Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tìm ra các thông số kỹ thuật tối ưu của quy trình trích lý tinh dầu bạch đàn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của tinh dầu và chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn đối với 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus DHM-03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 gây bệnh AHPNS ở tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm in vitro. Mời các bạn tham khảo!
Trang 1NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NHŨ TƯƠNG TỪ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY BẠCH ĐÀN TRẮNG
PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY Ở TÔM CHÂN TRẮNG
Lê Minh Hải1, Mai Thị Minh Ngọc2, Đoàn Quốc Hưng1
TÓM TẮT
Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) do tác nhân vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra là một trong những nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm công nghiệp Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tìm ra các thông số kỹ thuật tối ưu của quy trình trích lý tinh dầu bạch đàn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của tinh dầu và chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn đối với 2 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 gây bệnh AHPNS ở tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy các yếu tố trích lý, có ảnh hưởng đến hiệu suất trích lý tinh dầu bạch đàn và các điều kiện phù hợp để chưng cất tinh dầu bạch đàn bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước là: tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/7, nhiệt độ 1400C, thời gian 4,5 giờ Thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS của dịch chiết tinh dầu cây Bạch đàn trắng tương đối tốt, khả năng ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung Đường kính vòng
vô khuẩn thu được thấp nhất là 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl và đường kính vòng vô khuẩn thu được cao nhất là 23,55 mm với nồng độ thảo dược là 100 µl Sử dụng chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn trắng trị bệnh AHPNS trên tôm chân trắng cho thấy tỷ lệ chết giảm
Từ khóa: AHPNS, bạch đàn, tinh dầu, Vibrio, tôm chân trắng
1 ĐẶT VẤN ĐỀ2
Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) do tác nhân
vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra là một trong
những nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát
triển bền vững của ngành nuôi tôm công nghiệp Do
tác nhân gây AHPNS là vi khuẩn nên việc lạm dụng
kháng sinh trong nuôi tôm đã phổ biến thì nay lại
càng trở nên thường xuyên và tràn lan Sự lạm dụng
thuốc kháng sinh và sự thiếu hiểu biết về kháng sinh
trong nuôi trồng thủy sản nói chung đã gây ảnh
hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường
sinh thái và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn
kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả điều
trị bệnh và tăng nguy cơ nhiễm khuẩn có khả năng
kháng thuốc cho con người, động vật và tồn dư trong
thịt động vật thủy sản (Brown, 1989) Do vậy, hiện
nay hướng nghiên cứu các chất có hoạt tính kháng
khuẩn nguồn gốc thảo dược được tập trung nghiên
cứu nhằm tạo ra các sản phẩm sử dụng trong phòng
1
Trường Đại học Vinh
2
Trường Đại học Mở Hà Nội
trị bệnh mà thân thiện với môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm (Cos et al., 2006) Kháng sinh có nguồn gốc thảo dược đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng trị bệnh (Nguyễn Văn Thanh
và Nguyễn Thanh Hải, 2014) Dịch chiết lá sim và dịch chiết hạt sim đều cho kết quả kháng vi khuẩn gây AHPNS trong điều kiện in vitro (Đặng Thị Lụa
và cs., 2015)
Cây bạch đàn trắng được xem là cây dược liệu có thể dùng tươi, khô hoặc bào chế thành tinh dầu đều được Tinh dầu bạch đàn trắng được sử dụng để làm thuốc hỗ trợ kháng khuẩn đường hô hấp và chữa một
số bệnh ngoài da Là nguyên liệu chính cho chất gôm, có tác dụng điều trị tiêu chảy, dùng làm săn chắc niêm mạc họng, chống nhiễm trùng vết thương, chữa họng bị giãn và hỗ trợ cải thiện một số bệnh lý
về nha khoa (Đỗ Tất Lợi, 1999) Nhiều nghiên cứu đã khẳng định, hoạt chất chiết xuất từ cây bạch đàn trắng có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh trong đó đã có những chủng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh Trong nghiên cứu này, xác định các yếu tố trích ly tối ưu trong trích ly tinh dầu
Trang 2bạch đàn và thử nghiệm, đánh giá khả năng kháng
khuẩn của tinh dầu bạch đàn trắng và chế phẩm
dạng nhũ tương đối với một số chủng vi khuẩn gây
bệnh AHPNS nguy hiểm trên tôm, làm cơ sở khoa
học cho việc chế tạo các sản phẩm phòng trị bệnh
động vật thủy sản có nguồn gốc thảo dược
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Lá bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis
Dahnardt) được thu hái là loại lá trưởng thành sau
búp hai lá, được rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến
khô Lá khô được nghiền nhỏ đến đường kính < 0,1
mm, bảo quản trong túi nilon kín ở 40C làm nguyên
liệu để tách chiết Vi khuẩn V parahaemolyticus
DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 gây
AHPND đang được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm
Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà
Nội
Nguyên vật liệu khác bao gồm: Môi trường chọn
lọc của vi khuẩn Vibrio là Thiosulfate Citrate Bile
Salts (TCBS) rắn, được sử dụng để nuôi cấy vi
khuẩn Môi trường Nutrient Broth (NB) dạng lỏng
có bổ sung 2% NaCl, được hấp khử trùng ở 121oC
trong 15 phút và dùng để nuôi cấy thu dịch vi khuẩn
Môi trường Mueller Hinton Agar (MA) bổ sung 2%
NaCl được hấp tiệt trùng để nguội tới 40 - 50oC, đổ
vào đĩa petri có đường kính 10 cm với độ dày 4 ± 0,2
mm, sử dụng để thử kháng sinh đồ
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp lôi cuốn hơi nước tách chiết
tinh dầu bạch đàn trắng
Nguyên tắc: Bột lá bạch đàn khô được bổ sung
nước và gia nhiệt cho đến khi hỗn hợp sôi, hơi nước
tạo thành sẽ lôi cuốn tinh dầu đi lên 40 g bột lá bạch
đàn khô được bổ sung nước cất với tỷ lệ 1/5, 1/6,
1/7, 1/8 và 1/9 (bột lá bạch đàn: nước cất) và gia
nhiệt ở nhiệt độ 100-1400C trong thời gian 2,5-5 giờ
Hỗn hợp hơi lỏng tiếp tục vào hệ thống làm nguội và
ngưng tụ tạo thành dung dịch tinh dầu thô Dung
dịch này được bổ sung muối khan Na2SO4 với hàm
lượng 5% khối lượng/thể tích tinh dầu để tách, ly tâm
thu tinh dầu tinh chế
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus
DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 được cấy trên
đĩa thạch TCBS trong tủ ấm 290C/24 giờ để chọn
khuẩn lạc đơn điển hình Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy lắc trong bình tam giác với môi trường NB có bổ sung 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc ở 290C, tốc độ lắc
200 vòng/phút trong 15 giờ Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường NB được xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng =
600 nm Mật độ vi khuẩn sử dụng để định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu tinh dầu là là 108 cfu/ml
2.2.3 Phương pháp thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration) được xác định theo phương pháp hòa tan trong môi trường lỏng TSB Pha dung dịch đối chứng và tinh dầu thành dãy nồng độ cần thử Dãy nồng độ tinh dầu cần thử là 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm,
40 ppm, 80 ppm, 160 ppm, 320 ppm, 640 ppm, 1280
pha loãng theo dãy nồng độ thử và dung dịch đối chứng (DMSO) vào các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trường Lắc đều cho tinh dầu và dung dịch đối chứng hòa tan đều vào môi trường Dùng micro pipette hút 20 µl dịch vi khuẩn đã chuẩn bị đưa vào các ống nghiệm Nuôi ở 290C/24 giờ Mỗi thí nghiệm
từng loại vi khuẩn
2.2.4 Phương pháp bào chế nano nhũ tương
- Pha nước: nước, glycerin, dung dịch đệm phosphat pH 7,4 được đun nóng 70 - 750C
- Pha dầu: Tween 80, tinh dầu, Transcutol HP: đun nóng 65-700C
- Kết hợp 2 pha, siêu âm trong 5 phút; lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm
2.2.5 Xác định hình thái, kích thước hạt nano nhũ tương
Dữ liệu được chụp hình bởi sự trợ giúp của máy TEM (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
2.2.6 Phương pháp thử nghiệm trên động vật thí nghiệm
Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở giai đoạn PL15 được mua từ Tập đoàn Việt Úc, tôm trước khi thí nghiệm được xác định âm tính với V parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR, sau đó tôm được thuần dưỡng ở độ mặn 15‰ trong 15 ngày Tôm chân trắng ăn thức ăn bổ sung tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn sau 30
Trang 3ngày được gây nhiễm với sinh khối 02 chủng vi
khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, V
parahaemolyticus DHM-04.19 có mật độ vi khuẩn
108CFU/ml bằng phương pháp ngâm (Loc et al.,
2013) Cụ thể, thí nghiệm gây nhiễm gồm 8 công
thức thí nghiệm và lặp lại 3 lần, cụ thể 1) công thức
đối chứng dương: không bổ sung cao chiết và gây
nhiễm V parahaemolyticus; 2) công thức thí nghiệm
0,5%: tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu
bạch đàn mức 0,5% và gây nhiễm V
parahaemolyticus; 3) công thức thí nghiệm 1,0%: tinh
dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn 1,0%
và gây nhiễm V parahaemolyticus; 4) công thức thí
nghiệm 1,5%: tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh
dầu bạch đàn 1,5% và gây nhiễm V
parahaemolyticus; 5) công thức đối chứng âm:
Không bổ sung cao chiết và không nhiễm V
parahaemolyticus Tôm được bố trí trong bể kính có
thể tích 50 lít, độ mặn là 15‰ và được sục khí liên tục
với số lượng 20 con/bể Tôm chết sau gây nhiễm
được ghi nhận dấu hiệu bệnh lý và tái định danh lại vi
khuẩn gây nhiễm bằng kỹ thuật PCR
Tỷ lệ sống (%) = (Tổng số tôm thí nghiệm - Tổng
số tôm thí nghiệm chết) × 100
2.2.7 Xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được
lặp lại 3 lần Số liệu được xử lý thống kê sinh học sử
dụng Paired t-test với sự sai khác có ý nghĩa P < 0,05
3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Nghiên cứu các điều kiện trích ly tinh dầu
bạch đàn trắng
3.1.1 Xác định tỷ lệ nước bổ sung vào mẫu trích
ly
Trong quá trình trích ly bằng phương pháp lôi
cuốn hơi nước, nước được bổ sung vào mẫu bột lá
bạch đàn và gia nhiệt sẽ thẩm thấu vào trong các lớp
tế bào, gây phá vỡ túi tinh dầu và lôi cuốn tinh dầu
theo hơi nước trong quá trình chưng cất Nếu lượng
nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối
bao bọc xung quanh túi tinh dầu, làm tinh dầu không
thoát ra được Sử dụng càng nhiều dung môi để trích
ly thì khả năng khuếch tán của tinh dầu vào dung
môi càng lớn (Đặng Thị Lụa, 2015) Tuy nhiên, ở một
giới hạn nhất định lượng tinh dầu thu hồi sẽ tăng lên
không đáng kể dù tăng lượng dung môi Bên cạnh
đó, lượng nước quá nhiều làm giảm hiệu quả kinh tế
của quá trình chưng cất do tốn năng lượng cấp nhiệt,
tăng thể tích thiết bị Do vậy, xác định tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cho quá trình trích ly để đạt hiệu quả kinh tế cao nhất là cần thiết
Trong thí nghiệm này đã cố định bột lá bạch đàn
là 40 g và thay đổi lượng nước thêm vào để đạt tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/5 đến 1/9
Hình 1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
đến lượng tinh dầu bạch đàn Kết quả nghiên cứu và số liệu trên hình 1 cho thấy lượng tinh dầu thu được có xu hướng tăng tỷ lệ thuận với lượng dung môi sử dụng Với các mẫu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, lượng tinh dầu thu được tương ứng là 0,51; 0,57; 0,69; 0,69
và 0,66 ml Quy luật biến thiên này cũng phù hợp với công bố trước đây của Nguyễn Hoàng Lan và cộng
sự (2014) trong nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô Từ kết quả nghiên cứu trên đã lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/7 cho các thí nghiệm tiếp theo
3.1.2 Xác định nhiệt độ trích ly Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau (100 - 1400C) đến lượng thu hồi tinh dầu bạch đàn được trình bày trong hình 2
Hình 2 Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo
nhiệt độ trích ly Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu thu nhận tăng dần theo các mức nhiệt độ 100, 110, 120,
130, 1400C và đạt giá trị cao nhất ở 1400C với các giá
Trang 4trị tương ứng là 0,88; 0,94; 1,12, 1,58; 1,60 ml Với kết
quả thu được đã xác định nhiệt độ chưng cất là
1400C
Kết quả nghiên cứu và công bố trước đây của
Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014) trong
nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô
cho thấy nhiệt độ trích lý tinh dầu ở 5 mức nhiệt độ:
30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC thì hiệu suất thu nhận
tinh dầu tăng và hiệu suất thu nhận tinh dầu đạt cao
nhất (92,11%) Tăng nhiệt độ lên 70oC, hiệu suất thu
nhận lại giảm (89,91%) Do đó, nhiệt độ 60oC là thích
hợp cho quá trình trích ly tinh dầu tía tô So sách kết
quả nghiên cứu của chúng tôi với nghiên cứu của
Nguyễn Hoàng Lan và cộng sự (2014) trong
nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô
thì có sự khác biệt về mức nhiệt độ trích lý giữa 2
loài cây bạch đàn trắng và tía tô
3.1.3 Xác định thời gian trích ly
Thời gian trích ly phụ thuộc vào các yếu tố:
nguyên liệu, dung môi, nhiệt độ, bên cạnh đó, về
nguyên tắc thì thời gian trích ly càng dài thì hàm
lượng tinh dầu thu hồi càng cao (Đặng Thị Lụa,
2015) Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian đến một giới
hạn nhất định thì lượng tinh dầu thu được không
tăng nữa, đồng thời có thể ảnh hưởng xấu đến chất
lượng sản phẩm Do vậy, cần xác định thời gian trích
ly thích hợp Thời gian trích ly được khảo sát là từ 3-
5 giờ
Hình 3 Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo
thời gian trích ly
Số liệu ở hình 3 cho thấy: lượng tinh dầu thu hồi
có xu hướng tăng theo thời gian trích ly Cụ thể
lượng tinh dầu từ các mẫu thí nghiệm chưng cất ở 3;
3,5; 4 giờ thu được tương ứng là: 0,87; 1,08; 1,15; 1,18
ml Tuy nhiên, khi mẫu được chưng cất ở 5 giờ thì
lượng tinh dầu thu hồi được tương đương với lượng
tinh dầu thu hồi sau 4 giờ trích ly Kết quả này cũng
phù hợp với quy luật biến thiên của lượng sản phẩm
thu được khi tách chiết tinh dầu riềng theo công bố của Võ Kim Thành và cộng sự (2010) Mặt khác, thời gian trích ly kéo dài làm tiêu hao nhiều năng lượng cho quá trình cấp nhiệt Nguyễn Hoàng Lan và cộng
sự (2014) trong nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô thì thời gian trích ly được khảo sát là
10, 11,12, 13, 14 giờ, kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu nhận tinh dầu càng cao Tuy nhiên, khi thời gian tăng lên 13 và
14 giờ thì hiệu suất thu nhận tinh dầu có tăng nhưng không đáng kể
Vì vậy, thời gian thích hợp để trích ly tinh dầu bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước là 4,5 giờ
3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu bạch đàn
Tác dụng diệt khuẩn của tinh dầu bạch đàn trên
vi khuẩn gây AHPNS Khả năng diệt vi khuẩn gây AHPNS của tinh dầu bạch đàn được thể hiện trên bảng 1 và hình 4 Kết quả cho thấy tinh dầu bạch đàn có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS, đường kính vòng vô khuẩn bình quân tăng dần theo lượng tinh dầu bạch đàn sử dụng
Bảng 1 Tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây AHPNS của
tinh dầu bạch đàn in vitro Đường kính vòng vô khuẩn (mm)/các
chủng vi khuẩn
Lượng tinh dầu sử dụng (µl)
V parahaemolyticus DHM-03.18
V parahaemolyticus DHM-04.19
25 9,35 ± 0,05 13,06 ± 0,13
50 12,71 ± 0,18 13,40 ± 0,07
75 13,52 ± 0,25 13,90 ± 0,10
100 23,54 ± 0,51 23,55 ± 0,19 Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS của dịch chiết tương đối tốt, trong đó tác dụng đối với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-04.19 cao hơn so với chủng V parahaemolyticus DHM-03.18 (Hình 4) Khả năng ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu
bổ sung, đối với chủng V parahaemolyticus DHM-03.18, đường kính vòng vô khuẩn thu được thấp nhất
là 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl và đường kính vòng vô khuẩn thu được cao nhất là 23,54 mm ứng với nồng độ thảo dược là 100 µl Tương tự đối với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-04.19
Trang 5đường kính vòng vô khuẩn thu được thấp nhất là
13,06 mm và cao nhất là 23,55 mm Đặcbiệt, sự sai
khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
Hình 4 Khả năng kháng vi khuẩn gây AHPNS của
tinh dầu lá bạch đàn Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả
công bố của một số nhóm nghiên cứu trước về khả
năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thực vật Nghiên
cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo
dược đối với vi khuẩn Vibrio spp gây AHPNS, Đặng
Thị Lụa và công sự (2015) cũng đã bước đầu cho
thấy tiềm năng kháng vi khuẩn gây AHPNS của dịch
chiết lá trầu không và lá ổi với đường kính vòng vô
khuẩn tương ứng dao động từ 15 - 17,3 mm và 14,6 –
20 mm So sánh với kết quả trên, khả năng kháng
khuẩn của tinh dầu bạch đàn là cao hơn so với dịch
chiết lá trầu không và dịch chiết lá ổi
Kết quả nghiên cứu này cho biết tinh dầu bạch
đàn có tiềm năng phát triển thành chế phẩm thảo
dược phòng trị AHPNS trên tôm Hơn nữa, cây bạch
đàn là loại cây rất phổ biến ở nước ta, việc thu hái
như phương pháp đã miêu tả rất đơn giản, dễ làm và
dễ áp dụng là điều kiện thuận lợi để có nguồn vật liệu
để sản xuất chế phẩm với số lượng lớn
3.3 Nghiên cứu các điều kiện tạo nhũ tương tinh
dầu bạch đàn trắng
Trên thực tế, việc phòng và điều trị bệnh cho
tôm chủ yếu vẫn sử dụng kháng sinh Nguyên nhân
chủ yếu là do hiệu quả phòng trị bệnh của các chế
phẩm thảo dược chưa cao, lượng sử dụng nhiều, thời
gian sử dụng kéo dài Trong thực tế, phần lớn các
hoạt chất kháng sinh, kháng nấm trong thực vật đều
được thu nhận bằng những phương pháp truyền
thống, do đó độ ổn định chưa cao, nhất là với những
hoạt chất không hòa tan trong nước dẫn đến khó áp dụng trong nuôi trồng thủy sản
Các hoạt chất nếu không được tách chiết sẽ khó phát huy tác dụng do khó kiểm soát được liều thực tế của hoạt chất vì vậy không xác định được liều phòng bệnh hay trị bệnh hiệu quả Bên cạnh đó, đối với các loại chế phẩm ở dạng tinh dầu, do mức độ phân tán
và thẩm thấu hạn chế cũng dẫn tới hiệu xuất sử dụng kém làm giảm hiệu quả điều trị Việc bào chế các chế phẩm nhũ tương ở dạng nano với kích thước 100-400
nm làm giảm sức căng bề mặt, xác định được hàm lượng hoạt chất trong một liều điều trị hiệu quả, giúp phân tán đều chế phẩm trong môi trường, tăng cường sự hấp thu, thẩm thấu chế phẩm trong cơ thể vật chủ để điều trị hiệu quả
Bảng 2 Thành phần của dịch nhũ tương tinh dầu
bạch đàn Thành phần Khoảng biến thiên Nồng độ Span 80 0,5 - 1,5 (%) Loại chất diện hoạt thân nước
(Tween 80/Cremophor EL) 1%
Tinh dầu bạch đàn 3-5 (%) Loại dung môi dầu (Labrafac
PG, Isopropyl mirista) 3-5(%) Transcutol HP 1-2(%) Loại dung dịch đệm (Borat,
Phosphate, Citrate)
0,1 - 0,2 M (vừa đủ 100%)
Trong nghiên cứu này, chế phẩm kháng sinh dạng nhũ tương nano từ lá bạch đàn dùng để phòng
và điều trị bệnh cho tôm nuôi được bào chế thông qua hai bước: i) tách chiết tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước và ii) nhũ hóa bằng phương pháp siêu âm để sản xuất các chế phẩm dạng nhũ tương nano từ thực vật phòng và điều trị bệnh AHPNS cho tôm nuôi Việc nhũ tương hóa tinh dầu bạch đàn sẽ tập trung được các hoạt chất với nồng độ cao, giữ nguyên vẹn được hoạt tính sinh học, không gây ô nhiễm môi trường so với dạng thô, giảm gây thất thoát hoạt chất so với dạng cao đặc, giảm thiểu thất thoát hoạt chất so với dạng tinh dầu Các chế phẩm nhũ tương dạng nano này với những ưu điểm nổi bật so với phương pháp truyền thống như kích thước nm, được bổ sung chất hoạt động bề mặt giúp tăng độ hòa tan trong nước và có tính ổn định nhiệt động học cao, dễ dàng thẩm thấu vào tế bào và giúp tăng độ hấp thụ ở động vật thủy sản, qua đó có thể
Trang 6ứng dụng tốt trong điều trị bệnh cho tôm nuôi công
nghiệp
Trong các nghiên cứu này, công thức nhũ hóa
tinh dầu bạch đàn được thực hiện theo bảng 2 với các
thành phần cơ bản như sau: tinh dầu, glycerin (5%)
Tween 80 (hoặc Cremophor EL, Tween
80/Cremophor EL (1/1)), Span 80, Labrafac PG
(hoặc isopropyl myristat), Transcutol HP, đệm borat
(phosphat, citrat) (vừa đủ 100% kl/kl)
3.3.1 Ảnh hưởng của các thành phần và loại
thành phần tới sự giải phóng của hạt nhũ tương
Về ảnh hưởng của Tween 80 và isopropyl
myristat tới mức độ giải phóng dược chất từ nano
nhũ tương, kết quả trong hình 5 cho thấy nếu loại
dung môi pha dầu là isopropyl myristat tăng và
lượng Tween 80 giảm thì sẽ làm tăng mức độ giải
phóng
Hình 5 Ảnh hưởng của isopropyl myristat và
Tween 80 tới mức độ giải phóng dược chất từ
nano nhũ tương (Span 80 = 1,0%, Transcutol HP =
1,5%, đệm phosphat 0,15 M, pH = 7,0)
Hình 6 Ảnh hưởng của lượng tinh dầu và Span 80 tới
phần trăm giải phóng dược chất sau 6 giờ (isopropyl
myristat = 4,0%, Transcutol HP = 1,5%, đệm citrat
0,15 M, pH = 7,0) Kết quả nghiên cứu và hình 6 chỉ ra khi lượng
tinh dầu giảm và lượng Span 80 giảm thì phần trăm
dược chất giải phóng sau 6 giờ tăng Điều này có thể
thấy rằng với hoạt chất trong dạng nhũ tương có độ
tan trong pha nước lớn hơn tinh dầu Bên cạnh đó,
tinh dầu, bản thân nó cũng là một chất diện hoạt yếu
giúp cho sự hình thành nano nhũ tương một cách dễ
dàng do vậy khi tăng tỉ lệ Tween 80, Span 80 chỉ làm
tăng độ nhớt của nano nhũ tương nên làm chậm tốc
độ khuếch tán dược chất ra khỏi hệ
3.3.2 Xác định hình thái, kích thước hạt nano nhũ tương (TEM)
Cấu trúc nano nhũ tương có tinh dầu bạch đàn qua chụp TEM cho thấy có sự phân bố giọt đồng đều nhau và kích thước hạt nằm trong khoảng từ 20 - 250
nm Điều này có thể cho thấy tinh dầu vừa chứa hoạt chất vừa là chất diện hoạt yếu, nó giúp phân tách các hạt nano nhũ tương nhờ lực đẩy ion vì thế các hạt tách rời hẳn nhau và có kích thước khá đồng đều
Hình 7 Ảnh chụp TEM của nano nhũ tương chứa
tinh dầu bạch đàn 3.4 Nghiên cứu tác dụng phòng bệnh do hoại tử gan tụy ở tôm bằng nhũ tương tinh dầu
Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung nhũ tương tinh dầu bạch đàn và tinh dầu sau 30 ngày thì được gây nhiễm với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, theo dõi các biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ sống của tôm sau 14 ngày gây nhiễm
Hình 8 Tỷ lệ sống sót của tôm thí nghiệm sau 14
ngày thí nghiệm (%) Kết quả nghiên cứu được trình bày tại hình 8 cho thấy: ở các bể đối chứng âm không xuất hiện tôm chết, tỷ lệ sống đạt 100% cho đến khi kết thúc thí nghiệm, tôm hoạt động bình thường, gan tụy sẫm màu, ruột đầy thức ăn Ở bể đối chứng dương, tôm bắt đầu chết vào ngày thứ 2 sau khi gây nhiễm và
Trang 7giảm mạnh ở ngày thứ 3-9, tỷ lệ sống của bể đối
chứng dương là 15% sau 9 ngày gây nhiễm Ở các
công thức thí nghiệm bổ sung tinh dầu với hàm
lượng 1 và 1,5% và bổ sung nhũ tương tinh dầu với
hàm lượng 0,5-1% thì tôm ngừng chết sau 5 ngày thí
nghiệm, riêng công thức thí nghiệm bổ sung 0,5%
tinh dầu thì tôm ngừng chết sau 8 ngày thí nghiệm
So sánh tác dụng điều trị bệnh do vi khuẩn V
parahaemolyticus gây ra ở tôm của tinh dầu và nhũ
tương tinh dầu bạch đàn cho thấy, tỷ lệ sống của tôm
ở các bể sử dụng nhũ tương tinh dầu bạch đàn đạt
cao hơn so với các bể sử dụng tinh dầu ở cùng hàm
lượng, cụ thể: ở tất cả các bể thí nghiệm với hàm
lượng nhũ tương tinh dầu, tỷ lệ tôm sống đều đạt 95%
sau 5 ngày thí nghiệm và duy trì đến ngày thứ 14
trong khi các bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu
là 0,5%, tỷ lệ tôm sống đạt 75% sau 8 ngày thí nghiệm,
còn các bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu là 1 và
1,5% thì tỷ lệ tôm sống đạt 85% sau 5 ngày thí
nghiệm
Bên cạnh đó, quan sát dấu hiệu lâm sàng của
tôm sau khi gây nhiễm đã nhận thấy: sau 12 - 15 giờ
gây nhiễm ở các công thức thí nghiệm bổ sung tinh
dầu với hàm lượng 0,5; 1 và 1,5% tôm có dấu hiệu
giảm hoạt động, đặc biệt ở bể đối chứng dương, sau
24 giờ gây nhiễm, tôm có dấu hiệu bơi lờ đờ ít hoạt
động, bỏ ăn, ruột rỗng, gan tụy nhạt màu và teo
(Hình 9), các dấu hiệu bệnh lý trên tương tự với mô
tả của Lightner et al (2013)
A B
Hình 9 Tôm chân trắng thí nghiệm gây nhiễm với
vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan
tụy cấp A: Tôm bình thường có ruột đầy và gan tụy màu
sắc bình thường;
B: Tôm nhiễm bệnh nhạt màu ruột rỗng, gan tụy
teo
Nghiên cứu của Jayanthi et al (2013) cũng cho rằng, chiết xuất ethanol của lá cây đậu dầu (Pongamia pinnata) giúp tăng tỉ lệ sống của tôm sú (Penaeus monodon) khi gây nhiễm với WSSV Tỷ lệ sống của tôm được bổ sung chiết xuất ở mức 200 và
300 µg/g khối lượng thân tương ứng là 40% và 80% Nghiên cứu của Immanuel et al (2004) sử dụng chiết xuất thầu dầu làm thức ăn cho tôm Peneaus indicus (PL30) liên tục trong 30 ngày Kết quả ghi nhận tỷ lệ sống của tôm ở công thức thí nghiệm bổ sung cao chiết thầu dầu (58,88%) cao hơn công thức thí nghiệm đối chứng (24,44%); ngoài ra, các loại thảo dược khác được sử dụng trong thí nghiệm này cũng mang lại kết quả tương tự Balasubramanian et al (2008) nghiên cứu hoạt tính kháng virus (WSSV) trên tôm sú (P monodon) của chiết xuất cây cỏ gà (Cynodon dactylon)
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất C dactylon có hiệu quả cao trong việc phòng bệnh do WSSV; không có tôm chết ở công thức thí nghiệm
bổ sung 2% chiết xuất so với tỷ lệ chết 40% ở công thức thí nghiệm bổ sung 1% chiết xuất Tôm chân trắng được bổ sung cao chiết Gynura bicolor trong
6 ngày và gây nhiễm với V alginolyticus Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của tôm ăn thức ăn bổ sung G bicolor ở nồng độ 0,5; 1,0 và 2 g/kg thức ăn (36,7; 43,3 và 56,7%) cao hơn đáng kể (p<0,05) so với công thức thí nghiệm đối chứng (23,3%) Kết quả thí nghiệm gây nhiễm cho thấy việc bổ sung cao chiết thầu dầu giúp tôm chân trắng gia tăng sức đề kháng với V parahaemolyticus Điều đáng lưu ý, công thức thí nghiệm bổ sung 1,0% cho tỷ lệ sống cao hơn (P<0,05) so với công thức thí nghiệm bổ sung 0,5; 1,5% cao chiết Điều này có thể giải thích là do một
số hợp chất trong cao chiết lá thầu dầu khi được bổ sung liên tục trong thời gian dài với liều lượng lớn
có thể gây ức chế đáp ứng miễn dịch của tôm Theo Bigi và cộng sự (2004) chiết xuất lá thầu dầu tươi hay bằng methanol cũng cho thấy có độc tính cao đối với một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng
4 KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xác định ảnh hưởng của các điều kiện trích ly đến hiệu suất trích ly tinh dầu bạch đàn
và xác định các các thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp lôi cuốn hơi nước để trích ly tinh dầu bạch đàn là: tỷ lệ nguyên liệu/nước 1/7, nhiệt độ
1400C, thời gian 4,5 giờ
Trang 8Dịch chiết tinh dầu và nhũ tương tinh dầu bạch
đàn trắng có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn
Vibrio gây AHPNS tương đối tốt, khả năng ức chế vi
khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung, sự sai
khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
Thành phần Tween 80, Span 80 và isopropyl
myristate có ảnh hưởng tới mức độ giải phóng dược
chất từ nano nhũ tương Cấu trúc nano nhũ tương có
tinh dầu bạch đàn qua chụp TEM cho thấy có sự
phân bố giọt đồng đều nhau và kích thước hạt nằm
trong khoảng từ 20 - 250 nm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ashida, M., and H I Yamazaki (1990)
Biochemistry of the phenoloxidase system in insects
with special reference to its activation In: Ohnishi E
and Ishizaki H (eds) Molting and Metamorphosis
Springer-Verlag, Berlin pp 239–265
2 Aureli, P., Costantini, A., and Zolea, S (1992)
Antimicrobial activity of some plant essential oils
against Listeria monocytogenes Journal of food
protection 55(5): 344-348
3 Balasubramanian, G., Sarathi, M., Kumar,
S.R., and Hameed, A S (2007) Screening the
antiviral activity of Indian medicinal plants against
white spot syndrome virus in shrimp Aquaculture
263(1): 15-19
abuse in aquaculture World Aquac., 20(2): 34 - 43
5 Chang, Y P., Liu, C H., Wu, C C., Chiang, C
M., Lian, J L., and Hsieh, S L (2012) Dietary
administration of zingerone to enhance growth,
non-specific immune response, and resistance to Vibrio
alginolyticus in Pacific white shrimp (Litopenaeus
vannamei) juveniles Fish & shellfish immunology
32(2): 284-290
6 Cos P., Vlietinck A J., Berghe D V., and Maes
L (2006) Anti-infective potential of natural products:
How to develop a stronger in vitro ‘proof of concept’
J Ethnopharmacol., 106(3): 290 -302
7 Huỳnh Kim Diệu, Lê Thị Loan Em (2011)
Đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng
khuẩn của cây cỏ mực (Eclipta prostra) và cây diệp
sông Cửu Long Tạp chí Khoa học - Trường Đại học
Cần Thơ 2011:19a 149-155
8 Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học thành phố Hồ Chí Minh
9 Nguyễn Thị Hạnh và Đặng Thị Lụa (2015) Tác dụng diệt khuẩn của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại
tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 5
10 Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho (2013) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với E coli kháng ampicillin, kanamycin Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập
11, số 6: 804- 808
11 Immanuel, G., Vincybai, V C., Sivaram, V., Palavesam, A., and Marian, M P (2004) Effect of butanolic extracts from terrestrial herbs and seaweeds on the survival, growth and pathogen (Vibrio parahaemolyticus) load on shrimp Penaeus indicus juveniles Aquaculture 236(1-4): 53-65
12 Lightner, D V., Redman, R M., Pantoja, C R., Noble, B L., Loc, T (2012) In: M Shariff, R.P Subasinghe and J.R Authur (eds.) Diseases in Asian Aquaculture 1.Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines.pp 143-155
13 Đặng Thị Lụa, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Hải
Hà, Trường Thị Mỹ Hạnh, Phan Thị Vân (2015) Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá trầu không (Piper betle L.) và dịch chiết lá ổi (Psidium guajava) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi nước lợ Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 11/2015: 92 – 97
14 Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thanh Hải (2015) Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết là sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13,
số 7: 1101-1108
15 Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuât,
Lê Danh Tuyên, Ngô Thị Huyền Trang, Đỗ Thị Trang (2014) Nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập
12, số 3:404-411
16 Đỗ Tất Lợi (1968) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội
17 Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải (2014) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của
Trang 9dịch chiết cây mò hoa trắng (Clerodendron fragrans
từ phân lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu
chảy và thử nghiệm điều trị Tạp chí Khoa học và
Phát triển, 12(5): 683 - 689
18 Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải (2016) Tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá Trầu không (Piper betle) đối với vi khuẩn Aeromonas SPP và Streptococcus agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi Tạp chí Khoa học Việt Nam
2016, tập 14, số 6: 869- 8761
RESEARCH ON CREATING EMULSION FROM ANTIBACTERIAL COMPOUND OF
Eucalyptus camaldulensis FOR PREVENTION TREATMENT OF HEPATOPANCREATIC NECROSIS
IN WHITE SHRIMP
Le Minh Hai, Mai Thi Minh Ngoc, Doan Quoc Hung Summary
Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) caused by V parahaemolyticus is the main cause affecting the sustainable development of the shrimp farming industry The study was conducted in order to find out the optimal specifications Eucalyptus essential oil extraction, assessing the antibacterial ability of essential oil and Eucalyptus essential oil to two strains of bacteria V parahaemolyticus DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 causing acute hepatopancreatic necrosis in shrimp cultured in vitro laboratory The results show that the extraction factors, affecting the efficiency of extracting eucalyptus essential oil and the suitable conditions for distillating eucalyptus oil by steam attraction method are: materials/water ratio of 1/7, 1400
C, 4.5 hours The use of eucalyptus oil to inhibit AHPNS causing vibrio in the testing shows a positive result in which the resistance is positively correlated with the antimicrobial activity of esensial oil.The lowest obtained sterile ring diameter was 9.35 mm, corresponding to the amount
of 25 µl of essential oil and the highest diameter of sterile ring was 23.55 mm with an herbal concentration
of 100 µl Using white eucalyptus oil emulsion to treat AHPNS on white shrimp showed that the mortality rate decreased and still developed well
Keywords: Essential oil, Eucalyptus camaldulensis, AHPND, Vibrio, white shrimp
Người phản biện: TS Bùi Quang Tề
Ngày nhận bài: 16/7/2020
Ngày thông qua phản biện: 17/8/2020
Ngày duyệt đăng: 24/8/2020