dương (> 20 ml/kg/24 giờ)

Tăng glucose máu (glucose máu > 140mg/dl hoặc > 7,7 mmol/l)

 Triệu chứng viêm:

Tăng bạch cầu > 12000/mm3

hoặc giảm bạch cầu < 4000/mm3.

Số lượng bạch cầu bình thường nhưng tỷ lệ bạch cầu non > 10%

CRP > 2 lần bình thường

PCT > 2 lần bình thường

 Triệu chứng thay đổi huyết động:

Tụt huyết áp (huyết áp tâm thu < 90 mmHg, huyết áp trung bình < 70 mmHg,hoặc huyết áp tâm thu giảm > 40 mmHg so với huyết áp nền)

Độ bão hòa oxy máu tĩnh mạch trộn > 70%

Chỉ số tim > 3,5 lít/phút/m2.

 Triệu chứng rối loạn chức năng cơ quan:

Giảm oxy máu động mạch (PaO2/FiO2 < 300)

Thiểu niệu cấp (nước tiểu < 0,5ml/kg/giờ, ít nhất trong 2 giờ)

Tăng creatinin ≥ 0,5 mg/dl

Rối loạn đông máu (INR > 1,5 hoặc aPTT > 60 giây)

Giảm tiểu cầu (số lượng < 100.000/mm3)

Tăng bilirubin máu (bilirubin toàn phần > 4 mg/dl hoặc 70 mmol/l)

Mất nhu động ruột

 Triệu chứng giảm tưới máu mô:

Tăng lactate máu (> 3 mmol/l)

Chậm làm đầy mao mạch

Nhiễm khuẩn huyết nặng: định nghĩa NKH nặng vẫn không thay đổi so với

định nghĩa đồng thuận năm 1991, là tình trạng NKH kèm theo rối loạn chức năng đa cơquan

Sốc nhiễm khuẩn: NKH kèm theo tình trạng suy tuần hoàn cấp, biểu hiện

bằng tụt huyết áp kéo dài và không giải thích được bởi các nguyên nhân khác (huyết áptâm thu < 90 mmHg hoặc giảm > 40 mmHg so với huyết áp nền hoặc huyết áp trungbình < 60 mmHg mặc dù đã bù đủ dịch)

Năm 2016, Hội nghị đồng thuận lần 3 [78] đã đưa ra các định nghĩa mới vềnhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn và loại bỏ định nghĩa nhiễm khuẩn huyết nặng.Theo đó:

Nhiễm khuẩn huyết: tình trạng rối loạn chức năng cơ quan đe dọa tính mạng,

do đáp ứng của cơ thể đối với nhiễm khuẩn bị mất kiểm soát Rối loạn chức năng cơquan có thể được xác định bằng tăng điểm đánh giá suy cơ quan SOFA (≥ 2) so với giátrị nền Bảng điểm SOFA đánh giá 6 hệ cơ quan gồm thần kinh trung ương, hô hấp, timmạch, gan, thận và huyết học Trong đó, điểm SOFA nền thường được chấp nhận bằng

0 nếu bệnh nhân không có những rối loạn chức năng cơ quan (cấp hoặc mạn) trước đó.Bệnh nhân nghi ngờ NKH kèm theo điểm SOFA = 2 có tỷ lệ tử vong khoảng 10%.Như vậy, chẩn đoán NKH khi có ổ nhiễm/ ngõ vào (nghi ngờ hoặc xác định) kèm theotăng cấp tính điểm SOFA ≥ 2

Nghiên cứu của tác giả Seymour (2016) [76] đã giới thiệu bảng điểm SOFA rútgọn, gọi là quick SOFA (qSOFA) gồm 3 thông số: tần số thở, huyết áp và điểmGlasgow Kết quả cho thấy ở những bệnh nhân nằm ngoài khoa ICU, qSOFA có khảnăng tiên lượng tử vong tốt hơn điểm SOFA với diện tích dưới đường cong (AUC) lầnlượt là 0,81 và 0,79 Đây là công cụ giúp phát hiện sớm bệnh nhân nghi ngờ NKH tạicác lầu trại

Sốc nhiễm khuẩn: tình trạng NKH kèm theo bất thường về tuần hoàn và

chuyển hóa/ tế bào nặng đến mức làm tăng tỷ lệ tử vong (> 40%) Chẩn đoán SNK khiNKH kèm theo tình trạng tụt huyết áp (huyết áp trung bình < 65 mmHg) cần phải sửdụng vận mạch và tăng lactate máu > 2 mmol/L, mặc dù đã bù đủ dịch

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh

NKH có cơ chế bệnh sinh vô cùng phức tạp, khởi đầu với ngõ vào nhiễmkhuẩn, kích hoạt một đáp ứng viêm quá mức của cơ thể thông qua những con đường tínhiệu ngoại bào và tương tác giữa các tế bào, kết quả là một cơn bão hóa chất trung gian

được phóng thích Các hóa chất này làm mất điều hòa vi mạch, rối loạn hoạt động tithể, mất chức năng tế bào, kích hoạt giải mã các gen, gây chết tế bào theo chươngtrình Kết quả cuối cùng tùy vào những mức độ khác nhau của đáp ứng viêm, ở nhữnggiai đoạn khác nhau của NKH: tăng hoặc giảm đáp ứng viêm, ức chế miễn dịch Tuynhiên, không phải NKH nào cũng có cùng mức độ nặng hoặc cùng một tiên lượng.Như vậy, chính đáp ứng viêm hay tương tác giữa vật chủ với tác nhân gây bệnh, ở mức

độ phân tử - gen tạo nên đặc trưng riêng của mỗi cá thể NKH không phải là một quátrình đồng nhất mà nó trải qua nhiều giai đoạn phức tạp và đáp ứng miễn dịch của vậtchủ sẽ khác nhau theo từng giai đoạn Kết cục cuối cùng của quá trình này sẽ tùy vàokhả năng phục hồi trở về trạng thái cân bằng ban đầu của cơ thể [16]

Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm khuẩn huyết

(Nguồn: Boomer.J.S 2014 [16])

Đáp ứng miễn dịch trong NKH chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như bệnhđồng mắc (đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh ác tính…) cũng như độc lực của tácnhân gây bệnh Mặc dù cả hai quá trình trợ viêm và kháng viêm được kích hoạt đồngthời ngay khi khởi phát NKH nhưng đáp ứng viêm quá mức thường chiếm ưu thế hơntrên lâm sàng trong giai đoạn đầu [16] Giai đoạn tăng phản ứng viêm được xem nhưcơn bão cytokine gây ra do phóng thích TNF-ɑ, IL-1β, IL-6… Sự giảm đáng kể các tếbào miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thích nghi thông qua chết tế bào theo chương trìnhdẫn đến suy yếu dần đáp ứng cytokine này Ở đường A (Hình 1.1), bệnh nhân trải quamột đáp ứng kháng viêm có kiểm soát, giúp cơ thể phục hồi miễn dịch về trạng tháicân bằng Ngược lại, nếu đáp ứng kháng viêm trở nên mất kiểm soát, rơi vào trạng thái

ức chế miễn dịch có thể dẫn đến tử vong được biểu diễn bằng đường B và đường C(Hình 1.1) Ở đường B (Hình 1.1), khi tình trạng ức chế miễn dịch kéo dài có thể gây rahiện tượng “mệt mỏi” tế bào, rối loạn chức năng cũng như tăng biểu hiện PD-1 vàgiảm IL-7R trên tế bào lympho T Trong giai đoạn này, bệnh nhân có nguy cơ tái hoạtcác virus tiềm ẩn trong cơ thể, nhiễm khuẩn thứ phát (thường do tác nhân cơ hội) vàviêm phổi thở máy [16]

 Giai đoạn đáp ứng trợ viêm: Cơn bão cytokine

Hệ miễn dịch hoạt động như một đội ngũ tương tác và hiệp đồng với nhau.Đầu tiên, miễn dịch tự nhiên với thành phần chủ yếu là các bổ thể, các đại thực bào và

tế bào giết tự nhiên đóng vai trò hoạt hóa và điều khiển hệ thống miễn dịch thích nghi

Hệ miễn dịch tự nhiên có khả năng nhận diện phổ rộng các kháng nguyên thông quacảm nhận các phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh (PAMPs) nhờ vào các thụ thểchuyên biệt Từng bước, các phản ứng khu trú tại vùng nhiễm khuẩn sẽ trở thành đápứng hệ thống khi việc nhận diện được khuếch đại với ngày càng nhiều hệ thụ thể đượchuy động, nhiều loại tế bào miễn dịch được hoạt hóa, chính các tế bào này tạo ra cơnbão cytokine đi khắp cơ thể

Các phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh (PAMPs):

Các phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh gồm lipopolysaccharides (nội độctố) từ vi khuẩn Gram âm, các acid lipoteichoic và peptidoglycans (ngoại độc tố) từ vikhuẩn Gram dương, các mảnh DNA và RNA của siêu vi Hoạt động miễn dịch đượckích hoạt khi có sự tiếp xúc giữa các thụ thể nhận diện các PAMPs với tác nhân gâybệnh tương ứng [11] Có 4 loại thụ thể nhận diện PAMPs:

 Thụ thể dạng Toll

 Thụ thể lectin type C

 Thụ thể dạng axit Retinoic sản sinh bởi gen 1

 Thụ thể dạng chuỗi domain gắn kết Nucleotic

Có hiện tượng tăng giải mã các gen đáp ứng viêm thông qua các thụ thể này.Tuy nhiên, các phân tử này lại có cấu trúc rất giống với các phân tử phóng thích từnhững tế bào chết hoặc hư hại của cơ thể trong chấn thương, bỏng, tổn thương thiếumáu - tái tưới máu, viêm tụy cấp, đại phẫu…bởi những phân tử này đến từ các cấu trúcnội bào, lõi nhân DNA và ti thể vốn giống nhau giữa các sinh vật và chúng được gọichung là DAMPs (các phân tử liên quan đến tổn thương) Chính vì lý do này mà có sựtrùng lắp lớn trong biểu hiện đáp ứng viêm hệ thống giữa các bệnh cảnh khác như hồisức sau ngưng tim, chấn thương nặng, bỏng…với NKH [11]

Các phân tử liên quan đến tổn thương (DAMPs):

Các phân tử liên quan đến tổn thương (DAMPs) là các protein nội bào hoặccác hóa chất trung gian được phóng thích từ mô, cơ quan bị tổn thương hoặc các tế bàochết, được gọi chung là “alarmin” [11], gồm nhóm protein B1 có tính di động cao,protein S100, RNA hoặc DNA và các lõi histones

Trong NKH, nồng độ cao PAMPs/DAMPs trong máu đến từ các vi khuẩn bịtiêu diệt và từ các tế bào bị tổn thương, gây kích hoạt đáp ứng miễn dịch của cơ thể,dẫn đến tình trạng viêm đặc trưng do cơn bão cytokine Bệnh nhân NKH thường có

biểu hiện sốt, suy hô hấp và sốc là hậu quả của đáp ứng trợ viêm không kiểm soát haycòn được gọi là SIRS [24] Đáp ứng miễn dịch ban đầu này được điều hòa bởi các phân

tử PAMPs và DAMPs gắn kết lên các thụ thể nhận diện trên các tế bào miễn dịch bẩmsinh [22],[23],[37] Sự kích hoạt các thụ thể này dẫn đến sản sinh hàng loạt các phân tửtrợ viêm (TNF-ɑ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-gamma…) và các cytokine kháng viêm

Từ đó gây ra các đáp ứng bao gồm thúc đẩy hoạt động thực bào, tổn thương tế bào nộimạc mạch máu với hiện tượng thoát mạch, tổng hợp các protein pha cấp tính ở gan,hóa ứng động bạch cầu đến vị trí viêm hoặc nhiễm khuẩn và kích hoạt hệ thống đôngmáu [22],[23],[37]

Sự hoạt hóa bạch cầu đa nhân, đại thực bào và đơn bào tại vùng nhiễm khuẩn

sẽ kích hoạt hệ miễn dịch thích nghi, cho phép hệ miễn dịch thích nghi đáp ứng với tácnhân nhiễm khuẩn ban đầu Mục tiêu của quá trình này chính là phá hủy hoàn toàn cácDAMPs và PAMPs, theo sau bởi đáp ứng thích nghi về miễn dịch Quá trình này đượchoàn thành bằng cách trưởng thành và biệt hóa các tế bào lympho, chịu ảnh hưởng

“dấu ấn cytokine” của hệ miễn dịch tự nhiên Trong điều kiện bình thường, những đápứng này sẽ giới hạn, cân bằng giữa tác nhân gây bệnh và đáp ứng vật chủ giúp chophản ứng viêm khu trú tại chỗ Tuy nhiên, khi có sự mất điều hòa xảy ra, đáp ứng viêm

sẽ không còn khu trú tại vị trí nhiễm khuẩn mà trở thành đáp ứng hệ thống, tác độngđến các cơ quan xa như phổi (hội chứng nguy kịch hô hấp cấp), thận (tổn thương thậncấp), rối loạn đông máu…

 Giai đoạn giảm đáp ứng viêm: Hiện tượng liệt miễn dịch

Khi bệnh nhân sống sót qua giai đoạn phản ứng viêm mạnh mẽ ban đầu (cơnbão cytokine), cơ thể sẽ trải qua giai đoạn ức chế phản ứng viêm được gọi là hội chứngđáp ứng kháng viêm bù trừ (CARS) [33] Để đơn giản, diễn tiến của NKH được xemnhư gồm 2 giai đoạn: tăng phản ứng viêm thì đầu (cơn bão cytokine) và ức chế phảnứng viêm thì sau (liệt miễn dịch) [47],[86] Mức độ phản ứng viêm thì đầu phụ thuộc

vào nhiều yếu tố như tình trạng sức khỏe, bệnh đồng mắc, độc lực tác nhân gây bệnh,tải lượng tác nhân vi sinh và các yếu tố liên quan đến gen [16] Tiếp sau đó, các quátrình của cơ thể nhằm khống chế phản ứng viêm hệ thống quá mức có thể dẫn đến tìnhtrạng ức chế miễn dịch hậu quả, gây ra tăng nguy cơ nhiễm khuẩn thứ phát như viêmphổi thở máy [51], nhiễm khuẩn cơ hội [61],[65] tái hoạt các chủng virus Herpes tiềm

ẩn trong cơ thể như CMV [43], tăng nguy cơ rối loạn chức năng đa cơ quan Nhiềunghiên cứu cho thấy tình trạng ức chế phản ứng viêm là do khiếm khuyết miễn dịchđáng kể, trong đó bao gồm rối loạn đáp ứng miễn dịch thích nghi [46],[84]

Hệ miễn dịch thích nghi bao gồm các tế bào chuyên biệt mang tính đặc hiệukháng nguyên và quan trọng cho hình thành ghi nhớ miễn dịch, tạo ra các đáp ứng gợinhớ đối với kháng nguyên Tế bào T đặc hiệu kháng nguyên rất cần thiết để thúc đẩycác đáp ứng chống lại các tác nhân gây bệnh nội bào (vai trò của Th1) và ngoại bào(vai trò của Th2) thông qua cơ chế tương tác tế bào - tế bào hoặc cytokine [16] Tế bào

T CD4 thường được xếp loại là tế bào T giúp đỡ và kiểm soát các tế bào của hệ miễndịch thích nghi Tế bào T CD8 được xếp vào nhóm độc tế bào và có vai trò tiêu diệt các

tế bào mục tiêu như tế bào khối u, tế bào bị nhiễm khuẩn Còn miễn dịch dịch thể đượctạo ra bởi các tế bào lympho B với sự trợ giúp của tế bào lympho T [16] Các kháng thểđặc hiệu kháng nguyên có thể trung hòa độc tố, chỉnh sửa bổ thể, bám dính bề mặtnhằm thúc đẩy thực bào các tác nhân gây bệnh bởi tế bào đơn nhân hoặc tế bàolympho Các tế bào trình diện kháng nguyên có vai trò trình diện các kháng nguyên đãđược xử lý cho tế bào lympho T để khởi động đáp ứng miễn dịch hoặc tạo ra sự dungnạp của miễn dịch thích nghi

Đáp ứng miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thích nghi có thể diễn ra song songnhau Ở mức độ tế bào, hai tiến trình này diễn ra song song nhưng đối lập nhau, những

tế bào từ các khoang tạo máu (tủy xương, lách, hạch lympho và máu) trở nên giảm hoạtđộng Ngược lại, những tế bào từ các mô khác hoặc từ những tạng đặc (thận, gan, phổi,

não, ống tiêu hóa ) nhất là ở cơ quan nhiễm khuẩn lại có hiện tượng hoạt động quámức, biểu hiện tình trạng tăng đáp ứng viêm Trạng thái trợ viêm quá mức, tổn thương

từ khu trú trở thành đáp ứng hệ thống dẫn đến tổn thương mô, cơ quan, sốc và suy đa

cơ quan ở nhiều mức độ khác nhau Trong quá trình bệnh lý, đáp ứng miễn dịch thíchnghi được khởi phát bằng hoạt hóa tế bào T giúp đỡ 1 (Th1) Trong giai đoạn kế tiếp,quá trình trợ viêm tự dập tắt chậm chạp, trong khi đáp ứng miễn dịch thích nghi chuyểnsang đáp ứng của tế bào T giúp đỡ 2 (Th2) Giai đoạn sau này giúp cho cơ thể vượt quaquá trình trợ viêm và trở về trạng thái ban đầu Tuy nhiên, nếu đáp ứng miễn dịch thíchnghi trở nên mất điều hòa ở mức độ hệ thống, cơ thể rơi vào trạng thái tê liệt miễndịch, làm suy yếu các hàng rào bảo vệ cơ thể, nguy cơ tử vong cao do bội nhiễm

“Anergy” là tình trạng hệ miễn dịch không có khả năng đáp ứng với các khángnguyên Các tế bào lympho T mất khả năng khi chúng không thể biệt hóa hoặc sản xuấtcytokine để đáp ứng với các kháng nguyên đặc hiệu [17],[18] Heidecke và cộng sự[42] nghiên cứu chức năng của tế bào lympho T ở những bệnh nhân viêm phúc mạc vànhận thấy rằng có sự giảm chức năng tế bào T giúp đỡ 1 (Th1) mà không có sự tăngsản xuất cytokine từ tế bào T giúp đỡ 2 (Th2), tương thích với tình trạng mất năng lực.Khiếm khuyết biệt hóa tế bào lympho T và sản xuất cytokine liên quan có ý nghĩathống kê với tỷ lệ tử vong

1.2 HLA-DR TRÊN BẠCH CẦU ĐƠN NHÂN 1.2.1 Kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen - HLA)

Ổ gen liên quan đến thải ghép được gọi là phức hợp phù hợp mô chính nằmtrên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 Ở người, phức hợp phù hợp mô chính còn đượcgọi là kháng nguyên kháng bạch cầu người vì lần đầu tiên được định danh và phân lậpdựa trên những kháng thể kháng bạch cầu [21] Các kháng thể kết dính bạch cầu(leukoagglutinins) được tìm thấy trong huyết thanh của những người phụ nữ sanh đẻ

nhiều lần và ở những bệnh nhân có tiền sử truyền máu trước đó [21] Thải ghép cũngđược tìm thấy có liên quan với tăng các kháng thể chống bạch cầu đồng loại Hệ thốngHLA cũng được biết đến như là kháng nguyên ghép, nhưng vai trò sinh học cơ bản củacác phân tử HLA là điều hòa đáp ứng miễn dịch [13].

Ổ gen HLA được chia thành 3 vùng: lớp I, lớp II và lớp III

Lớp II Lớp III Lớp I

Hình 1.2 Phức hợp phù hợp mô chính trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6

(Nguồn: Choo S.Y [21])

Lớp I chứa các gen HLA-A, HLA-B và HLA-C đóng vai trò mã hóa chuỗinặng của các phân tử lớp I

Lớp II bao gồm một chuỗi các vùng dưới nhóm, mỗi vùng chứa gen A và B lầnlượt mã hóa cho chuỗi ɑ và chuỗi β [56] Lớp II chứa DR, DQ, DP (với ký tự đầu tiênchỉ lớp, ký tự thứ hai chỉ họ) Họ gen DR bao gồm 1 gen DRA và 9 gen DRB (DRB1đến DRB9) [21] Gen DRA mã hóa cho chuỗi ɑ cố định và gắn kết với nhiều chuỗi βđược mã hóa bởi các gen DRB Các chuỗi DR β1 đa hình được mã hóa bởi các allenDRB1 quyết định đặc điểm của kháng nguyên HLA-DR (DR1 đến DR9) Các halotype(kiểu gen đơn bội) HLA của một vài allen DRB1 chứa các locus DRB3, DRB4, DRB5được gắn kết đặc biệt Mỗi họ DP và DQ chứa gen biểu hiện các chuỗi ɑ, β và thêm cácgiả gen không được biểu hiện Các sản phẩm gen DQA1 và DQB1 hỗ trợ tổng hợp cácphân tử DQ và các sản phẩm gen DPA1, DPB1 hỗ trợ tổng hợp các phân tử DP

Lớp III không chứa gen mã hoá cho HLA, nhƣng chứa gen tổng hợp bổ thể(C2, C4, yếu tố B), yếu tố hoại tử u (Tumor Necrosis Factor - TNF) và 21-hydroxylase[10].

Sản phẩm của các gen DR, DQ, DP là chuỗi glycosylate polypeptide  và .Hai chuỗi này xuyên màng có cùng cấu trúc, bao gồm 2 vùng 1, 2 và 1, 2 ngoài tếbào, đƣợc neo vào trong tế bào bởi protein xuyên màng (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu tạo của HLA lớp II

(Nguồn: Choo S.Y [21])

1.2.2 Nghiên cứu về HLA-DR trên bạch cầu đơn nhân

Trong suốt gần 40 năm qua, nhiều tác giả đã tập trung nghiên cứu về các thayđổi miễn dịch trong nhiễm khuẩn huyết cũng nhƣ cố gắng tìm ra các biện pháp có thể

áp dụng trên lâm sàng để theo dõi sự thay đổi đáp ứng miễn dịch này Trong đó,BCĐoN trong máu ngoại vi đã đƣợc nhiều tác giả tích cực nghiên cứu bởi vì chúngđóng vai trò quan trọng cho cả miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu đểchống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật Đặc trƣng của BCĐoN là tập trung số lƣợnglớn các thụ thể trên màng tế bào liên quan đến chức năng miễn dịch nhƣ trình diện

kháng nguyên, thực bào và tiêu diệt tác nhân gây bệnh Kháng nguyên bề mặt tế bàođặc trưng nhất là HLA với phân nhóm HLA-DR có chức năng trình diện các chuỗipeptide đã được xử lý cho tế bào T CD4 và T CD8, từ đó giúp kiểm soát các tế bàochứa protein lạ [19],[67] Trên mô hình thực nghiệm, HLA-DR được điều phối mạnh

mẽ bởi các cytokine và nhiều chất khác như catecholamine, axit amin có ảnh hưởngđến sự biểu hiện của nó trên BCĐoN

Ở nhóm người khoẻ mạnh, BCĐoN biểu hiện > 90% HLA-DR Ở bệnh nhânnhiễm khuẩn huyết, BCĐoN trong máu ngoại vi giảm biểu hiện HLA-DR cho thấy quátrình rối loạn miễn dịch với ức chế miễn dịch kéo dài trong NKH mà cơ chế cho đếnnay vẫn chưa được hiểu rõ [79] Từ những năm 80, HLA-DR trên BCĐoN được sửdụng như một thông số tiên lượng cho quá trình diễn tiến đến nhiễm khuẩn và nhiễmkhuẩn huyết Nhiều tác giả đã nghiên cứu về vai trò của chỉ dấu HLA-DR trên BCĐoNtrong chẩn đoán và tiên lượng mức độ nặng, tiên lượng tử vong của bệnh nhân nhiễmkhuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu còn trái ngược nhau

Cho đến thời điểm hiện tại, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nàokhảo sát biểu hiện của HLA-DR trên BCĐoN và vai trò tiên lượng của nó ở bệnh nhânnhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về vai trò của HLA-DR trên BCĐoN

S.E.Perry

(2003) [67] N = 115

Giảm biểu hiện HLA-DR trên BCĐoN không liên quantăng tỷ lệ tử vong cũng nhƣ mức độ nặng biểu hiện bằngthang điểm APACHE II Tuy nhiên, bệnh nhân có biểuhiện HLA-DR thấp có thể phục hồi đƣợc tình trạng này

N = 288 Không có sự khác biệt về HLA-DR trong máu ngoại vi

giữa trẻ sơ sinh NKH và không NKH

Genel (2010)

Trẻ sơ sinh NKH có HLA-DR trên BCĐoN < 30% tăng

30 lần nguy cơ tử vong so với nhóm chứng

số để dò tìm kích thước tế bào Cùng với sự phát triển kỹ thuật, hiện tại có thể đánh giá

14 thông số khác nhau Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này liên quan tới ánh sáng tán

xạ và ánh sáng huỳnh quang phát ra, được tạo ra do nguồn ánh sáng kích thích (thường

là chùm tia laser) Các thông số thu được có thể là thông tin giá trị về các khía cạnhhóa sinh, sinh lý và phân tử của hạt Ánh sáng tán xạ trong kỹ thuật có liên quan trựctiếp với các đặc điểm cấu trúc và hình thái học của tế bào, trong khi đó, ánh sánghuỳnh quang có nguồn gốc từ các đầu dò đánh dấu huỳnh quang, tỷ lệ thuận với lượngđầu dò huỳnh quang gắn vào tế bào và các thành phần trong tế bào Có 2 loại Flowcytometry là phân loại (sorting) và không phân loại (non-sorting) Flow cytometrykhông phân loại dựa trên ánh sáng tán xạ và phát huỳnh quang, trong khi Flowcytometry phân loại còn có khả năng phân loại tế bào FACS (Fluorescence-activatedCell Sorting) là máy đếm tế bào theo dòng chảy, có khả năng phân loại các tế bào đượcđánh dấu huỳnh quang từ hỗn hợp các quần thể tế bào Kỹ thuật Flow cytometry được

sử dụng rộng rãi trong nhiều ứng dụng nhằm phát hiện các kháng nguyên màng tế bào,bào tương và kháng nguyên nhân Hơn nữa, Flow cytometry còn có thể khảo sát toàn

bộ tế bào và các thành phần cấu tạo: bào quan, nhân, DNA, RNA, chromosome,cytokin, hormon và protein [8] Việc phân tích các quá trình trong tế bào và chu trình tếbào nhờ việc đo nồng độ canxi và điện thế màng cũng là một trong những ứng dụngcủa kỹ thuật này

1.3.1 Cấu tạo của Flow Cytometry

Hệ thống dịch: có vai trò vận chuyển các tế bào trong một dung dịch đi qua

thiết bị để thu nhận các dữ liệu Hệ thống này bao gồm 2 thành phần: dịch bao và dòng

áp suất (Hình 1.4) Dịch bao là dung dịch pha loãng (thường dùng nước muối đệmphosphate), được tiêm vào buồng dòng chảy nằm tại trung tâm của thiết bị bởi dòng ápsuất Dòng mẫu phân tích trở thành lõi trung tâm trong dòng dịch bao gọi là dòng đồngtrục, được tạo ra dựa trên sự chênh lệch áp suất giữa dòng dịch bao và dòng mẫu phân

tích Tế bào sắp xếp thành hàng đơn khi đi qua chùm laser là nhờ áp suất dòng mẫuphân tích lớn hơn áp suất dịch bao Điều này cho phép chiếu sáng đồng đều mỗi tế bàonên được gọi là quá trình tập trung thủy động lực học [8].

Hệ thống quang học: Hệ thống quang học bao gồm chùm phát tia laser, thấu

kính và hệ thống thu nhận quang học Hệ thống thấu kính dùng để tập trung chùm tialaser Ánh sáng phản chiếu từ bờ của tế bào khi chiếu tia laser vào tế bào gọi là ánhsáng tán xạ Có 2 loại ánh sáng tán xạ là tán xạ thẳng (Forward scatter - FSC) và tán xạbên (Side scatters - SSC) (Hình 1.5) Những yếu tố ảnh hưởng đến sự tán xạ ánh sáng

là màng tế bào, nhân, các hạt của tế bào, hình dạng và bề mặt tế bào Tán xạ thẳng làphổ nhiễu xạ thu nhận đồng trục với chùm tia laser, phản ánh được bề mặt tế bào hoặckích thước, do đó thường được dùng để phân tích kiểu hình miễn dịch(immunophenotyping) Trái lại, tán xạ bên do những tia sáng khúc xạ và phản xạ đượcthu nhận vuông góc với chùm tia laser Tán xạ bên phản ánh mức độ phức tạp bêntrong, tính hạt của tế bào và quan trọng trong việc thu nhận ánh sáng huỳnh quang phát

ra từ kháng nguyên gắn huỳnh quang Hệ thống thu nhận quang học gồm một chuỗi cácthấu kính để thu nhận tia sáng phát ra do tương tác giữa chùm laser và vật thể, trong đó

có hệ thống gương và hệ thống lọc quang học để phân tách và hướng những tia sáng cóbước sóng chuyên biệt đến thiết bị dò quang học thích hợp

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của Flow Cytometry

(Nguồn: Adan A [8])

Hình 1.5 Ánh sáng tán xạ

(Nguồn: Adan A [8])

Hệ thống phân tích và dò tín hiệu: Tín hiệu ánh sáng phát ra từ vật thể khi đi

qua chùm tia laser sẽ được chuyển thành điện thế nhờ những cảm biến quang học Tínhiệu ánh sáng sẽ chuyển thành cường độ dòng điện Cường độ dòng điện này đượckhuếch đại và chuyển thành xung điện thế Xung điện này sẽ được chuyển thành tínhiệu số biểu thị trên sơ đồ (plot) hoặc đồ thị phân phối (histogram) (Hình 1.6)

Hình 1.6 Tiếp nhận và xử lý tín hiệu

(Nguồn: Adan A [8])

1.3.2 Cơ chế huỳnh quang

Các hợp chất huỳnh quang có dải bước sóng đặc biệt mà tại đó nó hấp thụ nănglượng ánh sáng Sự hấp thụ ánh sáng khiến electron chuyển từ trạng thái cơ bản lêntrạng thái kích thích, sau một thời gian ngắn, electron kích thích sẽ quay trở lại trạngthái cơ bản, phát ra năng lượng dưới dạng photon ánh sáng, hiện tượng này gọi là pháthuỳnh quang Nhuộm huỳnh quang để bộc lộ những thành phần bình thường khôngthấy được Các đầu dò huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong việc định danh tế bào,thụ thể bề mặt, bào quan, thành phần acid nucleic, hoạt động enzyme… Điểm quan

trọng của huỳnh quang là phổ hấp thụ và phổ phát xạ Tia phóng thích luôn có bướcsóng dài hơn so với tia kích thích Sự khác biệt bước sóng tối đa của 2 tia này gọi làbước chuyển Stoke Bước chuyển này cho phép đánh giá chất lượng thuốc nhuộm.Nhuộm huỳnh quang trong Flow cytometry được phân loại thành nhuộm đánh dấuprotein, nhuộm acid nucleic, nhuộm phân tử Để nhuộm đánh dấu protein, đoạn dòđược sử dụng là kháng thể Thuốc nhuộm thường dùng nhất để đánh dấu kháng thể làFluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE) và Allophycocyanin (APC).

1.3.3 Phân tích dữ liệu

Nguyên tắc chính của việc phân tích là tìm tế bào mà chúng ta quan tâm.Phương pháp này gọi là chọn cửa Mỗi cửa bao gồm nhiều vùng kết hợp lại với nhau.Mỗi vùng là tập hợp những điểm trên đồ thị được quyết định bởi người sử dụng Cửathường sử dụng nhiều nhất là đồ thị FSC và SSC giúp phân biệt các tế bào bạch cầu vớinhau dựa trên tính chất vật lý (Hình 1.7)

Hình 1.7 Đồ thị phân tích tế bào đơn nhân trong máu ngoại biên

sử dụng đồ thị SSC/FSC

(Nguồn: Adan A [8])

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu

Chọn các bệnh nhân nhập khoa Hồi sức cấp cứu, bệnh viện Chợ Rẫy trongkhoảng thời gian từ tháng 01/2019 đến cuối tháng 02/2020, được chẩn đoán NKH,SNK theo tiêu chuẩn năm 2016 của Hội nghị đồng thuận SCCM và ESICM, được làmxét nghiệm HLA-DR trên BCĐoN bằng kỹ thuật Flow cytometry

Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết theo SCCM và ESICM năm 2016 khi bệnhnhân có ổ nhiễm/ ngõ vào (nghi ngờ hoặc xác định) kèm theo tăng điểm SOFA 2 sovới điểm SOFA nền Thang điểm SOFA đánh giá 6 hệ cơ quan: hô hấp (PaO2/FiO2),đông máu (số lượng tiểu cầu), gan (bilirubin máu), tim mạch (tình trạng huyết áp, nhucầu vận mạch), thần kinh trung ương (điểm Glasgow) và thận (thể tích nước tiểu,creatinin máu) Điểm SOFA nền được chấp nhận bằng 0 nếu bệnh nhân không cónhững rối loạn chức năng cơ quan (cấp hoặc mạn) đã biết trước khởi điểm NKH

Xác định ổ nhiễm/ ngõ vào dựa trên thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng(hiện diện bạch cầu đa nhân trung tính trong dịch/ mô vô khuẩn, nhuộm Gram hoặc cấybệnh phẩm xuất hiện vi khuẩn gây bệnh, bằng chứng ổ nhiễm khu trú trên hình ảnhhọc)

Chẩn đoán sốc nhiễm khuẩn khi có tình trạng tụt huyết áp kéo dài (huyết áptrung bình < 65 mmHg) cần sử dụng vận mạch và lactat máu ≥ 2 mmol/l (mặc dù đã bù

đủ dịch)

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

 Dưới 18 tuổi

 Bệnh lý ác tính đang điều trị hoặc mới phát hiện

 Suy thận mạn giai đoạn cuối

 Xơ gan Child C

 Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính nhóm D

 Thời gian nằm Hồi sức dưới 48 giờ

 Mang thai

2.1.3 Cỡ mẫu

Lấy mẫu toàn bộ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu quan sát hồi cứu

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 03/2020 đến tháng 07/2020, chúng tôi thu thập dữ liệu từ hồ sơ bệnh

án của các bệnh nhân nhập khoa Hồi sức trong khoảng thời gian tháng 01/2019 đếntháng 02/2020, được chẩn đoán NKH, SNK và có kết quả HLA-DR trên BCĐoN

2.2.3 Phương pháp thu thập số liệu

Nghiên cứu viên thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án của các bệnh nhân nhậpkhoa Hồi sức được chẩn đoán NKH, SNK và được thực hiện xét nghiệm HLA-DR trênBCĐoN bằng kỹ thuật Flow cytometry Ghi nhận giá trị HLA-DR trên BCĐoN cùngvới các xét nghiệm máu thường quy khác (công thức máu, đông máu toàn bộ, chứcnăng gan, thận, điện giải đồ, lactate máu, khí máu động mạch, PCT, cấy máu và bệnh

phẩm) trong 24 giờ đầu nằm Hồi sức Ghi nhận các thông số lâm sàng, cận lâm sàng,thang điểm SOFA và APACHE II.

Ghi nhận giá trị các thông số này sau 48 giờ nằm Hồi sức từ hồ sơ bệnh án.Ghi nhận động học của HLA-DR trên BCĐoN

Ghi nhận kết cục điều trị: thời gian thở máy, thời gian nằm Hồi sức, thời giannằm viện, tỷ lệ tử vong tại khoa Hồi sức Phân tích kết quả (Sơ đồ 2.1)

Bệnh nhân trong nghiên cứu đƣợc điều trị NKH, SNK theo phác đồ của khoaHồi sức cấp cứu, bệnh viện Chợ Rẫy đã đƣợc Hội đồng Khoa học bệnh viện Chợ Rẫythông qua

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Ghi nhận kết cục: thời gian thở máy, thời gian nằm Hồi sức, thời gian nằmviện, kết cục tử vong tại Hồi sức

Ghi nhận các thông tin trên sau 48 giờ nằm Hồi sức: điểm SOFA, HLA-DRtrên BCĐoN, công thức máu, đông máu toàn bộ, chức năng gan, thận, điệngiải đồ, lactate máu, khí máu động mạch, PCT, kết quả vi sinh và khángsinh điều trị trong 48 giờ

PHÂN TÍCH SỐ LIỆU

Chọn các bệnh nhân NKH, SNK nhập khoa Hồi sức trong thời gian 01/2019

- 02/2020, không có tiêu chuẩn loại trừ và đƣợc thực hiện xét nghiệm

HLA-DR trên BCĐoN trong máu ngoại vi

Ghi nhận các thông tin: tuổi, giới, bệnh nền, ổ nhiễm, điểm APACHE II,điểm SOFA, giá trị HLA-DR trên BCĐoN, công thức máu, đông máu toàn

bộ, chức năng gan, thận, điện giải đồ, lactate máu, khí máu động mạch,PCT trong 24 giờ đầu