Bài viết trình bày về Vi khuẩn Lactobacillus thể hiện khả năng kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phộng. Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn này sau 16 giờ cũng thể hiện khả năng kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin từ khi khảo sát bằng phương cấy đối kháng trên đĩa thạch. Mời các bạn cùng tham khảo!
Trang 1KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA BỘ Ư TẬP
VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM
LÊN MEN TRUYỀN THỐNG
Nguyễn Tấn Lộc, Lê Thị Mỹ Diệu * , Nguyễn Bảo Trân,
Trần Minh Thư, Nguyễn Ngọc Gia Bảo
Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh
GVHD: TS Nguy ễn Hoài Hương
TÓM TẮT
Vi khuẩn Lactobacillus thể hiện khả năng kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phộng Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn này sau 16 giờ cũng thể hiện khả năng kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin từ khi khảo sát bằng phương cấy đối kháng trên đ a thạch
Từ khóa: Aspergillus sinh aflatoxin, hoạt tính kháng nấm, Lactobacillus, phương pháp cấy đối
kháng, vi khuẩn lên men lactic
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Lactobacillus spp là vi khuẩn gram (+), hình que hoặc hình cầu, không sinh bào tử, sinh acid lactic tạo thành một phần chính của vi khuẩn đường ruột thông thường ở người và động vật Chúng đẩy mạnh sự kháng lại những sinh vật ngoại sinh nhất là sinh vật mang mầm bệnh, hình thành các hợp chất đối kháng: bacteriocin đồng thời có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc sinh độc
tố aflatoxin
Aflatoxin là độc tố vi nấm gây ung thư gan sản sinh tự nhiên bởi một số loài thuộc chi Aspergillus đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Bên cạnh sử dụng các biện pháp, canh tác và phun thuốc, thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống diệt mầm bệnh Xử lý nguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạt khỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân Xử lý hạt giống bằng hóa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phòng trừ sâu bệnh hại cây trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao… Nhưng các hợp chất hóa học dần có những yếu điểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thành các loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe con người Việc sử dụng các hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho con người đang là một hướng mở rộng và một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acid lactic Đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Laitila A và cộng sự (2002),[4]; Kim Jeong Dong (2005),[3]; Muñoz
Trang 2chưa có ứng dụng vào bảo quản Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bộ sưu tập sẵn có vi khuẩn lên men lactic của phòng thí nghiệm và khả năng ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh
Các chủng nấm mốc chỉ thị thuộc Aspergillus flavus CĐP1, CĐP2 phân lập từ hạt đậu phộng mốc được cung cấp bởi Khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh
Daconil từ nhà sản xuất Công ty TNHH Việt Thắng
Bảng 1: Nguồn phân lập của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
L5, L3, L1, L10L, L2N Nem chua
2.2 Phương pháp
2.2.1 Khảo sát tính thuần khiết và đặc điểm nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp
Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ
ở 37 oC trong 24 giờ Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37 oC sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy bằng các thí nghiệm sinh lý, sinh hoá gồm: Nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalse, thử nghiệm khả năng sinh acid lactic (ARNOLD J
P (1987), [1]), khả năng lên men đường và khả năng di động
2.2.2 Khảo sát khả năng lên men lactic
Nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng 16 giờ, chuẩn độ acid tồng bằng NaOH 0,1 N, chỉ thị phenolphthalein đến màu hồng nhạt Xác định hàm lượng acid tổng quy ra acid lactic theo công thức:
1
%Acid lactic 100
2
V K V
trong đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)
V2: Thể tích nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml)
K: Thể tích nuôi cấy đem đi chuẩn độ (Acid lactic là 0,009)
Trang 32.2.3 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của chủng Lactobacillus spp với Aspergillus flavus CĐP1
Chủng vi khuẩn Lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở
37 oC, lắc 150 v/phút trong 16 giờ, tỷ lệ cấy giống là 5%
Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến Chủng nấm lần lượt được đục từ môi trường MRS cải tiến
đã cấy trước đó 3 ngày và đặt vào tâm đ a Dịch nuôi cấy được cấy 2 đường cách mép đ a 15 mm với 2 nghiệm thức là cấy đồng thời với nấm và cấy sau 1 ngày Theo dõi đường kính phát triểm của nấm Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần Tính tỷ lệ kháng nấm theo công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) =
D đối chứng + D thí nghiệm
100%
D đối chứng trong đó: D đối chứng: Đường kính (cm) đ a nấm đối chứng
D thí nghiệm: Đường kính (cm) đ a thí nghiệm
2.2.4 Khảo sát khả năng đối kháng nấm Aspergillus flavus CĐP2 trên đậu phộng
Hạt đậu phộng được rửa sạch bằng bằng cồn 70 sau đó rửa lại bằng nước cất ba lần và để ráo nước Dịch nuôi cấy L3 và L5 được chuẩn bị để ngâm đậu phộng Các nghiệm thức ngâm như sau: NT1: dịch nuôi cấy; NT2: dịch nuôi cấy pH6; NT3: dịch nuôi cấy đun 100 oC, 15 phút; NT4: dịch nuôi cấy pH6, đun 100 oC 15 phút; NT5: đối chứng âm nước cất; NT6 đối chứng dương Daconil Đậu phộng ngâm xong để ráo ở nhiệt độ phòng vào chai thủy tinh, bổ sung 0,1 ml huyền phù nấm mốc
ở mật độ 1,2*104 để đạt mật độ 102 bào tử/g Theo dõi ngày mọc tơ nấm
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy
Khảo sát tính thuần khiết và đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi khuẩn giữ trong bộ sưu tập là cần thiết trước khi thử hoạt tính sinh học của chúng Trên MRS agar, các chủng Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) đều thuần khiết, có khuẩn lạc tròn lồi, mép nhẵn, trắng sữa Các đặc điểm nuôi cấy khác được trình bày ở Bảng 1, cho thấy là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không
có khả năng di động, catalase âm tính, có khả năng sinh acid lactic, lên men đồng hình
Bảng 2: Kết quả hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng Lactobacillus spp
ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que dài
Trang 4Đặc điểm Các chủng Lactobacillus spp
ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que dài
Khả năng sinh acid lactic (thuốc thử
Uffelmann)
Lên men đường glucose, fructose,
galactose, mannose, sucrose, lactose,
maltose
Các thử nghiệm cho thấy, chủng L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 là giữ đặc điểm của chi Lactobacillus dựa trên Khóa phân loại Bergey
Hình 1: Khuẩn lạc chủng L10L trên môi trường MRS agar và tế bào C1 nhuộm gram
3.2 Khảo sát khả năng lên men lactic
Hàm lượng acid tổng của chủng vi khuẩn L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được xác định sau khi nuôi cấy trên môi trường MRS Broth trong vòng 16 giờ Trong đó chủng L2N sinh acid nhiều nhất 1.656%
và chủng C1 có mật độ sinh khối cao nhất là ODhc600 nm = 9.036
Hình 2: Nồng độ acid tổng và sinh khối sau lên men 16 giờ trong môi trường MRS
Trang 53.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp Aspergillus flavus CĐP1
Để khẳng định chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) với các chủng nấm và sử dụng đối chứng dương là Daconil Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm từ 25,3% - 47,5%, trong khi đó đối chứng Daconil là thuốc trừ nấm thương mại kháng 19,3% khi cấy đồng thời nấm và vi khuẩn Khi cấy khuẩn sau khi cấy nấm 1 ngày để nấm phát triển trước thì thông thường khả năng đối kháng giảm như trường hợp Daconil và các chủng L10L, KC1A, L1, chủng L5 cho khả năng đối kháng không đổi, chủng L2N, L3, C1 lại cho khả năng đối kháng tăng Các chủng L1, L3, L5, L2N, L10L có khả năng kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 xấp xỉ nhau và cao hơn KC1A và C1
Bảng 3: Tỷ lệ ức chế nấm (%) của các chủng Lactobacillus spp với CĐP1
Chủng lactic Cấy khuẩn đồng thời cấy nấm Cấy khuẩn sau 1 ngày cấy nấm
Hình 3: Thí nghiệm đối kháng Aspergillus flavus CĐP1 của Lactobacillus sp L5 sau 5 ngày đồng nuôi cấy
3.4 Kết quả bảo quản đậu phộng của vi khuẩn lactic
Các chủng L3 và L5 được chọn để tiếp tục khảo sát khả năng kháng nấm trên hạt đậu phộng Bảng
3 cho thấy hai chủng L3 và L5 kháng nấm Asp flavus CĐP2 khác nhau Chủng L5 chỉ kháng nấm khi không xử lý nhiệt, pH 6 kháng nấm tốt hơn pH acid sau nuôi cấy Ngược lại, chủng L3 phải xử lý
Trang 6Bảng 4: Số ngày chưa mọc tơ nấm từ khi cấy nấm Chủng Không xử lý pH6 100 o C-15 phút pH6,
100 o C-15 phút ĐC- (H 2 O) Daconil
4 KẾT LUẬN
Tất cả 7 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) đều có khả năng kháng nấm ngay cả khi cấy đồng thời và cấy khuẩn sau nấm 24 giờ Bản chất các hợp chất kháng nấm trong các chủng là khác nhau, còn có thể phụ thuộc vào xử lý nhiệt hoặc trong hòa sau nuôi cấy Kết quả này cho thấy nên khảo sát khả năng kháng nấm invivo mở rộng cho các chủng đối kháng invitro, sau đó có thể kết hợp các chủng có khả năng kháng nấm khác nhau để sản xuất chế phẩm
xử lý hạt giống
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] ARNOLD J P, M.D (1987) ‚A New Test For Lactic Acid In The Gastric Contents And A Method of Estimating Approximately The Quantity Present‛ The Journal of the American Medical Association (JAMA) Vol XXIX, No.08 pp 371
[2] CAST (1989) Mycotoxins: Economic and health risks Task Force Report No.116 Ames, Iowa, United States: Council for Agricultural Science and Technology (CAST)
[3] Kim Jeong Dong (2005) Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatu Inha University, Incheon: Institute of Industrial Biotechnology
[4] Laitila A, Alakomi H-L, Raaska L, Mattila-Sandholm T and Haikara A (2002) Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley Findland : VTT Biotechnology
[5] Muñoz R, Arena M.E,Silva J,González S.N (2010) Inhibition of mycotoxin-producing Aspergillus nomius vsc 23 by lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae Argentina: Facultad de Bioquímica