phương pháp họ đã sử dụng hiện đang được sử dụng phổ biếntrong các phòng thí nghiệm tế bào học để phân tích cấu trúcnhiễm sắc thể của một cá nhân, được gọi là nhiễm sắc thể đồkaryotype..
Trang 1BÀI 5 CÁC KỸ THUẬT CHẨN
ĐOÁN DI TRUYỀNMỤC TIÊU:
- Hiểu được một số kỹ thuật cơ bản dùng để chẩn đoán và phân tích di truyền
- Phân tích được một số kỹ thuật dùng để phân tích nhiễm sắc thể
- Phân tích được một số kỹ thuật dùng để phân tích gien
I MỞ ĐẦU
Những tiến bộ trong sinh học phân tử, sinh hóa và các côngnghệ chẩn đoán khác đang thay đổi những giới hạn xét nghiệm
và sàng lọc di truyền Cách đây không lâu, các tài nguyên như cơ
sở dữ liệu DNA được cá nhân hóa và những thử nghiệm ditruyền cá nhân thậm chí còn chưa được nghĩ tới Nhưng ngàynay, với thành công của dự án bộ gien người thì những dự đoán
về dữ liệu thông tin cá nhân của con người sẽ tăng lên
Hiện tại, các trình tự DNA đang được áp dụng để xác định
sự biến đổi di truyền giữa các cá nhân, trong các nhóm dân cư vàtrong hàng trăm loài động vật và thực vật trên khắp thế giới.Nhưng giải trình tự có thể tương đối tốn kém và mất thời gian
Trang 2phải nhận ra rằng lĩnh vực này sẽ tiến bộ nhanh chóng khi các kỹthuật mới được phát hiện và áp dụng Điều này tạo ra một tháchthức liên tục cho các nhà di truyền học Điều đó có nghĩa là tất
cả chúng ta cần cập nhật những tiến bộ mới thường xuyên và liêntục trong lĩnh vực này
II PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Khả năng phát hiện của các kỹ thuật chẩn đoán có liên quanđến bộ gien người phụ thuộc vào nhiều loại thông tin Một số cộtmốc quan trọng trong lịch sử chẩn đoán di truyền được cho trongBảng 1 Chưa có câu trả lời thỏa mãn cho câu hỏi liệu rằng các
kỹ thuật mới sẽ tiếp tục cải thiện chất lượng chẩn đoán Bởi vìcác kỹ thuật thực hiện khác nhau về chi phí, khả năng thực hiện
và chẩn đoán được các bệnh lý di truyền Không một kỹ thuậtnào phù hợp cho tất cả các tình huống trên Hơn nữa, dữ liệugien cũng chỉ là bước đầu tiên trong quá trình xem xét để thựchiện một quy trình chẩn đoán di truyền
III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ
III.1 NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ
Trong một thời gian dài các nhà khoa học cho rằng mỗi tếbào người chứa 48 nhiễm sắc thể cho đến năm 1956, khi Tjio vàLevan kết luận chính xác trên cơ sở nghiên cứu của họ rằng tếbào soma bình thường của người chỉ chứa 46 nhiễm sắc thể Các
Trang 3phương pháp họ đã sử dụng hiện đang được sử dụng phổ biếntrong các phòng thí nghiệm tế bào học để phân tích cấu trúcnhiễm sắc thể của một cá nhân, được gọi là nhiễm sắc thể đồ(karyotype) Thuật ngữ này cũng được sử dụng để mô tả hìnhảnh của một bộ nhiễm sắc thể của một cá nhân, được sắp xếptheo một kỹ thuật xác định.
Nhiễm sắc thể đồ là một kỹ thuật để thu nhận các nhiễmsắc thể trong giai đoạn metaphase của chu kỳ tế bào Các nhiễmsắc thể này được đóng gói chặt chẽ và không hiển thị rõ các dãybăng Ở cấp độ phân giải này, những thay đổi trên nhiễm sắc thể
có thể được xác định là những biến đổi về số lượng nhiễm sắcthể (aneuploidy) hoặc các bất thường về cấu trúc xảy ra trên cácđoạn trình tự lớn Hiện tại, những cải tiến về kỹ thuật tế bào học
đã thu nhận được các nhiễm sắv thể với các băng được biểu thịvới độ phân giải cao hơn (từ 500 – 1000 bands) Đây là độ phângiải mà mắt thường có thể nhìn thấy được bằng kính hiển vi,những thay đổi liên quan đến một số ít gien cũng có thể đượcnhìn thấy Mặc dù các nghiên cứu về nhiễm sắc thể vẫn là mộtcông cụ chính trong chẩn đoán di truyền học nhưng tiện ích tổngthể đang giảm khi các kỹ thuật mới hơn được phát triển
Trang 4Hình 1 Mô hình mô tả độ phân giải của các băng trên nhiễm sắcthể (a) Độ phân giải của băng theo chiều dài của nhiễm sắc thể (b) Bộ nhiễm sắc thể có độ phân giải cao (prometaphase) ở mức
độ phân giải 750 bands (Warren G Sanger PhD, University of Nebraska Medical Center, Omaha, Nebraska)
Chuẩn bị nhiễm sắc thể
Bất kỳ một loại tế bào nào trong cơ thể người có chứa nhântrải qua quá trình phân bào đều có thể được sử dụng để nghiêncứu nhiễm sắc thể Hầu hết các tế bào lympho lưu thông ở máungoại vi thường được sử dụng, mặc dù các mẫu để phân tíchnhiễm sắc thể có thể được chuẩn bị tương đối dễ dàng hơn bằngcách sử dụng tế bào từ mô da, tủy xương, nhung mao hoặc tế bào
ối (trong dịch ối của bào thai)
Trong trường hợp thu tế bào từ máu ngoại vi (tĩnh mạch),
Trang 5mục đích kích thích tế bào lympho T phân chia Các tế bào đượcnuôi cấy trong điều kiện vô trùng ở 37OC trong khoảng 3 ngày,trong thời gian tế bào phân chia thì bổ sung colchicine Thuốcnày có đặc tính cực kỳ hữu ích trong việc ngăn chặn sự hìnhthành của thoi phân bào, do đó ngăn cản sự phân chia tế bào vàdừng lại ở giai đoạn metaphase, thời điểm các nhiễm sắc thểđược ngưng tụ tối đa và do đó có thể nhìn thấy rõ nhất hình tháicủa nhiễm sắc thể Nước muối (hypotonic) sau đó được thêm vào
để gây shock nhược trương nhằm làm vỡ tế bào để thu nhận cácnhiễm sắc thể Các nhiễm sắc thể này sau đó được cố định trênlame và nhuộm màu để phân tích (Hình 2)
Trang 6Hình 2 Quy trình thực hiện thu nhận nhiễm sắc thể đồ từ máu ngoại vi dùng để phân tích và đánh giá một số bất thường trên nhiễm sắc thể.
Band nhiễm sắc thể
Một số phương pháp nhuộm màu khác nhau được sử dụng
để xác định các nhiễm sắc thể riêng lẻ nhưng band G (Giemsa)được sử dụng phổ biến nhất Các nhiễm sắc thể được xử lý bằngtrypsin, làm biến tính protein và sau đó được nhuộm bằng thuốcnhuộm gắn DNA (gọi là Giemsa), để làm cho mỗi nhiễm sắc thể
có một hình thái đặc trưng và tạo ra các band sáng và tối đặctrưng (Hình 3)
Trang 7Band G thường tạo ra bộ nhiễm sắc thể có chất lượng caophân tích cao với khoảng 400 đến 500 band Mỗi dải band trong
số này trung bình khoảng 6.000 đến 8.000 kilobase (kb) (khoảng
6 đến 8 megabases [mb]) của DNA Band có độ phân giải caothường thu ở giai đoạn sớm của quá trình nguyên phân như là kỳđầu hoặc tiền kỳ giữa, thu được nhiễm sắc thể đồ lên tới 800band nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao hơn nhiều Điều này liên quanđến việc ức chế phân chia tế bào đầu tiên với một tác nhân nhưmethotrexate hoặc thymidine Axit folic hoặc deoxycytidineđược thêm vào môi trường nuôi cấy, để phóng thích các tế bàovào trong nguyên phân Colchicine sau đó được thêm vào trongmột khoảng thời gian cụ thể, khi phần lớn tế bào đang dừng lại ởgiai đoạn tiền kỳ giữa và nhiễm sắc thể sẽ chưa hoàn toàn coxoắn cực đại, để tạo ra một dải band chi tiết hơn
Trang 8Hình 3 Một nhiễm sắc thể đồ band G của một người nam bình thường.
Phân tích nhiễm sắc thể đồ
Giai đoạn tiếp là phân tích nhiễm sắc thể, đầu tiên đếm sốlượng nhiễm sắc thể hiện diện trong một số tế bào đặc trưng, đôikhi được gọi là “cụm metaphase” (hình 4), sau đó là phân tíchcẩn thận kiểu hình dải band của từng nhiễm sắc thể trong từng tếbào được chọn
Hình 4 Một cụm metaphase điển hình được nhuộm band G (Mr
A Wilkinson, Cytogenetics Unit, City Hospital, Nottingham,UK)
Kiểu hình dải band của mỗi nhiễm sắc thể rất đặc trưng và
có thể dựa vào kiểu band chuẩn để giúp phân tích kiểu hình của
Trang 9từng nhiễm sắc thể (Hình 4) Tiến hành phân tích từng cặp nhiễmsắc thể tương đồng, bằng cách quan sát trực tiếp dưới kính hiển
vi hoặc sử dụng hệ thống chụp ảnh để chụp ảnh nhiễm sắc thể vàsắp xếp chúng theo một trật tự nhất định được gọi là nhiễm sắcthể đồ (karyogram) (Hình 5)
Trang 10Hình 5 Một nhiễm sắc thể đồ (karyogram) thể hiện kiểu band của từng nhiễm sắc thể được thực hiện bằng nhuộm huỳnh quang
và Giemsa
Trang 11III.2 LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (Fluorescent Situ Hybridization - FISH)
In-Công cụ chẩn đoán này là sự kết hợp giữa di truyền tế bàovới kỹ thuật di truyền phân tử, dựa vào một đoạn trình tự đơnDNA (gọi là đoạn mồi - probe) để bắt cặp với một trình tự bổsung của nhiễm sắc thể ở kỳ giữa, nhân tế bào ở gian kỳ hoặc cácsợi nhiễm sắc thể cô đặc Trong phép lai huỳnh quang tại chỗ(FISH), đoạn mồi DNA được đánh dấu huỳnh quang, sau đóđược lai với mẫu DNA của bệnh nhân, cho phép vùng DNAđược lai có thể được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.FISH đã được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán lâm sàng trong 20năm qua và ngày càng có nhiều loại mồi khác nhau đã được pháttriển
Phân loại đoạn mồi (probe)
Centromeric Probes
Bao gồm các chuỗi DNA lặp đi lặp lại được tìm thấy trong
và xung quanh tâm động của một nhiễm sắc thể cụ thể Ban đầu,các mồi này được sử dụng để chẩn đoán nhanh chóng các trườnghợp lệch bội phổ biến như trisomies 13, 18, 21 (dùng để chẩnđoán trước sinh từ mẫu gai nhau) cho đến khi được thay thế bằngphản ứng chuỗi polymerase định lượng
Trang 12Chromosome-Specific Unique-Sequence Probes
Đây là các loại mồi đặc trưng cho một locus cụ thể mà cóthể được sử dụng để xác định các trường hợp mất đoạn và lặpđoạn (Hình 6)
Hình 6 Hình ảnh metaphase của mẫu dò xác định vùng ELN gây
ra hội chứng William (Vysis), trên nhiễm sắc thể số 7 (7q11.23),cho thấy một mất đoạn có liên quan với hội chứng William.Nhiễm sắc thể bình thường có các tín hiệu đối với mẫu dò kiểm
soát (control probe) (màu xanh lá cây) và mẫu dò gien ELN (màu
cam) nhưng đã bị mất đoạn nhiễm sắc thể nên chỉ còn nhận diệnđược mẫu kiểm soát (Catherine Delmege, Bristol GeneticsLaboratory, Southmead Hospital, Bristol, UK)
Trang 13Whole-Chromosome Paint Probes
Bao gồm một hỗn hợp các loại mẫu dò từ các phần khácnhau của một nhiễm sắc thể cụ thể Khi hỗn hợp các mẫu dò nàyđược sử dụng cùng nhau trong một phép lai, toàn bộ một nhiễmsắc thể được phát huỳnh quang Nhuộm toàn bộ nhiễm sắc thể(chromosome painting) rất hữu ích để xác định sự tái sắp xếpphức tạp của một nhiễm sắc thể, như trong trường hợp chuyểnđoạn (Hình 6) và để xác định nguồn gốc của vật liệu nhiễm sắcthể bổ sung, chẳng hạn như các trường hợp vi chuyển đoạn và đểxác định vùng của nhiễm sắc thể được thêm vào có kích thướcrất nhỏ như trong trường hợp dạng vòng hoặc thêm đoạn
Danh pháp nhiễm sắc thể
Theo quy ước, mỗi nhánh nhiễm sắc thể được chia thànhcác vùng và mỗi vùng được chia thành các dải band, đánh sốluôn luôn từ tâm động ra ngoài (Hình 7) Một điểm nhất địnhtrên nhiễm sắc thể được chỉ định bởi số lượng nhiễm sắc thể, cácnhánh của nhiễm sắc thể được chia làm cánh ngắn (p) và cánhdài (q), vùng và dải band (15q12) Đôi khi, vùng bị bỏ qua, do đó15q12 sẽ được gọi đơn giản là band 12 trên nhánh dài của nhiễmsắc thể 15
Trang 14Hình 7 Nhiễm sắcthể X Mô hình mô tả cấu tạo của một nhiễm sắc thể với cácvùng được chia làm cánh ngắn (Xp), cánh dài (Xq), trên mỗicánh nhiễm sắc thể được chia thành các vùng được đánh số thứ
tự từ tâm động (centromere) ra tận vùng telomere, trên các vùnglại được chia thành các band được đánh số thứ tự trên mỗi vùng.Một hệ thống ký hiệu được sử dụng để mô tả, phân tích và ghi lại các kết quả trên bản nhiễm sắc thể đồ được cho trong bảng sau:
Trang 15Bảng 1 Bản mô tả một số thuật ngữ được sử dụng phổ biến trongnhiễm sắc thể đồ
del Mất đoạn 46,XX,del(1)(q21)
fra Điểm gãy
46,XX,5p-IV CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GIEN
IV.1 Phân tích đa hình đơn nucleotide (Single
Nucleotide Polymorphism - SNP)
SNPs (thường được phát âm là snips) là những khác biệt vềtrình tự của các nucleotide (đa hình) Ước tính có khoảng 10triệu SNP trong bộ gien người Tầm quan trọng của SNPs đượcxem như là các DNA locus maker Mặc dù đúng là một số SNP
Trang 16Các SNP được sử dụng cho các ứng dụng từ việc lập bản
đồ đối với các thành phần di truyền quan trọng nhất cho các tínhtrạng đa gien để cho phép so sánh giữa các mẫu DNA trong cácnghiên cứu pháp y hoặc xét nghiệm huyết thống
IV.2 Array-based Comparative Genomic
Hybridization (CGH)
Trong thập niên 1990, kỹ thuật Comparative GenomicHybridization (CGH) bắt đầu được phát triển Về bản chất kỹthuật này cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho phép đánh giátrên toàn bộ bộ gien tình trạng mất cân bằng của bộ nhiễm sắcthể CGH cũng có hạn chế về độ phân giải, CGH trong giai đoạnnày chỉ cho phép phát hiện các bất thường có kích thước tronggiới hạn 10 – 20 Mb Vào cuối thập niên 1990, kỹ thuật arrayCGH (Array-based Comparative Genomic Hybridization) ra đời
để giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH, vớiarray CGH những bất thường trên nhiễm sắc thể dưới dạng vimất đoạn (microdeletion) hoặc vi nhân đoạn (microduplication)
có thể được phát hiện một cách dễ dàng
Đối với kỹ thuật CGH, mẫu DNA đối chứng (DNA control)được đánh dấu bằng một loại thuốc nhuộm huỳnh quang (màuxanh lá cây) và DNA thử nghiệm được đánh dấu bằng thuốcnhuộm huỳnh quang (màu đỏ) Hai mẫu này sau đó được trộn lẫnvới nhau, khi xuất hiện điểm màu cam là khi nồng độ các mẫuđối chứng và mẫu thử có cùng mật độ gien như nhau Nhưng nếu
Trang 17vùng gien trong mẫu thử khác với mẫu đối chứng, thì sẽ phát racác màu huỳnh quang khác nhau Màu đỏ biểu thị cho sự lặpđoạn và điều này liên quan đến mật độ vượt mức từ mẫu thử,trong khi màu xanh lá cây biểu hiện cho sự mất đoạn DNA trongmẫu thử nghiệm Nói chung, kỹ thuật này cung cấp thông tin bản
đồ bộ gien cụ thể và có thể phát hiện bất kỳ thay đổi nào trong
bộ gien lớn hơn 50 kb hoặc hơn, mặc dù một số ứng dụng của kỹthuật này có thể có độ phân giải từ 100 bp trở xuống
Trang 18Hình 8 Sơ đồ minh họa các bước cơ bản trong kỹ thuật array CGH Kết quả cho thấy một trường hợp bị lặp đoạn (nhân đoạn)
từ mẫu thử nghiệm của bệnh nhân
Trang 19Về mặt thực hành array CGH được chia làm hai loại:
Array có mục tiêu (targeted array): gồm ít đoạn dò, phủtối đa những vùng đã được biết có các gen gây bệnh
Array toàn bộ genome (whole genome array): gồm cácđoạn dò phủ toàn bộ bộ gien
Kết quả trong kỹ thuật array CGH tùy thuộc vào từngtrường hợp cụ thể trong việc sử dụng các đoạn dò, máy quétmicroarray mà sẽ cho ra các kết quả khác nhau
Ví dụ dưới đây minh họa kết quả của một trường hợp phân tích bằng kỹ thuật arrayCGH:
arr cgh 16p11.2(29581455-30106101) x 1
arr cgh: Kết quả được phân tích bằng kỹ thuật array CGH.
16p11.2: Mất đoạn trên band 11.2 (vùng phụ band 2, band 1
của vùng 1) trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 16.
(29581455-30106101) x 1
Cặp base đầu tiên bị mất (hình 9) ở số 29.581.455 tính từ phía trái của nhiễm sắc thể Cặp base cuối cùng của đoạn mất là 30.106.101.
Trang 20Hình 9 Nhiễm sắc thể 16 bị mất đoạn từ cặp base số 29.581.455tính từ phía trái của nhiễm sắc thể đến base số 30.106.101 (vùngmàu đỏ).
IV.3 Gene Sequencing Strategies
Kỹ thuật xác định trình tự DNA (DNA sequencing) của mộtgien được phát triển lần đầu tiên vào đầu những năm 1970 vàphương pháp xác định trình tự DNA được phát triển bởiFrederick Sanger sớm trở thành phương pháp được ưa thích Kỹthuật này được sử dụng để nghiên cứu về gien nhằm phân tíchcác gien lạ, xác định các đột biến và đưa ra các kết luận dựa trênchẩn đoán di truyền học
Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt nhưsau:
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tựvào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tựchuỗi của vị trí này đã được xác định rõ Chuyển thể tức là đưacác vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn đểnhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết
và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự củavector tại vị trí chèn đoạn DNA
Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loạinucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) vàmột lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP:
Trang 21dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loạiddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G) Phản ứng được thựchiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau Bắtđầu từđoạn mồi, men DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào đểtổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và
sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP đượckéo vào thay vì dNTP Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vìddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ
3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi
để dNTP kếtiếp được gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng cócác mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng vớicác vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 10)
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gelpolyacrylamide biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi haycác dNTP bằng đồng vị phóng xạ32P hay 35S thì sau khi điện di,cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người taphát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ cácvạch này giải được trình tự của đoạn DNA