Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết rễ lá cây bồ công anh ở đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN TRƯƠNG THIỆN VŨ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH Ở ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN TRƯƠNG THIỆN VŨ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH

Ở ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

ĐÀ NẴNG, NĂM 2017

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG

ĐÀ NẴNG, NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Trương Thiện Vũ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

6 Bố cục đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BỒ CÔNG ANH 4

1.1.1 Giới thiệu chung về cây bồ công anh 4

1.1.2 Sơ lược về họ Cúc 4

1.1.3 Sơ lược về chi Lactuca 5

1.1.4 Giới thiệu một số đặc điểm của cây bồ công anh Việt Nam 6

1.1.5 Công dụng của cây bồ công anh trong đời sống 7

1.1.6 Nghiên cứu về dược tính cây bồ công anh 8

1.1.7 Một số công trình nghiên cứu về cây bồ công anh 9

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH 10

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN 13

1.3.1 Kỹ thuật chiết Soxhlet 13

1.3.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách 15

1.3.3 Chưng cất để loại dung môi 16

1.3.4 Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 16

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN LIỆU 19

2.1.1 Thu nguyên liệu rễ, lá cây bồ công anh 19

2.1.2 Sơ chế nguyên liệu 19

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 20

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 20

2.2.2 Hóa chất 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lí 21

2.3.2 Khảo sát điều kiện chiết thích hợp 22

2.3.3 Phương pháp tách chất 23

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học 23

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa DPPH 24

2.4 SƠ ĐỒ QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 28

3.1.1 Độ ẩm 28

3.1.2 Hàm lượng tro 29

3.1.3 Hàm lượng kim loại 29

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI 30

3.2.1 Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi n-hexan 31

3.2.2 Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi diclometan 40

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi etyl axetat 49

3.2.4 Khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng dung môi metanol 58

3.2.5 Hiệu quả chiết rễ, lá cây bồ công anh bằng các dung môi theo thời gian 68 3.2.6 Tổng hợp xác định thành phần hóa học của dịch chiết rễ, lá cây bồ công

anh bằng các dung môi 69

3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 74

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (Bản sao)

3.5 Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong rễ cây

3.8 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan

3.9 Kết quả chiết lá cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan theo

3.10 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan

3.11 Kết quả chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi diclometan

3.12 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết

diclometan từ rễ cây bồ công anh 42

Số hiệu

3.13 Kết quả chiết lá cây bồ công anh bằng dung môi diclometan theo

3.14 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết

diclometan từ lá cây bồ công anh 46

3.15 Kết quả chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi etyl axetat theo

3.16 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etyl

3.17 Kết quả chiết lá cây bồ công anh bằng dung môi etyl axetat theo

3.18 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etyl

3.19 Kết quả chiết rễ cây bồ công anh bằng dung môi metanol theo

3.20 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết metanol

3.21 Kết quả chiết lá cây bồ công anh bằng dung môi metanol theo

3.22 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết metanol

3.23 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất (%) chiết 68

3.24 Tổng hợp định danh các cấu tử có trong dịch chiết rễ, lá cây

3.25 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

2.1 Cây bồ công anh ở huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng 19 2.2 Rễ, lá bồ công anh sau khi phơi khô 20 2.3 Bột rễ, bột lá của bồ công anh sau khi xay 20 2.4 Sơ đồ quy trình nghiên cứu rễ, lá cây bồ công anh 27 3.1 GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ cây bồ công anh 33 3.2 GC-MS của dịch chiết n-hexan từ lá cây bồ công anh 36 3.3 GC-MS của dịch chiết diclometan từ rễ cây bồ công anh 42 3.4 GC-MS của dịch chiết diclometan từ lá cây bồ công anh 46 3.5 GC-MS của dịch chiết etyl axetat từ rễ cây bồ công anh 51 3.6 GC-MS của dịch chiết etyl axetat từ lá cây bồ công anh 55 3.7 GC-MS của dịch chiết metanol từ rễ cây bồ công anh 60 3.8 GC-MS của dịch chiết metanol từ lá cây bồ công anh 64

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Với sự phát triển quá nhanh của xã hội hiện nay dẫn đến nhiều vấn đề chưa được giải quyết kịp thời như: khí thải, nước thải công nghiệp, rác thải, … làm cho môi trường ngày càng trở nên ô nhiễm; dẫn đến hậu quả là con người phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức, cũng như phải đối mặt với nhiều nguy cơ bệnh tật Thực tế đó đã thúc đẩy chúng ta phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao hơn, tác dụng chọn lọc hơn và giá thành rẻ hơn để điều trị các bệnh hiểm nghèo

Ngày nay, y học hiện đại đã chứng minh nhiều loại thảo dược có tác dụng chữa bệnh thần kỳ Ưu điểm của các loại thảo dược là có tác dụng vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là thuốc tây, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ không mong muốn Trong số các loài cây thảo dược, cây bồ công anh được biết đến như là phương thuốc hữu hiệu có tác dụng thanh nhiệt giải độc, trị các chứng ung nhọt, sang lở, nhũ ung, trường ung, đau họng, mắt sưng đỏ đau, chứng viêm gan vàng da, viêm tiết niệu Bồ công anh còn có tên gọi khác là rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp trời, rau mũi cày Bồ công anh thường mọc hoang dại ven đường, các sườn đồi nhiều nắng Bồ công anh là loại cây thân cỏ sống dai, rễ đơn, dài, khỏe, thuộc loại rễ hình trụ [22], [25]

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học tại Đại học Windsor, họ phát hiện ra rằng rễ bồ công anh phá hủy các tế bào ung thư mà không làm hại các tế bào khỏe mạnh và kết quả đã được công bố trên trang web “Natural News” Ở Việt Nam và trên thế giới, các công trình nghiên cứu về loài cây này hầu như rất ít Người ta chỉ biết đến bồ công anh như là vị thuốc quý có giá trị chữa bệnh cao còn thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chất trong dịch chiết từ các bộ phận của bồ công

anh chưa được biết nhiều đến [24] Vì vậy, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách

và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết rễ, lá cây bồ công anh ở

Đà Nẵng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Mục tiêu chung:

+ Xác định thành phần hóa học trong rễ và lá cây bồ công anh từ đó làm tiền đề cho việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học cũng như tiến tới phân lập các chất làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu

- Mục tiêu cụ thể: với mục tiêu trên, trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài,

tôi sẽ tập trung giải quyết các mục tiêu cụ thể sau đây:

 Nghiên cứu chiết tách, lựa chọn dung môi chiết thích hợp

 Xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết hữu cơ của rễ và lá cây

bồ công anh

 Thăm dò hoạt tính sinh học trong một số dịch chiết của rễ và lá cây bồ công anh

3 Đối tượng nghiên cứu

- Rễ, lá cây bồ công anh được thu hái ở huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

4 Phương pháp nghiên cứu

 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu nhập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của rễ, lá cây bồ công anh

- Tìm hiểu phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định cấu trúc hóa học các chất từ thực vật

 Nghiên cứu thực nghiệm

- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu

- Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định các thông số hóa lý (xác định

độ ẩm trong nguyên liệu khô)

- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro

- Khảo sát định tính một số hợp chất hữu cơ trong rễ, lá cây bồ công anh

- Phương pháp chiết: chiết soxhlet trong dung môi n-hexan, diclometan (DCM), etyl axetat (EtOAc), metanol (MeOH)

- Phương pháp vật lý: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác

định hàm lượng các kim loại nặng; phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) nhằm xác định thành phần, định danh các cấu tử trong mỗi dịch chiết

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

a Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp các thông tin khoa học về quy trình chiết tách và thành phần cấu tạo một số hợp chất có trong rễ, lá cây bồ công anh

- Cung cấp các số liệu thực nghiệm cho các nghiên cứu tiếp theo sâu hơn về rễ,

lá cây bồ công anh

b Ý nghĩa thực tiễn

- Sử dụng rễ, lá cây bồ công anh chữa bệnh một cách khoa học, không chỉ dùng hạn chế trong y học cổ truyền mà còn có thể mở rộng nghiên cứu nhiều hơn để chế

tạo các dạng thuốc trong y học hiện đại

- Giải thích một cách khoa học một số công dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian của cây bồ công anh

6 Bố cục đề tài

Ngoài phần mở đầu, danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt, danh mục các bảng, danh mục các hình, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo và phụ lục Luận văn được chia làm các chương như sau:

Chương 1 Tổng quan

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BỒ CÔNG ANH

1.1.1 Giới thiệu chung về cây bồ công anh

Bồ công anh còn gọi là rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp

trời, rau mũi cày (Lactuca indica) là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc

(Asteraceae), chi Lactuca

Bồ công anh thường mọc hoang dại ven đường, các sườn đồi nhiều nắng, ở cao

độ từ thấp tới trung bình, sống một năm hoặc hai năm

Bồ công anh thường phân bố ở Đông Nam Á, Ấn Độ, đông Siberi, Nhật Bản và miền nam Trung Quốc, Đài Loan [22]

1.1.2 Sơ lược về họ Cúc

Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm Tên gọi khoa học của họ

này có từ chi Aster (cúc tây) Họ Asteraceae là họ lớn thứ nhất hoặc thứ hai trong

ngành Magnoliophyta, chỉ có họ Phong lan (Orchidaceae) là có thể có sự đa dạng lớn hơn, với khoảng 25.000 loài đã được miêu tả Họ này theo các định nghĩa khác nhau chứa khoảng 900-1.650 chi và từ 13.000-24.000 loài Theo dữ liệu của Vườn thực vật hoàng gia Kew mà APG II trích dẫn, họ này chứa 1.620 chi và 23.600 loài Các chi

lớn nhất là Senecio (1.500 loài), Vernonia (1.000 loài), Cousinia (600 loài),

Centaurea (600 loài)

Họ Cúc là một họ lớn có mức tiến hóa cao nhất trong các loài thực vật hạt kín hai lá mầm Họ này có hơn 350 đại diện ở Việt Nam, gần đây có thêm rất nhiều loài được nhập về trồng phục vụ ngành hoa kiểng, tên khoa học các loài này chưa được cập nhật trong các sách tra cứu thực vật

Họ Asteraceae phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực

ôn đới và miền núi nhiệt đới Bộ Asteraceae có thể được đặc trưng ở mức độ phân tử

và hình thái học Các đặc điểm chung bao gồm nhóm các oligosacarit nguồn gốc tự

nhiên (các phân tử đường sacaroza liên kết với nhau) như là nơi lưu trữ chất dinh dưỡng và các nhị hoa thông thường được tập hợp lại dày dặc xung quanh vòi nhụy hoặc thậm chí được hợp nhất lại thành ống xung quanh nó Thuộc tính thứ hai có lẽ gắn liền với sự thụ phấn đầu cơ (hay thứ cấp) và điều này rất phổ biến trong các họ của bộ này Một số cây thuộc họ Cúc được giới thiệu trong Hình 1.1

Hình 1.1 Một số cây thuộc họ Cúc

1.1.3 Sơ lược về chi Lactuca

Chi Lactuca, được biết dưới tên gọi thông thường là rau diếp, là một chi thực vật có hoa trong họ Cúc (Asteraceae) Chi này có khoảng 100 loài, phân bổ khắp thế giới, nhưng chủ yếu trong các khu vực ôn đới của đại lục Á-Âu

Đại diện được biết đến nhiều nhất là rau diếp (Lactuca sativa), với rất nhiều

giống và được trồng chủ yếu làm rau ăn, nhưng nhiều loài khác là các loại cỏ dại Chúng là các loài cây sống một năm hoặc lâu năm, có thể cao từ 10–180 cm Chúng tạo ra cụm hoa dạng đầu hình chùy có màu vàng, nâu hay tía với các cánh hoa tia Các loài không ăn được có thể chứa nhiều chất có vị đắng Các loài khác chứa nhựa giống như sữa

Các loài trong chi Lactuca thường có thân thẳng hình trụ Lá mọc ngay từ gốc thân, càng lên càng nhỏ dần; lá ở gốc có cuống còn lá ở thân không cuống Cụm hoa gồm nhiều đầu hoa hợp lại thành chuỳ kép, mỗi đầu có 10-24 hoa dạng lưỡi nhỏ màu

vàng Quả bế hình trái xoan dẹp, màu nâu, có mào lông trắng [26] Một số cây thuộc chi Lactuca được giới thiệu trong Hình 1.2

Hình 1.2 Một số cây thuộc chi Lactuca

1.1.4 Giới thiệu một số đặc điểm của cây bồ công anh Việt Nam

a Tên gọi

-Tên gọi khác: Bồ công anh, rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi

mác, diếp trời, rau mũi cà

-Tên tiếng Anh: Indian Lettuce

-Tên khoa học: Lactuca indica L

b Phân loại khoa học

Giới (regnum) Plantae

Bộ (ordo) Asterales

Họ (familia) Asteraceae Tông (tribus) Cichorieae Chi (genus) Lactuca

c Đặc điểm thực vật, phân bố

Cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica) là một loài cây thân thảo thuộc họ

Cúc (Asteraceae), sống một năm hoặc hai năm, không lông

Bồ công anh Việt Nam mọc hoang tại nhiều tỉnh miền Bắc Việt Nam Đây là loại cây rất dễ trồng bằng hạt, mùa trồng vào tháng 3-4 hoặc 9-10, cũng có thể trồng bằng mẩu gốc, sau 4 tháng là có thể thu hoạch được Thường thì nhân dân ta hái lá

về dùng tươi hay phơi hoặc sấy khô để dùng dần, không cần chế biến gì đặc biệt

Cây Bồ công anh Việt Nam hay Rau diếp Ấn Độ (Lactuca indica) có nguồn gốc

không rõ và phân bố ở Đông Nam Á, Ấn Độ, đông Siberi, Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc, Đài Loan

Cây thường mọc hoang dại ven đường, các sườn đồi nhiều nắng, ở cao độ từ

thấp tới trung bình Ít được trồng Có hai dạng là indivisa (cây được trồng với lá thẳng-mũi mác, không xẻ thùy) và runcinata với lá thuôn dài, xẻ thùy sâu hình lông

chim Cả hai loại đều dùng làm thuốc được [22] Hoa, lá, rễ cây bồ công anh Việt Nam được giới thiệu trong hình 1.3

Hình 1.3 Cây bồ công anh Việt Nam

1.1.5 Công dụng của cây bồ công anh trong đời sống

Tại Hoa Kỳ, nhiều người xem bồ công anh là thần dược có tác dụng điều trị bệnh sưng loét bao tử, ung độc, đặc biệt là ung thư vú Ở nước ta, bồ công anh mọc hoang dại ở các vùng như Đà Lạt, Tam Đảo, Sa Pa và cũng được trồng để lấy lá làm thuốc

Bồ công anh còn chứa nhiều chất sắt tương đương trong rau dền, hàm lượng vitamin A cao gấp bốn lần rau diếp và rất giàu các nguyên tố vi lượng như magie, potassium, calcium, sodium và nhất là vitamin C, B Ngoài ra bồ công anh còn chứa protein, chất béo, tinh bột Theo y học cổ truyền, một số tác dụng chữa bệnh của bồ

công anh như sau:

Chống loãng xương: hàm lượng magie cao trong bồ công anh rất tốt cho những bệnh nhân loãng xương, còi xương [5]

Chữa rối loạn gan mật: Phối hợp với cải xà lách xoong chế thành một loại nước

ép, sẽ rất hiệu quả và giúp gan mật hoạt động bình thường [8]

Chữa suy nhược cơ thể: Bồ công anh có tác dụng nâng đỡ và tăng cường hoạt động của các cơ quan nội tạng trong cơ thể, chữa suy nhược, biếng ăn Nó còn có tính lọc máu, tẩy độc cho cơ thể và làm gia tăng sức đề kháng [23]

Chữa các rối loạn trên hệ bài tiết: toàn cây bồ công anh được chế biến thành một loại trà, uống mỗi ngày làm gia tăng lượng nước tiểu bài tiết [8]

Chữa mụn cóc: cắt ngang phần gốc của cây và lấy chất dịch tiết ra từ cây bôi lên chỗ mụn cóc, 2-3 lần mỗi ngày, sẽ thấy hiệu quả [23], [24]

Chữa viêm tuyến vú, tắc tia sữa: phụ nữ sau khi sinh bị viêm tuyến vú gây đau nhức dữ dội, dùng lá sắc lấy nước uống [5]

Chữa các chứng viêm loét: bồ công anh còn chữa viêm loét dạ dày, ung thư vú,

mụn nhọt, ghẻ lở, các bệnh ngoài da, giúp làn da tươi sáng, trẻ hóa, ngừa ung thư nhờ tác dụng tăng cường thải độc cho gan [5], [8]

1.1.6 Nghiên cứu về dược tính cây bồ công anh

Bồ công anh (Đông y cho là thuộc về hàn lương) được áp dụng phương pháp lồng cử động đã thể hiện tác dụng an thần Flavonoid của bồ công anh đã được nghiên

cứu tác dụng sinh học thấy có tác dụng ức chế men oxy hóa khử peroxydaza và

catalaza máu chuột cống trắng Những thí nghiệm tiến hành với huyết thanh người

cüng cho những kết quả ức chế men oxy hóa khử rõ rệt [5], [8], [22], [23], [24] Theo tài liệu nước ngoài, tại một số nước, người ta có sử dụng và nghiên cứu những loài Lactuca khác như L.Virosa, L Sativa (rau diếp ăn của Việt Nam), thấy những cây này không độc và có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương gây ngủ nhẹ

Bồ công anh có tác dụng giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, tán kết, trị mụn nhọt Bồ công anh thường phối hợp với các vị thuốc khác

Các tác dụng dược lí của bồ công anh:

 Tác dụng kháng khuẩn in vitro trên các vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonellatyphi, Escherichia coli với nồng độ đến 25 µg/ml

 Tác dụng chống nấm in vitro trên Candida albican, Cryptococcus neoformans, trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus aiger với nồng độ đến 25µg/ml

 Tác dụng chống amib trên Entamoeba histolytica chủng STH đến nồng độ 125µg/ml

 Tác dụng chống sán Hymenolepis nana ở chuột cống trắng với liều 250mg/kg

 Tác dụng chống ung thư trên tế bào ung thư biểu mô mũi-thanh quản người

in vitro; trên tế bào ung thư bạch cầu dòng lympho, tế bào sarcom 180 và tế bào gây

u gan ở chuột nhắt trắng

1.1.7 Một số công trình nghiên cứu về cây bồ công anh

Mặc dù cây bồ công anh được biết đến như là một thảo dược có giá trị chữa được nhiều loại bệnh từ rất lâu, tuy nhiên tại Việt Nam cho đến nay có rất ít công trình nghiên cứu về nó Hiện nay, ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu khảo sát xác định thành phần hóa học có trong bộ phận của cây bồ công anh, chỉ có một vài nghiên cứu đánh giá trữ lượng, sự phát triển, phân bố, dược tính của cây

bồ công anh

Công trình nghiên cứu trong nước gần đây nhất ở trong nước là khảo sát bước đầu thành phần hóa học của cây bồ công anh trong cao chiết etyl axetat và đã cô lập

được một flavonoid là luteolin-7-O--D-glucopyranoside Theo nhiều tài liệu công

bố, luteolin-7-O-- D-glucopyra-noside có nhiều tác dụng trong y học đặc biệt là khả

năng ức chế tạo ra cholesterol có hại trong máu, làm giảm nguy cơ bệnh cao huyết áp

ở người [4]

Trên thế giới, các nghiên cứu xác định thành phần hóa học trong một số bộ phận khác nhau của cây bồ công anh cũng như hoạt tính của nó cũng được công bố Abdul Kadir M N Jassim và các cộng sự đã nghiên cứu xác định thành phần hóa học trong

dịch chiết etyl axetat từ lá cây bồ công anh và hoạt tính kháng khuẩn của nó [15] Jeong-Hun Park và các cộng sự đã tiến hành định lượng các hợp chất phenolic và nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết từ các bộ phận của cây bồ công anh [18] Ki Hyun Kim và các cộng sự đã phân lập được dẫn xuất của phenylpropanoid từ cây bồ công anh [20]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH

Thành phần hóa học đã được tìm thấy trong các loài bồ công anh khác nhau đã được công bố trên nhiều tạp chí khoa học [4], [15], [19], [21], [22] và được liệt kê trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học đã được tìm thấy trong các loài

bồ công anh khác nhau

H

Giúp tăng cường hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa sỏi mật ung thư ruột kết , ung thư cổ tử cung, giảm hàm lượng cholesterol trong máu [27]

2 Stigmasterol H

H H

O H

Giảm lượng cholesterol (cholesterol xấu), thành phần làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch [27]

LDL-STT Tên Công thức cấu tạo Hoạt tính

sinh học

3 Taraxasterol

Thanh nhiệt giải độc, lợi niệu tán kết, trị viêm tuyến limphô, đinh độc nhọt sưng, viêm viêm amidan cấp tính, viêm phế quản cấp [16]

6 Thiamin

Thiamin (vitamin B1) quan trọng trong việc chuyển hóa carbohydrates từ thực phẩm thành các sản phẩm cần thiết cho cơ thể

STT Tên Công thức cấu tạo Hoạt tính

sinh học

7 Riboflavin

Riboflavin cần cho sự hoạt hóa pyridoxin, sự chuyển tryptophan thành niacin, và liên quan đến sự toàn vẹn của hồng cầu [21]

8 Niacin

Kháng viêm trên đường ruột và viêm da, cải thiện huyết áp, chống co thắt phế quản, chống thấp khớp, hạ lượng mỡ máu

9 acid

Melissic

Tác dụng trừ thấp, tiêu viêm, lợi tiêu hoá

10 Phytol

Phytol có tác dụng giải độc gan, thông mật, lợi tiểu, nhuận tràng [7]

11 Squalene

Squalene giúp điều trị ung thư, các bệnh về da, bệnh hô hấp cũng như làm giảm viêm loét miệng và ngăn ngừa các bệnh do bức xạ gây ra [14]

STT Tên Công thức cấu tạo Hoạt tính

Nhận xét: Các nghiên cứu cho thấy bồ công anh có tác dụng rất lớn bởi nó có

chứa toàn bộ các hợp chất giúp tăng cường sức khỏe một cách tự nhiên như: alkaloids, steroids, and triterpenoids Rễ và lá bồ công anh còn chứa nhiều chất chống oxi hóa

là tác nhân thúc đẩy quá trình sản xuất các chất có lợi cho sức khỏe và bảo vệ hệ

thống tim mạch

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

1.3.1 Kỹ thuật chiết Soxhlet

Chiết tách là kỹ thuật lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng Có thể chiết từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn [11]

Có rất nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu thực vật Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn –lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, gồm sự ngấm kiệt (percolation), sự ngâm dầm (maceration), sự trích với máy chiết Soxhlet… [12], [14] Trong đề tài này sử dụng kỹ thuật chiết Soxhlet

Nguyên tắc

Chiết Soxhlet là kiểu chiết liên tục, quá trình chiết được thực hiện tuần hoàn trong bộ thiết bị chiết khép kín Kiểu chiết này cũng như chiết lỏng – lỏng nên về bản chất của sự chiết vẫn là định luật phân bố chất trong hai pha không trộn vào nhau Song ở đây pha mẫu là ở trạng thái lỏng, bột, hoặc dạng lá Còn dung môi chiết (chất

hữu cơ) là dạng lỏng [3], [6], [7]

Cách tiến hành: Bột rễ, lá bồ công anh xay mịn được đặt trực tiếp trong một túi

vải rồi cho vào ống D để dễ lấy bột lá cây ra khỏi máy Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E Không được để lượng bột lá cây trong ống D cao hơn vượt hơn mức cong của ống thông nhau E Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài

số (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E Lưu ý để thể tích lượng dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu

Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho cho dung môi trong bình cầu sôi đều nhẹ Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột lá cây Dung môi ngấm vào bột rễ, lá cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E, vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô

tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột lá cây Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở

hệ thống chỗ nút mài (2), rút lấy một giọt dung môi và thử trên miếng kính, nếu thấy

không còn vết gì trên kính là đã chiết kiệt

Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi, thu được cao chiết Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột lá cây được trữ lại trong bình cầu A, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt thí dụ như carotenoid có thể bị phân hủy

Do toàn hệ thống của máy đều bằng thủy tinh và được gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao Máy bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đó các bộ phận của máy, nhất là các nút mài do được gia công thủ công nên chỉ cần làm vỡ một bộ phận nào đó thì khó tìm được một bộ phận khác có thể vừa khớp để thay thế [3], [6], [12]

Hệ thống chiết soxhlet được mô tả như Hình 1.4

Hình 1.4 Hệ thống chiết soxhlet

1.3.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách

Yêu cầu dung môi hữu cơ sử dụng: hỗn hợp phản ứng là hỗn hợp lỏng-lỏng, rắn- lỏng cộng với dung môi hay tập hợp một số dung môi thì có độ hoà tan khác nhau, nồng độ các chất khác nhau và có tác dụng tương hỗ (thấm lấn), khuếch tán vào nhau Cho nên dung môi được lựa chọn phải đáp ứng những yêu cầu sau:

+ Phải có tính hoà tan chọn lọc, tức là hoà tan tốt các chất cần tách mà không được hoà tan hoặc hoà tan rất ít các chất khác

+ Không có tác dụng hoá học với các cấu tử của dung dịch

+ Không phá huỷ thiết bị

+ Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản

+ Không độc khi thao tác, không tạo hỗn hợp nổ với không khí

+ Rẻ tiền, dễ kiếm

+ Dung môi phải được tách ra sau quá trình trích ly bằng phương pháp đun nóng, chưng cất hoặc sấy Sau khi tách không để lại mùi vị lạ và làm bẩn sản phẩm Trong dung môi được lựa chọn hợp chất phải ít tan ở nhiệt độ thấp, tan tốt trong dung môi nóng và các tạp chất tan tốt trong dung môi lạnh hoặc không tan trong dung môi nóng Nếu chưa biết loại dung môi và khối lượng dung môi cần dùng, trước hết nên tiến hành thí nghiệm sơ bộ với những lượng chất rất nhỏ trong ống nghiệm Việc lựa chọn dung môi trước tiên phải dựa vào nhận thức kinh nghiệm rằng một chất được hoà tan tốt trong dung môi có cấu trúc hoá học tương tự với nó, nhất là với những hợp chất có cấu trúc đơn giản Các hỗn hợp dung môi như: nước-ancol, nước-dioxan, clorofom-ete dầu hoả cũng có thể rất thích hợp, phải xác định thành phần thích hợp nhất cho những hỗn hợp như vậy trong những thí nghiệm sơ bộ [11], [12], [14] Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không (evaporator) ở nhiệt độ 30-400C, chưng cất ở nhiệt độ cao hơn có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt

1.3.3 Chưng cất để loại dung môi

Chưng cất là phương pháp thường dùng để tách biệt và tinh chế những chất có nhiệt độ sôi khác nhau, bằng cách đun sôi chất lỏng thành hơi rồi ngưng tụ hơi lại thành những chất lỏng tinh khiết

1.3.4 Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

AAS là phương pháp dựa trên nguyên lý hấp thu của hơi nguyên tử Người ta cho chiếu vào đám hơi nguyên tử một năng lượng bức xạ đặc trưng của riêng nguyên

tử đó Sau đó đo cường độ còn lại của bức xạ đặc trưng này sau khi đã bị đám hơi

nguyên tử hấp thụ, sẽ tính ra được nồng độ nguyên tố có trong mẫu đem phân tích [2], [13]

Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không thu cũng không phát năng lượng, lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản Nhưng khi nguyên tử ở trạng thái hơi

tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ của nó Lúc này nguyên tử đã nhận bức xạ vào nó và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản Đó là tính chất đặc trưng của nguyên tử ở trạng thái hơi Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ nguyên tử của nguyên tố đó Phổ sinh ra trong quá trình này được gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [2], [13]

Nếu gọi năng lượng của tia sáng đã bị nguyên tử hấp thụ là E, thì ta có:

Hình 1.5 Sơ đồ khối thiết bị AAS

Trong đó: (1) là nguồn phát tia bức xạ đơn sắc, (2) hệ thống nguyên tử hóa, (3)

hệ thống đơn sắc, (4) đetector, (5) bộ khuếch đại tín hiệu

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)

Nguyên tắc: Nhờ có khí mang có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được

dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuếch đại

rồi chuyển sang bộ phận ghi Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận

in và lưu kết quả [11], [13]

Cấu tạo: Thiết bị được cấu tạo bởi 2 phần: phần sắc kí khí (GC) dùng để phân

tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần phổ khối (MS), mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối

Sắc kí khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng

lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc kí khí chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là hóa chất, chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Sắc kí ghép khối phổ (GC/MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay) Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu có thể dựa trên cấu trúc mới tìm ra được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học

Ưu điểm của phương pháp:

- Độ chính xác cao

- Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ

- Trang thiết bị không quá phức tạp

- Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn hợp phức tạp

- Kết quả thu nhận được một cách nhanh chóng (từ 1 - 100 phút)

- Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Thu nguyên liệu rễ, lá cây bồ công anh

Rễ, lá cây bồ công anh được thu hái ở huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (Hình 2.1)

Hình 2.1 Cây bồ công anh ở huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

Chọn hái những cây tươi, lá không bị héo vàng, không bị hư, sâu, có độ cao đều nhau từ 0.8-1m, đường kính khoảng 0.5cm

Chọn lấy những bộ rễ tươi, không bị úng, sâu, đường kính khoảng 0.2 cm

2.1.2 Sơ chế nguyên liệu

a Làm sạch nguyên liệu

Cây bồ công anh sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất, để cho quá trình chiết tách đạt hiệu quả cao thì giai đoạn làm sạch nguyên liệu phải thật cẩn thận [12] Trước hết tiến hành phân loại rễ và lá riêng biệt, sau đó tiến hành làm sạch nguyên liệu Các tạp chất trong rễ và lá chủ yếu là lớp bụi bẩn bám trên bề mặt Vì vậy sau khi thu hái nguyên liệu về cần phải loại bỏ những tạp chất này bằng cách cho rễ và lá vào hai chậu lớn và cho nước ngập, ngâm khoảng 5 phút, dùng tay khuấy đều và chà xát nhẹ lá để làm trôi hết bụi bẩn còn bám trên bề mặt rồi vớt ra rá có lỗ để ráo nước Tiến hành rửa 03 lần để lá sạch hoàn toàn

b Phơi khô nguyên liệu

Rễ, lá sau khi rửa sạch, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó thái nhỏ rễ,

lá rồi tiếp tục hong khô tự nhiên (Hình 2.2) Trong quá trình hong khô, thường xuyên

dùng tay xới nguyên liệu để nguyên liệu được khô đều

Hình 2.2 Rễ, lá bồ công anh sau khi phơi khô

c Nghiền thành dạng bột

Dùng máy xay để xay rễ, lá cây bồ công anh đã phơi khô thành dạng bột

(Hình 2.3)

Hình 2.3 Bột rễ, bột lá của bồ công anh sau khi xay

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer

- Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách thủy, cốc thủy tinh,

đũa thủy tinh, bình tam giác, ống đong, nhiệt kế, bình hút ẩm

2.2.2 Hóa chất

Trong quá trình làm thí nghiệm thì hóa chất được sử dụng được nêu trong bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu

chuẩn Nguồn gốc

2 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc

3 Etyl axetat Tinh khiết TCCS Trung Quốc

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lí

cứ 2 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi đem cân, làm như vậy cho đến khi khối lượng của mẫu và chén không đổi (m2)

Độ ẩm của mỗi mẫu được xác định theo công thức:

m0: khối lượng cốc (g)

m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)

b Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu

Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm Tiến hành: Mẫu rễ, lá bồ công anh sau khi xác định độ ẩm được giữ nguyên

trong chén sứ để tiến hành xác định hàm lượng tro Than hóa mẫu trên bếp điện Sau đó tiếp tục tro hóa trong lò nung ở nhiệt độ 5000C trong 5 giờ [12] Quá trình tro hóa kết thúc ta thu được tro trắng ngà, làm nguội trong bình hút ẩm, đem cân được m3 Hàm lượng tro của mỗi mẫu được tính theo công thức

m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)

m0 : khối lượng cốc (g)

m3: khối lượng cốc và mẫu sau khi nung (g)

c Xác định hàm lượng kim loại

Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm

Tiến hành: Mẫu sau khi tro hóa thì đem axit hóa bằng dung dịch HNO3 1N và định mức lên 25ml Lọc 2 lần để loại cặn không tan sau khi tro hóa, thu được dung dịch trong suốt rồi cho vào ống chứa mẫu đem xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS [12]

2.3.2 Khảo sát điều kiện chiết thích hợp

a Khảo sát thời gian chiết thích hợp

Hiệu suất chiết Soxhlet các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại

Cân một lượng khoảng 20 gam bột rễ, lá cây bồ công anh, gói kĩ trong túi vải lọc, sau đó cho một lượng dung môi xác định (200 ml) vào bình cầu Tiến hành chiết

Soxhlet với nhiệt độ tùy thuộc vào nhiệt độ sôi của từng dung môi Tiến hành chiết Soxhlet trong các khoảng thời gian khác nhau (4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ) [11], [12], [14]

Sau đó tính khối lượng riêng dịch chiết, khối lượng cao trong các dịch chiết Soxhlet thu được, % cao chiết Chọn thời gian chiết Soxhlet tối ưu để thu được dịch chiết có khối lượng riêng, khối lượng cao, % cao chiết lớn nhất

b Hiệu quả chiết bằng các dung môi

Từ kết quả khảo sát thời gian chiết thích hợp, so sánh các giá trị về khối lượng riêng của các dịch chiết và lượng cao thu được từ dịch chiết để xác định thời gian chiết tối ưu có khả năng thu được dịch chiết có khối lượng riêng, khối lượng cao, % cao chiết là lớn nhất

2.3.3 Phương pháp tách chất

Dung môi chiết tách: n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Thành phần hóa học của dịch chiết rễ, lá cây bồ công anh trong dung môi hexan, diclometan, etyl axetat, metanol được xác định bằng phương pháp sắc kí khí

n-ghép khối phổ (GC–MS)

Trong đó, hệ GC có cột tách mao quản Elite 35MS, kích thước: 30 m x 250 µm

x 0.25 µm, khí mang He Chương trình nhiệt độ : từ 50°C giữ 4 phút, tăng 5°C/phút đến 150°C giữ 5 phút, tăng 10°C/phút đến 280°C giữ 10 phút, thời gian chạy 52 phút Buồng tiêm mẫu trước, khí mang He, kiểu chia dòng Nhiệt độ buồng tiêm mẫu

280oC, áp suất dòng khí mang 7.6522 psi, tỉ lệ chia dòng 10:1 [7], [11], [12], [14]

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa DPPH

a Khái niệm về gốc tự do

Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người [10]

Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này

có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxyde ( •–

2

O ), nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2 Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc

tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể

Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây

ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis)

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho

có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu [10]

b Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau:

- Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp

của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenylpicrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác [10], [17]

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl) Phản ứng được thực hiện như

sau:

 Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH

DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Hoạt tính chống oxi hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ

UV, sử dụng thuốc thử là DPPH Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao

vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm

2.4 SƠ ĐỒ QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình nghiên cứu rễ, lá cây bồ công anh

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ

3.1.1 Độ ẩm

Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ và lá bồ công anh khô được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của mẫu rễ bồ công anh khô

m1: khối lượng mẫu ban đầu (g)

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)

Hàm lượng tro trung bình trong mẫu rễ và lá bồ công anh khô lần lượt là 4.616%

và 5.303% Hàm lượng tro trung bình rất thấp, thấp hơn so với hàm lượng tro toàn phần của một số dược liệu (dạng lá và rễ) được quy định Dược điển Việt Nam IV Với giá trị này, ta dự đoán được hàm lượng kim loại trong mẫu nguyên liệu là rất ít

3.1.3 Hàm lượng kim loại

Hàm lượng của 1 số kim loại nặng trong mẫu rễ và lá cây bồ công anh được xác định bằng phương pháp đo AAS Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6

Bảng 3.5 Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng

trong rễ cây bồ công anh

Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)

Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng

trong lá cây bồ công anh

Kim loại Hàm lượng (mg/kg) TCVN (mg/kg)

tư Ban hành các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm 2011 cho thấy hàm lượng một số kim loại nặng trong bồ công anh được trình bày ở bảng trên là hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người nên bồ công anh có thể dùng làm dược phẩm chữa bệnh

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT RỄ, LÁ CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI

Thời gian chiết xuất là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly