Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổ
Trang 1MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế
kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia
chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati).
Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi Thông thường lan được
sử dụng làm cảnh Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc
Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả
nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007 Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật
nhân giống loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume được triển khai
sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con
ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này
Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu
đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.
Trang 2CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến
Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ
Orchidoideae Trên thế giới đã thống kê được 51 loài Ở Việt Nam hiện thống kê
được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được
biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc
Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)
Họ: Phong lan (Orchidaceae)
Bộ: Phong lan (Orchidales)
Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt Cuống lá dài 2 - 3 cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn Bầu dài 13mm, có lông thưa
Mùa hoa tháng 2, tháng 4 Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 - 1600m Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng
Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…
Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến) Trước đó, lan
Kim tuyến (A setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu,
Trang 3dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958) Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này
Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan
Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3,
tháng 3/2006, trang 359-363) Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…
1.1.1 Đặc điểm hình thái
Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất
a Thân rễ
Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng,
bò dài Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm Đường kính thân rễ
từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm Thân rễ thường
có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông
b Thân khí sinh
Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,
ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt
c Rễ
Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một
Trang 4mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể Số
rễ trên một cây thường từ 3 - 10, trung bình là 5,4 Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm
d Lá
Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 - 4 cm, trung bình là 3,12 cm Lá có màu nâu
đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với
5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông thường có 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt
e Hoa, quả
Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi Mùa hoa tháng 10 - 12 Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm sau
Trang 5Hình 2.1 Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume
1.1.2 Đặc điểm phân bố
1.1.2.1 Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay
lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới
- Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây
gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v Chiều cao của
tầng A2 từ 15-25 m
- Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum
A
Thân ngầm Thân khí sinh
B
Trang 6bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v Chiều cao của tầng A3 từ
8-15m
- Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…
- Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…
- Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền
(Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae) Điển
hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…
- Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình
khoảng 20 cây/ha Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu
1.1.2.2 Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh
- Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến
phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90% Đặc điểm của cây bụi
và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng
từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ
Trang 7- Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát
ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng
1.1.2.3 Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao
- Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như
chân núi, sườn núi, đỉnh núi
- Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập
trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình
1.2 Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)
Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997)
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống
Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ
Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus
Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen
1.2.1.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro
Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu Một đặc tính quan trọng
Trang 8khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974)
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân
giống của con người Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta
hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại
Trang 9CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim
tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
+ Địa điểm: Trung tâm CNSH – Công ty TNHH MTV Giống Cây Trồng Số 1 – Trảng Bom – Đồng Nai
+ Thời gian:
2.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại auxin:
2.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.1 Ý nghĩa khoa học
- Khóa luận sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan
(Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến.
- Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume.
- Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
Trang 10setaceus Blume).
2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume
như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao
2.4 Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
2.5.Phương pháp nghiên cứu
Điều kiện nuôi cấy
- Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C