ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 09/2018 đến tháng
04/2019 tại Trung tâm Kiểm chuẩn Chất lượng Xét nghiệm Y học Đại học YDược TP.HCM.
Dân số mục tiêu
Mẫu máu toàn phần được thu thập tại Trung tâm Truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh, đảm bảo quy trình vô khuẩn và không nhiễm HIV, HBV, HCV, Giang mai và Sốt rét.
Cỡ mẫu nghiên cứu
Để đảm bảo mẫu sản xuất đạt tiêu chuẩn cho chương trình ngoại kiểm truyền máu, mẫu huyết cầu và huyết thanh cần phải có độ đồng nhất và ổn định Điều này phải tuân theo hướng dẫn đánh giá của ISO/IEC 17043:2010 trong từng nhóm nghiên cứu.
- Số mẫu được đánh giá độ đồng nhất: 10 mẫu ngẫu nhiên (ngày 0); Số mẫu được đánh giá độ ổn định: 03 mẫu/thời điểm/nhóm:
+ Đánh giá ngắn hạn: 03 mẫu/mỗi nhóm (ngày 0 – ngày 7): 3 x 01 = 03 mẫu
+ Đánh giá dài hạn (theo dõi tiếp ở các thời điểm 35, 42, 49 ngày: 03 mẫu/thời điểm/nhóm): 3 x 3 thời điểm (ngày 35, 42, 49) = 09 mẫu.
- Như vậy, cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu là: 10 mẫu + 3 mẫu + 9 mẫu 22 mẫu cho mỗi nhóm máu: A, B, AB và O.
- Để thuận tiện trong nghiên cứu và tránh lạc mất mẫu, chúng tôi sản xuất
50 mẫu cho mỗi nhóm: A, B, AB và O.
- Mẫu hồng cầu: 50 mẫu x 4 nhóm = 200 mẫu Mẫu huyết thanh: 50 mẫu x
Tiêu chuẩn chọn mẫu
- Mẫu máu toàn phần âm tính với HIV, HBV, HCV tại Trung tâm Truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy trong thời gian từ tháng 09/2018 đến tháng 04/2019.
- Mẫu máu có Coombs trực tiếp và gián tiếp âm tính.
- Mẫu máu toàn phần thể tích 250-450 mL, chống đông bằng chất CPDA, không bị tán huyết và không vón cục.
- Mẫu máu toàn phần được sản xuất không quá 07 ngày.
- Mẫu máu dương tính với HIV, HBV, HCV, giang mai, sốt rét.
- Mẫu máu có Coombs trực tiếp hoặc gián tiếp dương tính.
- Mẫu máu sử dụng các chất chống đông khác, bị tán huyết hay vón cục.
- Mẫu máu bị nhiễm khuẩn.
- Mẫu máu được sản xuất quá 07 ngày.
- Mẫu máu bị tán huyết sau khi tiến hành rửa 03 lần với NaCl 0,9%.
Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Nghiên cứu sẽ bắt đầu quá trình chọn mẫu và thu thập dữ liệu sau khi nhận được sự chấp thuận từ Hội đồng xét duyệt đề cương và Hội đồng y đức của Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
- Số liệu được thu thập từ các kết quả xét nghiệm trong quá trình theo dõi độ đồng nhất và ổn định của mẫu.
- Số liệu được được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, biểu diễn dưới dạng chỉ số trung bình, độ lệch chuẩn và độ biến thiên.
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 2.1 Máy móc và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
Máy sinh hóa tự động AU400 Beckman USA
Máy huyết học tự động XE5000 Sysmex Nhật Bản
Kính hiển vi điện tử Olympus Philipines
Tủ an toàn sinh học ESCO Singapore
Máy ELISA EXL80 BioTek USA
Máy ly tâm lạnh Eppendorff Đức
Bảng 2.2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao
Tên dụng cụ Nước sản xuất
Cân điện tử Đũa thủy tinh Việt Nam
Bộ dụng cụ đóng gói mẫu (hộp giấy, thùng mốt, ) Việt Nam
Cồn 70 0 Việt Nam Đầu côn vàng có lọc Việt Nam Đầu côn xanh có lọc Việt Nam
Giấy lọc định lượng Nhật
Nước cất 2 lần Việt Nam
Nước muối 0,9% Việt Nam Ống nghiệm 10x75mm USA Ống nghiệm nhựa thóp đáy Việt Nam Ống thủy tinh dán nhãn sẵn, có nắp kín Đức
Pipette nhựa Việt Nam Đĩa petri nhựa Việt Nam
Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử Tên hóa chất, thuốc thử Hãng sản xuất Nước sản xuất
Citric acid: monohydrat Merk Đức
Trisodium citrate-de-hydrate Merk Đức
Natural Agar Nam Khoa Việt Nam
MHA Nam Khoa Việt Nam
Ise High Serum Standard Beckman USA
Ise Low Serum Standard Beckman USA
Ise Mid Standard Beckman USA
Control serum level 1 Beckman USA
Control serum level 2 Beckman USA
Cell pack PK-30L Sysmex Singapore
Anti AB CE Immundiagnostika Đức
Anti AHG – IgG CE Immundiagnostika Đức
Anti D IgG Monoclonal CE Immundiagnostika Đức
Dung dịch LISS CE Immundiagnostika Đức
Phương pháp tiến hành
2.7.1 Chuẩn bị nguyên liệu thô
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ các túi máu toàn phần, hồng cầu lắng và huyết tương từ Ngân hàng máu Bệnh viện Chợ Rẫy, tuân thủ các quy định của Hội đồng y đức Tất cả các mẫu máu đã được sàng lọc âm tính với các bệnh lây truyền qua đường máu như HIV, HCV, HBV, Giang mai và Sốt rét bằng các kỹ thuật đúng quy định Các túi máu được thu thập và sàng lọc trong vòng 07 ngày, đảm bảo không có hiện tượng tiêu huyết hay ngưng kết sau khi ly tâm, cũng như không có kháng thể bất thường trên bề mặt tế bào hồng cầu và huyết tương.
Hình 2.1 Các túi máu làm nguyên liệu sản xuất mẫu Quá trình tách và làm sạch nguyên liệu sản xuất mẫu ngoại kiểm:
Các túi máu toàn phần thuộc nhóm máu A, B, O, AB được xử lý bằng cách quay ly tâm ba lần với tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút để tách huyết cầu và huyết tương Sau đó, huyết cầu được rửa sạch bằng nước muối sinh lý từ 2 đến 3 lần và tiếp tục quay ly tâm.
Quá trình tách huyết tương bao gồm việc quay 2000 vòng/phút trong 5 phút sau mỗi lần rửa để loại bỏ dịch nổi và lớp buffy coat (bạch cầu, tiểu cầu) Sau đó, cần pha huyền dịch hồng cầu 5% trong dung dịch bảo quản hồng cầu, bao gồm các thành phần như axit citric, dextrose, sodium chlorid, trisodium citratedihydrate, neomycine sulfate và chloramphenicol Cuối cùng, hỗn hợp này được trộn đều và phân phối vào các ống nghiệm nhựa vô trùng với thể tích 2mL mỗi ống và đậy kín nắp.
Huyết tương sau khi tách sẽ được chuyển đổi sang huyết thanh theo hướng dẫn của WHO, với việc bổ sung sodium azid Huyết thanh sau đó được phân phối vào các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 2mL và được đậy kín nắp.
Mẫu huyền dịch hồng cầu 5% và mẫu huyết thanh được bảo quản ở nhiệt độ từ 20°C đến 6°C Nhiệt độ tủ lạnh được theo dõi hàng ngày vào hai thời điểm: 9 giờ sáng và 16 giờ chiều.
Hình 2.2 Phân phối mẫu vào các ống nghiệm
Quá trình chuẩn bị hóa chất, thuốc thử:
Dung dịch bảo quản hồng cầu và hóa chất chuyển đổi huyết tương sang huyết thanh được pha chế và bảo quản theo hướng dẫn của WHO, như đã nêu trong phương pháp nghiên cứu Các sinh phẩm định nhóm máu và hiệu giá kháng thể cũng được bảo quản và sử dụng theo đúng chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Hình 2.3 Một số loại hóa chất dùng trong nghiên cứu
Thời gian theo dõi mẫu nghiên cứu:
Mẫu nghiên cứu được kiểm tra để đảm bảo tính đồng nhất ngay từ ngày đầu sản xuất Độ ổn định của mẫu được theo dõi trong suốt chương trình ngoại kiểm tại các thời điểm 0 ngày, 7 ngày, 35 ngày, 42 ngày và 49 ngày.
Phương pháp đo: Hct, Hb, Na + , K + , Lactate, LDH, FHb
Hct và Hb được xác định bằng máy huyết học tự động sử dụng phương pháp tổng trở và laser Nồng độ Na+, K+, Lactate và LDH được đo thông qua hệ thống máy sinh hóa tự động Đặc biệt, FHb được đo bằng phương pháp Human free haemoglobin (f-Hb).
ELISA Kit Tất cả các thông số này được nội kiểm và ngoại kiểm đạt chất lượng theo quy định.
Phương pháp đánh giá vô trùng
Để đảm bảo độ vô trùng của các mẫu hồng cầu và huyết thanh, 10 microlit mẫu được cấy lên thạch MHA và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 14 ngày Kết quả sẽ được theo dõi và đọc sau thời gian 14 ngày.
Phương pháp đo độ đặc hiệu của kháng nguyên, hiệu giá kháng thể Độ đặc hiệu của kháng nguyên được thực hiện trực tiếp với Anti A, Anti
B, Anti AB Hiệu giá kháng thể bằng cách pha loãng huyết thanh và cho phản ứng với hồng cầu mẫu tương ứng Chi tiết được thể hiện trong phụ lục đính kèm
Hình 2.4 Hiệu giá kháng thể tự nhiên trong huyết thanh
Hình 2.5 Hình thái hồng cầu quan sát trên kính hiển vi vật kính 40x (ngày 0)
2.7.2 Kiểm tra nguyên liệu đầu vào
Nguyên liệu đầu vào phải thỏa mãn các điều kiện đã nêu trong tiêu chuẩn mẫu được chọn vào nghiên cứu.
2.7.3 Chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh
2.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch Kaolin
- Hòa tan 10 g CaCl2.2H2O và 1 g MgCl2.6H2O trong 400 mL nước cất.
- Thêm 5 g Kaolin và bổ sung nước đến 100 mL.
- Bảo quản ở 4 o C cho đến khi sử dụng [36].
2.2.2.2 Chuyển đổi thành “huyết thanh”
- Rã đông huyết tương ở nhiệt độ phòng.
- Đong thể tích của huyết tương cho vào cốc thủy tinh sạch.
- Đặt cốc vào nồi cách thủy 37 o C để huyết tương nóng lên.
- Khuấy huyết tương, thêm 01 mL dung dịch Kaolin hỗn hợp trên mỗi 100 mL huyết tương, cộng thêm 0,1 gam sodium azid trên 100 mL huyết tương.
- Khi cục máu đông đã hình thành, tiếp tục khuấy trong khoảng một giờ.
- Đậy cốc và bảo quản ở 4oC qua đêm.
Đậy nắp cốc sạch bằng vải muslin và sử dụng dây cao su để lọc huyết thanh, giúp tối ưu hóa lượng huyết thanh thu được từ các cục máu đông.
Dung dịch bảo quản hồng cầu trong phòng xét nghiệm:
- Hòa tan axit citric monohydrat (0,5g), dextrose (19g), natri clorua (4,2g) và trisodium citrate (8g) trong 600 mL nước khử ion hoặc nước cất.
- Thêm cloramphenicol (0,33g) và neomycin sulphate (0,5g), trộn đều.
- Bổ sung vừa đủ 1000 mL bằng nước khử ion hoặc nước cất nhiều hơn. 2.2.4 Pha dịch treo hồng cầu 5% (huyền dịch hồng cầu 5%)
- Đưa dung dịch bảo quản (Alsever) về nhiệt độ phòng trước khi làm xét nghiệm.
- Lấy hồng cầu của các nhóm máu cho vào các ống nghiệm sạch.
- Cho dung dịch nước muối 0,9 %; lắc đều, ly tâm, sau đó loại bỏ những gạn nổi trên bề mặt hồng cầu (rửa 3 lần).
- Bơm 95 mL dung dịch bảo quản Alsever vào ống nghiệm vô trùng.
- Thêm 5 mL khối hồng cầu đã rửa vào ống nghiệm, lắc trộn nhẹ nhàng.
Ta có dung dịch treo hồng cầu 5% trong dung dịch chất bảo quản [36].
Ghi nhãn cho các ống nghiệm, sau đó lần lượt phân phối vào các ống nghiệm kín, khô, sạch, vô khuẩn:
- Dịch treo hồng cầu 5 %: mỗi ống 2mL, đậy kín nắp.
- Huyết thanh: mỗi ống 2 mL, đậy kín nắp.
2.2.6 Đánh giá độ đồng nhất của các mẫu
Lấy ngẫu nhiên 10 mẫu theo từng lô và đánh giá các thông số kiểm tra độ đồng nhất [21].
2.2.6.2 Mẫu hồng cầu Độ đồng nhất được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn Châu Âu và FDA Hoa
Kỳ, với độ biến thiên giữa các mẫu CV < 3,0 % được xem là ổn định Mức độ tiêu huyết được chia làm 4 cấp độ:
- Mức 0: không tiêu huyết (FHb < 500 mg/L)
- Mức 1: tiêu huyết nhẹ (500 mg/L ≤ FHb < 1000 mg/L)
- Mức 2: tiêu huyết trung bình (1000 mg/L ≤ FHb < 2000 mg/L)
- Mức 3: tiêu huyết nghiêm trọng (FHb ≥ 2000 mg/L)
Nếu tình trạng tiêu huyết của bất kỳ mẫu nghiên cứu nào vượt quá mức 2, thì mẫu xem như không đạt và không tham gia vào thử nghiệm.
Bên cạnh đó, một số chỉ số khác cũng được theo dõi độ đồng nhất mẫu như: thể tích, kháng nguyên, RBC, Hct, Hb, Na+, K+, Lactate, LDH [21].
2.2.6.3 Mẫu huyết thanh Độ đồng nhất được đánh giá dựa vào mức độ ngưng kết của kháng nguyên (Hồng cầu mẫu) và kháng thể trong huyết thanh, yêu cầu mức độ ngưng kết 4+ (12 điểm) ở ngày 0 Và hiệu giá kháng thể theo quy trình của bộ y tế, nồng độ pha loãng (+) 16-32 [21].
2.2.7 Đánh giá mức độ vô trùng
Kiểm tra vô trùng bằng cách cấy mẫu huyết thanh và hồng cầu trên thạch thường Thực hiện bằng cách cho 10 µL huyết thanh và 10 µL huyền dịch hồng cầu 5% vào ống môi trường thạch thường Đặt ống vào tủ ấm ở 37°C để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn Theo dõi và ghi nhận kết quả hàng ngày cho đến ngày thứ 14.
Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C ± 2°C, và nhiệt độ của tủ lạnh được kiểm tra hai lần mỗi ngày vào lúc 9 giờ sáng và 16 giờ chiều bằng nhiệt kế đặt trong tủ lạnh.
2.7.9 Đánh giá độ ổn định Đánh giá độ ổn định của mẫu trong điều kiện ngắn hạn và dài hạn theo hướng dẫn của ISO/IEC 17043:2010. Đánh giá ngắn hạn: Theo dõi mẫu từ ngày sản xuất (ngày 0) đến ngày 07 đặt trong điều kiện 2-6oC tại PXN, và mẫu được đặt trong điều kiện vận chuyển đến các đơn vị tham gia ngoại kiểm (nhiệt độ được duy trì trong khoảng từ 2- 10oC). Đánh giá dài hạn: Theo dõi mẫu từ ngày sản xuất (ngày 0) đến ngày thứ
49 đặt trong điều kiện 2 0C – 6 0C tại PXN.
Mẫu đánh giá độ ổn định được chọn ngẫu nhiên 03 mẫu từ mỗi lô mẫu, được phân tích các thông số:
- Mẫu hồng cầu: Kháng nguyên (Antigen), RBC, Hct, Hb, Na+, K+, Lactate, LDH vào các ngày 7, 35, 42 và 49.
- Mẫu huyết thanh: Mức độ ngưng kết của KN- KT và nồng độ kháng thể.
Kết quả sẽ được so sánh với kết quả đánh giá độ đồng nhất ban đầu (ngày
0) Sử dụng phần mềm Stata và phép kiểm định t - test với độ tin cậy 95 % để đánh giá độ ổn định, kết quả xác định theo giá trị “p”.
Giá trị p Giá trị trung bình các nhóm so với mẫu tại trung tâm p ≤ 0,05 Có sự khác biệt giữa các thời điểm, mẫu không ổn định
P > 0,05 Không có sự khác biệt giữa các thời điểm, mẫu ổn định
2.7.10 Xử lí mẫu nghiên cứu
Các mẫu nghiên cứu được xử lý như các mẫu theo quy trình xử lý mẫu thường quy.
Kiểm soát sai số
2.8.1 Kiểm soát sai lệch thông tin mẫu nghiên cứu Để hạn chế sai lệch thông tin của các mẫu nghiên cứu, các mẫu được dán nhãn và ghi đầy đủ thông tin của lô mẫu: tên và số thứ tự mẫu, ngày sản xuất, nhiệt độ bảo quản Tất cả các thông tin và số liệu nghiên cứu được lưu bằng phần mềm Excel để tiện cho việc tra cứu, cập nhật, phân tích tránh nhầm lẫn, mất thông tin nghiên cứu.
2.8.2 Kiểm soát sai lệch trong bảo quản mẫu
Mẫu nghiên cứu sau khi sản xuất cần được bảo quản ở nhiệt độ 2-6oC, với tủ lưu trữ luôn duy trì trong khoảng này Việc theo dõi nhiệt độ tủ lạnh được thực hiện hàng ngày bằng cách sử dụng nhiệt kế, ghi nhận kết quả vào 9 giờ sáng và 16 giờ chiều Nếu phát hiện sự không phù hợp, cần ghi nhận và điều chỉnh kịp thời để đảm bảo nhiệt độ bảo quản theo yêu cầu.
2.8.3 Kiểm soát sai lệch kết quả phân tích mẫu
Các trang thiết bị và máy móc xét nghiệm được bảo trì và bảo dưỡng định kỳ theo quy định, đảm bảo hiệu suất hoạt động tối ưu Hằng ngày, các xét nghiệm đều được thực hiện nội kiểm tra chất lượng nhằm đảm bảo độ chính xác cao cho kết quả xét nghiệm.
KẾT QUẢ
Kết quả sản xuất mẫu hồng cầu
Chúng tôi sản xuất 200 mẫu hồng cầu, chia thành 4 nhóm máu: A, B, AB và O, theo phương pháp đã trình bày Mỗi nhóm máu bao gồm 50 mẫu nghiên cứu.
50 mẫu hồng cầu A 5 % treo trong dung dịch bảo quản;
50 mẫu hồng cầu B 5 % treo trong dung dịch bảo quản;
50 mẫu hồng cầu AB 5 % treo trong dung dịch bảo quản;
50 mẫu hồng cầu O 5 % treo trong dung dịch bảo quản.
Các mẫu nghiên cứu được bảo quản ở nhiệt độ 2 0 C – 6 0 C trong thời gian từ 0 đến 49 ngày.
Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu hồng cầu
Kết quả cho thấy, A – antigen đạt 12 điểm; số lượng trung bình của hồng cầu giữa các mẫu là 502 ± 9,19 (103/uL); Nồng độ Hct 4,9 ±0,08 (%); Nồng độ Hb 1,48 ± 0,06 (g/dL); Na+ 145 ± 1.15 (mmol/l); K+ 4,01±0,17
(mmol/l); LDH 209 ± 3,22 (U/L); Lactate 6,16 ±0,3 (mg/dL); FHb 0,008 ± 0,001 (mg/L) Độ biến thiên giữa các mẫu CV% dao động trong khoảng 0,015
Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất nhóm A
Kết quả cho thấy: B – antigen đạt 12 điểm; số lượng HC trung bình là 492 ± 12,3 (103/uL); Hct 4,83 ± 0,08 (%); Nồng độ Hb 1,43 ± 0,09 (g/dL); Na+ 143,4 ± 2,63 (mmol/l); K+ 4,89 ± 0,13 (mmol/L); LDH 209 ± 3,4 (U/L); Lactate 6,08 ± 0,11
(mg/dL); FHb 0,003 ± 0,001 (mg/L) CV% từ 0,016 % đến 0,222 % (< 3,0%).
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ đồng nhất nhóm B
Kết quả cho thấy: AB – antigen đạt 12 điểm; Số lượng HC trung bình là
499 ± 11 (103/uL); Hct 4,89 ±0,09 (%); Hb 1,46 ±0,07 (g/dL); Na+ 147,6 ± 2,37 (mmol/L); K+ 4,0 ±0,18 (mmol/L); LDH 209,4 ± 4,12 (U/L); Lactate 6,24 ± 0,32 (mg/dL); FHb 0,004 ± 0,001 (mg/L) CV% dao động trong khoảng 0,016 % đến 0,14 % (< 3,0%).
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ đồng nhất nhóm AB
NHÓM AB (n) MEAN SD CV%
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ đồng nhất nhóm O
Kết quả cho thấy, số lượng trung bình của hồng cầu giữa các mẫu là
496 ±7 (103/uL); Nồng độ Hct 4,87 ±0,08 (%); Nồng độ Hb 1,45 ±0,05
(g/dL); Na+ 145,6 ±1,71(mmol/L); K+ 3,99 ±0,16 (mmol/L); LDH 209,5 ±2,45 (U/L); Lactate 6,16 ±0,3 (mg/dL); FHb 0,001 ±0,000 (mg/L) Độ biến thiên giữa các mẫu CV% dao động trong khoảng 0,012% đến 0,111% ( A > AB > B; CV% của Hct tốt giảm dần từ O = A > B > AB; và CV% của Hb tốt giảm dần từ O > A.
CV% của Na+ giảm dần theo thứ tự A > O > AB > B Đối với K+, CV% tốt nhất là B, sau đó là O, A và cuối cùng là AB Về LDH, CV% tốt nhất là O, tiếp theo là A, B và AB Cuối cùng, CV% của Lactate giảm dần từ B đến O = A và sau đó là AB.
Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu hồng cầu
Trong nghiên cứu về hồng cầu nhóm A, kết quả cho thấy mẫu lưu trữ trong điều kiện vận chuyển (7VC) có sự biến động so với mẫu lưu trữ lý tưởng (7LT) Cụ thể, các chỉ số p cho A-antigen là 1, RBC là 0,573, Hct là 0,46, Hb là 0,573, K+ là 0,617, LDH là 0,17, và Lactate là 0,301, tất cả đều có p > 0,05 Tuy nhiên, chỉ số Na+ lại có p = 0,006, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu hồng cầu nhóm A
NHÓM A (n=3) Ngày MEAN SD CV% P
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu hồng cầu nhóm B
NHÓM B (n=3) Ngày MEAN SD CV% P
Trong nghiên cứu về hồng cầu nhóm B, kết quả cho thấy rằng mẫu được bảo quản trong điều kiện lý tưởng có sự khác biệt đáng kể so với mẫu trong điều kiện vận chuyển Cụ thể, chỉ số p của B-antigen là 1, RBC là 0,417, Hct là 0,357, Hb là 0,595, Na+ là 0,052, K+ là 0,208, LDH là 0,741, và Lactate là 1, tất cả đều cho thấy p > 0,05.
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu hồng cầu nhóm AB
NHÓM AB (n=3) Ngày MEAN SD CV% P
Trong nghiên cứu về hồng cầu nhóm AB, kết quả cho thấy rằng mẫu lưu trữ trong điều kiện vận chuyển có sự biến động so với mẫu lưu trữ lý tưởng, với các chỉ số p cụ thể: A, B - antigen có p = 1; RBC có p = 1; Hct có p = 0,197; Hb có p = 1; Na+ có p = 0,669; K+ có p = 0,225; LDH có p = 0,514; Lactate có p = 0,637, tất cả đều có p > 0,05.
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu hồng cầu nhóm O
NHÓM O (n=3) Ngày MEAN SD CV% P
Trong nghiên cứu về hồng cầu nhóm O, kết quả cho thấy mẫu hồng cầu bảo quản trong điều kiện vận chuyển có sự biến động so với mẫu lưu trữ lý tưởng Cụ thể, chỉ số p của RBC là 0,529, Hct là 1, Hb là 0,435 và Lactate là 0,184, tất cả đều có p > 0,05 Tuy nhiên, các chỉ số Na+ với p = 0,033, K+ với p = 0,034 và LDH với p = 0,006 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu hồng cầu
Nghiên cứu về hồng cầu nhóm A từ ngày 0 đến ngày 49 cho thấy sự biến động rõ rệt ở các thông số theo dõi Cụ thể, A – antigen đạt 12 điểm; số lượng hồng cầu trung bình giảm từ 502 xuống 453 (103/uL); nồng độ Hct giảm từ 4,9% xuống 4,6%; nồng độ Hb cũng giảm từ 1,48 g/dL xuống 1,2 g/dL; và nồng độ Na+ giảm từ 145 xuống 118,67.
(mmol/l); K+ tăng 4,01 – 7,7 (mmol/l); LDH tăng 209 - 290 (U/L); Lactate tăng 6,16 - 10,4 (mg/dL) Độ biến thiên giữa các mẫu CV % dao động trong khoảng 0,004 % đến 0,079 % (< 3,0 %)
Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu hồng cầu nhóm A
NHÓM A (n=3) Ngày MEAN SD CV% p
Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu hồng cầu nhóm B
NHÓM B (n=3) Ngày MEAN SD CV % p
Trong nghiên cứu về hồng cầu nhóm B từ ngày 0 đến ngày 49, có sự biến động rõ rệt ở các thông số được theo dõi Cụ thể, A – antigen đạt 12 điểm, số lượng hồng cầu trung bình giảm từ 492 xuống 453,33 (103/uL), nồng độ Hct giảm từ 4,83 xuống 4,6 (%), và nồng độ Hb giảm từ 1,43 xuống 1,2 (g/dL) Nồng độ Na+ giảm từ 143,4 xuống 118,33 (mmol/l), trong khi nồng độ K+ tăng từ 4,89 lên 7,83 (mmol/l) Ngoài ra, LDH tăng từ 209 lên 286 (U/L) và lactate tăng từ 6,08 lên 10,77 (mg/dL) Độ biến thiên giữa các mẫu CV % dao động trong khoảng 0,006 % đến 0,032 % (< 3,0 %).
Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu hồng cầu nhóm AB
NHÓM AB (n=3) Ngày MEAN SD CV% p
Nghiên cứu trên hồng cầu nhóm AB từ ngày 0 đến ngày 49 cho thấy sự biến động rõ rệt ở các thông số theo dõi Cụ thể, điểm số A,B – antigen đạt 12 điểm; số lượng hồng cầu giảm từ 499 xuống 416 (103/uL); nồng độ Hct giảm từ 4,89% xuống 4,03%; nồng độ Hb giảm từ 1,46 g/dL xuống 1,2 g/dL; nồng độ Na+ giảm từ 147,6 xuống 116,33 (mmol/l); K+ tăng từ 4,0 lên 7,93 (mmol/l); LDH tăng từ 209,4 lên 289,67 (U/L); và lactate tăng từ 6,24 lên 13,43 (mg/dL) Độ biến thiên giữa các mẫu CV% dao động từ 0,005% đến 0,038% (< 3,0%).
Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu hồng cầu nhóm O
NHÓM O (n=3) Ngày MEAN SD CV% p
Nghiên cứu về hồng cầu nhóm O từ ngày 0 đến ngày 49 cho thấy sự biến động rõ rệt ở các thông số sinh hóa Số lượng hồng cầu trung bình giảm từ 496 xuống 403 (103/uL), nồng độ Hct giảm từ 4,87% xuống 4,00%, và nồng độ Hb giảm từ 1,45 g/dL xuống 1,13 g/dL Trong khi đó, nồng độ Na+ giảm từ 145,6 mmol/l xuống 115,33 mmol/l, và nồng độ K+ tăng từ 3,99 mmol/l lên 7,7 mmol/l Các chỉ số LDH và Lactate cũng có xu hướng tăng, với LDH từ 209,5 U/L tăng lên 282 U/L và Lactate từ 6,16 mg/dL lên 10 mg/dL Độ biến thiên giữa các mẫu CV % dao động từ 0,005% đến 0,05%, vẫn nằm dưới ngưỡng 3,0%.
Kết quả so sánh độ ổn định dài hạn của mẫu hồng cầu
Bảng 3.14 Kết quả độ ổn định dài hạn của mẫu hồng cầu 4 nhóm
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả mẫu trong 4 nhóm đều duy trì độ ổn định ở các đặc tính quan trọng như Antigen, RBC, Hct, Hb và nồng độ Na+, K+, Lactate, LDH Đặc biệt, Antigen trong mẫu từ ngày 0 đến ngày 49 giữ ổn định tốt với mức 12 điểm Kiểm định t-test cho thấy độ ổn định của mẫu qua các giai đoạn với p > 0,05, đồng thời số lượng HC ổn định trong 35 ngày (p > 0,05).
49 số lượng HC giảm khoảng 10% so với ngày 0 Tương tự, nồng độ Hct và
Hb cũng duy trì ổn định từ ngày 0 đến ngày 35, đến ngày 49 mẫu không còn đạt độ ổn định
Nồng độ Na+ giảm xuống theo thời gian bảo quản (0 – 49 ngày): (145 mmol/L - 118,67 mmo/L) K+ tăng từ 4,01 mmol/L – 7,70 mmol/L LDH tăng từ 209 mmol/L – 290 mmol/L Lactate cũng tăng cao từ 6,16 mmol/L - 10,40 mmol/L.
Kết quả đánh giá độ vô trùng mẫu hồng cầu
Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ vô trùng mẫu hồng cầu
Nhóm A Nhóm B Nhóm AB Nhóm O
1 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
2 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
3 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Tất cả các mẫu hồng cầu khi cấy trên môi trường MHA ủ 370C đều không có vi khuẩn mọc theo dõi trong thời gian 14 ngày.
Kết quả khảo sát hình thái hồng cầu
Trải dung dịch mẫu hồng cầu lên phiến kính và quan sát dưới kính hiển vi để nhận diện hình thái của hồng cầu, bao gồm hồng cầu tròn, màng hồng cầu nguyên vẹn và các hồng cầu đứng rời rạc.
Hình 3.2 Hình thái hồng cầu (ngày 0)
Kết quả sản xuất mẫu huyết thanh
- Mẫu huyết thanh của 4 nhóm: Nhóm máu A, Nhóm máu B, Nhóm máu AB, Nhóm máu O được sản xuất theo phương pháp đã trình bày Kết quả:
- Các mẫu nghiên cứu được bảo quản ở nhiệt độ 2 0C – 6 0C trong thời gian từ 0 đến 49 ngày
Hình 3.3 Đóng gói mẫu ngoại kiểm truyền máu
Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết thanh
Sau khi sản xuất, mẫu huyết thanh sẽ được đánh giá độ đồng nhất bằng cách lấy ngẫu nhiên 10 mẫu từ mỗi lô, mỗi mẫu có thể tích 2mL Mức độ ngưng kết của kháng thể nhóm máu trong huyết thanh sẽ được kiểm tra với hồng cầu mẫu tương ứng Đồng thời, hiệu giá kháng thể tự nhiên nhóm máu cũng sẽ được kiểm tra bằng cách pha loãng mẫu huyết thanh trong nước muối sinh lý từ ống 0 đến ống 12 và thực hiện phản ứng với hồng cầu mẫu tương ứng Kết quả của các thử nghiệm này sẽ được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.16 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết thanh
Anti B Score Nồng độ KT
Anti A Score Nồng độ KT
Anti AB Score Nồng độ
Kết quả đánh giá cho thấy, tất cả mẫu huyết thanh từ các nhóm A, B và O đều thể hiện hoạt độ kháng thể mạnh, với mức ngưng kết hồng cầu đạt 4+ (12 điểm) và nồng độ kháng thể đồng nhất ở mức 32.
Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn mẫu huyết thanh
Bảng 3.17 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn của mẫu huyết thanh
Anti B Score Nồng độ KT
Anti A Score Nồng độ KT
Anti AB Score Nồng độ KT
Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn cho thấy tất cả mẫu huyết thanh từ các nhóm A, B và O đều có hoạt độ kháng thể mạnh, ngưng kết với hồng cầu tương ứng ở mức 4+ (12 điểm) Nồng độ kháng thể trong các mẫu này đều đạt mức 32.
Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu huyết thanh
Kết quả đánh giá độ ổn định từ ngày 0 đến ngày 49 cho thấy tất cả mẫu huyết thanh ở các nhóm A, B và O đều có hoạt độ kháng thể mạnh, ngưng kết với hồng cầu tương ứng đạt mức 4+ (12 điểm) và nồng độ kháng thể đều ở mức 32.
Bảng 3.18 Bảng kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu huyết thanh nhóm A
Bảng 3.19 Bảng kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu huyết thanh nhóm B
Bảng 3.20 Bảng kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn mẫu huyết thanh nhóm O
Kết quả đánh giá độ vô trùng mẫu huyết thanh
Bảng 3.21 Kết quả đánh giá độ vô trùng của mẫu huyết thanh 4 nhóm A,
Nhóm A Nhóm B Nhóm AB Nhóm O
1 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
2 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
3 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Tất cả các mẫu huyết thanh khi cấy trên môi trường thạch MHA ủ 37 o C trong 14 ngày đều quan sát không thấy có vi khuẩn mọc.
BÀN LUẬN
Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm truyền máu
Hình 4.1 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm truyền máu hoàn thiện
(xem chi tiết phần Phụ lục) [22], [23], [29], [36]
Độ đồng nhất của mẫu hồng cầu
Mẫu hồng cầu trong các chương trình ngoại kiểm phải đảm bảo tính đồng nhất, đây là tiêu chuẩn bắt buộc để so sánh liên phòng được chính xác Mỗi đơn vị tham gia cần nhận được bộ mẫu giống nhau về các đặc tính kiểm soát Nếu nhà cung cấp không cung cấp lô mẫu đồng nhất, chương trình ngoại kiểm sẽ không hiệu quả Do đó, tính đồng nhất là điều kiện tiên quyết để đánh giá chất lượng của lô mẫu.
Nghiên cứu về mẫu hồng cầu nhóm A, B, AB và O cho thấy sự biến thiên rất thấp về các đặc tính của hồng cầu như Antigen, RBC, HB, Hct, cùng với các tính chất sinh hóa của dung dịch treo hồng cầu, bao gồm nồng độ Na+, K+ và LDH.
Lactate đều có CV < 3,0 %, chứng tỏ các mẫu có sự đồng đều với nhau ở cả 4 nhóm [2], [26], [27], [28]
Bảng 4.1 So sánh kết quả đo free - hemoglobin mẫu hồng cầu của 4 nhóm
Phương pháp đo mức độ tiêu huyết trong nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch men ức chế cạnh tranh trực tiếp Kháng thể đặc hiệu với Hb được phủ lên tấm vi mạch, sau đó mẫu chuẩn và nghiệm phẩm được bơm vào giếng Hb liên kết biotin Quá trình này dẫn đến sự ức chế cạnh tranh giữa Hb trong mẫu và Hb liên hợp biotin với kháng thể đã gắn trước Cuối cùng, sau khi rửa, avidin liên hợp Horseradish được sử dụng để phát hiện kết quả.
Peroxidase (HRP) được thêm vào giếng và sau đó rửa để loại bỏ các thành phần không liên kết Cơ chất phát quang được thêm vào giếng, tạo ra màu sắc tỉ lệ nghịch với lượng Hb liên kết Sự phát triển màu được dừng lại và cường độ màu được đo Kết quả cho thấy mức độ tiêu huyết trung bình của các mẫu dao động từ 0,001 mg/L (nhóm O) đến 0,008 mg/L (nhóm A), với CV% từ 0,078% đến 0,222% (< 3,0%).
Theo nghiên cứu của Yang Yu, Chunya Ma và Quain Feng về chương trình nội kiểm chất lượng trong truyền máu, kết quả cho thấy mức độ tiêu huyết của mẫu hồng cầu B là 72,8 ± 7,7 mg/L, thấp hơn 500 mg/L và đạt cấp độ 0 Mẫu hồng cầu nhóm O có mức độ tiêu huyết thấp nhất, trong khi mẫu nhóm A có tỷ lệ tiêu huyết cao nhất Mặc dù các phương pháp đo khác nhau được sử dụng trong các nghiên cứu, tất cả các mẫu đều đáp ứng tiêu chuẩn của Châu Âu và FDA Hoa Kỳ, với độ đồng nhất đạt yêu cầu cho mẫu ngoại kiểm.
Độ ổn định ngắn hạn của mẫu hồng cầu
Để đảm bảo chất lượng mẫu ngoại kiểm trong quá trình đóng gói và vận chuyển, cần kiểm soát độ ổn định ngắn hạn của mẫu Nhà cung cấp mẫu thử nghiệm phải quản lý các yếu tố có thể ảnh hưởng đến tính chất của bộ mẫu, đặc biệt là với mẫu hồng cầu, được đóng gói cẩn thận và vận chuyển trong khoảng nhiệt độ tối đa 10°C Chúng tôi thực hiện giám sát chất lượng bằng cách tạo điều kiện vận chuyển giả định tại Trung tâm kiểm chuẩn và đánh giá lại vào ngày thứ 07 so với mẫu bảo quản ở 2°C – 6°C Độ ổn định ngắn hạn được xác định thông qua phép kiểm định t-test với p > 0,05, nhằm so sánh các đặc tính của mẫu trong môi trường giả định với mẫu tại trung tâm.
Qua kết quả nghiên cứu độ ổn định ngắn hạn của lô mẫu ở 4 nhóm: A,
B, AB, O được thể hiện trong các bảng: 3.3.1; 3.3.2; 3.3.3 và 3.3.4 Cho thấy:
Hoạt động phản ứng của kháng nguyên được duy trì ở mức rất tốt trong tất cả các nhóm mẫu hồng cầu, cả khi được bảo quản lý tưởng tại trung tâm ở nhiệt độ 20°C – 60°C và khi vận chuyển trong điều kiện giả định với nhiệt độ từ 20°C – 100°C.
Vận chuyển mẫu không ảnh hưởng đến chất lượng kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu, đồng thời đảm bảo sự ổn định và đồng nhất của mẫu khi được phân phối đến các đơn vị tham gia ngoại kiểm.
Số lượng hồng cầu, hematocrit và hemoglobin được duy trì ổn định so với mẫu bảo quản tại trung tâm, với p > 0,05, cho thấy không có sự thay đổi đáng kể trong các chỉ số này.
Hemoglobin được bảo toàn trong giới hạn cho phép (p > 0,05), cho thấy mẫu hồng cầu ở các lô nghiên cứu ổn định trong suốt quá trình vận chuyển.
Trong quá trình vận chuyển mẫu thử nghiệm, các chỉ số sinh hóa đã có sự thay đổi đáng kể so với mẫu bảo quản tại trung tâm Cụ thể, nồng độ ion Natri giảm, trong khi ion Kali tăng cao hơn, cùng với sự gia tăng nồng độ LDH và Lactate Những biến đổi này diễn ra đồng nhất giữa các mẫu và tương đồng giữa các nhóm nghiên cứu Nguyên nhân có thể do nhiệt độ vận chuyển (2°C – 10°C) không đạt tiêu chuẩn bảo quản lý tưởng, dẫn đến các quá trình chuyển hóa của hồng cầu diễn ra mạnh mẽ hơn so với mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 20°C – 60°C.
Độ ổn định dài hạn của mẫu hồng cầu
Trong quá trình ngoại kiểm, mẫu cần đảm bảo độ ổn định để phục vụ cho việc đánh giá và kiểm tra khi phát hiện sự không phù hợp hoặc khi có yêu cầu gửi lại mẫu từ đơn vị tham gia Do đó, việc theo dõi tính ổn định của mẫu là rất quan trọng Mẫu hồng cầu được đánh giá ổn định dài hạn qua các giai đoạn 7, 35 và 42.
Các mẫu máu được sản xuất theo nhóm từ các túi máu khác nhau, với giả thuyết lý tưởng là không có sự biến đổi giữa các mẫu trong thời gian theo dõi Nghiên cứu sử dụng mẫu máu thu thập từ ngân hàng máu, cụ thể là máu của người hiến tặng, trong vòng 07 ngày sau khi lấy máu.
Hồng cầu là tế bào không có nhân, có vai trò quan trọng trong tuần hoàn và chứa các men cần thiết cho việc chuyển hóa glucose và sử dụng oxy Khi tuổi tác tăng, hệ thống chuyển hóa trong hồng cầu trở nên kém hoạt động, dẫn đến màng hồng cầu trở nên cứng giòn, dễ vỡ và bị đào thải khỏi hệ tuần hoàn Quá trình chuyển hóa chủ yếu diễn ra qua việc ly trích glucose để tạo năng lượng, giúp duy trì hoạt động của hồng cầu và cân bằng nồng độ ion natri và kali thông qua bơm natri Trong hồng cầu, ion kali chiếm ưu thế với nồng độ từ 100-150 mEq/L, trong khi ion natri chỉ khoảng 20 mEq/L Khi thiếu ATP, bơm natri không hoạt động, khiến ion natri và nước chỉ có thể đi vào mà không ra, dẫn đến hiện tượng hồng cầu trương to và vỡ.
Để loại bỏ kháng thể dư thừa và làm lộ các vị trí kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu, cần thực hiện quy trình rửa hồng cầu bằng nước muối sinh lý (NaCl) ba lần, nhằm tối ưu hóa phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể.
Việc rửa hồng cầu không chỉ loại bỏ sự ngưng kết của protein, bạch cầu, tiểu cầu và các hồng cầu đã thoái hóa, mà còn hạn chế sự tích trữ acid lactic trên bề mặt hồng cầu Điều này góp phần nâng cao hiệu quả bảo quản hồng cầu, theo nghiên cứu của tác giả Đỗ Trung Phấn.
Nghiên cứu năm 2003 chỉ ra rằng việc lọc bạch cầu khỏi hồng cầu giúp duy trì ổn định lượng histamin và serotonin sau 21 và 42 ngày bảo quản, trong khi hồng cầu không được lọc bạch cầu có sự thay đổi rõ rệt Bạch cầu gây ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng máu trong quá trình bảo quản do chúng có tuổi thọ ngắn, chết và phân hủy sau 48 – 72 giờ, giải phóng các thành phần nội bào vào huyết tương, làm giảm hiệu lực của hồng cầu và thay đổi pH máu Do đó, loại bỏ bạch cầu là cần thiết để nâng cao chất lượng sản phẩm hồng cầu, từ đó cải thiện độ chính xác của các kỹ thuật xét nghiệm truyền máu và đảm bảo an toàn cho bệnh nhân khi nhận máu.
Theo nghiên cứu của Yang Yu và Chunya, hồng cầu sau khi rửa chỉ có thể bảo quản trong 24 giờ, vì việc lưu trữ lâu hơn sẽ dẫn đến hiện tượng tan máu.
Nghiên cứu của Ma và Quain Feng tập trung vào việc xây dựng và đánh giá hiệu quả chương trình nội kiểm chất lượng phản ứng hòa hợp trong truyền máu, với đối tượng là hồng cầu được rửa bằng hai phương pháp khác nhau: dung dịch bảo quản MAP và NaCl Kết quả cho thấy hàm lượng K+, LDH và axit lactic đều tăng khi thời gian bảo quản kéo dài, nhưng không có sự khác biệt rõ rệt giữa hai nhóm sau 35 và 42 ngày bảo quản Nghiên cứu sử dụng NaCl 0,9% kết hợp với dung dịch bảo quản để tạo mẫu hồng cầu 3% – 5%, nhằm duy trì khả năng sống sót và chức năng của các thành phần máu trong các xét nghiệm truyền máu Khả năng tồn tại của hồng cầu được xem là yếu tố then chốt đảm bảo chất lượng xét nghiệm khi mẫu được bảo quản và vận chuyển Các chất chống đông được bổ sung nhằm hỗ trợ hoạt động chuyển hóa của hồng cầu, duy trì tình trạng chống đông và giảm thiểu sự thoái biến trong thời gian dự trữ.
Theo thông tư 26 của Bộ Y tế, các xét nghiệm trước truyền máu sử dụng hồng cầu nồng độ 1% và 3%-5% với phương pháp gel card và ống nghiệm Để bảo quản tốt hơn, nồng độ hồng cầu 5% được chọn làm mẫu Hồng cầu được treo trong dung dịch chứa citric acid để giảm pH, trisodium citrate-di-hydrate để cố định ion Canxi và ngăn ngừa đông máu, dextrose để duy trì ATP và nuôi dưỡng tế bào, adenin để cải thiện chức năng hồng cầu, và sodium chlorid để duy trì tính đẳng trương Ngoài ra, kháng sinh Neomycin sulphate và Chloramphenicol được bổ sung để ngăn ngừa nhiễm khuẩn trong quá trình thao tác.
Trong quá trình bảo quản hồng cầu, lượng ATP giảm dẫn đến khả năng sống của hồng cầu cũng giảm theo Thời hạn bảo quản tối đa được xác định khi vẫn duy trì được khả năng sống tối thiểu cho 70% hồng cầu Đồng thời, nồng độ 2,3-DPG cũng giảm nhanh chóng, ảnh hưởng đến chức năng của hồng cầu Để hạn chế những tác động tiêu cực này, việc bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C là cần thiết, nhằm giảm quá trình tiêu đường, tiết kiệm năng lượng tế bào và làm chậm quá trình acid hóa máu.
Kết quả đánh giá mẫu hồng cầu nhóm A cho thấy A-antigen duy trì ổn định ở mức 12 điểm từ ngày 0 đến ngày 49 Kiểm định t-test với p > 0,05 cho thấy số lượng hồng cầu ổn định trong 35 ngày, nhưng giảm 9,7% vào ngày 49 (p < 0,05) so với ngày 0 Tương tự, nồng độ hematocrit và hemoglobin cũng ổn định từ ngày 0 đến ngày 35.
49 với p < 0,05 (nồng độ hematocrit giảm 6,1%; hemoglobin giảm 18,9 %) mẫu không còn đạt độ ổn định theo phép kiểm này
Kết quả đánh giá mẫu hồng cầu nhóm B cho thấy B-antigen duy trì độ ổn định tốt từ ngày 0 đến ngày 49 với mức 12 điểm Số lượng hồng cầu có sự biến động, được kiểm tra bằng t-test với p > 0,05, cho thấy ổn định từ 35 ngày đến ngày 49, nhưng giảm 7,9% (p < 0,05) so với ngày 0 Nồng độ hematocrit và hemoglobin cũng ổn định từ ngày 0 đến ngày 35 (p > 0,05), tuy nhiên đến ngày 49, hematocrit giảm 4,8% và hemoglobin giảm 16,0% (p < 0,05), dẫn đến mẫu không còn đạt độ ổn định theo thống kê.
Kết quả đánh giá mẫu hồng cầu nhóm AB trong Bảng 3.3 cho thấy, AB
Trong nghiên cứu, antigen trong mẫu từ ngày 0 đến ngày 49 cho thấy độ ổn định tốt, duy trì ở mức 12 điểm Số lượng hồng cầu có sự biến động, với kiểm định t-test cho thấy p > 0,05, cho thấy số lượng hồng cầu ổn định từ ngày 0 đến ngày 35 Tuy nhiên, đến ngày 49, số lượng hồng cầu giảm 16,6% (p < 0,05) so với ngày 0 Nồng độ hematocrit và hemoglobin cũng duy trì ổn định từ ngày 0 đến ngày 35 (p > 0,05), nhưng đến ngày 49, nồng độ hematocrit giảm 17,6%.
%; hemoglobin giảm 17,8 % (p < 0,05) mẫu không còn đạt độ ổn định theo thống kê
Kết quả đánh giá mẫu hồng cầu nhóm O cho thấy rằng nhóm máu O không chứa kháng nguyên ABO trên bề mặt hồng cầu, vì vậy không cần kiểm tra hoạt động của kháng nguyên Số lượng hồng cầu ổn định trong 35 ngày đầu (p > 0,05), nhưng đến ngày 49, số lượng hồng cầu giảm 18,75 % (p < 0,05) so với ngày 0 Nồng độ hematocrit và hemoglobin cũng duy trì ổn định từ ngày 0 đến ngày 35 (p > 0,05).
49 nồng độ hematocrit giảm 17,9 %; hemoglobin giảm 22,1 % (p < 0,05) mẫu không còn đạt độ ổn định theo thống kê
Hình 4.2 Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi về số lƣợng hồng cầu từ ngày 0 đến ngày 49 của 4 nhóm máu
Hình 4.3 Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi heamatocrit từ ngày 0 đến ngày 49 của
Hình 4.4 Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi về heamoglobin từ ngày 0 đến ngày 49 của 4 nhóm máu
Dựa vào kết quả nghiên cứu 3 thông số: RBC, Hct và Hb; mẫu hồng cầu nhóm máu B có độ ổn định vượt trội so với các nhóm còn lại: B > A >
Nghiên cứu cho thấy mẫu AB > O đạt được độ đồng nhất và ổn định trong 35 ngày, mặc dù sau 42 đến 49 ngày, hồng cầu bị tổn thương và sự phá hủy gia tăng, với sự tăng mạnh của K+, LDH và Lactate Tuy nhiên, các chỉ số hoạt động chính của sản phẩm ngoại kiểm vẫn không bị ảnh hưởng rõ rệt, bao gồm hoạt động kháng nguyên hồng cầu, số lượng hồng cầu, Hct và Hb vẫn nằm trong tiêu chuẩn lâm sàng Nồng độ kháng nguyên bền vững là yếu tố quan trọng cho mẫu ngoại kiểm truyền máu Số lượng hồng cầu ở cả 4 nhóm giảm theo thời gian, nhưng đến ngày 49, mức giảm chỉ dưới 20% so với ban đầu, duy trì trong khoảng 300 – 500 (x 10^3) HC/mL, và hematocrit vẫn trong giới hạn thực hành 3% - 5%.
Độ vô trùng của mẫu hồng cầu
Môi trường dịch treo hồng cầu 5% giàu chất dinh dưỡng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn Do đó, việc kiểm soát chất lượng mẫu và theo dõi độ vô trùng là rất quan trọng Hai loại kháng sinh được bổ sung vào dung dịch bảo quản hồng cầu nhằm đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình sử dụng.
Neomycin sulphate và Cloramphenicol được sử dụng để kiểm tra độ vô trùng của mẫu Ba mẫu ngẫu nhiên từ mỗi lô sẽ được cấy phân lập trên môi trường MHA và theo dõi trong 14 ngày tại nhiệt độ 37 độ C.
Kết quả trong Bảng 3.15 cho thấy tất cả các đĩa MHA không có vi khuẩn mọc từ ngày 0 đến ngày 14 So với nghiên cứu của Hoàng Thị Thanh Hà về quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm đánh giá chất lượng PXN huyết thanh học HIV năm 2014, mẫu huyết thanh cũng được cấy trên môi trường thạch và canh thang thường, không phát hiện vi khuẩn sau 14 ngày, khẳng định mẫu nghiên cứu đạt tiêu chuẩn vô trùng.
Sau 14 ngày quan sát, không thấy khúm vi khuẩn mọc trên MHA Điều này chứng tỏ: Mẫu hồng cầu của 04 lô mẫu nhóm A, B, AB và O đều đạt tiêu chuẩn vô trùng để cung cấp cho chương trình ngoại kiểm truyền máu.
Quy trình sản xuất mẫu huyết thanh
Việc sản xuất mẫu ngoại kiểm cần được thực hiện sao cho giống với mẫu bệnh phẩm ở các phòng xét nghiệm Mặc dù các xét nghiệm truyền máu có thể thực hiện trên huyết tương và huyết thanh, theo Thông tư số 26 của Bộ Y tế, quy định lấy mẫu xét nghiệm truyền máu là 2 mL máu toàn phần chống đông EDTA và 3 mL máu toàn phần để lấy huyết thanh Nguyên liệu cho mẫu ngoại kiểm truyền máu phải là máu toàn phần/huyết tương từ Ngân hàng máu, nhưng huyết tương chất lượng không cao có thể tạo cục đông fibrin và ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Nghiên cứu của Hoàng Thị Thanh Hà năm 2014 cho thấy sự khác biệt trong sự tạo cục đông fibrin giữa các phương pháp Cụ thể, ống mẫu chuyển huyết tương thành huyết thanh bằng phương pháp Thrombin cho kết quả rõ nét hơn so với ống mẫu phục hồi bằng Canxi, nơi cục đông fibrin không rõ nét và làm cho huyết thanh bị đục.
Nhóm nghiên cứu đã thực hiện chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh nhằm tạo ra mẫu ngoại kiểm chất lượng, tuân thủ theo hướng dẫn của WHO về việc thiết lập chương trình EQA trong huyết thanh học nhóm máu.
Hướng dẫn xây dựng chương trình ngoại kiểm nhóm máu đã được trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu, với kết quả tạo ra 4 lô mẫu huyết thanh cho các nhóm A, B, AB và O Các mẫu huyết thanh này có độ trong suốt cao và màu sắc đồng nhất.
Độ đồng nhất của mẫu huyết thanh
Sau khi sản xuất, mẫu huyết thanh được phân phối vào các ống nghiệm nhựa cứng vô khuẩn với thể tích 2 mL/ống Tiến hành kiểm tra để đảm bảo sự đồng nhất giữa các mẫu Kết quả kiểm tra độ đồng nhất của mẫu huyết thanh, được thể hiện trong Bảng 3.16, cho thấy hoạt động của kháng thể nhóm máu hệ ABO của nhóm A, B và O hoàn toàn giống nhau với hoạt độ kháng thể 12 điểm và hiệu giá kháng thể.
32 So với kết quả nghiên cứu của Trần Hữu Tâm: Kết quả phân tích hai tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của mẫu huyết thanh kiểm tra chất lượng xét nghiệm định nhóm máu (2016) Với phương pháp: sản xuất các mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm chứa huyết thanh để định nhóm máu A, B, AB và O, tiến hành đánh giá độ đồng nhất, ổn định qua thời gian của các mẫu này Kết quả: không có sự sai biệt quá 03 nồng độ pha loãng từ lô sản xuất; đến thời điểm ngày thứ 30, kháng thể trong tất cả các ống kiểm tra đều có thể gây ngưng kết 1+ đối với kháng nguyên hồng cầu ở nồng độ pha loãng là 16
Các mẫu ngoại kiểm huyết thanh trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các nghiên cứu trước đó Việc sử dụng mẫu ngoại kiểm giúp đảm bảo tính đồng nhất, từ đó nâng cao chất lượng đánh giá kết quả và cải thiện hoạt động kiểm tra chất lượng xét nghiệm truyền máu.
Độ ổn định ngắn hạn mẫu huyết thanh
Đánh giá độ ổn định ngắn hạn của mẫu huyết thanh được thực hiện cùng với mẫu hồng cầu sau 07 ngày kể từ khi sản xuất Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa mẫu bảo quản tại trung tâm và mẫu trong điều kiện vận chuyển giả định Tất cả mẫu đều duy trì hoạt độ kháng thể tốt (12 điểm) và nồng độ hiệu giá kháng thể trong huyết thanh vẫn là 32 Điều này đảm bảo rằng các đơn vị tham gia ngoại kiểm truyền máu nhận được mẫu có các đặc tính giống nhau, từ đó mang lại kết quả phân tích chính xác và hiệu quả hơn.
Độ ổn định dài hạn của mẫu huyết thanh
Chúng tôi đã tiến hành lưu trữ mẫu huyết thanh ở nhiệt độ 2-6oC trong 49 ngày để theo dõi sự ổn định Kết quả ghi nhận vào các thời điểm ngày 0, ngày 7, ngày 42 và ngày 49 cho thấy cả hoạt độ kháng thể và hiệu giá kháng thể đều được duy trì ổn định, không có sự thay đổi đáng kể nào trong suốt quá trình bảo quản Do đó, mẫu huyết thanh này đáp ứng tiêu chuẩn sử dụng trong chương trình ngoại kiểm truyền máu.
Độ vô trùng của mẫu huyết thanh
Mẫu huyết tương được bổ sung sodium azid trong quá trình chuyển đổi sang huyết thanh để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, nhờ vào khả năng ức chế enzym cytochrome oxydase ở vi khuẩn Gram âm Sau đó, mẫu được cấy trên môi trường thạch MHA và ủ ở 37 độ C trong 14 ngày Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều không có vi khuẩn mọc cho đến ngày 14, đảm bảo mẫu huyết thanh sử dụng trong ngoại kiểm truyền máu đạt tiêu chuẩn vô trùng.