Tổng hợp các dẫn xuất amine có hoạt tính kháng tế bào ung thư ở người, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và nghiên cứu mô hình docking phân tử trên cơ sở phản ứng mannich từ 4-hydroxycoum

Bài viết trình bày về tính mới của nghiên cứu này về mặt hóa lý là cấu trúc có nhóm thế amine (vốn mang giá trị tương tác sinh học với các phân tử protein cao) của các dẫn xuất ở vị trí C-3 trên vòng 4-hydroxycoumarin mà các nghiên cứu trước chưa công bố. Mời các bạn cùng tham khảo!

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học

TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT AMINE CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

Ở NGƯỜI, KHÁNG KHUẨN, KHÁNG OXY HÓA VÀ NGHIÊN CỨU MÔ HÌNH

DOCKING PHÂN TỬ TRÊN CƠ SỞ PHẢN ỨNG MANNICH TỪ

4-HYDROXYCOUMARIN Đoàn Thị Kim Lai*, Phan Thành Công, Võ Thị Thu Hiền, Trần Văn Hiếu

Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

TÓM TẮT

Trong việc phát triển các thuốc kháng tế bào ung thư hoặc điều trị ung thư mới, một loạt các dẫn xuất coumarin mới mang nhóm thế amin (1a-j) đã được nhóm tác giả tổng hợp và đánh giá khả năng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7),

tế bào ung thư gan (HepG2) được cô lập từ tế bào ung thư ở người và thử nghiệm các hoạt tính kháng k�� mạnh, kháng oxy hóa tiềm năng Bên cạnh đó, nhóm tác giả còn nghiên cứu mô hình docking phân tử của các hợp chất có hoạt tính cao đối với tế bào ung thư vú 5NWH (tương ứng MCF-7) và k�� 2BX9 (tương ứng bacillus subtilis) từ Protein Docking Bank Trên cơ sở

mà rất nhiều công trình nghiên cứu trước đây khó đạt được Đặc biệt, tính mới của nghiên cứu này về mặt hóa lý là cấu trúc có nhóm thế amine (vốn mang giá trị tương tác sinh học với các phân tử protein cao) của các dẫn xuất ở vị trí C-3 trên vòng 4-hydroxycoumarin mà các nghiên cứu trước chưa công bố Kết quả nghiên cứu mô hình docking phân tử cho thấy hydro (trong cầu nối CH2-NH và trong cấu trúc amine) có khả năng liên kết cao với các thụ thể (receptor – đơn phân là các amino acid); đặc trưng cho đề tài là hợp chất (1j) với liên kết 1H-A:Asp194:O, năng lượng tự do Gibbs – 5.04 kcal/mol

SYNTHESIS THE AMINE DERIVATIVES FROM 4-HYDROXYLCOUMARIN

BASED MANNICH REACTION AND TEST BIOACTIVITIES Doan Thi Kim Lai*, Phan Thanh Cong, Vo Thi Thu Hien, Tran Van Hieu

Industrial university of Ho Chi Minh City

ABSTRACT

In the development of new anticancer drugs or new cancer treatments, a series of new coumarin derivatives carrying the amino substituents (1a-j) have been synthesized and evaluated by the authors on cervical cancer cell lines (HeLa), breast cancer (MCF-7), liver cancer cells (HepG2) isolated from human cancer cells and tested for strong antibacterial activities, potential oxidation resistance In addition, the authors also studied the molecular docking model of compounds with high activity for 5NWH - breast cancer cells (corresponding to MCF- 7) and 2BX9 bacteria (corresponding to bacillus subtilis) from Protein Docking Bank Based

on Mannich reaction, the refined product has a high purity and an efficiency of up to 50-70 %, that many previous studies have been difficult to achieve In particular, the novelty of our research is chemical properties of amine substituents (which have high biological interactions with protein molecules) of C-3 derivatives on the 4- hydroxycoumarin; that have not published Research results of molecular docking model show that hydrogen (in CH2-NH bridge and in amine structures) easily binds to receptors (receptors - monomer are amino acids); Characteristic for the project is compound (1j) with 1H-A: Asp194: O, Gibbs free energy - 5.04 kcal/mol

Keywords: Anticancer drugs, strong antibacterial activities, potential oxidation resistance

TỒNG QUAN

Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

chiếm một phần lớn các loại thuốc bán trên thị

trường, đặc biệt là bệnh truyền nhiễm cho thấy

chúng có hiệu lực vượt trội, tính chọn lọc và

tính đặc trị cao Tuy nhiên, số lượng sản phẩm

tự nhiên hạn chế; do đó, việc nghiên cứu các

hợp chất bán tổng hợp, tổng hợp toàn phần để

có thể cung cấp hàng triệu dẫn xuất có hoạt

tính sinh học cao và tiến tới thử nghiệm lâm

sàng để phát triển thuốc mới góp phần trong

việc ức chế hoặc phát triển thuốc kháng lại tế

bào ung thư Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc

hoạt tính thuốc, cho thấy các dẫn xuất nitro,

amin, azide thường có hoạt tính tốt với các tế

bào ung thư trong in vitro hoặc vivo Bên cạnh

đó, các đề tài Coumarin đã được nghiên cứu

từ những năm 1978 với rất nhiều các vị trí

nhóm thế khác nhau Tuy nhiên, đề tài tổng

hợp các dẫn xuất gắn vào vị trí C-3 khung

coumarin, dẫn xuất chứa C-N được nhóm tác

giả sử dụng trình duyệt SciFinder xác nhận là

những cấu trúc hoàn toàn mới

Phân tích cấu trúc tác chất chính 4-

hydroxycoumarin, đặc biệt vị trí C-3 - cơ sở

lựa chọn vị trí nhóm thế này là hiệu ứng liên

hợp vòng (khi có nhóm thế OH tạo hiệu ứng

tăng hoạt làm vị trí C-3 thừa điện tử) cùng tạo

hiệu ứng rút điện tử tự do từ nhóm carbonyl

(tại C-2) Hệ quả là hydro có độ linh động rất

cao – dễ dàng tham gia phản ứng Mannich mà

nhóm đề xuất Đây là tính mới và là cơ sở để

chọn tác chất có khung coumarin là 4-

hydroxycoumarin cùng phản ứng Mannich trong suốt thực nghiệm đề tài này

Giải thích lí thuyết cho các hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư, kháng oxy hóa) là mô hình mô phỏng tương tác các hợp chất với các phân tử sinh học Mô hình trình bày các cấu dạng, đặc điểm các liên kết vật lí giữa phố tử và thụ thể tế bào ung thư Kết quả của nghiên cứu này là bước đầu trong

sự nghiệp phát triển nghiên cứu khoa học và ứng dụng thực tiễn trong ngành Dược học bởi những giá trị sinh học cao, có hiệu quả kinh tế

và hướng xanh của đề tài

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất và dung môi từ nhà cung cấp thương mại Sigma Aldrich Tác chất chính: 4- hydroxycoumarin; Tác nhân phản ứng:

aminobenzoic acid, 4-aminobenzenesulfonic acid, methylamine, propylamine, morpholine; Dung môi: chloroform, ethylacetat, methanol, hexan, petroleum ether, ethanol, … Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Tất cả các quy trình được thực hiện trong hệ thống dung môi hoàn lưu

Phương pháp tổng hợp

Tổng hợp các dẫn xuất coumarin với các amine từ 4-hydroxy-2H-chromen-2-one trên

cơ sở phản ứng Mannich có cấu trúc tương tự

Hình 1 Các dẫn xuất tổng hợp

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học

Thuyết minh quy trình tổng hợp

Giai đoạn 1: Hình thành iminium ion

formaldehyde có mặt xúc tác acid HCl, điều

đầu khi quan sát thấy hệ phản ứng thay đổi

trạng thái (trong suốt hoặc có tinh thể trắng

xuất hiện) và kết thúc khi hệ đồng thể (khoảng

30 phút để đảm bảo amine đã hoàn toàn được

iminium hóa bởi formaldehyde)

Đồng thời chuẩn bị tác nhân chính coumarin,

bằng cách hòa 4-hydroxycoumarin vào dung

môi methanol cùng xúc tác acid HCl cho quá

trình enol hóa, hydro tại vị trí C-3 lúc này trở

nên linh hoạt

Lưu ý: hệ phản ứng là kín (vì hệ gồm các

amine, dung môi dễ bay hơi gây thất thoát,

độc)

Giai đoạn 2: Phản ứng chính: tác chất

nucleophile (4-hydroxycoumarin) tấn công

vào vị trí carbonyl

Cho dung dịch 4-hydroxycoumarin vào hỗn

hợp iminium ion ở trên, điều chỉnh pH khoảng

4-5 Đun hoàn lưu cách dầu để ổn định nhiệt

mỏng cùng dung môi giải ly có độ phân cực

trung bình (V chloroform/V methanol) Kết

thúc phản ứng, kết tinh lại sản phẩm và bảo

quản Sản phẩm sau phản ứng được rửa lại

trong dung môi methanol, ethylacetat và kết

tinh lại bằng hệ thống cô quay dung môi

mẫu không bị phá hủy vì nhiệt

Phương pháp phân tích kết quả

Phổ hồng ngoại được ghi nhận dưới dạng viên

kali bromide (KBr) trên máy quang phổ

Fourrier Transformation InfraRed Dữ liệu

trên máy quang phổ Advance Bruker 500 (500

môi và tetramethyl silane (TMS) làm chất

chuẩn nội Giá trị độ dời J tính bằng Hz Phổ

khối được xác định bởi High resolution

mass spectrometry (ESI-MS) Xác định nồng

độ ức chế tổi thiểu trên khuẩn bacillus subtilis

bằng phương pháp pha loãng dung môi (broth

dilution) Hoạt tính kháng oxi hóa thông qua

hydrogen và năng lượng docking phân tử với 5NWH (receptor - tương ứng với dòng tế bào ung thư vú MCF-7) bằng mô hình docking phân tử- sử dụng phần mềm AutoDock Tools

và BIOVIA Discovery Studio

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân tích hóa lý 4-hydroxy-3-[(methylamino) methyl]-2H- chromen-2-one (1a)

FT-IR (KBr): 3145, 3079, 2991, 2865, 2753, 2615(C-H), 1568, 1599, 1649 (C=O), 1567,

1499, 1452 (C=C), 1348, 1109 (C-O, C-N),

1H, Ar-H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.88 (d, J = 7.9

δ (ppm) 169.8, 165.1, 153.6, 131.4, 124.3, 123.8, 116.8, 116.6, 96.7, 44.4, 36.0; HR-MS

4-hydroxy-3-[(isopropylamino) methyl]- 2H-chromen-2-one (1b)

FT-IR (KBr): 2981, 2800 (C-H), 1639, 1598 (C=O), 1513, 1458, 1424 (C=C), 1326, 1197 (C-O, C-N), 755 (vòng thơm mang nhóm thế)

126.6, 125.0, 124.2, 121.5, 116.9, 116.6, 103.0, 49.4, 24.5; HR-MS (ESI): tính toán:

234.1122

4-{[(4-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl) methyl] amino} benzoic acid (1c)

FT-IR (KBr): 3315 (N-H), 2989, 2727 (C-H),

1624, 1597 (C=O), 1522 (C=C), 1302, 1274,

1242 (C-O, C-N), 907, 835, 665 (vòng thơm

7.61 (dd, J=8.2, 7.5, Hz, 1H, Ar-H), 7.38-7.31

(m, 2H, Ar-H), 6.79-6.75 (m, 2H, Ar-H), 4.01

(t, J = 6.8 Hz, 1H, N-H), 3.73 (d, J = 6.8 Hz,

khả năng bắt gốc tự do DPPH Xác định hoạt (ppm) 169.7, 168.1, 165.1, 153.6, 148.6,

tử cung) Đánh giá khả năng tạo liên kết

(ESI): tính toán: [M+H]+ = 312.0872, thực

4-{[(4-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)

methyl] amino} benzonitrile (1d)

FT-IR (KBr): 3315 (N-H), 2989, 2727 (C-H),

1624, 1597 (C=O), 1522, 1302 (C=C), 1274,

(s, 1H, N-H), 8.0 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 2H, Ar-

H), 7.59 (dd, J = 8.6, 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 7.42-

7.33 (m, 4H, Ar-H), 7.26 (s, 1H, O-H), 3.84

(ppm) 168.9, 164.6, 152.5, 132.7, 124.9,

124.2, 116.9, 116.6, 103.1, 20.1; HR-MS

3-[(1H-imidazol-1-yl) methyl] -4-hydroxy-

2H-chromen-2-one (1e)

FT-IR (KBr): 3064 (N-H), 2991, 2730 (C-H),

1649, 1599, 1567 (C=O), 1347, 1308, 752,

Hz, 1H, N-H), 7.76 (t, J = 1.7 Hz, 1H, Ar-H),

7.59-7.63 (m, 1H, Ar-H), 7.31-7.38 (m, 2H,

Ar-H), 7.13 (dd, J = 7.1, 1 Hz, 1H, imidazole-

H), 6.9 (dd, J = 4.4, 1.7 Hz, 1H, imidazole-H );

157.8, 153.4, 118.1, 124.9, 124.2, 137.1,

3-[(cyclopentylamino) methyl]-4-hydroxy-

2H-chromen-2-one (1f)

FT-IR (KBr): 3050 (N-H), 2959, 2875, 2807,

1600 (C=O), 1538, 1465 (C=C), 1404, 1363,

δ (ppm) 1.47-1.53 (m, 3H, cylophentynamine-

H), 1.61-1.74 (m, 4H, cylophentynamine-H),

1.85-1.90 (m, 1H, cylophentynamine-H),

1.95-1.99 (m, 1H, cylophentynamine-H), 3.89

7.22 (m, 1H, Ar-H), 7.41-7.47 (m, 1H, Ar-H),

132.7, 126.6, 125.0, 124.2, 121.5, 116.9,

116.6, 103.0, 36.0, 20.1; HR-MS (ESI): tính

4-hydroxy-3-(morpholinomethyl)-2H-

chromen-2-one (1g)

FT-IR (KBr): 3015, 2989, 2727 (C-H), 1624

(C=O), 1597, 1523, 1421 (C=C), 1345, 1274,

1H, H-O), 8.01 (dd, J = 8.0, 1.0 Hz, 1H, Ar- H), 7.56 (t, J =7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.57 (t, 1H,

Ar-H), 7.35–7.39 (m, 3H, morpholinomethyl-

H), 4.10 (d, J = 11.5 Hz, 4H, Ar-H), 3.84 (s,

106.3, 139.2, 124.2, 116.9, 77.4, 66.6, 52.29,

4-hydroxy-3-[(propylamino) methyl]-2H- chromen-2-one (1h)

FT-IR (KBr): 3232 (N-H), 2966, 2794, 2638 (C-H), 1648, 1601 (C=O), 1525, 1426, 1326,

124.3, 123.7, 116.8, 116.6, 96.7, 51.9, 44.4,

4-{[(4-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl) methyl] amino} benzenesulfonic acid (1i)

FT-IR (KBr): 3116 (N-H), 2975, 1655 (C=O),

1605, 1564, 1289 (C-O, C-N), 906, 830, 560

7.98 (dd, J = 8.2, 1.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.61 (dd,

J = 8.2, 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.39-7.32 (m, 1H,

Ar-H), 7.36-7.29 (m, 3H, Ar-H), 6.91-6.85

(m, 2H, Ar-H), 3.95 (t, J = 6.8 Hz, 1H, N-H),

116.9, 121.6, 121.8, 123.4, 127.1, 131.1, 132.9, 147.3, 151.9, 162.6, 163.7; HR-MS

4-hydroxy-3-[(phenylamino) methyl]-2H- chromen-2-one (1j)

FT-IR (KBr): 3108 (N-H), 2974, 1654 (C=O),

= 8.2, 1.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.61 (dd, J = 8.2, 7.5

Hz, 1H, Ar-H), 7.44-7.23 (m, 2H, Ar-H), 7.16-6.95 (m, 2H, Ar-H), 6.81-6.53 (m, 3H,

Ar-H), 3.99 (t, J = 6.8 Hz, 1H, N-H), 3.73 (d,

133.3, 129.5, 124.9, 122.3, 119.6, 118.1,

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học

115.7, 113.5, 101.6, 37.03; HR-MS (ESI):

Thảo luận kết quả phổ nghiệm

Kết quả phân tích phổ từ trên hoàn toàn phù

hợp với cấu trúc đề xuất của chúng tôi Trên

phổ 1H-NMR, Tín hiệu đặc trưng (N-H) xuất

hiện ở trường thấp (độ dời hóa học cao 8-9

ppm) Bởi vì, đối với các hợp chất dẫn xuất

amine là các vòng aromatic (chứa hệ liên hợp

đơn đôi) hút điện tử từ nguyên tử N (còn cặp đôi điện tử) Lúc này electron xung quanh hạt nhân H bị rút về phía N, tạo hiệu ứng giảm chắn điện từ Khi nhận từ trường Bo (từ trường ngoài) điện trường bổ sung trực tiếp đi vào vào hạt nhân nguyên tử; dẫn đến protol xuất tín hiệu ở từ trường cao tương ứng độ dời hóa học thấp)

Đánh giá hoạt tính sinh học và mô phỏng

mô hình docking phân tử Bảng 1 Tổng hợp hoạt tính sinh học của các hợp chất tiêu biểu

Hợp chất

Giá trị thực nghiệm (mM) (1) IC50 MCF-7

(2) IC50 HeLa

(3) SC50 DPPH

(4) MIC Bacillus subtilis

Docking phân tử (5) E-Gidds (kcal.mol-1)

(6) Số lượng liên kết

hydro

(1a)

Kết luận: biến thiên năng lượng liên kết ligand – receptor, sự

hình thành liên kết giữa cấu dạng (1a) và dòng tế bào ung thư

khác nhau với lý thuyết 8.75 lần; Có 2 liên kết hydrogen 1N -

A:Phe94:N và 1H – A:Asp194:OD2; Đề xuất thử nghiệm in

vivo

(1f)

Kết luận: biến thiên năng lượng liên kết ligand - receptor, sự

µM, giá trị hoạt tính thuyết và thực nghiệm khác nhau 2.27 lần; Có 1 liên kết hydrogen 1H - A:GLU93:O; Đề xuất thử

nghiệm in vivo

Hợp chất

Giá trị thực nghiệm (mM) (1) IC50 MCF-7

(2) IC50 HeLa

(3) SC50 DPPH

(4) MIC Bacillus subtilis

Docking phân tử (5) E-Gidds (kcal.mol-1)

(6) Số lượng liên kết

hydro

(1i)

Kết luận: Biến thiên năng lượng liên kết ligand –

receptor, sự hình thành liên kết giữa cấu dạng (1i) và dòng vi

2 liên kết hydrogen 1H - 2BX9:F:VAL2:O và 1O -

2BX9:C:Met1:N; Đề xuất thực nghiệm in vivo

(1j)

Kết luận: Biến thiên năng lượng liên kết ligand - receptor,

A:ASP194:O; Giá trị hoạt tính thực nghiệm và lý thuyết khác

nhau 3.08 lần, Đề xuất thử nghiệm in vivo

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học

Hợp chất

Giá trị thực nghiệm (mM) (1) IC50 MCF-7

(2) IC50 HeLa

(3) SC50 DPPH

(4) MIC Bacillus subtilis

Docking phân tử (5) E-Gidds (kcal.mol-1)

(6) Số lượng liên kết

hydro

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Đề xuất thực nghiệm hoạt tính sinh học khác

(kháng nấm, kháng viêm, kháng tế bào ung

thư tiền tuyến liệt), đồng thời thử nghiệm lên

tế bào bình thường để kết luận tính gây độc tế

bào của các dẫn xuất tiêu biểu

Các gốc coumarin có tính độc ít, ít gây sản phẩm phụ Chúng tôi đề xuất tổng hợp thêm các dẫn xuất từ theo cơ sở phản ứng Mannich tương tự

TÀI LIỆU THAM KHẢO

VIJAYA BHARGAVI, "Coumarins and Chromones: A Remarkable Scaffolds for Anti- inflammatory Activity," Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, vol 9, no 9,

pp 1483-1489, (2017)

EFTEKHARI, "Stereoselective Synthesis of β-Amino Ketones via Direct Mannich-Type

Reactions, Catalyzed with ZrOCl2·8H2O under Solvent-Free Conditions, "European

Journal of Organic Chemistry, vol 22, pp 5152–5157, (2006)

GARRETT M MORRIS, “Automated docking using a lamarckian Genetic algorithm and an

empirical Binding free energy function”, “Journal of Computational Chemistry, vol 19,

no 14, PP.1639 -1662, (1998)