TỔNG QUAN NỘI DUNG ĐỀ TÀI
GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG
Cây Đinh lăng, thuộc họ Araliaceae và chi Polyscias, có nguồn gốc từ Thái Bình Dương với gần 100 loài, chủ yếu phân bố ở khu vực này Trong số các loài cây cảnh, Đinh lăng thường bị nhầm lẫn do nhiều loại mang tên này, nhưng chỉ một số ít được sử dụng làm thuốc Loài phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms, hay còn gọi là Đinh lăng lá nhỏ, không chỉ được trồng làm cảnh và làm rau ăn mà còn được biết đến như một vị thuốc nam quý Đinh lăng đã được ghi nhận trong Dược điển Việt Nam như một vị thuốc bổ, tăng lực và sinh thích nghi, đồng thời được nhiều quốc gia như Trung Quốc, Liên Xô và Ấn Độ sử dụng với công dụng giải độc, kháng khuẩn và kháng viêm.
Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam, Đinh lăng có 6 loài:
(Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007)
Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng hương, Đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá) Polyscias balfouriana Bailey (Đinh lăng lá tròn, Đinh lăng lá xà cừ)
Polyscias filicifolia (Merr et Fourn) Bailey (Đinh lăng đuôi phƣợng, Đinh lăng lá rách)
Polyscias guilfeylei var licinita Bailey (Đinh lăng lá xoan xẻ, Đinh lăng lá xà cừ nhỏ)
Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Baylei (Đinh lăng lá trổ)
Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Đinh lăng đĩa)
Một số hình ảnh về các loài Đinh lăng:
Hình 2.1 Đinh lăng lá nhỏ
Hình 2.2 Đinh lăng lá tròn
5 Hình 2.3 Đinh lăng đuôi phƣợng
Hình 2.4 Đinh lăng lá xoan xẻ
Hình 2.5 Đinh lăng lá trổ
Hình 2.6 Đinh lăng đĩa Ngoài ra còn có Aralia chinensis L Araliacea – Đinh lăng Trung Quốc có ở rừng Đà Lạt
Theo nghiên cứu của Ngô Ứng Long và cộng sự tại Viện Y học Quân sự, rễ và lá của cây Đinh lăng chứa nhiều hợp chất quý giá như saponin, alkaloid, glucosid, flavonoid, tanin, và các vitamin B1, B2, B6, C Ngoài ra, chúng còn có phytosterol, acid hữu cơ, tinh dầu, cùng với nhiều nguyên tố vi lượng và các acid amin thiết yếu như lysin, cystein, methionin, chiếm tới 21,1% đường.
Võ Duy Huấn đã phân lập đƣợc một số saponin mới từ rễ và lá Đinh lăng
Trần Công Luận và cộng sự đã phân lập thành công 5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng, bao gồm panaxydol, panaxynol, (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, và (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Đặc biệt, hai hợp chất cuối chỉ được tìm thấy trong lá Đinh lăng, chưa từng phát hiện ở các cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae Bên cạnh đó, lá Đinh lăng còn chứa saponin triterpen với hàm lượng 1,65%, có genin dạng oleanolic.
The roots contain five polyacetylenic compounds, among which panaxydol, panaxynol, and (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol exhibit strong antibacterial properties and are effective against certain types of cancer.
Cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyacetylen:
(8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on
(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on panaxynol panaxydol
2.1.3 Tác dụng dƣợc lý (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2009; Trần Cao Sơn, 2015) Ở Việt Nam, các loài Đinh lăng đƣợc trồng rất nhiều và đa phần đều có thể sử dụng làm thuốc Nhƣng có rất ít tài liệu nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của từng loài Chỉ có cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về thành phần hóa học cũng nhƣ tác dụng dƣợc lý Đinh lăng đã đƣợc các nhà nghiên cứu ở Liên Xô thử nghiệm tác dụng tăng lực và chống stress trên các phi công, nhà du hành vũ trụ và công nhân làm việc dưới môi trường có bức xạ siêu tần, tác nhân độc hại
Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy rễ Đinh lăng có khả năng tăng cường sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, giúp chống lại mệt mỏi, theo Viện Y học quân sự.
Nghiên cứu của Ngô Ứng Long và cộng sự vào năm 1985 cho thấy Đinh lăng có độ độc thấp, với liều gây chết LD 50 theo đường tiêm phúc mạc là 32,9 g/kg chuột, cao gấp đôi so với Nhân sâm (16,5 g/kg) Mặc dù liều uống hằng ngày 60 g/kg có thể dẫn đến hiện tượng chuột chết sau 3 ngày, Đinh lăng vẫn được coi là ít độc Tuy nhiên, saponin trong Đinh lăng có khả năng gây huyết tán ở mức độ nhất định, và khi con người tiêu thụ quá nhiều, có thể gặp phải triệu chứng say, mệt mỏi, và tiêu chảy Đặc biệt, Đinh lăng không gây tăng huyết áp như Nhân sâm.
Các nghiên cứu trên chuột cho thấy Đinh lăng có khả năng tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, nâng cao sức đề kháng đối với bức xạ cao tầng, kéo dài thời gian sống khi nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei và tăng cường hiệu quả của thuốc chống sốt rét cloroquin.
Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy Đinh lăng có khả năng nâng cao sức chịu đựng cho bộ đội và vận động viên thể thao Ngoài ra, tác dụng của Đinh lăng trong việc tăng cân và tăng cường sức lực đã được xác nhận qua các thí nghiệm trên cả người và chuột.
Đinh lăng là một loại thảo dược quý giúp phục hồi sức khỏe nhanh chóng cho những người suy mòn, mới khỏi ốm, cải thiện khả năng ăn uống và giấc ngủ Việc sử dụng Đinh lăng để nấu nước uống hàng ngày như một loại thuốc bổ mang lại nhiều lợi ích cho cơ thể Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol được chiết xuất từ cây Đinh lăng cũng góp phần nâng cao sức khỏe.
Panax vietnamensis và Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng chuẩn khuẩn
Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được chủng khuẩn Gram âm
Từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về cao phối hợp từ rễ và lá Đinh lăng, chủ yếu tập trung vào lá do dễ thu hái Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng để kiểm tra tác dụng chống stress và trầm cảm, cho thấy Cao Đinh lăng có khả năng chống trầm cảm và cải thiện giấc ngủ bị rút ngắn do stress ở liều 45 – 180 mg/kg thể trọng Ở khoảng liều này, Cao Đinh lăng còn có tác dụng tăng lực và kích thích hoạt động.
10 động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch
Theo dân gian, Đinh lăng là thảo dược quý dùng để bổ sung sức khỏe, hỗ trợ điều trị suy nhược cơ thể, mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho ra máu, đau tử cung, đồng thời có tác dụng lợi tiểu và chống độc Nhiều bài thuốc dân gian hiện nay vẫn sử dụng Đinh lăng như một thành phần chính.
Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g Thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 - 3 lần uống trong ngày
Để chữa trị các triệu chứng như sốt kéo dài, nhức đầu, khát nước, ho, đau tức ngực và nước tiểu vàng, bạn có thể sử dụng bài thuốc từ các thảo dược tự nhiên Cụ thể, hãy chuẩn bị 30 g đinh lăng tươi (bao gồm rễ và cành), 10 g lá vỏ chanh, 10 g vỏ quýt, 20 g sài hồ (gồm rễ, lá và cành) và 20 g lá tre tươi Các thành phần này cần được cắt nhỏ, sau đó cho vào nồi, đổ ngập nước và sắc đặc để thu được 250 ml thuốc Chia lượng thuốc này thành 3 lần uống trong ngày để đạt hiệu quả tốt nhất.
Chữa sƣng vú: cành lá Đinh lăng 30 – 40 g Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống nóng Ngày uống 1 - 2 lần
Thuốc lợi sữa: lá Đinh lăng tươi 50 – 100 g, bong bóng lợn 1 cái, thái nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn
Chữa đau tử cung: cành và lá Đinh lăng rửa sạch, sao vàng, sắc uống thay chè
Chữa mẩn ngứa do dị ứng: lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, đổ 500 ml nước sắc còn 250 ml uống trong ngày Dùng liên tục trong 2 – 3 tháng
Chữa thiếu máu: rễ Đinh lăng, hà thủ ô, thục địa, hoàng tinh, mỗi vị 100 g, tam thất
20 g Tán bột, sắc uống ngày 100 g
Chữa viêm gan mạn tính bằng bài thuốc gồm các thành phần: rễ Đinh lăng 12 g, nhân trần 20 g, ý dĩ 16 g, hoài sơn, biển đậu, rễ cỏ tranh, xa tiền tử, ngũ gia bì, mỗi vị 12 g, cùng với uất kim, nghệ, ngưu tất, mỗi vị 8 g Sắc uống một thang mỗi ngày để hỗ trợ điều trị bệnh.
Chữa liệt dương hiệu quả với bài thuốc gồm các vị thuốc như rễ Đinh lăng, hoài sơn, ý dĩ, hoàng tinh, hà thủ ô, kỷ tử, long nhãn và cám nếp, mỗi vị 12 g Thêm vào đó, trâu cổ và cao ban long, mỗi vị 8 g, cùng với sa nhân 6 g Sắc uống một thang mỗi ngày để đạt hiệu quả tốt nhất.
Chữa sốt rét: rễ Đinh lăng, sài hồ, mỗi vị 20 g Rau má 16 g Lá tre, cam thảo nam, mỗi vị 12 g Bán hạ sao vàng 8 g, gừng 6 g Sắc uống
GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) được định nghĩa bởi Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp quốc (FAO) là các hợp chất hoặc hỗn hợp nhằm ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại Những tác nhân này bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh cho con người và động vật, cũng như các bộ phận không mong muốn của động vật và thực vật có thể gây hại hoặc ảnh hưởng đến quy trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản gỗ và sản phẩm từ gỗ, cũng như thức ăn chăn nuôi.
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) được sử dụng để kiểm soát côn trùng, nhện và các đối tượng khác trên động vật, cũng như làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra, thuốc BVTV còn có tác dụng làm rụng lá, thưa cây, và ngăn chặn rụng sớm của quả Việc sử dụng thuốc BVTV trước và sau khi thu hoạch giúp bảo vệ sản phẩm khỏi hư hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ngày càng được sử dụng phổ biến với nhiều loại và số lượng gia tăng Để dễ dàng trong việc sử dụng và quản lý, thuốc BVTV thường được phân loại thành các nhóm khác nhau Sự phân loại này rất đa dạng, tùy thuộc vào các tiêu chí như cấu tạo hóa học, mục đích sử dụng, nguồn gốc và mức độ độc tính.
Theo công dụng thì thuốc BVTV đƣợc phân loại nhƣ sau: trừ sâu, trừ nấm, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ vi khuẩn, trừ ốc sên …
Thuốc trừ sâu là hợp chất hóa học hoặc sinh học được sử dụng để kiểm soát, tiêu diệt sâu bệnh và điều chỉnh sự phát triển của cây trồng.
Thuốc trừ nấm là sản phẩm bảo vệ cây trồng và hạt giống, giúp ngăn chặn sự xâm nhập và gây hại của nấm bệnh, đồng thời có khả năng tiêu diệt các loại nấm gây hại.
2.2.3 Mức dƣ lƣợng tối đa trong dƣợc liệu
Trên toàn cầu, nông nghiệp sạch, đặc biệt là rau sạch, đang trở thành mối quan tâm hàng đầu, trong khi ngành Dược cũng chú trọng đến dược liệu sạch để sản xuất thuốc, nhằm loại bỏ dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật có thể gây hại cho sức khỏe con người Tuy nhiên, hiện tại, nghiên cứu về thuốc bảo vệ thực vật tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp quốc (FAO) cùng với Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã thiết lập quy định Codex về giới hạn tối đa cho phép của một số hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) trong nông sản Quy định này cụ thể hóa mức độ tồn dư của thuốc BVTV trên từng loại mẫu, bao gồm các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần khác có trong thuốc Tồn dư này có thể hiện diện trên cây trồng, nông sản, cũng như trong đất và nước sau một khoảng thời gian, chịu tác động của hệ sinh thái và các điều kiện môi trường.
MRL (Giới hạn dư lượng tối đa) là lượng tối đa của thuốc bảo vệ thực vật được phép tồn tại trong nông sản và thực phẩm mà không gây hại cho sức khỏe con người MRL được tính bằng miligam thuốc bảo vệ thực vật trên mỗi kilogam thực phẩm (mg/kg) theo quy định của Bộ Y Tế năm 2016.
ADI (Lượng hấp thu hàng ngày chấp nhận được) là lượng chất độc tối đa mà cơ thể con người hoặc động vật có thể hấp thụ mà không gây hại trong một ngày, được tính bằng mg hoặc µg cho mỗi đơn vị trọng lượng cơ thể (Bộ Y Tế, 2016)
Mỗi loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có mức giới hạn dư lượng (MRL) riêng cho từng nền mẫu, nhưng sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghệ hóa học đã dẫn đến việc xuất hiện nhiều loại thuốc BVTV mới mà chưa có quy định MRL cụ thể Để giải quyết vấn đề này, nhiều quốc gia như Nhật Bản, Mỹ và các nước châu Âu đã áp dụng mức MRL chung là 0,01 mg/kg cho tất cả các loại thuốc BVTV Do đó, các phòng thí nghiệm tại Việt Nam cũng đã áp dụng giá trị này trong quá trình kiểm nghiệm dược liệu.
Tên hóa học: 1-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-nitroimidazolidin-2-ylideneamine Khối lượng phân tử: 255,7 g/mol
Công thức phân tử: C 9 H 10 ClN 5 O 2
Imidacloprid là một loại thuốc bảo vệ thực vật thuộc nhóm Neonicotinoid, có tác dụng rộng rãi trong nông nghiệp, được sử dụng từ giữa những năm 1990 tại Đông Nam Á và châu Âu Thuốc này có thể được áp dụng qua phun lên lá, xử lý giống và xử lý đất với liều lượng thấp, và có đặc điểm không màu, không mùi Tuy nhiên, gần đây, một số quốc gia đã hạn chế việc sử dụng nhóm chất này do mối liên quan đến hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) ở ong mật, vì chúng làm suy yếu hệ thống miễn dịch của loài này, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng và tử vong Tại Việt Nam, imidacloprid vẫn được phép sử dụng trong nông nghiệp theo quy định của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
Bảng 2.2 Nghiên cứu về độc tính cấp của imidacloprid (Robert Krieger, 2001) Động vật thí nghiệm Đường dùng LD 50 /LC 50 (mg/kg thể trọng / mg/m 3 không khí)
Thỏ Da Không bị kích ứng
Thỏ Mắt Không bị kích ứng
Chuột lang Da Không thấy nhạy cảm
Bảng 2.3 Giới hạn tối đa dƣ lƣợng imidacloprid trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
ADI (mg/kg thể trọng) Thực phẩm MRL (mg/kg)
Các loại rau từ rễ và củ 0,5
2.2.5 Azoxystrobin (Ehab M.H Abdelraheem, 2015; T Nageswara Rao, 2012)
Tên hóa học: Methyl (E)-2-{2[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4- yloxy]phenyl}3-methoxyacrylate
Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol
Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm thuộc nhóm Strobin, chủ yếu được sử dụng để ngăn chặn sự hư hỏng của cây trồng do nấm Thuốc có nguồn gốc tự nhiên, thuộc nhóm Strobilurin và có tác dụng diệt nấm bằng cách ức chế hô hấp ở ty thể của nấm Azoxystrobin được hấp thu qua rễ và di chuyển trong mạch gỗ đến thân, lá, hoặc thẩm thấu qua bề mặt lá đến mép và rìa lá đang phát triển Nó hiệu quả trong việc hạn chế nguy cơ gây bệnh trên lá và đất, bao gồm các bệnh như nấm lá, bệnh đốm trắng, bệnh rụng lá và nhiều mầm bệnh khác trên các loại cây trồng.
Bảng 2.4 Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin Động vật thí nghiệm Giới Đường dùng LD 50 (mg/kg) LC 50 (mg/l)
Chuột nhắt Đực, cái Uống >5000
Chuột cống Đực, cái Uống >5000
Chuột cống Đực, cái Da >2000
Chuột cống Đực, cái Hít trong 4h Đực 0,698
Thỏ Cái Kích ứng da Không đáng kể
Thỏ Cái Kích ứng mắt Không đáng kể
Chuột lang Cái Trên da nhạy cảm
Bảng 2.5 Giới hạn tối đa dƣ lƣợng azoxystrobin trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
ADI (mg/kg thể trọng) Thực phẩm MRL (mg/kg)
Các loại rau họ bắp cải, cải bắp, cải bông
Các loại rau bầu bí 1
Các loại rau họ đậu, rau xà lách, lá rau diếp
Sâm khô (kể cả sâm đỏ) 0,3
2.2.6 Ƣu, nhƣợc điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay (Michelangelo
Anastassiades et al., 2003) Ưu điểm:
- Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng và phòng trừ khi xảy ra các trận dịch
- Cho hiệu quả trực tiếp, rõ rệt và tương đối triệt để
- Nâng cao năng suất rõ rệt
- Dễ ứng dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều vùng khác nhau
- Dễ gây độc cho người trực tiếp sử dụng thuốc (pha chế, phun thuốc …)
- Ảnh hưởng sâu sắc đến các quần thể sinh vật gây mất cân bằng sinh thái
Các loại thuốc bảo vệ thực vật có độ bền cao và thời gian lưu giữ lâu trong đất, như DDT, có tác động mạnh mẽ đến môi trường sống xung quanh Chẳng hạn, DDT cần đến 10 năm để phân hủy 95% lượng thuốc trong đất.
- Gây ra hiện tƣợng kháng thuốc Là một vấn đề đang cần đƣợc quan tâm hàng đầu, do sử dụng một loại thuốc liên tục trong nhiều năm
Hiện nay, xu hướng toàn cầu đang chuyển dịch sang việc hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có độc tính cao, nhằm bảo vệ môi trường Thay vào đó, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực tìm kiếm những loại thuốc mới với ưu điểm vượt trội và khắc phục những nhược điểm của các sản phẩm hiện có.
2.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV
2.3.1 Tình hình sử dụng HCBVTV trên thế giới (Trần Cao Sơn, 2015)
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ngày càng trở thành yếu tố quan trọng trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản xuất và đảm bảo an ninh lương thực Theo các chuyên gia, trong những thập kỷ 70, 80, và 90 của thế kỷ 20, thuốc BVTV đã đóng góp vào việc bảo vệ và tăng năng suất cho các loại cây trồng chủ yếu như lương thực, rau và hoa quả, với mức tăng khoảng 20 – 30%.
Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), ở các nước châu Á trồng nhiều lúa, 10 năm qua
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THUỐC BVTV
2.4.1 Phương pháp truyền thống (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013) Để chống lại các loài sinh vật gây hại, từ lâu người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu một cách rộng rãi trong nông nghiệp nhƣ: trồng lúa, rau, cây ăn quả và phổ biến hiện nay là dược liệu Mục đích của phương pháp phân tích đa dư lượng là phân tích đồng thời nhiều thuốc BVTV trong cùng một lần thực hiện, do đó kỹ thuật chiết cũng hướng đến chiết được càng nhiều thuốc BVTV càng tốt Đồng thời phương pháp phải được thực hiện nhanh chóng và dễ dàng, cùng với việc sử dụng một lƣợng dung môi tối thiểu mà vẫn chiết đƣợc tất cả thuốc BVTV có trong nền mẫu Đã có một vài phương pháp được sử dụng để xác định dư lượng thuốc trừ sâu tồn dư trong trái cây và nước ép trái cây như: chiết lỏng, chiết với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết vi pha rắn, chiết siêu tới hạn…Các phương pháp này thường tốn rất nhiều thời gian
Phương pháp phân tích đa dư lượng đầu tiên và nổi tiếng nhất là phương pháp Mills, được phát triển vào những năm 1960 bởi Cục quản lý dƣợc và thực phẩm Mỹ (FDA) bởi nhà hóa học P.A Mills Phương pháp này chủ yếu phân tích thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ bằng cách chiết xuất mẫu thực phẩm không chứa chất béo bằng acetonitril, sau đó pha loãng với H2O và phân loại thuốc trừ sâu vào dung môi không phân cực như petroleum ether Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế khi không thể phân tích đầy đủ các thuốc trừ sâu phân cực trung bình, đặc biệt là nhóm phospho hữu cơ Do đó, cần phát triển các phương pháp thay thế để xác định các hợp chất không được chiết xuất bởi phương pháp Mills, thường thông qua việc thay đổi dung môi chiết xuất ban đầu.
19 nhau bởi bước phân vùng, làm sạch và xác định thuốc BVTV (Anastassiades et al.,
Phương pháp chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật sử dụng dung môi để tách chất hoặc nhóm hợp chất từ hỗn hợp nghiên cứu Quá trình này bao gồm việc chuyển chất phân tích từ dung môi đầu tiên sang dung môi thứ hai không hòa tan Việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng để tránh hao hụt chất cần phân tích và loại bỏ tạp chất Các yếu tố như độ tan, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất hòa tan khác cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết Để tăng cường quá trình chiết, có thể sử dụng các tác nhân vật lý như lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, hoặc sóng siêu âm Đối với mẫu có nhiều tạp chất, cần kết hợp thêm các phương pháp làm sạch khác.
Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng thường được áp dụng để
- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu
Phân chia cao thô ban đầu chứa nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực, được tách thành các phân đoạn với tính phân cực khác nhau.
Vào năm 2009, Tiến sĩ Nguyễn Thị Bích Thu đã công bố nghiên cứu về ứng dụng sắc ký khối phổ trong việc phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến Nghiên cứu này áp dụng phương pháp chiết mẫu bằng siêu âm, tiếp theo là làm sạch mẫu bằng cột nhồi silicagel kết hợp với 10% than hoạt, và cuối cùng là định lượng bằng kỹ thuật GC/MS.
2.4.2 Phương pháp QuEChERS (Trần Cao Sơn, 2015)
Trong những năm gần đây, phương pháp QuEChERS (viết tắt của nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định và an toàn) đã có sự phát triển đáng kể Được báo cáo lần đầu bởi Anastassisdes và Lehotay, phương pháp này được phát triển bởi Sở Nông nghiệp Hoa Kỳ vào năm 2003 QuEChERS là một phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc trừ sâu trên nhiều loại nền mẫu khác nhau, yêu cầu khoảng 70 – 100% nước trong thành phần, với mẫu khô được bổ sung nước.
Phương pháp này được phát triển để chiết xuất thuốc bảo vệ thực vật trên trái cây và rau quả, đồng thời làm sạch mẫu khỏi các tạp chất như đường, acid béo, acid hữu cơ, sterol, protein, chất màu và nước thừa So với các phương pháp truyền thống như chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn, phương pháp này mang lại nhiều tiện lợi hơn Nó đơn giản và hiệu quả trong việc chiết và làm sạch các mẫu có nền phức tạp, bao gồm hai bước chính.
Chiết xuất và phân chia bằng dung môi hữu cơ và dung dịch muối là quy trình quan trọng Sau đó, phần nổi trên bề mặt được tách ra và làm sạch thông qua kỹ thuật chiết phân tán pha rắn (d-SPE).
Năm 2005, Lehotay và các cộng sự đã xác nhận hiệu quả của phương pháp phân tích thuốc trừ sâu trên 207 trong số 235 chất trong mẫu rau quả, tuy nhiên, độ thu hồi của các chất nhạy với pH bị ảnh hưởng Để cải thiện độ thu hồi, Lehotay đã điều chỉnh phương pháp bằng cách sử dụng đệm acetat với pH 4,8 - 5,0, và phương pháp này đã được nghiên cứu tại 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia, trở thành phương pháp chính thức của AOAC 2007.01 vào năm 2007 Cùng thời điểm, Anastassiades và cộng sự phát triển một phương pháp QuEChERS khác với đệm citrat ở pH khoảng 5, phương pháp này đã được thẩm định liên phòng tại nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và trở thành tiêu chuẩn châu Âu CEN 15662.
Hiện nay, phương pháp chiết thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) theo QuEChERS vẫn được áp dụng với ba quy trình chiết chính: phiên bản gốc do Anastassiades và Lehotay phát triển, phiên bản sử dụng đệm acetat theo tiêu chuẩn AOAC, và phiên bản dùng đệm citrat theo tiêu chuẩn châu Âu.
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
Phương pháp gốc ban đầu
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
+ 50mg C18; 7,5mg GCB (lựa chọn thêm)
Phương pháp AOAC 2007.01 (Đệm acetat pH 4,8-5)
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
Na 3 citrat + 1,5 g Na 2 citrat; 1,5g NaCl
+ 50 mg C18; 7,5 mg GCB (lựa chọn thêm)
Phương pháp EN 15662 (Đệm citrat pH 5)
21 Ưu điểm của phương pháp QuEChERS (Michelangelo Anastassiades, 2003)
Nhanh (8 mẫu trong khoảng 30 phút)
Đơn giản (các bước thực hiện không quá khó, sai số tối thiểu)
Rẻ (không tốn kém nhiều khi chuẩn bị mẫu)
Lƣợng dung môi sử dụng thấp (10 ml acetonitril)
Hầu nhƣ không cần dụng cụ thủy tinh
Đƣợc dùng trên phạm vi rộng các thuốc trừ sâu (chất phân cực, chất phụ thuộc vào pH)
Chiết xuất bằng acetonitril, được phân tích qua sắc ký khí và sắc ký lỏng, đã trở thành phương pháp phổ biến trong việc phân tích đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ở Việt Nam Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp mới này, dựa trên lý thuyết của QuEChERS, đồng thời điều chỉnh một số bước để phù hợp với điều kiện thực tế và tối ưu hóa quy trình một cách hiệu quả nhất.
Năm 2005, Ths Trần Việt Hùng đã tiến hành nghiên cứu nhằm xác định thuốc bảo vệ thực vật trong dược liệu thông qua các phương pháp chiết nóng, chiết lạnh và chiết Soxhlet Nghiên cứu này còn kết hợp việc sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi phân tích bằng sắc ký khí.
KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS
HPLC, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao, là một phương pháp phân tích ra đời từ năm 1967-1968, được phát triển từ sắc ký cột cổ điển Hiện nay, HPLC đã trở nên hiện đại và phát triển mạnh mẽ nhờ sự tiến bộ trong công nghệ chế tạo máy phân tích Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc, giúp định tính và định lượng các thuốc đa thành phần Ngoài ra, HPLC cũng đã được áp dụng nhiều trong lĩnh vực dược liệu.
Phương pháp HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật phân tích hóa lý quan trọng, được sử dụng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các chất với hai pha không hòa lẫn: pha tĩnh trong cột hiệu năng cao và pha động là dung môi rửa giải Khi dung dịch hỗn hợp được đưa vào cột, các chất sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và chất phân tích Việc bơm dung môi pha động vào cột sẽ làm cho các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến sự phân tách rõ rệt Sau khi rời khỏi cột, các chất sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện, cho phép định lượng chính xác các thành phần trong hỗn hợp.
22 gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC diễn ra nhờ sự vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển qua cột sắc ký, nó sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Quá trình rửa giải và tách các chất phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, chất tan và pha động Sự tách biệt xảy ra khi hỗn hợp các chất tương tác khác nhau với pha tĩnh, do tính chất lý hóa và cấu trúc phân tử, dẫn đến việc chúng di chuyển với tốc độ khác nhau để tách ra.
2.5.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC
Hình 2.8 Cấu tạo hệ thống HPLC
Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động 2 - Bộ phận khử khí 3 - Bơm cao áp 4 -
Bộ phận tiêm mẫu sử dụng syringe hoặc auto sampler để đưa mẫu vào hệ thống Cột sắc ký với pha tĩnh có thể được điều nhiệt để tối ưu hóa quá trình phân tách Đầu dò detector nhận tín hiệu từ các thành phần trong mẫu Hệ thống máy tính điện tử được cài đặt phần mềm để nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống Cuối cùng, thiết bị in dữ liệu giúp ghi lại kết quả phân tích.
Pha động đóng vai trò quan trọng trong sắc ký, quyết định khả năng tách các chất khỏi hỗn hợp Việc lựa chọn dung môi pha động với độ phân cực phù hợp là cần thiết, có thể sử dụng từ 2 đến 3 dung môi trong một lần phân tích Nhiều yếu tố như pH, tỷ lệ và thành phần pha động, bọt khí, cũng như dung môi không tinh khiết có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích, dẫn đến sự không đạt yêu cầu Do đó, dung môi sử dụng trong sắc ký cần phải được tinh khiết.
23 khiết dựng cho HPLC Tất cả cỏc mẫu thử phải được lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi tiêm vào cột
Trong HPLC, bơm là bộ phận quan trọng nhất, yêu cầu khả năng cung cấp chính xác và ổn định dòng chảy Nó cần chịu được áp lực cao lên đến 5000 psi và có khả năng cung cấp một lượng lớn dung môi pha động.
Bộ phận tiêm mẫu là thiết bị quan trọng giúp đưa mẫu vào cột sắc ký với dung tích từ 5 đến 100 µl Có hai phương pháp tiêm mẫu: tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động.
Cột sắc ký, được coi là trái tim của quá trình sắc ký, thường được làm bằng thép không gỉ với hình dạng thẳng và thể tích thay đổi Pha tĩnh bên trong cột được lựa chọn tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký cụ thể Trước khi mẫu đi vào cột chính, nó cần phải đi qua cột bảo vệ (tiền cột) nhằm đảm bảo tuổi thọ của cột phân tích.
Detector là bộ phận quan trọng trong hệ thống HPLC, đóng vai trò như "não bộ" để phát hiện chất cần phân tích Tùy thuộc vào bản chất của mẫu, có nhiều loại detector khác nhau như detector khối phổ (MS), detector chuỗi diod quang (DAD), detector huỳnh quang (FLD), detector khúc xạ và detector ion hóa ngọn lửa Trong số đó, detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) được sử dụng rộng rãi nhất nhờ vào độ nhạy cao của nó.
2.5.4 Ứng dụng của HPLC trong dƣợc liệu
Ứng dụng quan trọng nhất của việc phân tích là xác định các thành phần trong dược liệu, bao gồm cả dịch chiết và phát hiện các tạp chất cũng như chất giả mạo trong dược liệu hoặc sản phẩm dược phẩm.
Các phương pháp phân tích hiện đại cho phép xác định hàm lượng các chất thông dụng một cách hiệu quả Người dùng có thể định lượng một chất đơn lẻ hoặc đồng thời nhiều chất trong cùng một lần phân tích, tùy thuộc vào việc lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp.
Có thể sử dụng để theo dõi và đánh giá sự thay đổi hàm lượng các chất của dược liệu trong quá trình bảo quản hoặc trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất.
- Dùng để phân lập các chất tinh khiết từ dƣợc liệu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát dư lượng hai hóa chất bảo vệ thực vật imidacloprid và azoxystrobin trong dược liệu tươi và khô của rễ và lá cây Đinh lăng được thực hiện vào tháng 06/2017 tại nhiều địa điểm khác nhau.
- Dược liệu lá tươi và rễ tươi lấy tại một số vườn trồng Đinh lăng ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp
- Dƣợc liệu lá khô và rễ khô thu mua tại một số cửa hàng dƣợc liệu ở Cần Thơ,
3.1.2 Chất chuẩn – Hóa chất – Dung môi
Silicagel cỡ hạt 40 – 63 àm (Merck) Bản mỏng silicagel 60 F 254 (Merck)
Dung môi: methanol, petrolium ether (60-90), diclorometan, cloroform, ethylacetat, aceton và một số dung môi cơ bản trong phòng thí nghiệm
Nước cất 2 lần, acetonitril, methanol JK Baker (Merck)
Chất chuẩn imidacloprid với độ tinh khiết 99,82%
Chất chuẩn azoxystrobin với độ tinh khiết 99,60%
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch hai chuẩn gốc azoxystrobin 160 àg/ml và imidacloprid 40 àg/ml được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 8,0 mg azoxystrobin và 2,0 mg imidacloprid, sau đó hòa tan trong acetonitril Dung dịch được chuyển vào bình định mức 50 ml và bổ sung acetonitril đến vạch Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc được tính toán dựa trên lượng cân thực tế và độ tinh khiết của các chất chuẩn Để đảm bảo chất lượng, các dung dịch chuẩn gốc cần được bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp với azoxystrobin 4 àg/ml và imidacloprid
Để chuẩn bị dung dịch 1 àg/ml (Dung dịch 2), lấy chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn gốc 1 cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm acetonitril đến vạch Dung dịch này cần được bảo quản trong tủ lạnh để đảm bảo chất lượng.
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp bao gồm azoxystrobin 0,8 àg/ml và imidacloprid 0,2 àg/ml (Dung dịch 3) được tạo ra bằng cách lấy chính xác 10 ml dung dịch 2 cho vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm acetonitril đến vạch Dung dịch này cần được bảo quản trong tủ lạnh để đảm bảo độ ổn định.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, Nhật và đầu dò UV-Vis
Cột C18 RP ( 250 mm x 4,6 mm; 5 àm) và tiền cột tương ứng
Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 1800
Máy lắc siêu âm Elma S 100 H – Đức
Cân phân tích với độ chính xác 0,1 – 0,0001 g
Bếp đun cách thủy Memmert – Đức
Bình định mức, pipet thủy tinh và các dụng cụ cần thiết khác
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tùy thuộc vào tính chất của đối tượng nghiên cứu là dược liệu và đối tượng phân tích là thuốc bảo vệ thực vật, cần áp dụng các phương pháp xử lý mẫu phù hợp để đạt được kết quả chính xác.
Để làm giàu đối tượng phân tích trong mẫu dược liệu khô, cần áp dụng phương pháp xử lý phù hợp do pH đa dạng và sự hiện diện của nhiều chất diệp lục Giai đoạn làm sạch mẫu đóng vai trò quan trọng, giúp tăng khả năng phát hiện và giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu.
Phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng về thành phần của các loại dược liệu khác nhau.
Mục tiêu chính của quá trình xử lý mẫu là chiết xuất tối đa thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đồng thời giảm thiểu tạp chất Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được áp dụng, bao gồm chiết bằng dung môi, chiết siêu tới hạn, chiết pha lỏng dưới áp suất, chiết vi sóng, chiết pha rắn, chiết phân tán pha rắn, vi chiết pha rắn và phương pháp QuEChERS.
3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ, rửa sạch để khô (đối với mẫu tươi)
Qui trình chiết mẫu HCBVTV trên nền mẫu dược liệu tươi:
Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dược liệu tươi
Qui trình chiết mẫu HCBVTV trên nền mẫu dược liệu khô yêu cầu độ ẩm khoảng 80% để đạt hiệu suất cao nhất, theo Anastassiades Do đó, cần bổ sung nước cho dược liệu khô trước khi tiến hành chiết Mỗi lần chiết nên sử dụng khoảng 3 g dược liệu khô và thêm nước để làm ẩm bột dược liệu.
Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn
+ 20 ml dung môi chiết/ 3 lần
Lắc với khoảng 10 ml H 2 O (lớp dưới)
Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dưới)
Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 àm
+ Hòa cắn với 10 ml ACN
Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút
Hình 3.2 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu khô
3.2.3 Khảo sát dung môi chiết:
Trong kỹ thuật chiết bằng dung môi, độ phân cực của dung môi cần phải phù hợp với chất phân tích để đạt hiệu quả tối ưu Acetonitril là dung môi phổ biến nhất được sử dụng, bên cạnh đó, nhiều dung môi khác như n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether, methanol, dicloromethan và aceton cũng được áp dụng để chiết xuất thuốc bảo vệ thực vật từ dược liệu.
3 g mẫu/bình nón 100 ml (Làm ẩm vừa đủ)
Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn
+ 20 ml dung môi chiết/ 3 lần
Lắc với khoảng 10 ml H 2 O (lớp dưới)
Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dưới)
Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 àm
+ Hòa cắn với 10 ml ACN
Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút
Để chọn dung môi chiết thích hợp, cần dựa vào độ tan của hai hoạt chất trong dung môi Tiến hành chiết trên mẫu thử có thêm chuẩn nhằm tối đa hóa việc chiết xuất hai hoạt chất và giảm thiểu tạp chất Đánh giá sơ bộ có thể thực hiện bằng cách quan sát trên sắc ký lớp mỏng (SKLM).
Bảng 3.1 Độ tan của hai hoạt chất trong nước và dung môi hữu cơ (Ursula Banasiak,
2011) Độ tan ở 20 o C Imidacloprid (g/L) Azoxystrobin (g/L) n-hexan < 0,1 0,057
3.2.4 Khảo sát phương pháp làm sạch mẫu thử
Chấm dịch chiết mẫu thử lên SKLM giúp quan sát imidacloprid, azoxystrobin và các chất khác trong nền mẫu Đối với dược liệu tươi hoặc bộ phận trên mặt đất, cần phương pháp xử lý phù hợp do pH đa dạng và sự hiện diện của chất diệp lục, nhựa, chất béo Giai đoạn làm sạch mẫu rất quan trọng, tăng khả năng phát hiện và giảm ảnh hưởng của nền mẫu.
3.2.4.1 Loại tạp bằng SPE (chiết pha rắn)
Chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) là phương pháp chiết dựa trên sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, với pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp trong ống nhỏ Khi pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ lại, và sau đó được rửa giải bằng dung môi phù hợp Thể tích dung môi rửa giải thường nhỏ hơn nhiều so với thể tích dịch ban đầu, cho phép không chỉ làm sạch mà còn làm giàu mẫu qua quy trình SPE.
Kỹ thuật tinh chế dịch chiết lỏng – lỏng đã được sử dụng từ lâu, và hiện nay không chỉ là một phương pháp tách chiết độc lập mà còn được tích hợp vào hệ thống GC và HPLC.
Kỹ thuật này có nguyên tắc cơ bản giống như sắc ký cột Thường được áp dụng để đạt mục đích khác nhau:
- Để xác định mức độ phân cực của hợp chất chƣa biết
- Để làm đậm đặc một hợp chất đang ở trong một dung dịch rất loãng với thể tích lớn
- Để phân chia cao thô ban đầu thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau
Để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên, cần tiến hành khảo sát từ cao thô ban đầu hoặc ở giai đoạn tinh chế cuối cùng Kỹ thuật SPE mang lại nhiều ưu điểm trong quá trình này.
- Đơn giản, nhanh, không tạo nhũ, tiết kiệm dung môi
- Khả năng tinh chế cao, không hƣ hay mất mẫu thích hợp với GC, HPLC đặc biệt với các mẫu phân cực
- Kết quả lặp lại, tỷ lệ hồi phục cao
- Tin cậy, không nhiễm vì không sử dụng lại
- Có thể làm hàng loạt, có thể tự động hóa
Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng làm sạch và làm giàu mẫu hiệu quả Tuy nhiên, nó cũng gặp một số hạn chế trong việc phân tích đa dạng lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) Mỗi loại kỹ thuật chỉ phù hợp với từng hoạt chất cụ thể, điều này gây khó khăn trong việc phân tích đồng thời nhiều loại thuốc BVTV từ các nhóm khác nhau.
3.2.4.2 Loại tạp bằng sắc ký cột cổ điển
Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lƣợng lớn từ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần
Tách sản phẩm bằng sắc ký cột silicagel với cỡ hạt 40-60 micromet, sử dụng hệ dung môi cloroform – methanol (97:3) Xác định phân đoạn chứa hai chất phân tích thông qua HPLC, so sánh với hỗn hợp hai chuẩn và loại bỏ các phân đoạn không mong muốn Tập trung các phân đoạn chứa sản phẩm và cô thu hồi dung môi để thu được mẫu phân tích Cuối cùng, hòa mẫu vào dung môi thích hợp để tiến hành phân tích.
3.2.4.3 Loại tạp bằng than hoạt tính
Để tẩy màu dung dịch chiết, có thể cho dung dịch này chảy qua một cột ngắn chứa than hoạt tính hoặc sử dụng một becher, cho than hoạt tính vào dung dịch và để yên trước khi lọc bỏ bột than.
Than hoạt tính có khả năng hấp phụ hiệu quả các chất màu trong thực vật như chlorophyll a, chlorophyll b, carotene và xanthophyll Tuy nhiên, nhược điểm của nó là có thể hấp thu cả những hợp chất cần khảo sát, ví dụ như alcaloid như morphin, strychnin và quinin.
3.2.5 Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
Thẩm định qui trình định lượng được thực hiện dựa trên các tiêu chí quan trọng như tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng Các tiêu chí này được hướng dẫn theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc và Quyết định số 07/QĐ-QLD của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế, ban hành ngày 11 tháng.
3.3.1 Tính phù hợp hệ thống
Tính phù hợp hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp Được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp
Pha dung dịch hai chuẩn với nồng độ azoxystrobin là 0,8 àg/ml và nồng độ imidacloprid là 0,2 àg/ml Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần
Tính phù hợp của hệ thống được xác định qua các thông số sắc ký như diện tích pic (S), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng (AS).
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tối đa đƣợc phép cho các lần tiêm lặp lại là 2% Ngoài ra, hệ thống phải đạt các yêu cầu sau:
- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ A S ≤ 1,5)
- Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5)
Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu tự tạo ở mục 3.2.5
- Sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
Sắc ký đồ mẫu tự tạo yêu cầu thời gian lưu của pic phải tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn Nếu có thêm pic tạp xuất hiện, độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (R S ≥ 1,5) theo quy định của phương pháp sắc ký lỏng trong Dược điển Việt Nam IV.
Chuẩn bị cỏc mẫu thử cú nồng độ azoxystrobin/imidacloprid là 0,32/0,08 àg/ml; 0,64/0,16 àg/ml; 0,8/0,2 àg/ml; 0,96/0,24 àg/ml; 1,28/0,32 àg/ml tương ứng với 40 %,
80 %, 100 %, 120 % và 160 % so với nồng độ sử dụng ở thử tính phù hợp hệ thống, mỗi mẫu tiêm 3 lần, xác định diện tích pic, tính giá trị trung bình Đánh giá:
- Vẽ đường biểu diễn của diện tích pic trung bình theo nồng độ phân tích
- Xác định các hệ số B o (độ dốc), B (tung độ gốc), R 2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy (ŷ = B 0x + B) Thường chấp nhận sự tuyến tính khi 0,995 ≤ R 2 ≤ 1
- Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy
3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
Phương pháp phân tích thuốc BVTV phải đáp ứng yêu cầu để phân tích được ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng MRL (0,01 mg/kg hay 10 àg/kg)
LOD là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng không nhất thiết để có thể định lƣợng đƣợc
LOQ (Limit of Quantitation) là lượng tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử, cho phép định lượng với độ chính xác và độ đúng cao Thông số này rất quan trọng trong việc xác định các chất có nồng độ thấp, đặc biệt là trong việc phát hiện tạp chất và sản phẩm phân hủy.
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) là một chỉ số quan trọng để đánh giá giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trong phân tích Trong đó, S đại diện cho chiều cao tín hiệu của chất phân tích, còn N là mức độ nhiễu của đường nền.
- LOD đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 3
- LOQ đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 10
3.3.5 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần
- Độ chính xác trung gian
Tiến hành nhƣ độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc và người thực hiện
Để đảm bảo độ chính xác trong phân tích, yêu cầu đặt ra là giá trị RSD của hàm lượng hai hoạt chất phải được xác định từ 6 mẫu thử trong một ngày và 6 mẫu thử trong ngày khác, với RSD không vượt quá 2%.
3.3.6 Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %)
Chuẩn bị 9 mẫu thử với 3 mức nồng độ khác nhau là 80%, 100% và 120%, mỗi mức có 3 mẫu Tiến hành sắc ký cho từng mẫu một lần và tính diện tích pic Dựa vào phương trình hồi quy, suy ra nồng độ tìm thấy và so sánh với nồng độ ban đầu để tính tỷ lệ phục hồi.
Ms: nồng độ khi pha (àg/ml)
Mt: nồng độ tỡm thấy (àg/ml) từ phương trỡnh hồi quy của đường tuyến tớnh
- Tỷ lệ phục hồi phải trong khoảng 98 –102%
- RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp