Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enz

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÀNH TRUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ

(FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUẾ 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÀNH TRUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ

(FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã số: 60540101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS VÕ VĂN QUỐC BẢO

HUẾ 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong Luận văn là trung thực, được các

đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một tài liệu

nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thành Trung

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện và hoàn thành Luận văn cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản

thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể.

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học Thầy

giáo TS Võ Văn Quốc Bảo đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo điều kiện thuận lợi

để cho tôi hoàn thành tốt Luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy, Cô giáo Khoa Cơ khí - Công nghệ,

Phòng Đào tạo Sau đại học cũng như Quý Thầy, Cô trong Trường Đại học Nông Lâm,

Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã truyền đạt những kiến thức cơ bản về lý

luận và thực tiễn trong thời gian qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện thuận

lợi, giúp đỡ và ủng hộ khuyến khích trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

luận văn tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện Luận văn có gì sai sót rất mong Quý Thầy, Cô và các

bạn đóng góp ý kiến để Luận văn được hoàn thiện hơn

Huế, ngày… tháng… năm 2017

Học viên cao học

Nguyễn Thành Trung

TÓM TẮT

Protease được chiết xuất từ nhựa quả vả, chứa chủ yếu enzyme ficin; một loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả

cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme ficin, nhằm nâng

cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế để từ đó nghiên cứu bước đầu về khả năng làm mềm thịt của chế phẩm ficin

Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn các thông số kỹ thuật thích hợp Kết quả cho thấy, quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 2,212 (mg/ml) và 1,015 (Hp/ml) khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96% là 1/4 và nhiệt độ chiết 3°C Thời gian thu nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 45ºC, pH = 6, bền nhiệt từ 35ºC đến 50ºC trong một giờ

Ngoài ra, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng làm mềm thịt của chế phẩm khi khảo sát được độ dai của thịt bò sau 20 phút là 50,60 N và tỷ lệ mất nước giảm còn 17,33%

so với mẫu đối chứng 25,13%

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích của luận văn 1

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 3

1.2 TỔNG QUAN PROTEASE 5

1.2.1 Giới thiệu về protease 5

1.2.2 Phân loại protease 5

1.2.3 Nguồn thu nhận protease 7

1.2.4 Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 13

1.3.1 Giới thiệu chung về quả vả 13

1.3.2 Đặc điểm hình thái 14

1.3.3 Đặc điểm sinh học 15

1.3.4 Thành phần hóa học của nhựa vả 15

1.3.5 Enzyme ficin 15

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Phạm vi nghiên cứu 23

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.3 Hóa chất 24

2.1.4 Một số thiết bị chính 24

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả 24

2.2.3 Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả 25

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein 27

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease 28

2.3.4 Phương pháp vật lý 28

2.3.5 Phương pháp cơ học 28

2.3.6 Phương pháp xác định độ mềm thịt bò 28

2.3.7 Phương pháp toán học 29

2.3.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ 32

3.2 KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA 33

3.3 KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL 34

3.4 KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE 35

3.5 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE 35

3.6 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ 38

3.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm ficin 38

3.6.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chế phẩm ficin 39

3.6.3 Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm ficin 39

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ 40

3.7.1 Khảo sát độ dai của thịt 40

3.7.2 Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 KẾT LUẬN 42

4.2 KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo từng loại dung môi 33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến độ dai của thịt bò 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến tỷ lệ mất nước của thịt bò 41

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Quá trình tổng quát thu nhận Enzyme từ thực vật 12

Hình 1.2 Quả vả 13

Hình 1.3 Nhựa quả vả 15

Hình 1.4 Chế phẩm Enzyme Wied N 20

Hình 1.5 Chế phẩm Enzyme-Mix 20

Hình 1.6 Chế phẩm ficin 20

Hình 2.1 Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch của quả vả 23

Hình 2.2 Thu mua thịt bò tại lò giết mổ gia súc 23

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [6], [18] 25

Hình 3.1 Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo độ chín của quả 32

Hình 3.2 Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% 34

Hình 3.3 Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo thời gian 35

Hình 3.4 Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo nhiệt độ 36

Hình 3.5 Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa quả vả 37

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin 38

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ chế phẩm ficin 39

Hình 3.8 Khả năng bền nhiệt của chế phẩm ficin 40

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Protease là enzyme công nghiệp rất quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm cùng sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học – thực phẩm, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều.Trên thế giới nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, đưa vào ứng dụng các chế phẩm protease trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thương mại hóa chế phẩm này Ở Việt Nam, có rất nhiều nghiên cứu về enzyme, tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng vẫn còn hạn chế và hiện nay chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng để

sử dụng trong các ngành công nghiệp Nước ta vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài nên giá thành rất cao Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu và phát triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là một ngành công nghiệp đầy tiềm năng [2], [3]

So với protease động vật và vi sinh vật, protease thực vật cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng phổ biến Bên cạnh hai loại enzyme bromelain và papain thì ficin cũng là một enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm [6]

Ficin, có nhiều trong các loại quả cây họ sung (vả), được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ sung để chống lại hiện tượng kết tủa protein trong quá trình làm trong bia, ngăn cản sự hóa nâu trong rau củ, xử lí phế phụ phẩm trong chế biến phế thực phẩm…), trong y học như: làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun Ngoài ra, có nhiều ứng dụng đang được nghiên cứu như: sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnh ngoài da, mụn nhọt [10], [33]

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên các loại cây họ sung nói chung và loại cây vả nói riêng phát triển rất thích hợp Tuy nhiên, sản phẩm từ cây vả chỉ biết đến qua các món thực phẩm được dùng hằng ngày như: vả trộn, vả kho thịt, hay dùng làm rau mà chưa có nhiều nghiên cứu về protease trên loại cây này Lá và quả vả đều chứa một lượng lớn protease trong đó chủ yếu là ficin, nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme tự nhiên

Từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế

phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata Lour) và bước đầu khảo sát khả năng

làm mềm thịt bò" để thực hiện nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu sau

2 Mục đích của luận văn

- Thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm ficin ở quy mô phòng thí nghiệm

- Khảo sát một số tính chất của chế phẩm ficin

- Bước đầu ứng dụng chế phẩm ficin thu được để làm mềm thịt bò

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn

- Nâng cao giá trị sử dụng của quả vả, nguồn thực vật phổ biến ở Huế

- Góp phần bổ sung dữ liệu nghiên cứu về nguồn protease từ thực vật

- Sử dụng thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid để xác định hàm lượng protein Bên cạnh đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, đặc biệt đóng vai trò quan trọng đối với các quy trình chế biến thực phẩm Enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhẹ nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định [2], [14]

Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Nó có thể được tiết ra ngoài dịch tế bào, tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường (gọi là enzyme ngoại bào) hoặc giữ lại bên trong tế bào (enzyme nội bào) Hiện nay trong các nguồn nguyên liệu trên, vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme ở quy mô lớn cho công nghiệp Tuy nhiên, khi ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, nguồn nguyên liệu này cần phải lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe con người Chính vì thế, trong một số ngành sản xuất thực phẩm, nguồn enzyme chính được khai thác từ động vật và thực vật [10], [16]

Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn loại nguyên liệu giàu enzyme và dễ dàng tinh chế enzyme Cho đến nay, đã biết được nhiều loại cấu trúc hóa học của nhiều loại enzyme quan trọng Đáng chú ý là trong nhóm ngoại của đa số enzyme hai cấu tử có chứa vitamin: piruvatdecacbonxylase chứa B1 (thiamin), aminotransferase chứa B6 (piridoxan), Ngoài ra, một số hợp chất khác như glutation dạng khử, nucleotid và các dẫn xuất, estephosphat của một số monosacharid cùng tham gia vào thành phần coenzyme của enzyme [3], [17]

Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác thông thường Bên cạnh đó, tính chất đặc trưng của enzyme vẫn là tính đặc hiệu Đó

là một trong những khác biệt giữa enzyme và các chất xúc tác khác [3] Người ta phân biệt hai kiểu đặc hiệu chính là đặc hiệu cơ chất và đặc hiệu kiểu phản ứng:

- Đặc hiệu kiểu phản ứng: thể hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một trong các phản ứng chuyển hóa nhất định

Ví dụ: phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân

- Đặc hiệu cơ chất: cơ chất là chất có phản ứng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme Mức độ đặc hiệu của các enzyme không giống nhau Có những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với cơ chất nào khác Nhưng cũng có những enzyme có tác dụng lên một kiểu liên kết hóa

học trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các thành phần tham gia tạo thành mối liên kết đó, chúng thể hiện tính đặc hiệu tương đối Có enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất, nó thể hiện đặc hiệu quang học Ngoài ra, enzyme còn có khả năng phân biệt được hai gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học [10], [14]

Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lí, cơ học, hóa học Có ba khó khăn khi tách enzyme khỏi tế bào cần hết sức lưu ý [10]:

- Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó

- Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi tác động của các yếu tố bên ngoài

- Enzyme là protein Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme Do đó, việc tách protein – enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp được những khó khăn nhất định

Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lí theo những phương pháp trên Dịch chiết thu được, người ta gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này, ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme và các thành phần của tế bào

Như vậy, việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme Công việc này hoàn toàn không dễ dàng Do đó việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất hoạt tính hoạt động của enzyme [4] Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp như: gây biến tính chọn lọc dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối hoặc dung môi hữu cơ, phương pháp hấp thụ chọn lọc khi cho chúng vào cột chất hấp thụ, phương pháp sắc ký dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protien tan trong nước và tác nhân trao đổi ion

Để xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme, người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng

1.2 TỔNG QUAN PROTEASE

1.2.1 Giới thiệu về protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (CO – NH) trong phân tử protein hoặc trong các cơ cấu tương tự Quá trình thủy phân liên kết peptid được biểu diễn qua chuỗi phản ứng sau:

Protein ―> Pepton ―> Polypeptid ―> Acid amin Đây là quá trình thủy phân tương đối phức tạp, có sự tham gia của nhiều protease khác nhau [12], [14]

Trong các protease, protease của hệ tiêu hóa được phát hiện sớm nhất Từ lâu người ta đã tách được protease từ dạ dày và từ dịch tụy tạng của động vật Bên cạnh

đó, một số nghiên cứu về protease thực vật cũng được nghiên cứu

Năm 1874, người ta đã công bố nhận được protease từ hạt của một cây họ đậu, nhiều tác giả thấy rằng, dịch chiết từ cây đại mạch, bông lau, đu đủ có khả năng phân giải protein [17]

Ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu, thăm dò, phát hiện và khảo sát tính chất về enzyme này nhưng cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng Hầu hết các chế phẩm enzyme dùng trong nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất đều phải nhập ngoại Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng là vấn đề cần thiết và mang ý

nghĩa thực tiễn [15]

1.2.2 Phân loại protease

Theo phân loại quốc tế, protease được chia làm hai phân nhóm (exo – peptidase, endopeptidase) [10], [12]

1.2.2.1 Exopeptidase

Là nhóm enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptid ở đầu mạch, gồm

có 3 loại:

+ Amynopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nằm kề nhóm amin tự do

trong chuỗi polypeptid

H2N – CH – CO – NH – CH – CO – – NH – CH – COOH

R1 R2 R3

+ Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid mà có nhóm cacboxyl

(-COOH) nằm gần kề trong chuỗi polypeptid

H2N–CH –CO –NH –CH –CO – –NH – CH – CO – NH – CH – COOH

+ Serin – proteinase (Ser-EP) là những enzyme trung tính, có nhóm –OH, có

một phân tử Ser hoạt động tại vị trí xúc tác, vị trí này có tác dụng tương hỗ với cơ chất protein Các Ser – EP được tìm thấy có liên quan tới quá trình sinh lý như sự lão hóa,

sự chết của tế bào, sự tạo gỗ, sự nảy mầm

+ Cystein – proteinase (Cys – EP): là những enzyme có nhóm –SH trong trung

tâm hoạt động; là một nhóm proteinases thực vật được nghiên cứu nhiều nhất Cơ chế xúc tác của enzyme có liên quan đến nhóm cystein tham gia nhiều quá trình sinh học như quá trình lão hóa sự tạo gỗ, sự cố định protein trong quá trình nảy mầm Cys – EP được biết đến nhiều nhất là protein giống caspase, các peptid giống papain, bromelain, ficin và ngoài ra chứa các protein loại cathepsin

+Aspartic – proteinase gồm các liên kết peptid có các nhóm bên của aminoacid

kỵ nước và hoạt động ở pH acid (pH < 7) Mặc dù, các enzyme này đã được tìm thấy ở nhiều loại thực vật, nấm mốc Tuy nhiên sự quan tâm đến nhóm này là rất ít, chủ yếu gồm các protein cardosin và cathepsin

Cardosin được chiết từ hoa Cynara cardunculus khô và được sử dụng trong sản

xuất phomat từ sữa cừu của Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha Cathepsin được tìm thấy trong các hạt chưa nảy mầm, trong suốt thời gian nảy mầm và trong các mô sống của đại mạch bao gồm cả chồi và rễ

+ Metallo – proteinase: chủ yếu được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng

như các loại vi sinh vật bậc cao Hầu hết loại enzyme này chứa Zn, lượng rất ít chứa Co và Mn Một metallo – proteinase tồn tại trong lá đậu nành, có nhiều nhất trong các giai đoạn sau của quá trình phát triển của lá

1.2.3 Nguồn thu nhận protease

Protease là một enzyme rất cần thiết cho quá trình sinh lý trong cơ thể sống và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Chính vì vậy, chúng phân bố khá phổ biến ở vi sinh vật, động vật và thực vật Tuy nhiên, sự phân bố của chúng có tính không đồng đều giữa các loài, các cá thể và ngay cả các mô, các bộ phận trên một cơ

thể sinh vật [6], [15], [17]

1.2.3.1 Protease vi sinh vật

Thu nhận enzyme từ vi sinh vật đang được nghiên cứu và triển khai rộng rãi Các enzyme thu nhận từ nguồn này thường có tính đặc hiệu cao, cho các sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng Nguồn protease chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn

Trong số các vi khuẩn, chủng có khả năng tổng hợp protease mạnh là Bacillus subtilis,

Bacillus menseneterisus, Bacillus thermoproteoliticus và một số thuộc giống Clostridium [16]

Các chế phẩm proteinase được sản xuất từ vi sinh vật đa dạng, phong phú về chủng loại và tính chất Đặc biệt, các proteinase của vi khuẩn có nhiều ưu điểm hơn so với proteinase của nấm mốc như tốc độ phản ứng nhanh, độ bền nhiệt lớn Trên thế giới, chế phẩm proteinase đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đã được thương mại hóa Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới, nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme thu được Trong khi đó, các nghiên cứu thăm dò thu nhận chế phẩm proteinsae từ nguồn vi khuẩn ở nước ta vẫn còn quá ít so với trên thế giới Vấn đề đặt ra là cần phải tuyển chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteinase ngoại bào cao góp phần tạo tiền đề phát triển công nghiệp sản xuất enzyme từ vi khuẩn ở Việt Nam

1.2.3.2 Protease động vật

Protease thu nhận từ động vật được nghiên cứu và ứng dụng khá lâu Tuy nhiên khả năng thu nhận không cao do nó chỉ có ở các bộ phận nhất định trong cơ thể động vật và chứa một lượng không nhiều Enzyme thu nhận từ động vật có tính đặc hiệu ít rộng rãi so với enzyme từ thực vật và vi sinh vật Do vậy, khả năng thủy phân của enzyme thuộc nhóm này thấp nhất Hiện nay, người ta đã tách được renin từ dạ dày bê, trypsin từ tụy tạng bò [16]

Trypsin: trypsin có khối lượng phân tử 23,3kD là enzyme tiêu hóa đường ruột

chính phù hợp với sự thủy phân protein thực phẩm Nó là một serine proteinase và thủy phân mối liên kết peptide giữa lysine và arginine

Chymotrypsin: chymotrypsin có khối lượng phân tử 23,8kD được tìm thấy trong

dịch tụy Nó đặc hiệu với mối liên kết peptide có các nhóm carboxyl của các amino acid thơm như phenylalanine, tyrosine hoặc tryptophan

Pepsin: pepsin có khối lượng phân tử 24,5kD là một proteinase acid được tìm

thấy trong dạ dày của hầu hết động vật có xương sống Dạng hoạt động của nó được giải phóng từ dạng zymogen như pepsinogen do quá trình tự phân khi có mặt acid HCl Enzyme này thủy phân mối liên kết peptide giữa hai amino acid ưa béo

Rennin: rennin là proteinase giống pepsin (rennin, chymosin: EC 3.4.23.4) được

sinh ra ở dạng tiền enzyme không hoạt động trong dạ dày của tất cả các động vật có vú

và được chuyển thành dạng rennin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá trình tự xúc tác của chúng

Do đa số nguồn proteinase động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu quả kinh tế cao nên gần đây các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với proteinase thực vật và vi sinh vật

1.2.3.3 Protease thực vật

Việc nghiên cứu protease thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với công trình của nhà bác học Kiecgov người Nga, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa bột thành đường Và đến năm 1929, lần đầu tiên Summer đã tách được protease từ thực vật ở dạng tinh thể (urease) Trong những năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số protease thực vật ở các mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo mục đích sử dụng Protease thu nhận từ thực vật chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ enzyme Một

số enzyme thu nhận từ thực vật đã được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công nghiệp Trong đó, phải kể đến papain trong đu đủ, bromelain có trong dứa, ficin trong quả sung và keratinase có trong các cây họ đậu [6], [14]

Papain: papain là một loại protease thực vật truyền thống, sử dụng lâu đời và

được tách chiết từ trái đu đủ (Carica papapya) Chế phẩm thô của enzyme có tính đặc

hiệu rộng do có chứa nhiều enzyme peptydase và proteinase Papain đặc biệt bền nhiệt,

có thể chịu được 100ºC trong 3 giờ, nhiệt độ tối thích 60 - 70ºC và pH tối thích thường

là giữa 5 (với gelatin) và 7 (với casein, hemoglobin, albumin trứng) Tính chất enzyme

phụ thuộc vào nguồn thực vật, các điều kiện khí hậu và phương pháp tách, tinh chế [14]

Ở Việt Nam, nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu tách chiết, điều chế và khảo sát một số tính chất của papain từ nhựa đu đủ xanh Chế phẩm proteinase từ nhựa đu đủ là hỗn hợp của papain, chymopapain, peptidase III và peptidase IV và bị ức chế hoàn toàn bởi flavonoid tách từ bọ mẩy (Clorodendron cyrtophyllum Turez) ở nồng độ

200mg/l [14]

Bromelain: bromelain được thu từ thân cây và dịch chiết của quả dứa Enzyme

này có tính chất giống như một cystein protease Biên độ pH rộng từ 3 – 10 nhưng pH tối thích giữa 5 và 8 tùy cơ chất (5-6 với gelatin và hemiglobin, 7-8 với casein), nhiệt độ tối thích là 50 - 60ºC Nhiệt độ bất hoạt của enzyme là 70ºC Bromelain có phổ tác dụng

rộng như papain nên ngày càng được dùng thay cho papain vì papain rất đắt (làm mềm thịt, chế biến bia, bánh, chế biến dầu cá, nước mắm ) Bromelain còn được sử dụng trong y học và trong công nghiệp Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm nghiên cứu về chế phẩm enzyme này [10], [18]

Các tác giả Nguyễn Đình Huyên, Trần Minh Tâm, Lê Thị Thanh Mai (1997) đã nghiên cứu hoạt tính của promelain trong quá trình phát triển của quả dứa và cho thấy rằng hoạt tính promelain cao nhất ở thời điểm 25 ngày trước khi quả chín

Harrach và cộng sự (1995) đã tinh sạch, xác định tính chất của các proteinase có trong chồi dứa đã phát hiện rằng chế phẩm này có tám phân đoạn khác nhau Trong đó

có ba phân đoạn chính, hai phân đoạn trong số đó có pH thích hợp 4-4,5 và một phân đoạn hoạt động ở pH trung tính

Ficin: là mủ của một loại sung có màu vàng kem đến màu hồng và pH biến động

tương đối rộng (3-9) tùy thuộc vào cơ chất gelatin, hemiglobin hay casein Ficin thương mại

là hỗn hợp của một số enzyme protease và peroxydase cộng thêm chất độn (đường hay bột) [10]

Keratinase: người ta có thể sản xuất protease từ một số nhóm thực vật, các

protease này có khả năng thủy phân lông, tóc Sự phân giải lông, tóc có phần quan trọng để sản xuất acid amin thiết yếu – lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống nước tiểu

Từ việc tìm hiểu về protease có nguồn gốc thực vật ở trên cho thấy các enzyme này có mặt ở nhiều loài thực vật và phân bố ở trong các mô khác nhau Cho đến nay, ở Việt Nam các tác giả chỉ mới tập trung nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của các chế phẩm protease trên đối tượng đu đủ và dứa Nghiên cứu thăm dò khả năng thu nhận chế phẩm này ở các loài thực vật khác nhau như ở các loại cây họ sung (vả) vẫn còn hạn chế

1.2.4 Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau

1.2.4.1 Nguyên tắc tách và tinh chế enzyme

Enzyme rất dễ bị giảm hoạt độ dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài, do đó khi tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt độ của enzyme cần tiến hành nhanh quá trình tinh chế trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và môi trường có pH thích hợp [10], [15], [17]

Không có quy trình cụ thể nào để chiết xuất và tinh chế enzyme khác nhau

Do enzyme có mặt trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật nên quá trình tách và tinh chế enzyme sẽ được thực hiện theo các bước tổng quan sau [6]:

- Thứ nhất phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau như:

+ Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa

+ Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm

+ Phương pháp hóa học: sử dụng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate

- Thứ hai sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo phương pháp trên

- Thứ ba dung dịch enzyme thô thu được chứa nước, protein không phải enzyme

và các tạp chất cần loại bỏ Vì vậy, để thu được một enzyme nào đó ở dạng tinh khiết

có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và nhiều giai đoạn tinh sạch khác nhau

Khi thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme, lực hút giữa các phân tử protein và các phân tử nước bao quanh chúng bị giảm Nếu tiếp tục bổ sung dung môi hữu cơ nồng độ dung dịch đạt đến một mức độ nào đó thì các phân tử protein liên hợp với nhau tạo thành kết tủa Tùy theo tính chất của từng loại protein, dung môi và điều kiện kết tủa mà mỗi enzyme sẽ được kết tủa ở nồng độ enzyme thích hợp nào đó Các dung môi thường được sử dụng phổ biến để kết tủa enzyme là rượu etylic, isopropylic, ethanol hoặc aceton Tuy nhiên các dung môi có thể gây nên sự vô hoạt enzyme vì vậy, cần phải tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp

Khi bổ sung muối đến nồng độ quá bão hòa, các ion muối có tác dụng phá vỡ lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein do sự hút các cực trái dấu của phân tử nước, kết quả là các phân tử protein bị mất lớp vỏ nước và có thể liên hợp lại với nhau để tạo thành phân tử lớn hơn Tác dụng kết tủa của các ion muối tỷ lệ thuận với lực ion của chúng và như vậy mỗi loại protein trong hỗn hợp sẽ được kết tủa tối đa ở một nồng độ muối xác định nào đó Muối được dùng phổ biến ở đây là (NH4)2SO4 Ngoài

ra, NaCl cũng hay được dùng để kết tủa enzyme động vật

Dựa vào tính tương tác của enzyme với chất hấp phụ không cực nhờ tương tác kỵ nước và tương tác Vanderwaals hoặc tương tác protein với các chất hấp phụ có cực nhờ liên kết ion và liên kết hydro Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ (thường là hydrat oxit nhôm, silica gel hydrat apatit ) khi đó tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại protein, các protein khác nhau sẽ được hấp phụ khác nhau Sau đó, dùng các dung dịch đệm thích hợp để rút enzyme cần tách ra khỏi cột

Dựa vào sự trao đổi ion giữa protein (enzyme) tích điện và các chất nhựa trao đổi Khi cho dịch enzyme chảy từ từ vào cột của chất nhựa trao đổi, protein (enzyme) nào có khả năng đẩy các ion linh động của chất nhựa trao đổi lớn hơn sẽ được giữ lại trên cột trước tiên, còn các protein (enzyme) nào có khả năng đẩy các ion linh động này yếu hơn sẽ được giữ lại chậm hơn trên cột Sau đó, cho dung dịch chất điện rửa (dung dịch chất điện giải có nồng độ tăng dần) dẫn qua cột, các ion của dung dịch rửa

sẽ đẩy ra khỏi nhựa các protein vừa liên kết với nhựa Khi đó, protein (enzyme) nào có

ái lực với nhựa kém nhất sẽ bị đẩy ra khỏi nhựa sớm nhất Kết quả các protein (enzyme) khác nhau sẽ được tách ra ở các thời điểm khác nhau

Hình 1.1 Quá trình tổng quan thu nhận Enzyme từ thực vật [3], [7], [28], [29]

1.3 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU

1.3.1 Giới thiệu chung về quả vả

Vả có tên khoa học Ficus auriculata Lour, là một loài cây thuộc chi Ficus, nó có

quả giống như sung nhưng lớn hơn và có lá to hơn Đây là loài có nguồn gốc từ Hymalaya, miền nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam Quả vả có rất nhiều tên gọi khác nhau, người Trung Quốc gọi là đại quả dung, đại diệp dung, viên diệp dung, ở nước ta có nơi gọi là cây ngõa Là loài cây thường xanh nhưng trong một số vùng khí hậu nó có thể rụng lá trong mùa đông [39]

Hình 1.2 Quả vả

Ở Việt Nam, giống Ficus có khá nhiều loài khác nhau Có thể kể tên một số loài

sung, vả như sau:

Sung trổ (Ficus variegata) Sung (Ficus racemosa L.) Sung ba thùy (Ficus hirta) Sung thằn lằn (Ficus pumila L.)

Vả (Ficus auriculata Lour) Sau đây là đặc điểm mô tả của một số loài thuộc giống Ficus có ở Việt Nam: Cây vả (Ficus auricalata Lour): cây đại mộc nhỏ, thân to, nhánh to Lá to gần

như tròn, mặt đưới có 5-7 gân lá, cuống lá khoảng 2,5cm, quả làm rau ăn Cây được trồng nhiều nơi ở Việt Nam và mọc hoang trong rừng

Cây sung trổ (hay còn gọi là ngõa rừng, vả rừng) (Ficus variegata Blume) là cây

thân gỗ nhỏ, có nhánh, đường kính 5-6 cm rất nhẵn Lá hình trái xoan ngược, tù và có khi tròn ở gốc, đầu hơi nhọn hoặc không, mặt trên lá rất nhẵn, bóng, mặt dưới màu nhạt, mép lá có hoặc hơi có răng cưa không đều, lá dài 13-22 cm, rộng 5-13 cm, cuống 2-4 cm Quả xếp 1-2 quả trên các nhánh từ gốc hoặc trên thân già, có cuống, quả hình

cầu, nhẵn hoặc có lông mịn, quả khi chín có màu lục sọc đỏ hoặc đỏ, đường kính 3-4

cm Quả chín có vị ngọt

Cây si (Ficus benjamica L.) là cây ưa ẩm, mọc hoang, hiện nay được trồng ở

nhiều nơi Nhựa để chữa ứ huyết, nhức mỏi, chữa ho, cắt cơn hen

Cây vú bò, hay vú chó (Ficus heterophyllus L.) mọc hoang ở vùng đồi, ven rừng

dùng làm thuốc bổ chữa hư lao, bạch đới, ngâm rượu chữa tê thấp

Cây xộp (Ficus pumila L hay Ficus glomerata Roxb) mọc hoang nhiều nơi và

được trồng ở một số vùng, dùng làm thuốc bổ, quả làm mứt ăn ngon

Cây sung (Ficus racemosa L.) là loài cây nhỏ, không có rễ phụ, cành mềm có

nhiều vảy, u lồi và sẹo, lúc non có lông nâu mềm, lá hình bầu dục thuôn tù ở gốc, nhọn

ở đỉnh, mặt trên bóng, mép nguyên hay nhăn nheo, trên phiến lá có nhiều u nhỏ gọi là

vú sung Quả phức xếp dày đặc ở thân, cành, màu đỏ nâu khi chín, có hoa quanh năm, quả ăn được Cây thường mọc ở nơi ẩm ướt, bờ ao

Theo Đỗ Tất Lợi (1981) Ficus racemosa L mọc hoang và được trồng khắp nơi ở

Việt Nam Tên thông thường là sung, ưu đàm hoặc Lova (tiếng Campuchia) Loài sung này có thân cây to, không có rễ phụ Thân có nhựa màu trắng như sữa, lá hình mũi giáo, đầu nhọn Lá non cả 2 mặt đều phủ lông, phiến lá nguyên hoặc hơi có răng cưa,

dài 4-10 cm, rộng 4-8 cm Lá sung bị loài sâu Syllidae ký sinh gây ra những mụn nhỏ

Quả mọc thành từng chùm trên thân hoặc những cành to không mang lá Khi chín quả màu đỏ nâu, mặt quả phủ lông mịn, cuống quả ngắn

Từ nhựa có thể tách chiết được enzyme ficin sử dụng cho quá trình làm mềm thịt,

làm tan máu bầm, hoặc lọc trong nước giải khát Ngoài ra, từ các cây giống Ficus

người ta còn tách chiết được một số hợp chất tự nhiên khác như: monoterpenoid, triterpenoid, các hợp chất phenol, flavonoid

- Quả vả to bẹp rộng đến 4cm, có lông vàng vàng Quả vả mọc thành chùm trên những cành già hoặc ở gốc thân, trên những nhánh riêng không có lá Khi non quả có

vỏ màu xanh lục, có lông mịn, khi chín có màu đỏ thẳm [36]

- Vả thường thu hoạch quanh năm nhưng thời điểm thu hoạch quả vả cho chất lượng cao nhất vào tháng 8 trở đi [38]

1.3.2.2 Nhựa vả

Nhựa quả vả có màu trắng đục giống màu của sữa Nhựa vả là một vị thuốc quý

có công dụng chữa bệnh được y học cổ truyền ứng dụng chữa một số bệnh phổ biến như đau nhức, các bệnh về đường ruột [35] Nhựa vả còn có tác dụng kháng khuẩn nên người ta thường tận dụng nguyên liệu này để thoa lên các nốt mụn Cách trị này cho hiệu quả khá cao và rất an toàn [37]

Hình 1.3 Nhựa quả vả

1.3.3 Đặc điểm sinh học

- Cây thuộc loại cây ưa sáng và ẩm, thường mọc ven sông suối, khe nước, thung lũng ẩm của cả rừng nguyên sinh và thứ sinh, trên các nương rẫy Cây mọc nhanh, tái sinh chồi mạnh [39]

- Các bộ phận của cây có thể thu hái quanh năm Cây vả là loại cây không hạt nhưng rất dễ trồng, chỉ một thân cây nhỏ cắm xuống đất cũng có thể mọc rễ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh [39]

1.3.4 Thành phần hóa học của nhựa vả

Theo Nguyễn Đức Lượng (2012), thành phần nhựa vả gồm: cao su, renin, albumin, cerin, malic acid, resin, protease, diatase, esterase, lipase, đường, catalase, peroxydase và đặc biệt là ficin [10]

1.3.5 Enzyme ficin

Enzyme ficin hay còn gọi là ficain là một thiol-protease có trong dịch nhựa của

các loài vả, sung thuộc giống Ficus, họ Moraceae Tương tự các protease thực vật

khác (papain, bromelain), ficin cũng có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) ở trung tâm hoạt động, quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme

Ficin là một protease được tìm thấy trong dịch nhựa của những cây thuộc giống

Ficus Các cây thuộc giống Ficus có tên gọi thông thường là vả, sung, họ Moraceae,

bộ Urticales

1.3.5.1 Tính chất của enzyme ficin

- Tính chất vật lý: Trọng lượng phân tử: 23000 – 27000 kda

Nhiệt độ hoạt động: 30 – 80ºC Nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính xúc tác: 40 – 65ºC

bị giảm xuống Dưới tác dụng của các tác nhân oxy hóa, ficin bị mất hoạt tính

* Cơ chế hoạt động

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine trong hoạt động thủy phân của ficin Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt) Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme Đầu tiên, ficin kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amin Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide

Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí

bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…)

Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định

1.3.5.2 Sự hoạt hóa và bất hoạt của ficin

Giống như các hợp chất sinh học khác, ficin cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức,

phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch

Các yếu tố hoạt hóa: khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy giải của protein cũng tăng lên Hoạt tính của ficin cũng tăng lên khi nó kết hợp với một trong số các nhân tố khử như: cyanide, cysteine, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoetthanol Các yếu tố kìm hãm: cũng như các loại enzyme thủy giải protein khác, nhóm -SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của Ficin Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenide, ido acetic acid, chloroaceramide hay iodoacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzyme sẽ bị bất hoạt

Tính chuyên biệt: enzyme ficin có thể thủy giải các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen Ficin còn có thể thủy giải các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo Dựa vào công thức cấu tạo chung R’ - NH – CHR –

CO – X, sự phân cắt nối – CO – X được xác định khi gốc R là chuỗi bên của glycine, serine, threonine, methionine, lysine, arginine, citruline, leucine, isoasparagine và tyrosine Những cơ chất có gốc R xuất phát từ alanine, phenylalanine hoặc tryptophan

có thể đóng vai trò như một chất cho hoặc nhận trong các phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) do ficin xúc tác Thành phần X của các cơ chất này không những xuất phát từ các rượu, ammoniac, mercaptan, aniline, hoặc -nitrophenol Một nhóm benzoyl carbobenzoyl đã được sử dụng như chất thay thế R’ của cơ chất nhân tạo

Sự khác biệt trong việc khảo sát tính chuyên biệt của ficin cũng được giải thích bởi nguyên do: hầu hết các thí nghiệm đã được tiến hành với các chế phẩm enzyme chưa tinh sạch và chế phẩm thu được là hỗn hợp nhiều hợp chất có hoạt tính riêng lẻ

và có thể bị biến đổi Englund (1968) đã khảo sát tính chuyên biệt của một hợp chất có hoạt tính của chế phẩm ficin bằng cách cho nó phản ứng với chuỗi β đã được oxy hóa của insulin, kết quả xác định được 7 điểm phân cắt chính xác và có 2 sự phân cắt khác được đánh dấu phóng xạ

Mặc dù không có mô hình phân cắt có tính chuyên biệt nhưng dường như có một

sự ưu tiên thủy phân những liên kết peptide liên quan đến các acid amin thơm

Tính bền vững: Bền vững với nhiệt độ; khi khảo sát tính bền vững của enzyme ficin dạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 50ºC Dịch enzyme ficin sẽ bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài

mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzyme bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxy hóa

Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng (4,5 – 9,5) độ bền vững của enzyme ficin đạt đến mức cực đại nhưng trong một vùng pH hẹp dao động quanh pH =

7 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu Nguyên nhân là do một nhóm –SH tối cần thiết bị oxy hóa Tuy nhiên sự giảm tính bền vững ở pH này sẽ mất đi khi gia tăng

nồng độ cystein từ 0,01 lên 0,025M

Ficin có độ bền vững cực đại ở pH = 7,5 và pHopt trung bình ở khoảng 6-7,5

Cơ chế xúc tác: các loại enzyme protease thu từ đu đủ, vả, dứa có tên là thiol – protease, cysteinprotease hay sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 40 – 80ºC ở pH tự nhiên Tâm hoạt động của các enzyme này bao gồm có hai amino acid là cysteine và histidine

Cơ chế thủy phân xảy ra ở hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn ‘‘acyl hóa ‘‘

Giai đoạn 2: giai đoạn ‘‘deacyl hóa“ có sự tham gia của phân tử nước

Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng thủy phân protein của ficin [5]

Nhiệt độ: hoạt động thủy giải protein của enzyme ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzyme, tốc độ phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ Mỗi enzyme có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của nó, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến tối đa Điểm nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạt động enzyme

Độ pH: độ pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme Mỗi enzyme có một trị số pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme được gọi là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến mức cực đại

Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme do:

- Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme

- Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất

- Tác dụng vào độ bền của phân tử enzyme

1.3.5.3 Ứng dụng ficin trong công nghệ thực phẩm

- Trong công nghệ thịt: ficin được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protease trong thịt, kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn [2] Làm mềm thịt có thể được tác động bởi proteinase nội sinh, đặc biệt là enzyme cathepsin và bởi các proteinase trung tính được tìm thấy trong hoặc gần protein sợi cơ trong quá trình chín Ngoài các chế phẩm enzyme từ nguồn thực vật, người ta còn sử dụng enzyme có nguồn gốc vi khuẩn để làm mềm xương động vật Các proteinase thực vật có hoạt động đáng kể lên mô liên kết, chủ yếu là collagen và elastin và thể hiện sự hoạt động một ít lên các protein sợi cơ Các enzyme thủy phân protein của vi sinh vật cũng tác động đáng

kể lên các sợi cơ nhưng chỉ có tác động nhẹ lên sợi collgen và không tác động lên elastin Ưu điểm của chế phẩm enzyme từ nguồn vi khuẩn là chúng có khả năng chịu nhiệt, do đó khi nấu hoạt động của enzyme vẫn còn Chính vì vậy, cần kết hợp giữa

enzyme thực vật và vi sinh vật để làm mềm thịt được hiệu quả cao hơn [1], [17]

- Trong quá trình chế biến cá: sản xuất nước mắm hay khi muối cá, protease có trong cá sẽ thủy phân protein cá Tuy nhiên, quá trình này xảy ra chậm, yếu và thời gian kéo dài Khi ta bổ sung thêm lượng protease từ bên ngoài vào sẽ làm tăng tốc độ thủy phân và rút ngắn thời gian chế biến Do protease làm biến đổi nhanh chóng cấu trúc của mô và cơ, làm gia vị thấm vào nhanh hơn nên sẽ rút ngắn thời gian muối cá, ngoài ra, protease còn làm tăng hương vị của sản phẩm [17]

- Trong công nghệ sữa: chủ yếu sử dụng ficin có tác dụng làm đông tụ sữa như renin, pepsin và một số protease vi sinh vật trong quá trình sản xuất Khi sử dụng protease, phomat sẽ chóng chín, nâng cao được chất lượng và có thể tạo ra được các loại phomat khác nhau Các ficin sẽ thủy phân một phần protein thành các acid amin và peptid phân tử thấp Các chất này có ảnh hưởng tốt đến hương vị của phomat [10], [17]

- Trong công nghệ giải khát: ficin được sử dụng để làm trong nước hoa quả và làm trong bia Ngoài ra, ficin được sử dụng trong sản xuất bia, rượu để phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase, do đó làm tăng nhanh quá trình đường hóa tinh bột [10], [17]

Ficin cũng được dùng để bảo quản những sản phẩm chứa protein trong sữa, bơ và sữa khô bằng cách làm giảm hiệu quả chịu nhiệt của kappa casein ở mức thấp nhất và làm cho vật liệu của sữa chịu đựng được tốt quá trình xử lý nhiệt hoặc thanh trùng Pasteur

Trong y học

Chế phẩm enzyme ficin chưa được ứng dụng nhiều, tuy nhiên người ta đã sử dụng enzyme này làm thuốc xổ giun, trị các bệnh do ký sinh trùng đường ruột gây ra, loét da, đau họng, dùng làm thuốc thử tế bào máu

Ở Việt Nam, enzyme ficin tinh sạch chưa phổ biến và chưa được dùng trong y học nhưng từ lâu, nhân dân ta coi nhựa sung, nguồn thu nhận của enzyme ficin là một

vị thuốc quí để chữa nhức đầu và một số bệnh ngoài da (chốc, nhọt, sưng đau, tụ máu )

Trong các lĩnh vực khác

Enzyme ficin có khả năng kìm hãm hiện tượng Melanosis (đốm đen) ở loài tôm

hồng (Penaeus duorarum) một cách đáng kể Ficin tác động như một chất thay thế cho

các sulfite trong việc tránh khỏi sự hình thành các chấm đen dưới điều kiện bảo quản đông lạnh hơn một tuần Người ta cho rằng mô hình tác động của enzyme ficin là sự kìm hãm lên enzyme polyphenol oxydase, tác nhân gây nên hiện tượng xuất hiện đốm đen ở tôm

Ở các nước Âu Mỹ trước đây, ficin là một thành phần trong nước rửa chén Sau này nó không được dùng nữa vì người ta thấy nó có tác dụng xấu đối với da

Bên cạnh đó, ficin còn được dùng trong việc nghiên cứu sự thủy phân thức ăn cho bò và một số ứng dụng trong lĩnh vực thú y

Một số chế phẩm enzyme ficin thương mại

Ficin thương mại là hỗn hợp một số protease và một ít peroxidase cộng thêm chất độn (đường hoặc bột), màu nâu nhạt, không mùi hoặc có thể là nhựa vả (sung) tươi được trích từ thân sau đó lọc rồi sấy phun hoặc đem sấy rồi nghiền thành bột

Enzyme Wied N: chứa hỗn hợp của các enzyme thực vật như: bromelain,

papain, lipase, amylase, ficin, chiết xuất hạt nho và cây cà chua bổ sung vào chế độ ăn

hỗ trợ tiêu hóa giúp tăng cường chức năng đường ruột, tăng khả năng bảo vệ tế bào bởi

các vi sinh vật

Enzyme-Mix: kết hợp các enzyme bromelain các enzyme bromelain từ quả dứa,

papain từ quả đu đủ và ficin từ quả sung hỗ trợ tiêu hóa protein

Ficin: hổ trợ tiêu hóa

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

- Năm 2008, Devaraj KB và cộng sự đã tinh sạch và khảo sát một số tính chất của ficin từ sung tây Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin đã tiến hành tinh sạch enzyme

từ nhựa quả sung bằng các phương pháp sắc kí, điện di để thu được enzyme tinh sạch đồng thời khảo sát nhiệt độ và pH thích hợp cho hoạt độ của chúng [22]

Cũng cùng chủ đề này, Nison Sattaya cũng nghiên cứu lĩnh vực này trên đối tượng cây sung được trồng tại Thái Lan vào năm 2012 [26]

- Năm 2012, Hamid Zare và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng protease và tiến hành tinh sạch ficin có trong dịch nhựa Hamid Zare đã sử dụng phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein còn phương pháp sắc kí để tinh sạch enzyme ficin [23]

- Năm 2014, Mohammed Gagaoua và cộng sự, đã xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme ficin thu nhận từ quả vả [25]

- Năm 2014, Danielle Baeyens-Volant và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu phương pháp tinh sạch và tìm hiểu về đặc tính của protease trên nhựa vả Nghiên cứu này sử dụng phương pháp tinh sạch bằng điện di mini SDS và phương pháp sắc

ký lọc gel để xác định phân tử lượng của enzyme protease trong nhựa vả Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã xác định được nhiệt độ và pH tối ưu của protease [21]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

- Năm 2012, trong Công nghệ enzyme của Nguyễn Đức Lượng giới thiệu các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ficin có trong nhựa quả sung Đối với phương pháp tách chiết Nguyễn Đức Lượng sử dụng dung môi hữu cơ và muối để kết tủa protease, sau đó tiến hành tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc kí lọc gel sephadex G75 [10]

Hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về enzyme ficin trong quả vả được công bố, phần lớn các đối tượng nghiên cứu chỉ tập trung ở papain trong quả đu đủ, bromelain trong quả dứa Mặc dù, ở nước ngoài đã có nhiều nghiên cứu về enzyme ficin trong nhựa vả Nhu cầu sử dụng các nguồn enzyme từ thực vật ứng dụng trong thực phẩm rất lớn chúng ta chủ yếu nhập từ nước ngoài nên giá thành rất cao Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển thu nhận chế phẩm enzyme ficin trong nước là việc rất cần thiết và là một ngành công nghiệp đầy tiềm năng

* Tính mới của đề tài

Thứ nhất: với tình hình trong và ngoài nước như đã trình bày ở trên ta thấy được vẫn chưa có nhiều sự quan tâm trong nước đối với loại enzyme ficin trong quả

vả Trong khi đó, các enzyme khác như bromaline, papain đã được nghiên cứu và ứng dụng

Thứ hai: bước đầu ứng dụng vào trong quá trình làm mềm thịt, sẽ mở ra một cái nhìn mới đối với các nhà nghiên cứu về ứng dụng của enzyme ficin

Thứ ba: muốn giới thiệu đến với mọi người và giúp mọi người biết đến quả vả nhiều hơn cũng như biết được giá trị khi sử dụng chúng trong đời sống Có thể ứng dụng trực tiếp vào trong các bữa ăn hằng ngày

Từ những lý do trên, việc lựa chọn và thực hiện đề tài này rất có ý nghĩa khoa

học và thực tiễn

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế và phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm – Khoa Cơ khí - Công nghệ, Trường Đại học Nông Lâm Huế

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

- Dịch nhựa quả vả được thu nhận ở ba giai đoạn thu hoạch khác nhau (quả non, quả vừa chín tới, quả thu hoạch) trên địa bàn Tỉnh Thừa Thiên Huế

Hình 2.1 Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch của quả vả

- Thịt bò được thu mua tại lò giết mổ Hương An, thị xã Hương Trà và Thủy Xuân, thành phố Huế

Hình 2.2 Thu mua thịt bò tại lò giết mổ gia súc

- Tủ sấy: hiệu Memmert - Đức

- Cân phân tích: hiệu Satorius – Đức

- Máy khuấy từ: hiệu IKA C-MAG HS10 – Đức

- Máy vortex mixer: hiệu Pioway – Trung Quốc

- Máy đo độ dai WDS-1

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả

+ Khả năng thu nhận nhựa quả vả: độ dày vết cắt, độ sâu, thời gian nhiệt độ + Khảo sát đối tượng thu nhận: quả non, quả thu hoạch,quả già

+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tủa protein: dung môi, tỷ lệ dịch nhựa/dung môi, thời gian và nhiệt độ kết tủa

2.2.2 Khảo sát một số tính chất đặc trưng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm ficin

+ Nhiệt độ, pH hoạt động

+ Khả năng bền nhiệt

2.2.3 Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

+ Khảo sát độ dai của thịt bò

+ Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả

2.3.1.1 Quy trình tách nhựa từ quả vả

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [9], [10]

* Thuyết minh quy trình:

Dịch nhựa được thu nhận khi quả vả vừa mới thu hoạch vào buổi sáng sớm Dùng bình tam giác đặt trong xô đá để hứng lấy dịch nhựa chảy ra từ cuống quả vả Tiếp tục cắt thêm một đoạn khoảng 0,5 – 1cm trên cuống quả để tận thu dịch nhựa Lưu ý, trong quá trình cắt cuống không được cắt thâm vào thịt quả quá 2cm [10] Ngoài ra, tránh nhiễm bụi, tạp chất, kim loại, tránh ánh sáng và luôn giữ ở điều kiện lạnh để tránh ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme trong quá trình thu nhận Sau

đó, dịch nhựa từ quả vả (gọi là nhựa vả) nhanh chóng đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ < 5ºC

2.3.1.2 Quy trình tách enzyme ficin từ nhựa quả vả

Hình 2.4 Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ nhựa quả vả [9], [10], [25]

Quả vả

Khấy từ (100 vòng/phút, 5 phút)

Ly tâm thu tủa (10000 vòng/phút,

4oC10phút) Dịch nổi

Lấy nhựa (điều kiện lạnh)

Hòa tan trong nước cất

Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC)

Bảo quản enzyme

Kết tủa protein

Chế phẩm enzyme Dung môi

Nước cất

Tạp chất cặn bẩn

Dung môi

* Thuyết minh quy trình:

Dịch nhựa thu được bảo quản ở nhiệt độ đông (-20ºC) sau đó ta đem xuống ngăn lạnh trước khi tiến hành thu nhận enzyme ficin Tiến hành hòa tan dịch nhựa với nước cất bằng cách cân 5g dịch nhựa hòa với nước cất tỉ lệ 1/2 [5] Sử dụng máy khuấy từ (100 vòng/phút), trong thời gian 2 – 3 phút để tạo điều kiện cho quá trình hòa tan được triệt để Tiếp theo, dung dịch được tách tạp chất và các phần không tan bằng máy ly tâm lạnh (4000 vòng/phút, trong 10 phút) Sau khi ly tâm ta loại bỏ lớp cặn dưới đáy và một phần dịch trắng đục nổi lên trên bề mặt, chỉ thu phần dịch ở giữa để tiến hành kết tủa protein Tại giai đoạn kết tủa bằng dung môi hữa cơ ta tiến hành khảo sát các loại dung môi (ethanol, aceton) cần tủa, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (1/1, 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5), thời gian (30 phút, 60 phút và 90 phút), nhiệt độ (1ºC, 3ºC và 5ºC) kết tủa Dựa vào phương pháp loại suy chúng tôi sẽ lựa chọn các thông số thích hợp cho quá trình kết tủa protein

có trong dịch nhựa Để thu nhận tủa protein chúng tôi tiến hành ly tâm lạnh (10000 vòng/phút, 10 phút, 4oC) Sau khi ly tâm lượng kết tủa sẽ lắng xuống dưới và được tách bằng cách lọc hoặc hút Sau đó, làm khô tủa từ 2 giờ – 3 giờ trong điều kiện lạnh Kết tủa thu được đem đi hòa trong dung dịch đệm phosphat để tiến hành đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và hoạt độ protease bằng phương pháp Amano

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford sẽ được trình bày chi

tiết ở phụ lục 1.1

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại

và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid Trong dung dịch mạnh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại ở 595nm Nhờ đó mà xác định được nồng độ protein Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein Trong môi trường của gốc mang điện tích dương,

sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần một giờ [4], [5] Xây dựng đường chuẩn Albumin, từ đó xác định hàm

lượng protein trong V(ml) để chế phẩm thô được tính theo công thức:

mg protein = b*10 -3 *m*V (CT1) Trong đó

b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)

m: hệ số pha loãng

V: thể tích dung dịch chế phẩm enzyme thô (ml)

µgtyrozin × 0,8

t

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease

Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano được trình bày ở phụ lục

1.2 [2], [11]

Nguyên tắc: protein (casein) làm cơ chất Xác định độ hoạt động phân giải protein của enzyme trên cơ sở xác định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng, bằng phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme

Đơn vị hoạt động của proteolitic (casein) là lượng enzyme mà trong 60 phút ở 30ºC có khả năng phân giải protein tạo các sản phẩm hòa tan trong trichloroacetic, cho phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với 1µg tyrosin Hoạt độ riêng của các chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt động proteolitic trên 1ml protein chế phẩm [22] Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosin và dựa vào đồ thị đường chuẩn tính lượng µg tyrozin tương ứng Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 0,2ml dung dịch enzyme đã lấy xác định hoạt độ theo công thức:

+ Xác định pH bằng máy đo pH điện tử hiệu Hansan – Ý

+ Đo mật độ quang trên máy đo quang phổ: UV- Nhật Bản

2.3.5 Phương pháp cơ học

Sử dụng các biện pháp xử lý cắt cuốn để thu dịch nhựa từ quả

Phương pháp lọc, ly tâm để tách dịch nhựa

2.3.6 Phương pháp xác định độ mềm thịt bò

2.3.6.1 Cách lấy mẫu

Mẫu thịt bò (longissimus dorsi) được lấy tại hai cơ sở giết mổ gia súc: tại Hương

An, thị xã Hương Trà và tại Thủy Xuân, thành phố Huế Sau 2 giờ giết thịt, mẫu được

xử lý và phân tích độ dai và các chỉ tiêu liên quan như tỷ lệ mất nước và màu sắc của thịt bò Các chỉ tiêu được theo dõi sau 0, 5, 10, 15 và 20 phút sau khi bổ sung chế