Khảo sát tình hình sử dụng và nghiên cứu tác động làm lành vết thương của một số cây thuốc dân gian được sử dụng bởi đồng bào kho tại vườn quốc gia bidoup núi bà

HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN MINH CẦN KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC DÂN GIAN ĐƯỢC SỬ DỤNG BỞI ĐỒNG BÀO K’H

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN MINH CẦN

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC DÂN GIAN ĐƯỢC SỬ DỤNG BỞI ĐỒNG BÀO

K’HO TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP-NÚI BÀ

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 62420201

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Phản biện 2: PGS.TS Đái Thị Xuân Trang

Phản biện 3: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Phản biện độc lập 2: PGS.TS Đái Thị Xuân Trang

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Đặng Thị Phương Thảo

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Đặng Thị Phương Thảo Số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Minh Cần

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học và Phòng Đào tạo Sau đại học đã luôn quan tâm, tạo điều kiện để chúng tôi được tham gia và hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ

Xin trân trọng cảm ơn Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử và Môi trường, Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cả về vật chất và tinh thần để tôi được tham gia nghiên cứu và hoàn thành luận án này

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu và quý thầy cô đồng nghiệp tại trường Đại học Phạm Văn Đồng đã cho phép và hỗ trợ tôi được tham gia học tập và hoàn thành khóa đào tạo tiến sĩ

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh, chị, bạn bè trong khóa học, các

em học viên cao học, sinh viên cùng tham gia nghiên cứu, giúp đỡ và chia sẻ với tôi

ở Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, trường Đại học Khoa học Tự nhiên

TP Hồ Chí Minh

Đặc biệt, tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc với cô PGS TS Đặng Thị Phương Thảo đã hết sức tận tụy, kiên nhẫn hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu Tấm lòng đối với học trò, sự nghiêm khắc và bao dung của cô luôn là tấm gương sáng cho tôi trong quá trình công tác, giảng dạy sau này Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án này

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2020

Nguyễn Minh Cần

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vết thương và quá trình làm lành vết thương 3

Khái niệm và phân loại vết thương 3

Sinh lý của vết thương 4

Các phân tử điều khiển quá trình sửa chữa vết thương 12

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương 17

1.2 Tổng quan về cây thuốc dân gian 21

Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc trên thế giới 21

Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc ở Việt Nam 24

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu cây thuốc làm lành vết thương trong và ngoài nước 26

Khả năng kháng oxy hóa 26

Khả năng kháng khuẩn 28

Khả năng kháng viêm 30

Khả năng kích thích tăng sinh và di chuyển của các tế bào biểu mô da 31

iv

Các mô hình in vivo trong nghiên cứu làm lành vết thương 32

1.4 Tổng quan về vườn Quốc gia Bidoup-Núi Bà 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Cách tiếp cận của đề tài 35

2.2 Thiết bị, hóa chất 36

Thiết bị 36

Vi khuẩn 36

Hóa chất, môi trường 37

Dòng tế bào động vật 37

Chuột thí nghiệm 38

2.3 Thu mẫu và xử lý mẫu 38

Các cây thuốc sử dụng trong nghiên cứu 38

Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu và chiết cao 39

2.4 Xác định hàm lượng phenol toàn phần 41

2.5 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 41

2.6 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH 42

2.7 Đánh giá khả năng kháng khuẩn 43

2.8 Đánh giá khả năng kháng viêm trên đại thực bào chuột RAW 264.7 43

Xác định độc tính của cao chiết trên tế bào RAW 264.7 43

Khảo sát khả năng ức chế tiết NO của cao chiết 45

2.9 Đánh giá khả năng kích thích tăng sinh trên NBS chuột NIH-3t3 46

2.10 Đánh giá khả năng làm lành vết thương trên mô hình chuột 47

Chuẩn bị cao chiết 47

Chuẩn bị chuột 48

v

Tạo vết thương và thử thuốc 48

Đánh giá khả năng làm lành vết thương biểu kiến của cao chiết 49

2.11 Đánh giá đặc điểm mô học của vết thương 50

2.12 Realtime-PCR định lượng mRNA các gene có liên quan đến quá trình làm lành vết thương 50

2.13 Xử lý thống kê 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát và xây dựng bộ sưu tập các cây thuốc làm lành vết thương 52

Thiết lập bộ sưu tập một số cây thuốc được người K’Ho sử dụng điều trị vết thương 52

Khảo cứu thông tin về hoạt tính làm lành vết thương các cây thuốc trong bộ sưu tập 55

3.2 Khảo sát khả năng làm lành vết thương của các cây thuốc trong bộ sưu tập 63

Kết quả thu nhận cao chiết và thành phần hóa học sơ bộ 63

Khả năng kháng oxy hóa 67

Khảo sát khả năng kháng khuẩn 72

Khả năng kháng viêm mô hình đại thực bào chuột RAW 264.7 78

Khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi 83

Khả năng làm lành vết thương trên mô hình chuột 86

Khả năng làm lành vết thương của cao chiết EtOH 70% từ rễ HTOT 88

Khả năng làm lành vết thương của cao chiết EtOH 70% từ lá RTB trên mô hình chuột 96

3.3 Những đóng góp mới về dữ liệu khoa học của các cây thuốc trong luận án 102

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 107

vi

4.2 Đề nghị 109DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 110TÀI LIỆU THAM KHẢO 111PHỤ LỤC 1: HÌNH THÁI, ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CÂY THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG TRONG BỘ SƯU TẬP 1PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CÂY THUỐC KHẢO SÁT TRONG LUẬN ÁN 9PHỤ LỤC 3 BẢNG CÂU HỎI KHẢO SÁT 10PHỤ LỤC 4 CÔNG DỤNG DÂN GIAN, DƯỢC TÍNH VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CỦA CÁC CÂY THUỐC KHẢO SÁT TRONG LUẬN ÁN 13PHỤ LỤC 5: CÁC ĐƯỜNG CHUẨN TRONG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA 38PHỤ LỤC 6: DỮ LIỆU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT 40PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ ĐO ĐỘ HẤP THU QUANG PHỔ Ở BƯỚC SÓNG 550 NM TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH NITRIC OXIDE TRÊN TẾ BÀO RAW 264.7 CỦA CÁC CÂY THUỐC ĐƯỢC KHẢO SÁT TRONG LUẬN ÁN 42PHỤ LỤC 8: HÌNH ẢNH TIẾN TRÌNH LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG TRÊN CHUỘT

XỬ LÝ VỚI CAO CHIẾT RỄ HÀ THỦ Ô TRẮNG VÀ RAU TÀU BAY 48PHỤ LỤC 9: KẾT QUẢ REALTIME PCR MÔ VẾT THƯƠNG NGÀY THỨ 7 50

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các yếu tố tăng trưởng chọn lọc và các cytokine tại vị trí vết thương 16Bảng 1.2 Thống kê cây thuốc đã biết ở Việt Nam 24Bảng 2.1 Một số cây thuốc được sử dụng điều trị vết thương trong y học cổ truyền của người K’Ho tại VQGBDNB 38Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong phân tích qRT-PCR 51Bảng 3.1 Phương thức sử dụng một số cây thuốc điều trị vết thương trong y học dân gian của người K’Ho 53Bảng 3.2 Tổng hợp các dược tính và thành phần hóa học đã công bố có liên quan đến khả năng làm lành vết thương từ một số cây thuốc được sử dụng điều trị vết thương tại VQGBĐNB 56Bảng 3.3 Hiệu suất (%) thu nhận cao chiết trên khối lượng mẫu khô từ các mẫu cây thuốc 63Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol và flavonoid trong cao chiết EtOH 70% từ các mẫu cây thuốc khảo sát trong luận án 66Bảng 3.5 Nồng độ ức chế 50% gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng oxy hóa quy đổi theo GA của cao chiết EtOH 70% từ các cây thuốc khảo cứu trong luận án 70Bảng 3.6 Khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ các cây thuốc điều trị vết thương khảo sát trong luận án 75Bảng 3.7 Nồng độ gây độc thấp nhất của cao chiết từ các cây thuốc được khảo sát trong luận án trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 79Bảng 3.8 Khả năng kháng viêm in vitro trên mô hình đại thực bào RAW 264.7 của cao chiết từ các cây thuốc được khảo sát trong luận án 81Bảng 3.9 Tác động của các cao chiết lên khả năng tăng sinh của nguyên bào sợi NIH-3T3 84Bảng 3.10 Tác dụng làm lành vết thương trên chuột của các cao chiết EtOH 70% từ các cây thuốc khảo sát trong luận án 87Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cao chiết EtOH 70% rễ HTOT lên tốc độ co và thời gian lành vết thương 89

viii

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của cao chiết EtOH 70% từ lá RTB lên tốc độ co và thời gian lành vết thương 97Bảng 3.13 Tổng hợp các tác dụng có liên quan đến quá trình làm lành vết thương ở

8 cây thuốc được người K’Ho sử dụng điều trị vết thương ở VQGBĐNB được khảo sát trong luận án 103

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tiến trình làm lành vết thương 5

Hình 1.2 Tiểu cầu giải phóng các yếu tố đông máu tại vết thương 6

Hình 1.3 Bạch cầu trung tính xâm nhập vết thương 7

Hình 1.4 Nguyên bào sợi chiếm ưu thế tại vết thương sau 3-5 ngày 9

Hình 1.5 Sự hình thành sẹo là kết quả của sự lành vết thương 11

Hình 1.6 Độ căng của vết thương tăng theo thời gian 12

Hình 1.7 Các pha của quá trình làm lành vết thương và sự tạo thành NO 14

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thu nhận cao chiết 40

Hình 2.2 Phản ứng của gốc tự do DPPH với chất kháng oxy hóa 42

Hình 2.3 Quá trình khử MTT tạo thành formazan 44

Hình 2.4 Quá trình chuyển hóa trong phản ứng Griess 45

Hình 3.1 Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết EtOH 70% các cây thuốc khảo cứu trong luận án 69

Hình 3.2 Sự tương quan giữa TPC, TFC và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết EtOH 70% từ các cây thuốc khảo sát trong luận án 72

Hình 3.3 Tác động của cao chiết EtOH 70% từ rễ HTOT lên đặc điểm mô học của vết thương ở ngày thứ 7 90

Hình 3.4 Khả năng kháng viêm của cao chiết EtOH 70% từ rễ HTOT trên vết thương ở chuột 92

Hình 3.5 Cao chiết EtOH 70% từ rễ HTOT làm tăng số lượng nguyên bào sợi và mức độ biểu hiện của TGF-β1 94

Hình 3.6 Cao chiết EtOH 70% rễ HTOT làm tăng mức độ biểu hiện của mRNA của VEGF 95

Hình 3.7 Tác động của cao chiết EtOH 70% lá RTB lên đặc điểm mô học của vết thương ở ngày thứ 7 98

Hình 3.8 Khả năng kháng viêm của cao chiết EtOH 70% lá RTB trên mô hình chuột 99

x

Hình 3.9 Cao chiết EtOH 70% lá RTB làm tăng mật độ của NBS và mức độ biểu hiện của TGF-β1 100Hình 3.10 Cao chiết EtOH 70% lá RTB làm tăng mức độ biểu hiện của mRNA của VEGF 101

xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT

TBS Tế bào sừng (keratinocyote)

VQGBDNB Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà

TỪ VIẾT TẮT TIẾNG ANH

2,2'azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic) acid

-

α-SMA Alpha-smooth muscle actin Sợi α actin ở tế bào cơ trơn DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl -

EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu mô

xii

FGF Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trường nguyên

bào sợi FRAP Ferric reducing antioxidant

Nồng độ gây chết tối thiểu

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

mg GAE/g drm miligram gallic acid equivalent /

gram dried raw materials

Hàm lượng phenol tương đương số mg acid gallic/g mẫu khô

mg GAE/gE miligram gallic acid equivalent /

gram extract

Hàm lượng phenol tương đương số mg acid gallic/g cao chiết

xiii

mg QE/g drm miligram quercetin equivalent /

gram dried raw materials

Hàm lượng flavonoid tương đương số mg quercetin/g mẫu khô

mg QE/gE miligram quercetin equivalent /

gram extract

Hàm lượng flavonoid tương đương số mg quercetin/g cao chiết

mg GAEAC/g

drm

miligram gallic acid equivalent antioxidant capacity / gram dried raw materials

Khả năng kháng oxy hóa tương đương số miligram gallic acid/gram bột dược liệu khô

mg GAEAC/gE miligram gallic acid equivalent

antioxidant capacity / gram extract

Khả năng kháng oxy hóa tương đương số miligram gallic acid/gram cao chiết MMP Matrix Metalloproteinase Proteinase hoạt động cần có

ion kim loại trong chất nền NF-kB nuclear factor kappa-light-chain-

enhancer of activated B cells

Yếu tố nhân kappa - chuỗi nhẹ tăng cường tế bào hoạt hóa B PDGF platelet-derived growth factor Yếu tố tố tăng trường có

nguồn gốc tiểu cầu

TFC Total flavonoid contain Hàm lượng flavonoid tổng số TGF-β Transforming growth factor beta Yếu tố tăng trưởng chuyển

dạng beta TNF-α Tumor Necrosis Factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha

VEGF Vascular endothelial growth

1

MỞ ĐẦU

Các tổn thương trên mô da là một vấn đề phổ biến trong đời sống Theo ước tính của Forbes hàng năm có khoảng 50 triệu ca bị thương ở mức độ nghiêm trọng trên toàn thế giới Chi phí chữa trị các ca bị thương mạn tính tiêu tốn khoảng 25 tỉ USD mỗi năm [70] Các chế phẩm chữa trị vết thương hiện nay chủ yếu dựa trên các sản phẩm tổng hợp hóa học với nhiều tác dụng phụ, độc tính cao như các loại gel, thuốc

mỡ chứa chất sát trùng như sulfadiazine bạc, povidone-iodine, chất kháng sinh như bacitracin, neomycin, nitrofurazone … [47,127], các loại gel kháng viêm có chứa corticoid [343] Ngoài ra còn có các sản phẩm công nghệ cao như các loại gel có chứa các cytokine ở người với giá thành tương đối cao [161]

Cây thuốc dân gian có quá trình sử dụng lâu đời nên thường được xem là an toàn, thân thiện, ít tác dụng phụ Nhiều cây thuốc truyền thống đã và đang được sử dụng điều trị vết thương một cách hiệu quả trong y học cổ truyền ở nhiều nước Một số cây thuốc đã được kiểm nghiệm hiệu quả lâm sàng và phát triển thành sản phẩm điều trị vết thương hiệu quả, ít tác dụng phụ như gel cây lô hội, các sản phẩm kem từ nghệ hoặc kem có chứa curcumin, thuốc cao cây sến mật (Mudaxin) [24],…

Hiện nay, việc sử dụng cây thuốc dân gian đang giảm dần kèm theo nguy cơ mai một và thất truyền những tri thức quý báu do sự phát triển nhanh chóng của các loại tân dược Do đó, việc thực hiện các nghiên cứu để tìm hiểu tính năng, tác dụng của cây thuốc dân gian nói chung và cây thuốc dân gian trong chăm sóc, điều trị vết thương nói riêng là một việc làm hết sức cần thiết và cấp bách Các tri thức khoa học

về cây thuốc là cơ sở quan trọng cho việc bảo tồn tri thức y học bản địa, bảo tồn cây thuốc và tiến tới khai thác và phát triển các sản phẩm mới một cách hiệu quả

Qua quá trình sống gần gũi với thiên nhiên, người K’Ho ở Lâm Đồng đã tích lũy được nhiều tri thức y học dân gian quý giá trong chăm sóc, điều trị sức khỏe nói chung

và vết thương nói riêng Những kinh nghiệm quý giá này cần được nghiên cứu, đánh giá thấu đáo về cơ sở khoa học, kịp thời phát hiện các cây thuốc, bài thuốc quý nhằm phục vụ công tác bảo tồn nguồn cây thuốc và tri thức y học bản địa, tiến tới khai thác

2

có hiệu quả Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát tình hình sử

dụng và nghiên cứu tác động làm lành vết thương của một số cây thuốc dân gian được sử dụng bởi đồng bào K’Ho tại Vườn Quốc gia Bidoup-Núi Bà” với các mục

tiêu nghiên cứu cần đạt được là:

- Xác định các cây thuốc được sử dụng trong điều trị vết thương và phương thức

sử dụng cây thuốc trong điều trị vết thương trong cộng đồng người K’Ho tại Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà (VQGBĐNB)

- Khảo sát hoạt tính làm lành vết thương của các cây thuốc được xác định và làm sáng tỏ một số cơ chế tác động hỗ trợ làm lành vết thương của các cây thuốc đã được xác định

Để đạt được các mục tiêu này, luận án sẽ thực hiện các nội dung nghiên cứu như sau:

1 Điều tra, khảo sát tập quán sử dụng cây thuốc trong điều trị vết thương của đồng bào K’Ho tại VQGBĐNB và khảo cứu tài liệu về dược tính, thành phần hóa học

có liên quan đến tác dụng làm lành vết thương của các cây thuốc này

2 Khảo sát hoạt tính có liên quan đến khả năng làm lành vết thương trên mô

hình in vitro, gồm (i) khả năng kháng oxy hóa, (ii) kháng khuẩn, (iii) kháng viêm và

(iv) kích thích tăng sinh nguyên bào sợi

3 Khảo sát tác động làm lành vết thương của các cây thuốc trên mô hình chuột

và làm sáng tỏ cơ chế làm lành vết thương thông qua đánh giá kết quả mô học của vết thương cùng với sự biểu hiện của một số gene mã hóa cho các cytokine quan trọng

có liên quan đến quá trình làm vết thương là NF-κB1, TNFα, TGF-β1 và VEGF Kết quả của luận án sẽ góp phần giải thích, làm sáng tỏ công dụng dân gian của các cây thuốc, đề xuất thêm các hướng nghiên cứu có liên quan để tiếp tục hiểu rõ bản chất quá trình làm lành vết thương và cơ chế tác dụng của cây thuốc Từ đó kịp thời phát hiện những tiềm năng quý của cây thuốc để phục vụ cho công tác bảo tồn

và khai thác các loại cây thuốc này

CHƯƠNG 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1 TỔNG QUAN VỀ VẾT THƯƠNG VÀ QUÁ TRÌNH LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG

Khái niệm và phân loại vết thương

Vết thương là sự gián đoạn tính liên tục của các mô hoặc cơ quan do các tác động

từ bên ngoài như các tác động cơ học (cắt, rạch, xé…), các tác động hóa học (do acid, base…) hoặc tác động nhiệt Các tổn thương này sẽ kéo theo các tổn thương về mạch máu và nhiễm trùng do bị mất đi mô da bảo vệ [67,71,259]

Có nhiều cách tiếp cận để phân loại vết thương Các tiêu chí phân loại vết thương thông dụng hiện nay chủ yếu dựa trên nguyên nhân gây vết thương, mức độ nhiễm khuẩn, độ sâu của vết thương và thời gian lành vết thương

 Căn cứ theo nguyên nhân bị thương, vết thương được chia thành các dạng tổn thương như sau [67,259]:

-Tổn thương do tác nhân cơ học, bao gồm các dạng tác động như bị xé, cắt, rạch, trầy, dập, đâm, cắn…

- Tổn thương do tác nhân hóa học: các tổn thương gây ra do các acid, base và các hóa chất ăn mòn khác

- Tổn thương do nhiệt độ (quá nóng hoặc lạnh sâu)

- Ngoài ra, còn có một số loại vết thương có cơ chế tổng hợp do nhiều tác nhân tác động cùng lúc, ví dụ như vết thương do đạn bắn sẽ bao gồm cả tác động đâm, xé, dập và nhiệt độ

 Căn cứ theo mức độ nhiễm khuẩn, vết thương được chia thành [8,67,71]:

- Vết thương sạch (clean wound): các vết thương ngoại khoa, tiến hành trong điều kiện vô trùng, không nằm trong vùng của các cơ quan hô hấp, tiêu hóa, niệu - sinh dục Không có dấu hiệu viêm, nhiễm trùng

- Vết thương sạch nhiễm (vết thương sạch có nguy cơ nhiễm khuẩn) contaminated wound): là vết thương ngoại khoa tiến hành trong điều kiện vô trùng nhưng nằm trong vùng của các cơ quan hô hấp, tiêu hóa, niệu - sinh dục Tức là nguồn nhiễm của các vết thương này chủ yếu từ bên trong cơ thể

 Căn cứ vào thời gian từ khi bị thương, vết thương được chia thành vết thương cấp tính và mạn tính:

- Vết thương cấp tính (acute wound) là những vết thương mà quá trình lành vết thương diễn ra bình thường, có sự đồng bộ giữa các pha sinh lý và lành trong vài tuần, thường dưới 4 tuần [67,86]

- Vết thương mạn tính (chronic wound) là những vết thương không thể lành sau 4 tuần xử lý hoặc không thể tự lành sau 8 tuần Thời gian lành vết thương bị kéo dài do một số sai hỏng ở một số điểm trong tiến trình lành vết thương, thường quá trình này

sẽ bị kẹt lại ở pha viêm hoặc pha tăng sinh [67,86]

Sinh lý của vết thương

Quá trình làm lành vết thương là một quá trình phức tạp, liên quan đến nhiều sự tương tác của các chất nền ngoại bào, chất trung gian hòa tan, các cytokine, chemokine và nhiều loại tế bào khác nhau Mục đích của việc sửa chữa vết thương là phục hồi sự toàn vẹn của mô bị tổn thương Quá trình này gồm có 4 giai đoạn xen kẽ nhau về thời gian là pha đông máu, pha viêm, pha tăng sinh và pha tái cấu trúc [130]

5

Một số quan điểm khác gộp giai đoạn đông máu và viêm thành pha viêm, và chia quá trình này thành 3 pha xen kẽ với nhau về không gian và thời gian là quá trình viêm, quá trình hình thành mô và tái cấu trúc mô (Hình 1.1) [211]

Hình 1.1 Tiến trình làm lành vết thương

Trong giai đoạn viêm, sau khi tiểu cầu ngưng kết, các loại bạch cầu sẽ thâm nhập vào vết thương, giúp ngăn chặn các vi sinh vật và loại bỏ xác tế bào, làm sạch vết thương, đồng thời tiết ra nhiều cytokine quan trọng trong phản ứng viêm và cả trong giai đoạn tăng sinh sau đó

Trong giai đoạn tăng sinh, mô hạt (granulation tissue - là loại mô liên kết hình thành trên bề mặt các vết thương, mô bao gồm các tế bào biểu mô, đại thực bào và nguyên bào sợi (NBS) cùng với các chất nền như collagen, fibronectin, protein) và biểu mô hình thành, phát triển và dần phủ đầy khu vực bị thương để phục hồi sự toàn vẹn của mô Các phân tử cấu trúc trong chất nền ngoại bào có sự thay đổi mạnh mẽ trong giai đoạn này, chúng được tổng hợp, phân hủy, tái cấu trúc để dần phục hồi lại chức năng của mô bị tổn thương Phản ứng tại vết thương ở mức độ tế bào bao gồm tương tác trực tiếp giữa tế bào - tế bào, tế bào - chất nền và quá trình truyền tín hiệu gián tiếp giữa các quần thể tế bào khác nhau qua các chất trung gian Nhiều yếu tố đã được xác định có liên quan đến quá trình liên lạc giữa biểu mô và các tế bào da để kích thích quá trình làm lành vết thương Sự cân bằng hết sức nhạy cảm giữa các chất

Dòng tế bào đi vào

Nguyên bào sợi

Co mạch

Hình thành cục máu đông

Lắng tụ collagen Liên kết chéo các

6

trung gian kích thích và các chất ức chế trong suốt các giai đoạn khác nhau của quá trình sửa chữa vết thương có vai trò thiết yếu đối với sự cân bằng nội môi của mô sau khi bị thương [108,160]

1.1.2.1 Pha viêm

Hình 1.2 Tiểu cầu giải phóng các yếu tố đông máu tại vết thương

Viêm là giai đoạn đầu tiên của quá trình lành vết thương Ngay sau khi mô bị tổn thương, các mạch máu bị đứt ngay lập tức co lại, các yếu tố đông máu nằm trong lớp

mô liên kết bên dưới biểu mô bị phơi ra không khí Tiểu cầu bị ngưng kết hình thành nên các nút cầm máu ban đầu, đồng thời giải phóng nhiều yếu tố tham gia quá trình đông máu và nhiều cytokine và chemokine tiền viêm, hỗ trợ làm lành vết thương Các yếu tố đông máu hoạt hóa quá trình biến đổi prothrombin thành thrombin, thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo nên các cục đông máu (thrombus) bền vững, dẫn đến sự cầm máu Sự phá hủy tiểu cầu giải phóng ra các chất thu hút các tế bào gây viêm, các chất làm co mạch và chất hoạt hóa các yếu tố cần thiết cho NBS và tế bào biểu mô (Hình 1.2) Cục đông máu và các mô bị tổn thương xung quanh giải phóng

ra các cytokine tiền viêm và yếu tố tăng trưởng như TGF-β (Transforming growth factor-β), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (platelet-derived growth factor - PDGF), yếu tố tăng trưởng NBS (fibroblast growth factor - FGF) và yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor - EGF) [130]

Mạch máu

Sự phơi bày các yếu tố mô

thromboplastic

Nguyên bào sợi

Bạch cầu đơn nhân tại chỗ

Tiểu cầu

Hồng cầu

Biểu bì (thượng bì)

Trung bì

Hạ bì (mô mỡ dưới da)

7

Trong vòng 2 - 3 ngày đầu sau khi bị thương, bạch cầu đơn nhân là loại tế bào chiếm ưu thế trong quần thể tế bào viêm Các bạch cầu đơn nhân được thu hút và thâm nhập vào vết thương, biệt hóa thành đại thực bào (macrophage) và kết hợp với các đại thực bào tại chỗ điều khiển quá trình làm lành vết thương Những tế bào này điều hòa quá trình phục hồi bằng cách tiết ra các yếu tố tăng trưởng, chủ yếu có tác dụng kích thích quá trình di trú và tăng sinh của NBS và các tế bào biểu mô (Hình 1.3) [211] Có đến hơn 20 cytokine và các yếu tố tăng trưởng đã được phát hiện là do đại thực bào tiết ra Việc thiếu hụt bạch cầu đơn nhân và đại thực bào gây ra những biến đổi nghiêm trọng đối với quá trình lành vết thương, bao gồm việc tăng nguy cơ nhiễm trùng, trì hoãn sự tăng trưởng của NBS và giảm sự hình thành mạch mới [211]

Các tế bào sừng (keratinocyte - TBS) cũng tham gia khởi động quá trình gây viêm

Ở người, khi bị kích thích bởi các stress như tổn thương do vật lý, nhiễm khuẩn, nhiệt

độ, hóa chất, TBS tiết ra các chất trung gian như IL-8 và các chemokine (như exotatin), hoặc lectin và galectin Các chất này sẽ tham gia khởi động quá trình viêm [114] Miodovnik và cs (2012) nhận thấy có sự gia tăng mRNA và mức độ biểu hiện của các protein IL-8, TNF-α và phân tử kết dính liên bào ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) khi kích thích dòng TBS ở người HaCaT bằng acid polyinosinic-polycytidylic (poly (I:C) - một chất giả lập tình trạng vết thương) Sự kích thích rất rõ ràng trong khoảng 4-6 giờ đầu và giảm về mức bình thường sau

Tế bào sừng

Neutrophil

Nguyên bào sợi

Hình 1.3 Bạch cầu trung tính xâm nhập vết thương

Trong vòng 24 giờ sau khi bị thương, các bạch cầu trung tính sẽ tràn vào vết thương, dọn dẹp các mảng vụn, tiêu diệt vi sinh vật, tiết các chất thu hút và hoạt hóa bạch cầu đơn nhân và lymphocyte Tế bào sừng sẽ di chuyển khi chất nền tạm thời xuất hiện [211]

8

khoảng 24 giờ [223]

Phản ứng viêm và các tế bào bạch cầu có vai trò rất quan trọng trong quá trình lành vết thương Loại bỏ đại thực bào trong giai đoạn sớm và giai đoạn giữa của quá trình làm lành sẽ gây hậu quả nghiêm trọng đến sự phục hồi vết thương [212] Tuy nhiên, thời gian phản ứng viêm càng ngắn thì vết thương càng nhanh phục hồi, phản ứng viêm vượt mức sẽ làm chậm quá trình làm lành vết thương Theo Koh và DiPietro (2011) thì nếu kiểm soát tốt được vấn đề nhiễm trùng, việc ức chế viêm sẽ làm vết thương lành nhanh hơn Sự giảm thiểu các tế bào gây viêm tại vết thương cũng giúp giảm việc hình thành sẹo Một số trường hợp thực nghiệm đã ghi nhận vết thương lành nhanh hơn khi ức chế một số cytokine tiền viêm như IL-1 [188] Nhiều nghiên cứu đã cho thấy quá trình làm lành vết thương ở giai đoạn bào thai không có phản ứng viêm và không hình thành sẹo [108,188]

Cơ thể sinh vật có khả năng tự điều tiết phản ứng viêm bằng cách tiết ra một số chất ức chế phản ứng viêm thông qua các cơ chế như ức chế đáp ứng, sự tăng sinh của đại thực bào và ức chế sự sản sinh các yếu tố gây viêm Tiêu biểu là protein IL-

10 Interleukin này được tiết ra bởi một số loại tế bào như tế bào T, đại thực bào Ngoài tác dụng chính là kháng viêm, IL-10 còn có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình tăng trưởng và biệt hóa của nhiều loại tế bào khác như lympho T, B, tế bào biểu mô… [227]

hệ thống giá đỡ là các fibrin và fibronectin mới hình thành Các NBS tại chỗ được hoạt hóa và gia tăng quá trình tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phân chia Do đó, trong khoảng 3-5 ngày sau khi bị thương, NBS là loại tế bào chiếm ưu thế (ở trường

ra cũng lắng đọng lên trên lớp fibronectin và lớp giàn đỡ bằng GAG

Có ít nhất 19 loại collagen đã được mô tả Hầu hết các collagen được tổng hợp bởi NBS, chỉ có một số ít được tổng hợp bởi các tế bào biểu mô Trong đó, collagen loại I và III là những dạng collagen sợi chính cấu tạo nên ECM và là protein cấu trúc chủ yếu của da cả ở vết thương và những chỗ bình thường [219] Sự kết hợp các quần thể tế bào mật độ cao chủ yếu gồm tế bào mạch máu, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân

và NBS ở trong một chất nền loãng tạm thời chứa fibronectin, acid hyaluronic và collagen dẫn đến sự tạo thành mô hạt (granulation tissue) [211]

 Sự co vết thương

Sau khi mô hạt hình thành, miệng vết thương hở sẽ từ từ co lại (vết thương hở xảy

ra khi bị thương, bỏng, hoặc vết thương đóng bị nhiễm khuẩn lở ra) Sự co là quá

Hình 1.4 Nguyên bào sợi chiếm ưu thế tại vết thương sau 3-5 ngày

Nguyên bào sợi được hoạt hóa và xuất hiện ở viết thương sau 3-5 ngày, chúng tiết ra các thành phần làm chất nền và các yếu tố tăng trưởng tiếp tục kích thích quá trình lành vết thương Tế bào sừng bắt đầu di trú và bao phủ bề mặt chất nền mới Sự di trú bắt đầu từ rìa vết thương cũng như từ các ổ tế bào biểu mô ở tuyến mô hôi và chân lông ở trung tâm vết thương [211]

10

trình mô da xung quanh bị kéo về phía vết thương theo kiểu tỏa tròn Sự co vết thương làm giảm kích thước vết thương đáng kể mà không cần hình thành mô mới Các thành phần làm lành vết thương sẽ giúp vết thương đóng lại, điều này giúp cho quá trình lành nhanh hơn nhiều so với trường hợp chỉ có sự đóng vết thương nhờ sự biểu mô hóa, đồng thời cũng làm giảm diện tích hình thành sẹo

Khả năng co của vết thương phụ thuộc vào vị trí, diện tích vết thương và khả năng

di chuyển của da Ở người, sự co vết thương lớn nhất ở thân và vùng đáy chậu, thấp nhất ở vùng tận cùng các chi và trung bình ở khu vực đầu và cổ [211] Trong nghiên cứu về làm lành vết thương, thuật ngữ sự co vết thương (wound close/wound contraction) thường chỉ chung mức độ giảm diện tích vết thương, bao gồm cả độ co

do sự kéo dãn mô da và quá trình biểu mô hóa

 Sự biểu mô hóa

Trong vòng vài giờ sau khi bị thương, các TBS ở rìa vết thương thay đổi hình thái Trong các tổn thương ở da, lớp biểu bì dày lên, các tế bào nền (basal cell - lớp tế bào trong cùng của biểu mô) ở rìa vết thương phồng lên và di trú lên trên vùng da bị khuyết (Hình 1.4) Khi những tế bào biểu mô bắt đầu di chuyển, chúng không phân chia cho đến khi sự liên tục của của biểu mô được phục hồi Các tế bào biểu mô mới được cung cấp bởi các tế bào nền ở khu vực gần rìa vết thương Các tế bào biểu mô trải ra và di trú đến phủ lên bề mặt chất nền vết thương thành từng mảng Các glycoprotein bám dính tế bào như tenascin và fibronectin có tác dụng như những

“tuyến đường sắt” để cho việc di chuyển của tế bào biểu mô trên lớp chất nền được thuận lợi hơn Theo sau sự tái thiết lập lớp biểu mô, TBS và NBS tiết ra laminin và collagen type IV để tạo thành màng cơ sở (basement membrane) [219] TBS chuyển thành dạng hình trụ và phân chia khi các lớp phủ của tầng biểu mô được hình thành, dẫn đến sự tái tạo lại màng bảo vệ vết thương chống sự nhiễm khuẩn và mất nước

11

1.1.2.3 Pha tái cấu trúc

Quá trình tái cấu trúc là quá trình phục hồi lại hệ thống chất nền ngoại bào và cấu trúc bên dưới lớp biểu mô mới lành, nhằm khôi phục lại các tính chất ban đầu (độ bền, sức căng, tính đàn hồi, ) của lớp biểu mô tại vị trí vết thương Quá trình này kéo dài từ ngay sau khi vết thương liền miệng đến khoảng 1-2 năm sau đó Sự điều hòa quá trình tái cấu trúc còn chưa được nghiên cứu sâu Đây là quá trình cân bằng giữa tổng hợp, lắng đọng và thoái hóa Trong giai đoạn này, các liên kết chéo giữa collagen được hình thành giúp tăng cường sức căng của vết thương Enzyme lysyl oxidase là enzyme chính trong việc hình thành các liên kết chéo giữa các phân tử collagen [269] Collagenase, gelatinase và stromelysin là các proteinase hoạt động cần có ion kim loại trong chất nền (matrix metalloproteinase - MMP) có tác dụng làm thoái hóa các thành phần của ECM Sự cân bằng giữa quá trình lắng đọng và thoái hóa của collagen có thể được đánh giá phần nào qua hoạt động của các MMP MMP

bị điều hòa bởi các protein ức chế MMP ở

trong mô (tissue inhibitor of matrix

metalloproteinase-TIMP) Một hướng

nghiên cứu đang được quan tâm là xem xét

sự cân bằng giữa MMP - TIMP trong quá

trình tái cấu trúc của vết thương [211]

Cuối cùng, quá trình lành vết thương sẽ

dẫn đến sự hình thành sẹo (Hình 1.5) Sẹo

là cấu trúc thiếu sự tổ chức trong mô so với

các mô bình thường xung quanh, đặc biệt

do sự mất trật tự trong quá trình lắng tụ collagen Các sợi collagen mới được tiết ra bởi NBS xuất hiện sau khoảng 3 ngày sau khi bị thương Sau khi chất nền collagen được hình thành, các gói sợi chặt chẽ sẽ lấp đầy vết thương Sự sắp xếp của collagen tại vị trí bị thương khác hẳn với sự sắp xếp ở các biểu mô thông thường

Trong suốt quá trình tái cấu trúc, vết thương dần dần trở nên bền vững hơn theo thời gian Độ căng của vết thương tăng nhanh trong khoảng 1-8 tuần sau khi bị

Hình 1.5 Sự hình thành sẹo là kết quả của sự lành vết thương

Hình 1.6 Độ căng của vết thương tăng theo thời gian

Các phân tử điều khiển quá trình sửa chữa vết thương

Các yếu tố tăng trưởng có vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa hóa hướng động và quá trình lành vết thương Những yếu tố này chủ yếu có bản chất protein, được giải phóng bởi nhiều loại tế bào khác nhau tại vết thương [160] Chúng có thể tác động theo kiểu tự tiết (autocrine) hoặc cận tiết (paracrine) để kích thích hoặc ức chế sự tổng hợp protein của tế bào tại vị trí vết thương, và có nhiều chức năng xen kẽ nhau (Bảng 1.1) Một số nhóm yếu tố chủ yếu trong quá trình lành vết thương là:

1.1.3.1 TNF-α

TNF-α chủ yếu được tiết ra bởi đại thực bào và bạch cầu trung tính và đóng một vai trò thiết yếu trong phản ứng viêm TNF-α cảm ứng quá trình viêm và có nồng độ tăng lên trong suốt quá trình viêm [61,160] Ở nồng độ thấp, TNF-α thúc đẩy quá trình làm lành vết thương Tuy nhiên, nồng độ cao của TNF-α gây ức chế quá trình

13

biểu mô hóa, cản trở sự tổng hợp alpha-smooth muscle actin (α-SMA) và sự tạo thành NBS - cơ (myofibroblast) [61,125] TNF-α cùng một số cytokine tiền viêm khác như IL1 có tác dụng hoạt hóa yếu tố nhân kappa B1 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), NF-κB1 Sau khi được hoạt hóa, NF-κB1 quay trở lại điều hòa quá trình dịch mã của hàng loạt cytokine và chemokine tiền viêm như TNF-

α, IL-1, IL-6, IL-12, CXCL1, CXCL2, RANTES [74], nồng độ NF-κB1 thường tăng lên trong phản ứng viêm [238,260] Do đó, cùng với các interleukin như IL1, IL6, IL10, TNF-α và NF-κB1 thường được dùng nhưng những marker chỉ thị quan trọng của phản ứng viêm [169,255]

1.1.3.2 Nitric oxide

Nitric oxide (NO) là một phân tử nhỏ được hình thành từ L-arginine trong quá trình viêm nhờ sự xúc tác của 3 dạng đồng phân của nitric oxide synthase (NOS) Dạng cảm ứng được của enzyme này (inducible nitric oxide synthase - iNOS) được tạo thành ở giai đoạn sớm trong quá trình lành vết thương bởi các tế bào viêm, trong

đó chủ yếu là bởi đại thực bào Ở pha tăng sinh sẽ có nhiều loại tế bào tham gia tiết

NO, tuy nhiên, lượng tiết thấp hơn hẳn lượng tiết do đại thực bào thực hiện Hình 1.7 cho thấy tương quan giữa nồng độ NO được giải phóng từ con đường iNOS và các giai đoạn trong quá trình làm lành vết thương

Trong quá trình làm lành vết thương, lượng NO tiết ra gần như tỉ lệ thuận với sự xuất hiện và giảm đi của các tế bào viêm là bạch cầu trung tính và macrophage, trong

đó đặc biệt cao ở pha viêm, đạt đỉnh vào khoảng ngày thứ 3 sau khi bị thương và giảm nhanh sau đó [355] Do đó, NO thường được xem là một phân tử chỉ thị của quá trình viêm Tương tự như phản ứng viêm, việc thiếu hụt hay dư thừa NO đều làm giảm khả năng làm lành của vết thương Ức chế hoạt động của gene iNOS làm chậm quá trình phục hồi vết thương, và bổ sung arginine hoặc NO hỗ trợ quá trình làm lành [355] Tuy nhiên, vì là một gốc tự do nên nếu bị biểu hiện vượt mức, NO sẽ gây độc cho tế bào, phá hoại các phân tử DNA, protein và làm hỏng quá trình làm lành vết thương [91,198,199]

14

Hình 1.7 Các pha của quá trình làm lành vết thương và sự tạo thành NO

Nguồn: Witte và cs, 2002 [355]

1.1.3.3 Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu PDGF

PDGF được giải phóng từ tiểu cầu hạt alpha ngay lập tức sau khi bị thương PDGF thu hút bạch cầu trung tính, đại thực bào và NBS đến vết thương và có vai trò như một tác nhân phân bào (mitogen) mạnh Đại thực bào, tế bào biểu mô và NBS cũng tham gia tiết PDGF PDGF kích thích NBS tổng hợp ECM mới, chủ yếu là các thành phần không có bản chất collagen như các GAG và các protein bám dính PDGF cũng làm tăng số lượng collagenase do NBS tiết ra, do đó, nó có tham gia vào cả quá trình tái cấu trúc vết thương [56,87]

1.1.3.4 Transforming Growth Factor-beta - TGF-β

TGF-β trực tiếp kích thích quá trình tổng hợp collagen và giảm sự phân hủy chất nền của NBS TGF-β được giải phóng từ tiểu cầu và đại thực bào tại vết thương Ngoài ra, TGF-β còn được giải phóng từ NBS và TBS TGF-β là một yếu tố tự tiết,

tự nó kích thích quá trình tổng hợp và tiết của nó TGF-β cũng thực hiện hóa hướng động cho NBS và đại thực bào xâm nhập vết thương [211]

TGF-β là một yếu tố tăng trưởng cho các dạng sợi, gia tăng tốc độ lành vết thương

ở khâu tăng trưởng tổng hợp các chất sợi Chúng có liên quan đến các dạng bệnh lý

xơ hóa ở các hệ cơ quan khác nhau và được cho là yếu tố trong sự hình thành sự dính ruột TGF-β kích thích sự tổng hợp ECM và sự tích lũy, gia tăng sự biểu hiện của

15

integrin, từ đó làm tăng sự tương tác giữa tế bào và chất nền [56,81]

1.1.3.5 Các yếu tố tăng trưởng NBS

Sự hình thành mạch được kích thích bởi các yếu tố tăng trưởng NBS (Fibroblast Growth Factor - FGF) acid và kiềm (FGF-1 hay aFGF và FGF-2 hay bFGF) Tế bào nội biểu mô mạch máu, NBS và đại thực bào tiết ra FGF-1 và FGF2 Các FGF kích thích sự phân chia của tế bào nội biểu mô mạch máu và sự hình thành các mao mạch mới Chúng cũng là yếu tố thu hút tế bào nội biểu mô mạch máu và NBS

1.1.3.6 Yếu tố tăng trưởng nội biểu mô mạch máu

Các yếu tố tăng trưởng nội biểu mô mạch máu (Vascular endothelial growth factor

- VEGF) được tiết bởi nhiều loại tế bào trong quá trình làm lành vết thương, bao gồm NBS, tế bào biểu mô, bạch cầu trung tính, đại thực bào, tiểu cầu và tế bào cơ trơn VEGF có tiềm năng kích thích sự hình thành mạch Nó tác động theo kiểu paracrine

do nó kích thích sự tăng trưởng của tế bào nội biểu mô mạch máu sau khi được tiết

ra từ các tế bào gần đó Sự biểu hiện của nó gia tăng trong điều kiện thiếu oxy, tương

tự như điều kiện tại vết thương VEGF cũng có vai trò hết sức quan trọng đối với quá trình làm lành vết thương Sự thiếu hụt VEGF làm chậm quá trình làm lành vết thương

[59,156].

1.1.3.7 Một số yếu tố khác

Sự biểu mô hóa được kích thích trực tiếp bởi ít nhất 3 yếu tố: Yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidemal growth factor - EGF) và yếu tố tăng trưởng TBS (Keratinocyte growth factor 1 và 2 - KGF1/KGF2) EGF được giải phóng bởi TBS và tác động theo kiểu autocrine, trong khi đó KGF tác động theo kiểu paracrine, các yếu tố KGF do NBS tiết ra nhằm kích thích TBS nguyên phân và biệt hóa

Yếu tố tăng trưởng giống insulin I (insulin-like growth factor I - IGF-I) kích thích

sự tổng hợp collagen ở NBS, đồng thời phối hợp với PDGF và bFGF để kích thích quá trình tăng sinh của NBS INF-γ có tác dụng điều hòa làm giảm sự tổng hợp collagen Các interleukin tham gia các chức năng của tế bào viêm tại vết thương (xem Bảng 1.1)

EGF Tiểu cẩu, đại thực

NBS TBS Di trú, tăng sinh và biệt hóa

HSP70 TBS, fibrolast Tế bào giết tự nhiên

(natural killer) và tế bào trình diện kháng nguyên

Tiền gây viêm, kháng hiện tượng

tự miễn dịch autoimmunity), hoạt hóa miễn dịch bẩm sinh

(anti-IFN-α NBS, lymphocyte NBS, đại thực bào Hoạt hóa đại thực bào, ức chế

tăng sinh của NBS và tổng hợp MMP

IGF-1 NBS, đại thực bào,

huyết thanh

NBS, TBS Tăng sinh, tổng hợp collagen

IL-1α, IL-1β Đại thực bào, bạch

cầu hạt trung tính

Đại thực bào, NBS, TBS Tăng sinh, tổng hợp collagenase,

chemotaxis PDGF-A, -B, -C, -

mô, tế bào cơ trơn mạch máu

Chemotaxis, tăng sinh, tổng hợp collagen, tổng hợp thành mạch máu, co vết thương, ức chế sự ngưng kết của tiểu cầu

TGF-β1, β2, β3 Đại thực bào, tiểu

cầu, NBS, TBS, tế bào biểu mô

Tế bào gây viêm, TBS, NBS

Chemotaxis, tăng sinh, tổng hợp

và cô đọng chất nền, tạo thành mạch máu, giảm sự thoái hóa chất nền ngoại bào do MMP

TGF-α Đại thực bào, tiểu

cầu, TBS

TBS, NBS, tế bào biểu

mô

Vận động, tăng sinh và kích thích

sự biểu hiện của VEGF

TNF-α Đại thực bào, tiểu

cầu, TBS

TBS, đại thực bào, NBS Hoạt hóa sự biểu hiện các yếu tố

tăng trưởng VEGF-A,-B,-C, -D Đại thực bào, TBS,

NBS

Tế bào biểu mô Kích thích tăng trưởng và di trú

của tế bào biểu mô để tạo thành mạch, tăng tính thấm của mạch bạch huyết

17

Chất nền ngoại bào (Extracellular matrix - ECM) là nơi chứa đựng các yếu tố tăng trưởng ở dạng tiềm ẩn trong điều kiện bình thường, không bị tổn thương Khi có sự tổn thương và phá hủy chất nền, các yếu tố tăng trưởng sẽ được hoạt hóa và tham gia quá trình khởi động cũng như làm lành vết thương

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương

Nhiều yếu tố có thể làm giảm quá trình lành vết thương Có thể chia các yếu tố này thành 2 nhóm: nhóm yếu tố tại chỗ (local factor) và nhóm yếu tố cơ thể (systemic factor) Yếu tố tại chỗ là những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp lên các đặc điểm của chính vết thương, ví dụ như tình trạng oxy hóa, nhiễm khuẩn của vết thương Trong khi đó yếu tố cơ thể là trạng thái sức khỏe tổng thể hoặc tình trạng bệnh tật có ảnh hưởng đến khả năng lành vết thương của cá thể Các yếu tố này có mối liên hệ với nhau Yếu

tố cơ thể ảnh hưởng tới quá trình làm lành bao gồm các yếu tố như tuổi tác, dinh dưỡng, tình trạng sử dụng thuốc điều trị, bệnh lý mạn tính như đái tháo đường, béo phì, nhiễm HIV…[130]

1.1.4.1 Oxygen

Oxygen rất quan trọng đối với sự trao đổi chất của tế bào, đặc biệt đối với quá trình cung cấp năng lượng dưới dạng ATP, điều kiện thiết yếu đối với mọi quá trình lành vết thương Nó giúp làm giảm sự nhiễm trùng, kích thích sự hình thành mạch, gia tăng quá trình biệt hóa và di chuyển của TBS, quá trình tái biểu mô hóa, tăng cương sự tăng sinh của NBS và sự tổng hợp collagen, tăng cường quá trình co vết thương Do có sự gián đoạn của mạch máu và nhu cầu cao về oxygen tại vết thương nên vi môi trường tại vết thương giai đoạn đầu sẽ bị thiếu oxy, nhất là tại khu vực bị tổn thương mãn tính Nồng độ oxygen đo qua da ở khu vực tổn thương mãn tính là 5-20mm Hg, so với giá trị của mô thông thường là 30-50mm Hg [130]

1.1.4.2 Sự nhiễm khuẩn

Ngay khi bị thương, vi sinh vật trên da sẽ xâm nhập vào các lớp mô bên dưới Vi sinh vật xâm nhiễm vết thương có thể ở mức độ nhiễm bẩn (contamination - là sự có mặt của các vi sinh vật không nhân đôi tại vết thương) hoặc nhiễm khuẩn tại chỗ (local infection/critical colonization) là tình trạng nhiễm các vi khuẩn nhân đôi tại vết

18

thương, gây ra các phản ứng đáp trả của mô tại vết thương, hoặc nhiễm khuẩn nghiêm trọng với sự sinh sản của vi sinh vật kéo theo sự tổn thương của mô nhiễm khuẩn, thậm chí nhiễm khuẩn vào máu Các vi khuẩn và nội độc tố có thể kéo dài sự duy trì của các cytokine tiền viêm như IL-1 và TNF-α và kéo dài phản ứng viêm, làm tăng nguy cơ viêm mãn tính và làm vết thương không lành được Sự kéo dài phản ứng viêm làm gia tăng sự xuất hiện của các MMP, họ protease này có tác dụng phân giải ECM Kèm với sự gia tăng nồng độ protease là sự phá hủy nhanh chóng các yếu tố tăng trưởng có bản chất protein Các vi khuẩn xâm nhiễm vết thương còn tự tiết ra các polysaccharide ngoại bào tạo thành các màng sinh học (biofilm) giúp gắn giữ

chúng tại vết thương, ngăn cản tác dụng diệt khuẩn của chất kháng sinh S aureus,

P aerugionsa và các β-hemolytic Streptococci là các vi khuẩn chủ yếu gây ra nhiễm

trùng vết thương [130]

1.1.4.3 Tuổi tác

Tuổi tác là một trong những nguyên nhân làm giảm khả năng lành vết thương Các nghiên cứu cho thấy tuổi tác làm chậm thời gian lành vết thương nhưng không ảnh hưởng đến chất lượng quá trình lành vết thương Sự trì hoãn làm lành vết thương liên quan đến những biến đổi trong phản ứng viêm, bao gồm giảm khả năng xâm nhập của bạch cầu, giảm khả năng thực bào của đại thực bào, trì hoãn quá trình tái biểu mô hóa, quá trình tổng hợp collagen [130]

19

vitamin C có vai trò đa năng, thiếu vitamin C làm giảm quá trình lành vết thương, giảm tăng trưởng NBS và sự tổng hợp collagen trong NBS, làm mỏng thành mao mạch, giảm đáp ứng miễn dịch và do đó làm tăng nguy cơ nhiễm trùng [130]

1.1.4.5 Tình trạng sử dụng thuốc điều trị

 Các corticosteroid

Các thuốc kháng viêm tác động toàn thân như các glucocorticoid thường được sử dụng làm các tác nhân kháng viêm trong điều trị Các thuốc này đã được biết rõ có tác dụng ức chế quá trình làm lành vết thương thông qua hiệu ứng kháng viêm toàn thân và ức chế các phản ứng của tế bào tại vết thương, bao gồm cả sự tăng sinh của NBS và sự tổng hợp collagen Các corticosteroid trong cơ thể làm vết thương lành lại với lớp mô hạt chưa hoàn chỉnh và giảm sự co vết thương [116,130] Corticosteroid còn ức chế sự tổng hợp hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1, yếu tố cảm ứng sự thiếu oxy), một trong những yếu tố phiên mã chính của quá trình lành vết thương [342] Các corticosteroid đường hấp thu toàn thân còn làm gia tăng khả năng nhiễm khuẩn Tuy nhiên, đối với vết thương mãn tính, việc điều trị với một liều nhỏ corticosteroid lại làm tăng khả năng làm lành vết thương, giảm đau và giảm dịch rỉ vết thương, ức chế sự hình thành mô hạt quá mức đến 79% số ca điều trị Trước những tác dụng ngược chiều này, việc sử dụng các corticosteroid trong điều trị vết thương cần được xem xét cẩn trọng để hạn chế các tác dụng phụ [144]

 Các loại thuốc kháng viêm không có bản chất steroid

Các thuốc kháng viêm không có bản chấn steroid (Non-Steroid Inflammatory Drus - NSAID) ví dụ như ibuprofen được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm và bệnh thấp khớp và dùng làm thuốc giảm đau Hầu như chưa có dữ liệu nào chứng tỏ được việc sử dụng NSAID trong thời gian ngắn có tác dụng xấu lên tiến trình làm lành vết thương Tuy nhiên, tác dụng phụ của các thuốc này lên quá trình lành vết thương trong một thời gian sử dụng dài vẫn đang là một vấn đề cần xem xét Trên mô hình động vật, việc sử dụng ibuprofen đường hấp thu toàn thân có ảnh hưởng chống tăng sinh trên vết thương với kết quả là làm giảm số lượng NBS, làm yếu sức

Anti-20

căng của da, giảm sự co vết thương, làm chậm sự biểu mô hóa và giảm sự tạo mạch máu [130]

 Các loại thuốc hóa trị liệu khối u

Hầu hết các loại thuốc hóa trị liệu (chemotherapeutic) khối u được thiết kế để ức chế sự trao đổi chất, ức chế phân bào, giảm sự sinh mạch máu mới Do đó, chúng cản trở quá trình lành vết thương [116]

1.1.4.6 Hormone sinh dục

Các hormone sinh dục có mối liên quan nhất định đối với sự lành vết thương ở các độ tuổi khác nhau So sánh giữa nhóm phụ nữ lớn tuổi và nam giới lớn tuổi, nhóm nam giới có thời gian làm lành vết thương dài hơn Một phần nguyên nhân là do estrogen của nữ giới và androgen của nam giới và các dạng tiền chất của chúng có ảnh hưởng khá lớn đến sự lành vết thương Estrogen tác động lên quá trình lành vết thương bằng cách điều hòa hàng loạt gen có liên quan đến quá trình tái tạo, sinh chất nền, ức chế protease, chức năng biểu bì và các gen cơ bản có liên quan đến quá trình viêm Gilliver và cs (2007) đã phát hiện estrogen có thể cải thiện tình trạng giảm khả năng làm lành vết thương do tuổi tác ở phụ nữ, trong khi đó androgen lại tác động theo hướng ngược lại [124]

Bệnh đái tháo đường ảnh hưởng đến hàng trăm triệu người trên khắp thế giới Các

cá nhân bị đái tháo đường có thời gian lành vết thương cấp tính bị kéo dài hơn so với bình thường Nhiều trường hợp chúng còn phát triển thành các vết loét mãn tính ở chân, với tần suất lên đến 15% tổng số bệnh nhân bị đái tháo đường [130]

21

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY THUỐC DÂN GIAN

Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc trên thế giới

Trong số 350.000 loài thực vật đã được xác định cho đến nay, khoảng 35.000 loài được sử dụng cho mục đích y tế và 0,5% trong số đó đã được nghiên cứu thành phần hóa học [9] Hơn 8.000 loài thực vật được biết đến có hiệu quả điều trị bệnh trong khu vực châu Á - Thái Bình Dương, khoảng 10% trong số chúng được sử dụng thường xuyên, phần lớn được thu hái từ tự nhiên [62] Cây thuốc phân bố nhiều nơi trên thế giới, nhưng tập trung nhiều nhất khu vực nhiệt đới Khoảng 25% thành phần của tất

cả các thuốc hiện đại đều có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật [83,90,314] Đối với thuốc kháng khối u và kháng sinh, khoảng 60% các loại thuốc hiện có trên thị trường và hầu hết các loại đang ở giai đoạn thử nghiệm lâm sàng đều

có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu từ thực vật bậc cao [83]

Thảo dược có vai trò quan trọng bậc nhất trong chăm sóc sức khỏe cho con người

từ xa xưa Từ sau chiến tranh thế giới thứ 2, vị trí dẫn đầu này lại thuộc về các loại dược phẩm tổng hợp Tuy nhiên, do dược phẩm tổng hợp gây nhiều tác dụng phụ nên các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược đã dần được ưa chuộng hơn Doanh số bán hàng của các loại thuốc từ thảo mộc đã tăng đáng kể ở Châu Âu từ đầu những năm

1960 Ở Mỹ, các loại thuốc từ thảo mộc đã được cho phép bán như thực phẩm chức năng, dùng bổ sung vào chế độ ăn hàng ngày từ cách đây nhiều năm [142]

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), 80% dân số Châu Phi sử dụng thảo mộc truyền thống trong chăm sóc sức khỏe [328] Tại Mỹ, trong năm 2007, khoảng 38% người trưởng thành và 12% trẻ em sử dụng một số loại hình chữa bệnh của y học cổ truyền, doanh số bán lẻ hàng năm của các sản phẩm thảo dược tại đây được ước tính khoảng 5,1 tỷ USD [151] Ở Ấn Độ, khoảng 960 loài thực vật được sử dụng bởi các ngành công nghiệp dược, trong đó 178 loài được sử dụng với số lượng lớn, vượt 100 tấn mỗi năm Thị trường trên toàn thế giới hàng năm cho những sản phẩm này đạt 60 tỷ USD [151] Theo ước tính, riêng thị trường châu Âu đạt khoảng

7 tỷ USD vào năm 1997 Trong đó, Đức chiếm khoảng 50%, khoảng 3,5 tỉ USD; tiếp theo là Pháp, 1,8 tỷ USD; Ý 700 triệu USD; Vương quốc Anh, 400 triệu USD; Tây

22

Ban Nha 300 triệu USD; Hà Lan, khoảng 100 triệu USD [52,65,213] Mặc dù ngày càng có những tiến bộ to lớn trong y học hiện đại trong những thập kỷ gần đây, nhưng dược liệu truyền thống vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe [72]

Theo (WHO) khoảng 65-80% dân số sống ở các nước đang phát triển sử dụng thực vật như một phương thức chăm sóc sức khỏe cơ bản [40] Tuy nhiên, cho đến nay, tương đối ít các loại thuốc thảo dược đã được đánh giá một cách khoa học để chứng minh sự an toàn, lợi ích tiềm năng và hiệu quả của chúng [90,314]

Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria, Hoa Kỳ và các tổ chức như WHO đã chi các khoản đầu tư đáng kể trong nghiên cứu các loại thuốc thảo dược truyền thống Các ngành công nghiệp cũng đã đầu tư hàng triệu đô la Mỹ cho việc tìm kiếm các loại thuốc thảo mộc có triển vọng và các hợp chất hóa học mới [328] Hàng triệu đô la Mỹ được chi cho nghiên cứu và tiềm kiếm các thuốc mới có nguồn gốc thảo dược [352] Một số lượng lớn các thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện với nhiều loại thảo dược, như

chiết xuất Ginkgo biloba (được sử dụng để điều trị thần kinh trung ương và rối loạn tim mạch) và Hypericum perforatum (sử dụng như thuốc chống trầm cảm) [69]

Y học cổ truyền có lịch sử lâu đời và đã được công nhận bởi chính phủ của các nước trong khu vực Đông Nam Á Trong số 11 thành viên của khu vực Đông Nam

Á, có 5 quốc gia có viện nghiên cứu quốc gia về y học cổ truyền Chính phủ các nước Đông Nam Á đang khuyến khích các bác sĩ làm việc với các thầy thuốc và hỗ trợ việc nghiên cứu về học cổ truyền

Nhiều loài thực vật có giá trị y tế đã được nghiên cứu nhằm phục vụ cho mục đích điều trị bệnh Theo ước tính, có tới hơn 60% phương pháp điều trị ung thư trong thực nghiệm đều dựa trên các sản phẩm tự nhiên Trong 177 loại thuốc đã được phê duyệt trên toàn thế giới trong điều trị ung thư, hơn 70% là dựa trên các sản phẩm tự nhiên hoặc bắt chước tự nhiên, nhiều loại trong số chúng được cải thiện bằng cách kết hợp với hóa chất Từ năm 2005 đến 2007, 13 loại thuốc có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên đã được phê duyệt ở Hoa Kỳ Ngoài ra, trong 252 loại thuốc có tên trong danh

23

mục thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 11% là hoàn toàn có nguồn gốc từ thực vật [151]

Các loại thuốc thảo dược đang đóng một vai trò ngày càng quan trọng trong nền

y học của mỗi quốc gia Tuy nhiên, việc sử dụng các cây thuốc đang đối mặt với rất nhiều vấn đề khó khăn như các cây thuốc có giá trị chưa xác định, được ghi chép và công bố đầy đủ [62] Vì vậy nhu cầu nghiên cứu trong lĩnh vực thuốc thảo dược là rất lớn, những nghiên cứu về chất lượng, độ an toàn, hiệu quả lâm sàng của các cây thuốc được sử dụng thường xuyên là rất cần thiết [151] Thực tế cũng cho thấy số lượng các

đề tài nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thuốc từ thảo dược liên tục gia tăng và

ở mức cao trong nhiều năm gần đây

Theo chiến lược phát triển y học cổ truyền của WHO trong giai đoạn 2014 - 2023, các hoạt động phát triển y học cổ truyền hướng tới ba mục tiêu chiến lược:

- Xây dựng kiến thức cơ sở để quản lý hoạt động của y học cổ truyền thông qua các chính sách quốc gia phù hợp;

- Tăng cường đảm bảo chất lượng, an toàn, sử dụng hợp lý và hiệu quả y học cổ truyền và bổ sung quy định cho các sản phẩm, phương thức thực hiện và các thầy thuốc đang hành nghề;

- Thúc đẩy bảo hiểm y tế toàn dân bằng cách tích hợp các dịch vụ y học cổ truyền

và bổ sung thay thế vào cung cấp dịch vụ y tế và tự chăm sóc sức khỏe [353]

Tài nguyên cây thuốc trên thế giới là rất lớn nhưng không phải là vô hạn, sự tàn phá nhanh chóng thực vật trên diện rộng đã dẫn tới thực trạng là một số cây thuốc tiềm năng đã bị biến mất hoàn toàn Y học hiện đại đang đối đầu với nhiều khó khăn như các bệnh nan y, xuất hiện các bệnh mới, hiện tượng kháng thuốc, tác dụng phụ không mong muốn,… làm cho xu hướng sử dụng thuốc quay về với thiên nhiên, mở

ra tiềm năng ứng dụng cho các loại cây thuốc dân gian Việc bảo tồn và phát triển nền y học dân gian sẽ là một trong những hướng đi rất quan trọng trong công tác bảo

vệ, chăm sóc sức khỏe con người trong tương lai

24

Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm và có địa hình thay đổi liên tục, do đó đã hình thành nên một hệ thống tài nguyên sinh học vô cùng phong phú và

đa dạng Theo ước tính, ở Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật có mạch, trong

đó đã xác định 3.948 loài là cây thuốc Bên cạnh đó còn có hơn 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 200 loài tảo Trong đó, rất nhiều loài đã và đang có triển vọng được sử dụng làm thuốc (Bảng 1.2) [9,17] Hàng trăm cây thuốc đã được khoa học hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng [9]

Bảng 1.2 Thống kê cây thuốc đã biết ở Việt Nam

Nguồn: Nguyễn Thượng Dong và cs (2006) [9]

Trong gần 4000 loài cây thuốc đã biết ở Việt Nam hiện nay, phần lớn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian Số loài được xác minh khoa học về giá trị, cơ chế chữa bệnh (kể cả từ nguồn tài liệu nước ngoài) chỉ chiếm khoảng 20 - 30% Trong khi đó, số liệu thống kê của ngành Y tế gần đây cho biết, mỗi năm ở Việt Nam tiêu

25

thụ từ 30.000 - 50.000 tấn các loài dược liệu khác nhau Trên 2/3 khối lượng này được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm [9]

Việt Nam có nền y học cổ truyền rất phong phú về các cây thuốc, bài thuốc và vị thuốc Một số vị danh y đã dày công sưu tầm, nghiên cứu, biên soạn được một số tài liệu có giá trị rất cao về cây thuốc như “Nam dược thần hiệu” của Tuệ Tĩnh [4], “Hải Thượng y tông tâm lĩnh” của Lê Hữu Trác Sau cách mạng tháng Tám năm 1945, các nhà khoa học Việt Nam có nhiều thuận lợi trong việc sưu tầm, nghiên cứu nguồn tài nguyên cây thuốc và đã cho ra đời hàng loạt các tác phẩm, các công trình nghiên cứu

có giá trị như: “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi (2000), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” - Viện Dược liệu (2003), và đặc biệt là cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi (1999), trong đó mô tả công dụng, thành phần hóa học, nơi sống và thu hái của hơn 3.200 loài cây thuốc, v.v Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các công trình nghiên cứu chuyên sâu về thành phần và vai trò của cây thuốc đã được tiến hành ở Việt Nam và trên khắp thế giới Nhiều nghiên cứu liên quan tới hoạt tính của cây thuốc (kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm, v.v [1,14]) đã mở ra nhiều hướng đi mới cho việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ thảo dược

Nền y học cổ truyền bản địa của cộng đồng các dân tộc ở nước ta là kho tri thức quý báu và hết sức phong phú, đa dạng Tuy nhiên, các tri thức và kinh nghiệm dân tộc thường chỉ được sử dụng và lưu truyền trong một phạm vi hạn hẹp (dân tộc, dòng

họ, gia đình) nên chưa được phát huy để phục vụ cho xã hội và có nguy cơ thất truyền rất cao Do đó, nghiên cứu bảo tồn và phát huy vốn tri thức truyền thống về sử dụng cây thuốc là một nhiệm vụ vô cùng cần thiết và cấp bách Nhiệm vụ này đã được đưa vào nhóm mục tiêu chủ đạo trong Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm

2020 và định hướng đến năm 2030 được phê duyệt tại Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30 tháng 10 năm 2013 của Thủ tướng Chính phủ [22]

Nhận thức được tầm quan trọng này, những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu, bảo tồn và phát huy tri thức y học dân tộc Phạm Hồng Ban và cs (2013) đã