BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Tên bài: ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT PROTEIN

c Kết quả- Khi thực hiện xong thí nghiệm trên, chúng ta thu được 2 kết tủa  Kết tủa 1 thu được khi cho protein trứng tác dụng với muối trung tính NH42SO4 và lắc đều  Kết tủa 2 thu được

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG – Bm Công nghệ Sinh học

o_oOo_o

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

GVBM:

Nhóm 2

Bài số: 1

Tên bài: ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT PROTEIN

Ngày thí nghiệm: 17/08/2018

ĐIỂM

1 Nguyên tắc:

Phản ứng màu Biuret là phản ứng dùng để nhận biết sự có mặt của liên kết peptide trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ Do các protein là các mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide) nên chúng cũng có phản ứng Biuret

Các hợp chất có từ 2 liên kết peptide có thể liên kết với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo ra phức có màu đỏ hoặc tím đỏ đặc trưng Cường độ màu của phức hợp phụ thuộc vào số lượng liên kết peptide trong mạch

2 Cách tiến hành

Ống

nghiệm Biuret Protein trứng NaOH 10% CuSO4 2%

1

Cho vào ống nghiệm vài tinh thể ure, đun nhẹ,

3 Kết quả

Ống nghiệm 1 : Ure tan tạo thành Biuret Sau khi cho dd NaOH 10% và CuSO4

2%, dung dịch chuyển từ trắng trong sang màu đỏ tím

Ống nghiệm 2 : Sau khi cho dd NaOH 10% và CuSO4 2% vào dd protein , dung dịch chuyển sang màu tím xanh

4 Giải thích

Do lượng liên kết peptit ở ống nghiệm 1 chứa biure rất ít nên ống nghiệm 1 chỉ chuyển sang màu đỏ tím

Còn ở ống nghiệm 2, lượng peptit có trong protein trứng vô cùng nhiều nên mới làm ống nghiệm chuyển sang màu tím xanh

5 So sánh với lý thuyết:

Lý thuyết cho thấy rằng cường độ màu của phức hợp phụ thuộc vào số lượng liên kết peptid trong mạch Vì vậy kết quả sau khi thực hành ở cả 2 ống nghiệm xác minh cho lý thuyết trên là đúng

II Các phản ứng kết tủa Protein

1 Kết tủa Protein bằng muối trung tính

a) Nguyên tắc

Các muối trung tính phổ biến nhất thường gây kết tủa protein là các muối kim loại kiềm, kiềm thổ như NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4,… Cùng một muối trung tính nhưng ở các nồng độ khác nhau thì khả năng kết tủa khác nhau

b) Cách tiến hành

Tủa 1

3ml dung dịch protein trứng

+3ml(NH4)2SO4 bão hòa

Cho vào ống nghiệm 1.Lắc

đều

Thu dịch lọc trong

Cho vào ống nghiệm 2.Lắc

đều

Lọc

+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể cho đến khi không

tan nữa

Tủa 2

c) Kết quả

- Khi thực hiện xong thí nghiệm trên, chúng ta thu được 2 kết tủa

 Kết tủa 1 thu được khi cho protein trứng tác dụng với muối trung tính (NH4)2SO4 và lắc đều

 Kết tủa 2 thu được khi cho dịch lọc trong đã thu được sau khi lọc với tinh thể muối (NH4)2SO4, khi lắc lên thì thấy rõ những hạt li ti kết tủa

d) Nhận xét và so sánh với lý thuyết

- Kết tủa 1 là globulin và kết tủa 2 thu được là albumin Đây là 2 loại

protein chính có trong lòng trắng trứng 2 protein này đã bị kết tủa khi cho tác dụng với muối trung hòa (NH4)2SO4 Hiện tượng này chứng minh cho lý thuyết protein có thể bị kết tủa bởi muối trung tính

- Lưu ý: Muối trung tính tạo kết tủa có tính thuận nghịch, vì vậy sau khi

phản ứng kết thúc thì kết tủa có thể quay trở lại bình thường

- Dùng phản ứng tủa thuận nghịch này để chiết protein dưới dạng tinh

khiết, điều chế những sản phẩm men, nội tiết tố Vì trong quá trình, muối kết protein không mất đi các tính chất vật lí, hóa học và sinh học đặc hiệu

e) Giải thích:

 Tại sao khi cho protein tác dụng với muối trung tính thì lại xuất

hiện kết tủa ?

- Vì trong chuỗi protein có các gốc R ưa nước hướng ra ngoài, từ đó phân

tử protein sẽ dễ bị hydrat hóa, từ đó xuất hiện một lớp phân tử nước bao xung quanh, có đầu tích điện âm quay ra ngoài, làm protein ‘tan’ trong nước Khi chúng ta cho muối trung hòa (NH4)2SO4 vào thì thực tế chúng

ta đã cho các ion NH4 + và SO42- vào và các ion này đã lấy đi lớp lớp áo ion- bên ngoài, hay nói đúng hơn là làm bất hoạt cac gốc ưa nước của protein, làm chúng kết tụ lại với nhau để tạo thành kết tủa

 Tại sao kết tủa đầu tiên xuất hiện là globumin mà không phải

là albumin:

- Vì đường kính phân tử globumin lớn hơn so với albumin Các ion NH4+

và SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin hơn, từ đó tạo

ra kết tủa của globumin trước albumin

ta được dung dịch bán bảo hòa albumin Nên khi cho tinh thể (NH4)2SO4

vào tức làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bảo hòa, lúc này albumin có hiện tượng kết tủa

2 Kết tủa protein bằng acid hữu cơ

a) Nguyên tắc:

- Sử dụng acid hữu cơ để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch ở protein

b) Cách tiến hành

2 ống nghiệm chứa mỗi ống 1ml protein

trứng

+ 5 giọt acid sunfolsalisilic ,lắc nhẹ

Ống

+5 giọt TCA 10%, lắc nhẹ

c) Kết quả:

- Ở ống 1 có xuất hiện kết tủa đục

- Ở ống 2 có xuất hiện kết tủa đục nhưng với thời gian nhanh hơn và độ đục nhiều hơn so với ống 1

d) Nhận xét và so sánh với lý thuyết:

- Vì axit Sunfosalisilic có thể kết tủa protein polypeptide và axit amin còn

TCA* chỉ có khả năng kết tủa protein

- Vì axit sunfosasilic là axit mạnh hơn TCA nên sẽ có thời gian nhanh hơn

và độ đục nhiều hơn

- Lưu ý: Sau khi tác dụng với acid hữu cơ, protein đã kết tủa, biến tính và

không thể trở lại trạng thái ban đầu vì acid hữu cơ là tác nhân gây kết tủa

không thuận nghịch

3 Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng

a) Nguyên tắc:

Sử dụng các ion kim loại nặng( hầu hết là nằm trong nhóm chuyển tiếp)

để tác dụng với protein gây kết tủa Thường những phản ứng này xảy ra cực kì nhanh chóng, vì thế có thể ứng dụng vào việc giải độc cho cơ thể khi nhiễm các kim loại nặng như chì, thủy ngân,…

b) Cách tiến hành thí nghiệm :

Cho mỗi ống nghiệm 1ml lòng trắng trứng

Ống

nghiệm

Dung dịch nhỏ vào

hiện kết tủa

1 Pb(CH3COO)2 2% Nhỏ 1 giọt

theo thành ống chờ cho đến khi kết tủa xuất hiện

Cho lượng thừa để xem tủa tan

3

c) Kết quả:

1 Ống 1 xuất hiện kết tủa màu trắng đục, sau đó từ từ tan

2 Ống 2 xuất hiện kết tủa, khi cho thêm vào 1 lượng muối thì kết tủa không tan và tách lớp

3 Ống 3 xuất hiện kết tủa màu vàng nâu, khi cho dư muối thì kết tủa tan nhanh

4 Ống 4 chuyển từ màu xanh trắng sang xanh nhạt do có xuất hiện kết tủa, sau khi cho thêm muối thì kết tủa tan

Ống nghiệm chứa lòng trắng trứng

Sau khi cho dung dịch vào mỗi ống nghiệm

d) Nhận xét và so sánh với lý thuyết:

Các muối kim loại nặng khi tác dụng với protein sẽ tạo thành kết tủa do các ion kim loại nặng làm lộ các đầu kỵ nước của protein ra ngoài và biến tính protein sâu sắc, phá vỡ cấu trúc bậc 2,3 của protein

 Tại sao ion kim loại có hóa trị cao hơn thì làm kết tủa tan nhanh hơn so với ion kim loại có hóa trị thấp hơn ?

- Trả lời:

 Tại sao khi cho dư một lượng muối nhất định thì kết tủa trong ống nghiệm tan ?

- Trả lời: Vì khi bỏ dư lượng muối thì sẽ dẫn đến dư thừa các ion kim loại nặng và kết tủa lại bị tan ra do phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) Ion có hóa trị càng cao thì kết tủa càng dễ tan trở lại

4 Kết tủa protein bằng nhiệt

a) Nguyên tắc:

- Sử dụng nhiệt độ và các chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua đó rút

ra nhiệt độ là một trong những nguyên nhân chính gây kết tủa

b) Cách tiến hành thí nghiệm:

- Bước 1: Lấy 5 ống nghiệm và cho vào mỗi ống 2ml dung dịch protein trứng

- Bước 2:

nghiệm

Protein

trứng

CH 3 COOH 1%

CH 3 COOH 10%

NaOH 10%

NaCl bão hòa

Gia Nhiệt Thứ tự

xuất hiện kết tủa

tủa

tủa

c) Kết quả:

- Ống nghiệm 1 có xuất hiện kết tủa màu trắng, khi dừng đun thì không thấy trở lại trạng thái ban đầu, thời gian xuất hiện lâu hơn ống nghiệm 2,5

- Ống nghiệm 2 có xuất hiện có kết tủa trắng đục, thời gian xuất hiện nhanh hơn ống 1

- Ống nghiệm 3,4 không thấy xuất hiện kết tủa sau khi đun ở 1 khoảng thời gian

- Ống 5 xuất hiện kết tủa sớm nhất, khi lấy ra ngoài 1 thời gian thì không thấy trở lại trạng thái ban đầu

Ống nghiệm trước khi nhỏ dung dịch (chỉ chứa lòng trắng trứng)

Sau khi cho dung dịch và đun sôi

d) Nhận xét và so sánh với lý thuyết

- Ống 1 do có sự tác dụng với nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, các liên kết thứ cấp bị phá vỡ, từ đó protein vón cục không theo 1 quy luật nào tạo thành kết tủa

- Ống 2 có kết tủa trắng đục vì khi cho 1 giọt axit axetic 1% sẽ tạo nên môi trường axit yếu Nhóm -COO- bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện

- Ống 3 khi cho 0.5 ml axit axetic 10% sẽ tạo nên môi trường axit mạnh

Do tính háo nước của axit và môi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- được trung hòa còn các nhóm

NH3+ không được trung hòa Phân tử protein vẫn còn tích điện dương Do

đó không tạo kết tủa

- Ống 4 khi thêm 2 giọt NaOH 10% sẽ gây môi trường kiềm Nhóm NH3+

được trung hòa Vì vậy khi đun sôi điện tử âm cuả tiểu phân tử protein vẫn còn Protein tích điện âm không tạo tủa

- Ống 5 khi cho 5 giọt axit axetic 1% và 2 giọt NaCl bảo hòa sẽ tạo nên môi trường trung hòa về điện, từ đó tạo kết tủa

 Nhiệt độ là tác nhân chính gây biến tính và gây kết tủa ở protein Vì nhiệt độ là tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên khi sử dụng tác nhân này nên cân nhắc kỹ Để tránh làm biến tính protein trong thực phẩm, chúng ta có thể sử dụng các biện pháp xác định nhiệt độ gây biến tính protein

5. Xác định điểm đẳng điện của protein

a) Nguyên tắc:

- Điểm đặc trưng của điểm đẳng điện protein là ở đó protein bị kết tủa lại

Từ đó, chúng ta có thể xác định độ pH cần để gây kết tủa protein hoặc ngược lại Dựa trên 1 thước đo pH đã xác định từ trước, việc xác định điểm đẳng điện có thể giúp protein tránh kết tủa hoặc ngược lại

b) Cách tiến hành thí nghiệm:

Ống

nghiệm

Na2HPO4

0,2M(ml)

Acid citric 0,1M(ml)

pH tương ứng

Lượng dd albumin 1%

(ml)

Rượu ethylic(m l)

Thang độ đục( 1 trong nhất,

4 đục nhất)

- Lấy 4 ống nghiệm bắng nhau(sạch, sấy khô),cho vào mỗi ống nghiệm

dung dịch Na2HPO4và acid citric theo bảng sau,lắc đều rồi cho albumin

vào, thêm cồn, lắc nhẹ Để yên trong 5 phút xuất hiện kết tủa ở các mức

độ khác nhau

c) Nhận xét và so sánh với lý thuyết

- Điểm đẳng điện của protein gần nhất với 4.7 do ở pH 4.7 thì mức độ kết

tủa đạt lớn nhất

- Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức là tổng số điện tích âm và tổng số

điện tích dương của phân tử protein bằng 0, lúc đó, protein sẽ không thể

dễ dàng di chuyển và kết tụ lại với nhau

6 Đông tụ sữa bằng protease

a) Nguyên tắc:

- Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông

tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định

b) Cách tiến hành thí nghiệm:

- Pha dung dịch sữa gầy 10% trong CaCl2 0,01M.

- Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc hoặc ly tâm thu nước trong là dịch enzyme

- Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt

500C

- Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1-0,5ml), lắc đều

- Tiếp tục giữ ở 50 0C, ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào cho đến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế.(dung dịch enzyme cần được chuẩn

bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1-5 phút)

c) Kết quả tính toán:

Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nghiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC

Sau đó cho lượng enzyme (khoảng 0.1 – 0.5ml) vào, lắc đều

Hạt sữa nhỏ trên nền đỏ của nhiệt kế.

d) Nhận xét và so sánh với lý thuyết:

- Protease động tụ sữa là một dạng protease có khả năng tấn công vào vị trí Phe(105)-Met(106) của kappa- casein làm lộ ra các đầu kị nước và dẫn tới hiện tượng động tụ

- Protease được lấy từ thơm chứa enzym bromelin

VS=5ml

T= 11/12 phút

VE= 0.5ml

K=0.2

E = ? ĐV/ml

- Công thức tính: E = Vs∗K T∗Ve = 55∗0.55∗0.2 = 2.1818 ĐV/ml