Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn methylobacterium extorquens

Ảnh hưởng của nguồn Carbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens .... Khả năng sinh tổng hợp protein của chủng VK Methylobacte

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THANH HIỀN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN

EXTORQUENS

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Mỹ

Đà Nẵng - Năm 2019.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi

Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả khóa luận

Nguyễn Thị Thanh Hiền

Khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu khoa học tự lực đầu tiên mà

tôi đã hoàn thành trong sự nghiệp học tập và nghiên cứu khoa học của mình Chính vì vậy trong quá trình thực hiện đã gặp không ít khó khăn Tuy nhiên, nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ từ phía gia đình, thầy cô và bạn bè mà tôi đã có thể hoàn thiện được khóa luận này

Trước hết tôi xin cảm ơn ba mẹ và người thân đã giúp đỡ và động viên về tinh thần cũng như vật chất để tôi có tập trung hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô – TS Phạm Thị Mỹ đã định hướng cũng như động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận, giúp tôi từng bước đến gần hơn với khoa học Cảm ơn cô đã luôn theo sát, truyền đạt các kiến thức và những kĩ năng vô cùng bổ ích về mặt chuyên ngành Chính những kiến thức quý báu mà cô đã truyền đạt là nguồn tư liệu vô cũng quan trọng để tôi có thể hoàn thành tốt bài khóa luận này Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn cô!

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Sinh – Môi trường đã giúp tôi trang

bị kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tôi thực hiện tốt

đề tài nghiên cứu của mình

Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã luôn bên cạnh, chia sẻ kiến thức và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Hiền

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined 2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về vi khuẩn Methylobacterium extorquens 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 3

1.1.3 Một số ứng dụng của VK Methylobacterium extorquens 4

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protein của vi khuẩn M extorquens 6

1.2 Khái quát về protein đơn bào 10

1.2.1 Quy trình sản xuất protein đơn bào [12] 12

1.2.2 Những vấn đề cần lưu ý trong sản xuất protein đơn bào 12

1.3 Một số nghiên cứu về việc sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật 15

1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 15

1.3.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Thời gian và địa điểm thực hiện 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp thực hiện đề tài 20

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 20

2.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn M extorquens 22

2.4.4 Xác định mật độ 22

2.4.5 Xác định hàm lượng sinh khối protein 23

2.4.6 Phương pháp xử lí số liệu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Ảnh hưởng của nguồn Carbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens 27

3.1.1 Khả năng sinh trưởng của VK Methylobacterium extorquens trên các nguồn Carbon khác nhau 27

3.1.2 Khả năng sinh tổng hợp protein của chủng VK Methylobacterium extorquens trên các nguồn Carbon khác nhau 30

3.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens 32

3.2.1 Khả năng sinh trưởng của VK Methylobacterium extorquens trên các nguồn Nitơ khác nhau 32

3.2.2 Khả năng sinh tổng hợp protein của chủng VK Methylobacterium extorquens trên các nguồn Nitơ khác nhau 36

3.3 Ảnh hưởng kết hợp của nguồn Carbon và Nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens 38

3.4 Xác định hàm lượng protein tổng số của chủng VK Methylobacterium extorquens trên môi trường tối ưu 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 50

CTAB: Cetyltrimethyl-ammonium bromide

MOB: Aerobic MethaneOxidizing Bacteria

EFP Eurolysine Fodder Protein

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

ĐC Đối chứng

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tế bào VSV (% theo khối lượng khô) [11] 11

Bảng 1.2 Hàm lượng acid amine không thay thế của một số nguồn protein [12] 12

Bảng 2.1 Lập đồ thị chuẩn nồng độ protein 25

Bảng 2.2 Kết quả OD đường chuẩn protein 25

Bảng 3.1 Mật độ tế bào vi khuẩn Methylobacterium extorquens ở các nguồn Carbon khác nhau (10 8 CFU/ml) 28

Bảng 3.2 Mật độ tế bào vi khuẩn Methylobacterium extorquens ở các nguồn Nitơ khác nhau (10 8 CFU/ml) 34

Bảng 3.3 Mật độ tế bào và nồng độ protein thu được của VK M extorquens khi nuôi ở môi trường MMS có bổ sung các tỉ lệ C/N khác nhau 38

Bảng 3.4 Hàm lượng protein trong sinh khối một số chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu sản xuất SCP 41

Hình 1.1 Vi khuẩn Methylobacterium extorquen [14] 4

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa nguồn Carbon của VK M extorquens [28] 7

Hình 1.3 Chu trình chuyển hóa Glucose của VK Methylobacterium extorquens [29] 8 Hình 1.4 Sự khử nitrat đồng hóa của VK Methylobacterium extorquens 9

Hình 1.5 Con đường đồng hóa ammonia (Theo Prescott và cs, 2005) 9

Hình 1.6 Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và glutamate synthase 10

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20

Hình 2.2 VK M extorquens cấy ria trên đĩa thạch sau 3 ngày nuôi cấy 21

Hình 2.3 VK M.extorquens cấy ria trên ống nghiệm sau 3 ngày nuôi cấy 21

Hình 2.4 Quy trình thực hiện định lượng protein theo phương pháp Lowry 25

Hình 2.5 Mối quan hệ tương quan giữa mật độ quang và nồng độ protein Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Khuẩn lạc của VK Methylobacterium extorquens khi nuôi trên các nguồn Carbon khác nhau so với mẫu đối chứng 28

Hình 3.2 Nồng độ protein thu được của VK M extorquens ở các nguồn Carbon khác nhau (µg/ml) 31

Hình 3.3 Khuẩn lạc của VK Methylobacterium extorquens khi nuôi trên các nguồn Nitơ khác nhau so với mẫu đối chứng 33

Hình 3.4 Nồng độ protein thu được của VK M extorquens ở các nguồn Nitơ khác nhau (µg/ml) 36

Hình 3.5 Nồng độ protein thu được của VK M extorquens ở các nghiệm thức bổ sung kết hợp tỉ lệ giữa nguồn Carbon và Nitơ khác nhau (µg/ml) 40

1

độ gia tăng dân số; sự phân phối nguồn protein không đồng đều giữa các nơi trên thế giới; môi trường ô nhiễm đã làm mất dần nguồn lợi thức ăn từ tự nhiên làm thiếu hụt nguồn protein đa bào Do đó, những ưu điểm của protein đơn bào như khả năng sinh sản và phát triển nhanh, hàm lượng protein cao, thành phần cân đối và đầy đủ, dễ điều khiển chất lượng bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc tác động vào hệ gene, chủ động trong sản xuất, ít chiếm diện tích đã mở ra tiềm năng thay thế nguồn protein đa bào và vi sinh vật là nguồn cung cấp thức ăn trong tương lai [12]

Protein đơn bào (Single-cell protein – SCP) là thuật ngữ thường dùng để chỉ phần protein thu được trong sinh khối khô của các tế bào hoặc tổng lượng protein tách chiết được từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, được sử dụng làm nguồn thức ăn cho con người hay nguồn thức ăn chăn nuôi Các protein đơn bào có thành phần protein cao (60-80% khối lượng khô của tế bào), chất béo, carbohydrate, acid nucleic, vitamin và chất khoáng Chúng cũng chứa nhiều các axit amin thiết yếu như lysine và methionine [2]

Công nghệ sản xuất protein đơn bào là công nghệ nuôi cấy và thu sinh khối các

vi sinh vật Nó ra đời được coi là một phương pháp hứa hẹn có thể giải quyết được vấn

đề thiếu protein trên toàn thế giới Công nghệ sản xuất protein đơn bào bao gồm cả các quá trình chuyển vị sinh học, biến đổi các sản phẩm phụ ít giá trị và chi phí thấp, thường là các chất thải, trở thành sản phẩm với giá trị dinh dưỡng và giá trị thị trường cao hơn Một trong những nguồn cơ chất được quan tâm hiện nay là methanol bởi nó

có nhiều ưu điểm vượt trội so với những cơ chất khác như n-paraffin, khí metan hay thậm chí một số hợp chất carbohydrate [1]

Chi Methylobacterium là nhóm vi khuẩn hồng, dinh dưỡng methyl tùy ý

(pinkpigmented facultatively methylotrophic, PPFM) Chúng cư ngụ chủ yếu ở vùng diệp quyển, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu Với khả năng sử dụng nguồn carbon

rẻ tiền là methanol, hàm lượng protein trong tế bào chiếm trên 70% trọng lượng khô

mà thành phần protein, acid amin và các phân tử sinh học khác tương tự như cá tự

2

nhiên, chủng Methylobacterium sp được đánh giá là chủng vi khuẩn có tiềm năng lớn

cho quá trình sản xuất protein đơn bào giá thành thấp ở quy mô công nghiệp [2]

Một hướng tiếp cận mới hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm đó là hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn protein thay thế trong thức ăn nuôi trồng thủy sản Trong một nghiên cứu mới nhất vào đầu năm

2017 tại một công ty công nghệ sinh học có trụ sở tại Massachusetts KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger Williams và Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã chỉ ra rằng chế độ ăn có

chứa từ 30% đến 100% vi khuẩn dạng viên Methylobacterium extorquens đóng vai trò

như một chất thay thế protein nông nghiệp có chất lượng cao trong thức ăn cho thủy

sản (tôm, cá) Đặc biệt một đặc điểm nội sinh mang lại lợi thế là M extorquens chứa

các hợp chất carotenoid chống oxy hóa tự nhiên, giúp tăng cường khả năng miễn dịch [3]

Xuất phát từ những lí luận thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Carbon và Nitơ đến khả năng sinh tổng hợp

protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens”

2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu thiết lập môi trường nuôi cấy tối ưu để sản xuất nhanh sinh khối tế

bào và sinh tổng hợp nhiều protein của chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens thông qua việc xác định nguồn Carbon, Nitơ và tỉ lệ Carbon/Nitơ thích hợp

3 Ý nghĩa của đề tài

Kết quả của đề tài là cơ sở để xây dựng quy trình thu nhận protein đơn bào từ

chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens ở quy mô công nghiệp

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về vi khuẩn Methylobacterium extorquens

1.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố

Methylobacterium extorquens là một loại vi khuẩn phổ biến rộng rãi môi trường

sống bị cô lập như nước thải, đất hoặc thực vật (Doronina 1996; Kohler-bụi năm 1986; Vorholt 2012) Trong nghiên cứu của những năm gần đây thì chủng VK

Methylobacterium extorquens, được xem như là một sinh vật mô hình cho việc nghiên

cứu Methylotrophy, tức là sử dụng các nguồn carbon không có liên kết C-C là nguồn carbon và năng lượng duy nhất (Anthony 1982, Anthony 2011)

Vi khuẩn Methylobacterium extorquens là một methylotrophic có sắc tố hồng

dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM), chúng

có khả năng sử dụng các nguồn C1 (Methanol, Methylamine, Formaldehyde, ) và kể

cả các nguồn Carbon với liên kết C-C của hai, ba hoặc bốn nguyên tử Carbon như Acetate, Ethanol hoặc D – Glucose với sự hiện diện của oxy (Ochsner 2014) [4]

Vị trí phân loại Methylobacterium extorquens trong giới vi sinh vật như sau: Giới: Bacteria; Ngành: Proteobacterium; Lớp: Alphaproteobacteria; Bộ: Rhizobiales; Họ: Methylobacteriacea; Chi: Methylobacterium; Loài:

Methylobacteirium extorquens

Vi khuẩn Methylobacterium extorquens là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, được phân

lập từ môi trường có oxy hòa tan như ao hồ, đất, bề mặt lá, nốt sần của rễ cây họ đậu, không khí, thực phẩm, mỹ phẩm,… và ngay cả ở trong nước máy [5]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Methylobacterium extorquens là vi khuẩn Gram âm, thường có hình que, kích

thước 0,8–1 × 1–8 µm Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những hình dạng bất thường khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng

Vi khuẩn M extorquens thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng

[6] Chúng có khả năng di dộng nhờ vào các tiêm mao ở cực hay cận cực [7] Vi khuẩn

M extorquens sinh trưởng ở nhiệt độ tối thích 25-300C và ở pH trung tính từ khoảng 7

đến 9 [6] Hầu hết M extorquens thường tăng trưởng chậm Sau 3-7 ngày nuôi cấy ở

nhiệt độ 300C trên môi trường Methanol Mineral Salt (MMS) thì khuẩn lạc thường có

màu hồng nhạt đồng nhất Sắc tố hồng đặc trưng của vi khuẩn M extorquens là hợp

4

chất carotenoid, không bị hòa tan trong nước, không phát ánh sáng huỳnh quang và hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm [27, 43]

Hình 1.1 Vi khuẩn Methylobacterium extorquen [14]

(a) – Hình thái khuẩn lạc (b) – Hình dạng VK dưới kính hiển vi

Ở môi trường lỏng nuôi cấy tĩnh VK Methylobacterium extorquens tạo thành một

lớp mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc

[30, 59] Chủng VK M extorquens không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có

khả năng phân giải các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA Đặc biệt chủng VK này không có khả năng tạo ra các enzyme như β-galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase, L-arginine dihydrolase (ngoại trừ enzyme Urease) [27, 30, 31]

1.1.3 Một số ứng dụng của VK Methylobacterium extorquens

VK Methylobacterium extorquens có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau

có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Trong nghiên cứu gần đây

của Daniel Abanda-Nkpwatt et al 2006 cho thấy VK Methylobacterium extorquens có

khả năng thúc đẩy tăng trưởng của cây con, làm tăng trọng lượng và chiều dài chồi của

lúa mì, lúa mạch, ngô và cà rốt Ngoài ra VK Methylobacterium extorquens còn có khả

năng ức chế tiêu diệt côn trùng có hoạt tính cao chống lại một số loài Lepidoptera từ

Bacillus thuringiensis [30]

Bên cạnh đó, VK Methylobacterium extorquens còn có khả năng sinh tổng hợp

PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) – một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn carbon

5

dự trữ ở VSV PHB được coi như là một loại nhựa sạch, không gây ô nhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm PHB được điều chế thành các sản phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùng trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt, … (D Bourque và cộng sự,

1995) Ở Methylobacterium extorquens AM1 trên môi trường có nguồn carbon là

succinate thì lượng PHB tạo thành chiếm 15-20% trọng lượng sinh khối khô, trong môi trường có methanol lượng PHB tạo ra chiếm tới 80% trọng lượng khô và đối với

VK Methylobacterium fujisawaense trên môi trường glucose chỉ sinh tổng hợp được

lượng PHB chiếm khoảng 12,4% Trong tế bào VK, PHB được dự trữ trong túi bên trong tế bào PHB bắt màu đặc hiệu với thuốc nhuộm Nile blue, phát ánh sáng đỏ khi được xem dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng 235nm [25]

Ngoài ra, VK Methylobacterium extorquens còn có khả năng tạo ra

phytohormone (chất phụ gia và cytokinin) và tương tác với quá trình chuyển hóa nitơ thực vật thông qua enzyme urease của vi khuẩn hoặc thông qua việc tạo ra các nốt sần

cố định đạm (Jourand et al , 2004 , Omer et al , 2004 b ; Lee và cộng sự , 2006 )

Đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm VK Methylobacterium extorquens là nhóm vi

khuẩn đầy tiềm năng Với khả năng sử dụng methanol – nguồn nguyên liệu rẻ tiền – cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng để tạo các sản phẩm

có giá trị như SCP, β-carotene, vitamine B12 [30] Sự hình thành vitamin B12 của

Methylobacterium extorquens và tác dụng thúc đẩy tăng trưởng của nó đối với cây khoai tây và cây thuốc lá đã được mô tả ( Kalyaeva et al , 2001 ) Hàm lượng protein trong tế bào Methylobacterium extorquens chiếm gần 80% tính theo trọng lượng chất

khô nên chúng là nhóm VK đầy tiềm năng trong sản xuất SCP [47] Ngoài ra, đây là chủng VK có sắc tố hồng đặc trưng không bị hòa tan trong nước, không phát ánh sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid nên đó là một đặc điểm nội sinh đặc biệt mang lại lợi thế cho chúng trong việc thu sinh khối SCP ứng dụng làm thức ăn thủy sản Các

hợp chất carotenoid như astaxanthin và canthaxanthin của Methylobacterium extorquens có khả năng chống oxy hóa cao vừa có khả năng tăng cường miễn dịch vừa

tạo được màu sắc cho thức ăn của thủy hải sản [44]

Về tổng thể, quá trình sinh tổng hợp protein là quá trình dịch mã di truyền trên khuôn mẫu ARNm, gồm 3 giai đoạn: khởi động, kéo dài, kết thúc với sự tham gia của nhiều yếu tố và các enzym khác nhau Trong đó, nguồn Carbon và Nitơ là hai yếu tố đóng vai trò vô cùng quan trọng

1.1.4.1 Nguồn Carbon

Methylobacterium extorquens là một methylotroph có khả năng tăng trưởng trên

cả hai hợp chất carbon đơn và đa carbon M extorquens sử dụng chu trình serine, con

đường EMC và chu trình PHB để đồng hóa một carbon Con đường ethylmalonyl-CoA

(EMC) là một trong những con đường đồng hóa trung tâm của M extorquens trong

quá trình tăng trưởng trên các chất nền C1 và C2 [27], [28]

Methylotrophy được chia thành ba phần chính: quá trình oxy hóa (có thể bao gồm cả Demethylation và/hoặc dehalogenation) của một chất nền methyl hóa Formaldehyde hoặc gốc methyl hoặc methylen (thường gắn với H4F); sự oxy hóa của formaldehyde hoặc methyl/methylene-H4F thành CO2 và quá trình đồng hóa một nguyên tử cacbon của formaldehyde với chu kỳ RuMP hoặc CBB hoặc của methylene-

H4F và CO2 qua chu trình serine (Chistoserdova 2011)

M extorquens oxy hóa methanol tạo thành hợp chất tiền đề là Formaldehyde

(Anthony 1986) Ngoài ra, methylamine có thể từ methylame bị oxy hóa thành formaldehyde (Chistoserdov 1994) Sau đó một số oxidase hình thành bị oxy hóa thành CO2 (Chistoserdova 2007; Chistoserdova 1998) và một nguyên tử cacbon của methylene-H4F trên chu kỳ serine được đồng hóa, với methylen-H4F được hình thành

7

bởi sự ngưng tụ tự phát của H4F và hình thành hoặc bằng cách thắt chặt, dưới tiêu thụ

ATP [51], [53] Sự trao đổi chất chính của M extorquens được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa nguồn Carbon của VK M extorquens [28]

Ngoài ra, đối với các nguồn đa Carbon như D – Glucose, VK M extorquens sử

dụng con đường chuyển hóa Glucose thành Pyruvate Giai đoạn này thường tạo thành một số ATP cũng như NADH hoặc FADH2 Cuối cùng carbon trong chất dinh dưỡng được chuyển vào chu trình acid tricarboxylic phân tử được oxy hoá hoàn toàn thành

CO2 đồng thời với sự tạo thành ATP, N ADH và FADH2 Phần lớn ATP bắt nguồn từ chu trình acid tricarboxylic (và các phản ứng của giai đoạn 2) là do sự oxy hoá của NADH và FADH2 nhờ chuỗi vận chuyển electron Oxy hoặc đôi khi, một phân tử vô

cơ khác là chất nhận electron cuối cùng [29]

Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 2 dạng:

+ Dạng vô cơ: dạng khí nitơ trong không khí (N2, N2O, NO, NO2) và nitơ tồn tại

ở các dạng muối khoáng như ammoni (NH4+), nitrit (NO2-), nitrate (NO3-

+ Dạng hữu cơ: protein, polypeptit, acid amin…trong xác sinh vật

a) Vi khuẩn M extorquens có khả năng hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng nitơ khác

nhau dưới dạng:

- Dạng nitơ vô cơ như NH3, NH4+, NO3- Chúng có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ ở dạng các hợp chất vô cơ như trên, từ đó tổng hợp nên các nhóm amin cho

cơ thể

Đồng hóa nitơ trong vi khuẩn M extorquens trải qua 2 quá trình: quá trình khử

nitrat (NO3-) và quá trình đồng hóa amoni (NH4+) [30]

9

Quá trình khử nitrat (NO3- ): Phản ứng này xảy ra để chuyển hóa nguồn nitơ vô

cơ thành amoniac (NH3) Quá trình chuyển hoá có sự tham gia của ATP, Mo và Fe theo sơ đồ và các bước:

Hình 1.4 Sự khử nitrat đồng hóa của VK Methylobacterium extorquens

(Theo Prescott và cs, 2005)

Con đường thứ nhất để đồng hóa amonia Sự đồng hóa ammonia nhờ glutamate dehydrogenase (GDH) và transaminease Các GDH phụ thuộc NADP hoặc NAD có thể tham gia vào đây Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ ammonia cao

Hình 1.5 Con đường đồng hóa ammonia (Theo Prescott và cs, 2005)

 Con đường thứ hai dùng đồng hoá amonia: Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và glutamate synthase Con đường này hoạt động có hiệu quả ở những nồng

độ ammonia thấp

10 urease

Hình 1.6 Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và glutamate synthase

(Theo Prescott và cs, 2005)

Qui tắc chung của con đường này là:

 Amin hoá trực tiếp các acid xêto tạo acid amin:

Acid kêto + NH4+ → Acid amin

 Chuyển vị amin:

Acid amin + acid kêto → acid amin mới + acid kêto mới

 Hình thành amit: liên kết phân tử NH3 với acid amin dicacboxilic

Acid amin đicacboxilic + NH4+

→ amit b) Dạng nitơ hữu cơ như protein, polypeptit, acid amin Các hợp chất hữu cơ chứa

cả C và N (peptone, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu, )

có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật Đặc biệt, vi

khuẩn M extorquens có khả năng sinh ra enzyme Urease, giúp phân hủy Ure tạo thành

NH3:

(NH2)2CO + 2H2O = (NH4)2CO3(NH4)2CO3 2NH3 + CO2 + H2O

1.2 Khái quát về protein đơn bào

Thuật ngữ “protein đơn bào” (Single-cell protein – SCP) là thuật ngữ được gọi theo quy ước, dùng để chỉ vật chất tế bào VSV dùng làm thức ăn cho người và động vật Thông thường sản phẩm tạo ra không phải là protein thuần khiết mà là các tế bào

đã xử lý thuộc nhiều loại VSV khác nhau, cả VSV đơn bào, lẫn đa bào, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và tảo Thuật ngữ này được đưa ra ở Viện Công nghệ Massachusette vào năm 1966 và vẫn được sử dụng cho đến nay, để chỉ nguồn thức ăn

- Không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khí hậu cũng như điều kiện đất đai

- VSV sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu suất chuyển hóa cao Các nguyên liệu thường là phế phẩm, phụ phẩm của những ngành khác, như rỉ đường, dịch kiềm sulfit, paraffin dầu mỏ Hiệu suất chuyển hóa cao: hydrat cacbon được chuyển hóa tới 50%, cacbuahydro – tới 100% thành phần chất khô tế bào

- Các VSV có chứa hàm lượng protein cao và có giá trị dinh dưỡng

- VSV dễ chuyển gen hơn so với thực vật và động vật và dễ dàng đưa ra sản xuất

ở quy mô lớn

Các VSV có khả năng phát triển nhanh tùy theo từng loài Trong các điều kiện thuận lợi, thời gian cho lượng sinh khối gấp đôi đối với từng loại sinh vật khác nhau: đối với vi khuẩn là 0,3-2 giờ, nấm men 1-3 giờ, tảo 2-6 giờ, nấm mốc 4-12 giờ Bên cạnh đó hàm lượng protein trong tế bào rất cao (vi khuẩn 60-70%, nấm men – 40-60%) và chất lượng protein tốt thể hiện qua thành phần các acid amin Nhiều acid amin có trong VSV với hàm lượng cao, giống như trong sản phẩm của thịt, sữa Protein VSV đặc biệt giàu leucine, chính vì vậy là một lợi thế khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, vì trong thức ăn thường thiếu acid amin này Tuy nhiên hàm lượng các acid amin chứa lưu huỳnh lại thấp [11]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tế bào VSV (% theo khối lượng khô) [11]

12

Bảng 1.2 Hàm lượng acid amine không thay thế của một số nguồn protein [12]

Acid amine Lúa mì Trứng Spirulina

maxima

S

cerevisiae

Cadida lipolytica

Ngoài ra, tế bào VSV chứa nhiều loại vitamin Nấm men giàu vitamin nhóm B,

vi khuẩn chỉ chiếm ưu thế về vitamin B12 Tảo chứa nhiều β-caroten (provitamin A) và tocopherol Nấm mốc chứa ít vitamin nhất

1.2.1 Quy trình sản xuất protein đơn bào [12]

Quy trình để sản xuất SCP bao gồm các bước chính sau đây:

- Chuẩn bị nguồn C, thường là phải qua một tổ hợp xử lý vật lý và hóa học

- Chuẩn bị môi trường thích hợp chứa nguồn C và các nguồn N, P và các chất dinh dưỡng khác

- Cấy VSV mong muốn

- Tách sinh khối tế bào VSV khỏi môi trường tiêu dùng

- Hậu xử lý sinh khối (tùy theo yêu cầu sử dụng)

1.2.2 Những vấn đề cần lưu ý trong sản xuất protein đơn bào

a) Tuyển chọn vi sinh vật

Một VSV được sử dụng cho mục đích sản xuất SCP làm nguồn thức ăn protein cho người hoặc động vật cần phải có một số đặc điểm sau: thời gian nhân đôi ngắn, có khả năng tạo thành 40-70% protein, tiêu hóa tối đa các chất dinh dưỡng của môi trường, không gây bệnh và tiết vào môi trường những độc tố, có sức bền cao và chịu

13

được ở điều kiện nuôi cấy không vô trùng, dễ dàng tách ra khỏi dịch nuôi cấy trong điều kiện tuyển nổi và ly tâm tách và giá thành sản xuất thấp [11, 12, 28] Cụ thể đối với từng loại VSV như sau:

Đối với tảo

Ở tảo người ta thường dùng ba chi để sản xuất SCP là: Chlorella, Spirulina và Scenedesmus chúng có thể có phương thức sinh dưỡng là quang hợp, hoá tổng hợp

hoặc là dị dưỡng Phương pháp hay dùng là phương pháp quang hợp Trong trường hợp này nhân tố giới hạn là ánh sáng, vì vậy kinh tế nhất là dùng các hồ hở dưới ánh sáng mặt trời Tuy nhiên khi tiến hành nuôi tảo ở các hệ thống có quy mô lớn thì khó

có thể giử được các điều kiện vô trùng với giá thành thấp và trong trường hợp này nguy cơ nhiễm tạp là nghiêm trọng Mặt khác, mật độ tế bào khi nuôi tảo thường thấp (ở các hệ thống nuôi lớn chỉ thu được 1-2 gam/lít tính theo trọng lượng khô) để có thể đạt được điều kiện chiếu sáng tốt, song điều này sẽ dẫn đến chi phí tốn kém hơn khi

thu hoạch Riêng tảo Spirulina có thể thu hoạch kinh tế hơn nhờ biện pháp lọc hoặc

vớt Thành phần các cao phân tử của tảo thay đổi rất nhiều phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng Hàm lượng protein thô (N x 6,25) có thể chiếm tới 60%, thành phần các amino acid cân đối, riêng amino acid chứa lưu huỳnh thấp Tảo chứa nhiều sắc tố, một

ưu điểm khi được dùng làm thức ăn gia súc, song lại không tốt cho dinh dưỡng của người [10,12]

Đối với vi khuẩn

Hàm lượng protein trong một số loài vi khuẩn có thể đạt đến 82% tính theo trọng lượng chất khô với chất lượng tốt thể hiện ở sự cân đối các thành phần acid amin Bên cạnh đó vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể dùng được nhiều loại cơ chất Tuy nhiên vì kích thước tế bào vi khuẩn nhỏ và các điều kiện nuôi cấy phức tạp hơn nên cần chú ý một số vấn đề sau: trong quá trình nuôi cấy pH cần giữ ở 5-7, nếu không

sẽ có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh, hàm lượng các acid nucleic đặc biệt là RNA cũng cao (tới 20%) và cần phải được loại bỏ [12, 33]

Một số loài vi khuẩn có thể sử dụng để thu nhận SCP là: vi khuẩn sử dụng hydro

(hydrogenomonas) như H.eutropha, H facillis, H ruhlandii; Pseudomonas saccharophila; vi khuẩn sử dụng methane (Methylobacteria) như Methylomonas methanica; một số loài thuộc chi Methylobacterium [11]

14

Đối với nấm men

Nấm men đã được sử dụng để sản xuất SCP với quy mô lớn từ lâu, đặc biệt là

việc sử dụng các loài trong những chi như Saccharomyces, Torulopsis và Cadida Tuy

nhiên cũng như vi khuẩn việc sản xuất SCP từ nấm men cần lưu ý một số điểm sau: tốc độ sinh trưởng của nấm men tương đối cao nhưng không bằng các chủng vi khuẩn sinh trưởng nhanh nhất; pH trong lên men thường giữ ở 3-5, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc làm giảm nguy cơ nhiễm trùng; hàm lượng protein nằm vào khoảng 50- 60%, tuy nhiên hàm lượng acid nucleic có thể lên tới 15%, vì vậy cần phải tiến hành các biện pháp để làm giảm lượng acid nucleic; thành phần amino acid cân đối nhưng so với vi khuẩn thì hàm lượng các amino acid chứa lưu huỳnh còn thấp hơn Để

sử dụng cần phải bổ sung thêm methionine [10, 12]

Đối với nấm sợi [10, 12]

Khi chọn giống nấm sợi để sản xuất SCP trước hết cần lưu ý có nhiều loài mang độc tố, chúng thường xuyên đe dọa tính mạng mà đặc biệt gây ung thư cho con người Ngày nay người ta đã tìm được trên 20 loại hoạt tính khác nhau các độc tố ở nấm sợi

So với vi khuẩn và nấm men, nấm sợi thường có tốc độ sinh trưởng chậm hơn Gần đây người ta đã phân lập được các chủng có tốc độ sinh trưởng gần bằng nấm men và nấm sợi có một số đặc điểm sau:

- Giới hạn thích hợp cho sinh trưởng khá rộng (từ 3- 8), tuy nhiên trong sản xuất cần giử pH < 5 để tránh nhiễm khuẩn Việc nhiễm nấm men thường hay xẩy ra nếu môi trường không được khử trùng tốt

- Khi nuôi cấy chìm nấm sợi thường tạo thành các đám sợi, điều này có ưu điểm

là làm cho việc thu hoạch dễ dàng, nhưng lại có nhược điểm là hạn chế sự phân bố đồng đều không khí trong toàn bộ hệ sợi

- Hàm lượng protein thô nằm trong khoảng 50- 55%, song khi sinh trưởng nhanh hàm lượng acid nucleic sẽ cao (RNA tới 15%)

- Thành phần amino acid của nấm sợi cân đối, tuy nhiên các amino acid chứa lưu huỳnh cũng có mặt ở nồng độ thấp

b) Nuôi cấy [12]

Dù là lên men diễn ra dưới điều kiện vô trùng hoặc điều kiện sạch đều cần phải

có biện pháp để tránh tạp nhiễm như: đun nóng hoặc lọc các thành phần môi trường và

15

khử trùng thiết bị lên men; khác với tảo, các quá trình sản xuất SCP đều cần thông khí mạnh; nhiệt tạo ra phải có hệ thống làm lạnh

c) Thu hồi sinh khối [12]

Nấm men và vi khuẩn thường được thu hồi bằng ly tâm (vi khuẩn cần năng lượng

ly tâm cao hơn), trong nhiều trường hợp cần cả nhân tố vón cục (kết bông/ kết cụm) Các VSV ở dạng sợi có thể thu hồi nhờ ly tâm vắt (lọc vắt), giá thành sẽ rẻ hơn Phải loại bớt càng nhiều nước trước khi làm khô để tránh tốn kém Tuỳ thuộc vào loại cơ chất và loại sản phẩm, sinh khối cần được hậu xử lý để loại các thành phần cơ chất hoặc làm giảm hàm lượng các chất không mong muốn như acid nucleic Một nhược điểm quan trọng của SCP là thường chứa hàm lượng acid nucleic cao, đặc biệt là ở vi khuẩn, nấm men và nấm sợi Nếu các loại SCP dùng để làm thức ăn cho người thì là cả vấn đề, bởi vì con người thiếu enzyme uricase xúc tác cho sự oxy hoá acid uric thành allantoin hoà tan hơn Đã có những phương pháp đề ra nhằm làm giảm hàm lượng acid nucleic trong SCP như thủy phân bằng kiềm, chiết bằng hóa chất, điều khiển về sinh trưởng và sinh lý tế bào hoặc hoạt hóa RNAase (bằng xử lý nhiệt ngắn) Tuy nhiên những phương pháp này thường sẽ làm giảm giá trị sinh học của SCP

1.3 Một số nghiên cứu về việc sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật

1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

SCP có nguồn gốc lịch sử ở Đức khi trong Thế chiến thứ nhất, khoảng 50% protein nhập khẩu đã được bù đắp bởi nấm men Sản xuất protein nấm men được tiến

hành từ đầu thế kỷ XX ở Đức với phương pháp nuôi Candida utilis trên rỉ đường, sau

đó năm 1936 được tiến hành sản xuất lớn trên cơ sở nuôi trong dịch kiềm sulfit – dịch thải của công nghiệp cellulose, ở Mỹ năm 1946 mới tổ chức sản xuất sinh khối nấm men và đến này nhiều nước trên thế giới đã tổ chức sản xuất loại sản phẩm này dùng chủ yếu cho chăn nuôi và có thể tách làm tinh sạch protein dùng trong dinh dưỡng cho người – làm thức ăn nhân tạo hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm Trong khoảng trên nửa thế kỷ gần đây, công nghiệp sản xuất SCP đã có những bước phát triển nhảy vọt do việc người ta sử dụng hydrocacbua của dầu mỏ, khí đốt làm nguồn cacbon và năng lượng rất có hiệu quả trong nuôi cấy nhiều loại VSV [12] Lợi ích của việc sản xuất protein đơn bào không chỉ dừng lại ở việc cung cấp nguồn thức ăn cho

Nghiên cứu sản xuất SCP từ Vi khuẩn oxy hóa methane (MOB) được tiến hành

từ những năm 70 của thế kỷ trước với sản phẩm thương mại tiêu biểu là Bioprotein của công ty Norferm Danmark A/S (Đan Mạch) Trong nghiên cứu tạo SCP từ

Methylococcus capsulatus (Bath), Skrede và đồng tác giả (1998) đã sử dụng khí tự

nhiên (91% methane, 5% ethane, 1,7% propane, 1% butane) làm cơ chất, theo đó sản phẩm sinh khối có hàm lượng protein thô, chất béo, tro tương ứng là 70%, 10% và 7% [52] Thành phần các amino acid thiết yếu của SCP từ MOB cũng tương tự như trong nguồn đạm bột cá và bột đậu tương [33]

Chủng MOB khác là Methylomonas sp DSM 580 đã được sử dụng để sản xuất

SCP từ methanol, đạt hiệu suất 0,44 g trọng lượng khô/g methanol, hàm lượng protein thô lên tới 76% [29] Công nghệ sản xuất SCP có khả năng góp phần giải quyết vấn đề thiếu hụt protein trên thế giới, đặc biệt trong lĩnh vực chăn nuôi SCP từ MOB nuôi bằng methane không những tạo ra nguồn đạm chất lượng cao mà còn góp phần giảm tác động của khí nhà kính này lên sự ấm lên toàn cầu [18]

Davies, S.J and Wareham, H., (1988) đã nghiên cứu sử dụng Eurolysine Fodder

Protein (E.F.P.) là một protein đơn bào thương mại thu được từ vi khuẩn Micrococcus glutamicus để làm thức ăn cho cá rô phi (Oreochromis mossambicus) Khi tiến hành

thử nghiệm cho cá rô phi ăn với tỷ lệ thức ăn bổ sung 5, 10, 15 và 20% E.F.P để thay thể bột cá, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng với các tỉ lệ 5, 10% E.F.P đưa lại kết quả tốt nhất Khi cá cho ăn 15 và 20% E.F.P nhận thấy sự giảm đáng kể tốc độ tăng

Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã chỉ ra rằng chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% VK

dạng viên Methylobacterium extorquens đóng vai trò như một chất thay thế protein

nông nghiệp có chất lượng cao trong thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) [28, 54]

1.3.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam

SCP được sử dụng trong chăn nuôi như nguồn thay thế protein truyền thống (từ thực vật và động vật), ngày càng được quan tâm nghiên cứu trước tình hình an ninh lương thực, ô nhiễm môi trường và biến đổi khí hậu [45] Các VSV thường được sử

dụng cho mục đích sản xuất SCP gồm nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Candida utilis, Geotrichum candidum), nấm sợi (Aspergillus oryzae, Fusarium venenatum,Sclerotium rolfsii, Polyporus, Trichoderma), vi khuẩn (Rhodopseudomonas capsulate, Methylococcus capsulatus)… Để tạo lượng sinh khối

lớn, các VSV này được nuôi trên các loại cơ chất khác nhau, đặc biệt nhiều loại chất thải và phụ phẩm hữu cơ có thể được tận dụng [38]

Trong những năm gần đây, quá trình nghiên cứu và ứng dụng sinh khối tảo vào chăn nuôi, trồng trọt tại Việt Nam theo chiều hướng tăng nhanh và đáp ứng nhu cầu của xã hội Lưu Thị Tâm và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh học đã bước đầu nghiên

cứu ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin làm thức ăn bổ

sung cho cá hồi vân ở Việt Nam Kết quả từ nghiên cứu cho thấy, ngoài việc gia tăng

sự tạo màu của thịt cá trong quá trình tăng trưởng thì việc bổ sung thêm sinh khối tảo

H.pluvialis vào thành phần thức ăn đã làm tăng chất lượng của thịt cá hồi, đặc biệt là

hàm lượng canxi và acid béo docoxahexaenoic (DHA) trong thịt cá [14] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã có công bố về ảnh hưởng của các tác nhân lên quá trình tăng

18

trưởng của H pluvialis với mục đích tối ưu hóa quá trình sản xuất sinh khối loài tảo

này trong sản xuất astaxanthin [15]

Carotenoid, một dạng sắc tố tự nhiên, có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bao gồm y học, mỹ phẩm, thức ăn chăn nuôi và công nghiệp thực phẩm Trong những năm gần đây, sự gia tăng nhu cầu sử dụng carotenoid từ các nguồn tự nhiên đã thúc đẩy nhiều nỗ lực lớn để cải thiện sản xuất carotenoid từ các nguồn sinh học, do đó mở ra cơ hội phát triển vi tảo Trong nghiên cứu của một nhóm tác giả từ Trường Đại học Cần Thơ, một loại vi tảo biển dị dưỡng, dòng BCM05 có khả năng sản xuất carotenoid đã được phân lập thành công từ các mẫu lá bần đang trong giai đoạn phân hủy ở rừng ngập mặn của tỉnh Cà Mau Kết quả phân tích trình tự một phần vùng gen 18S rRNA của dòng BCM05 cho thấy, có 97% đồng hình với trình tự của

loài Aurantiochytrium sp B072 Qua phân tích cây phả hệ bằng phần mềm MEGA

5.05 và sử dụng giá trị bootstrap cao với 1.000 lần lặp lại, dòng BCM05 đã được xác

định và được đặt tên là Aurantiochytrium sp BCM05 Dòng vi tảo này có thể được

xem là nguồn vi tảo tiềm năng để sử dụng làm thức ăn bổ sung cho động vật thủy sản hoặc để sản xuất carotenoid với số lượng lớn [5]

Võ Thị Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng nước thải sau chưng cất cồn của

nhà máy rượu Bình Tây làm môi trường nuôi cấy giống hỗn hợp VSV (Bacillus sp ≥

107 CFU/ml, Lactobacillus sp ≥ 107 CFU/ml, Saccharomyces sp ≥106 CFU/ml) tạo

chế phẩm sinh học BIO-HR không chứa Coliforms, có mùi thơm và vị chua và bảo

quản được trong thời gian trên một tháng Hiệu quả sử dụng của chế phẩm BIO-HR (2,5 ml Bio-HR/lít nước) cho gà Lương Phượng 3 tuần tuổi uống, sau 8 tuần nuôi, tăng trọng bình quân (kg/con) cao hơn lô đối chứng 30%; hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) thấp hơn lô đối chứng 16% [3] Nguyễn Thị Hiếu Thu và công sự đã phân lập được chủng

vi khuẩn oxy hóa methane BG3 từ nước thải sau biogas qua bước làm giàu trong môi trường khoáng dịch thể với methane (30% pha khí trong bình nuôi) là nguồn năng lượng và cacbon duy nhất Chủng BG3 gồm các tế bào hình oval, kích thước 0,8-1×16 -1,8 μm, hầu như không chuyển động So sánh trình tự gần đủ của16S rDNA từ chủng

BG3 với các trình tự tại GenBank cho thấy BG3 thuộc chi Methylomonas, loài gần gũi nhất là M koyamae (97%) Vị trí phân loại trong chi Methylomonas còn được khẳng định qua phân tích trình tự gen pmoA mã hóa cho tiểu đơn vị α của enzyme

19

methanemonooxygenase ở chủng này Ngoài methane, chủng BG3 có thể sử dụng methanol làm cơ chất để sinh trưởng Chủng BG3 sử dụng methane để tạo sinh khối với hiệu suất ∼2,8 m3 methane/kg sinh khối khô, chứa hàm lượng protein thô ở mức cao (68,69%) Với khả năng chuyển hóa methane, khí nhà kính đáng quan tâm thứ hai sau CO2, thành sinh khối làm nguồn đạm chất lượng cao cho chăn nuôi, chủng BG3 có tiềm năng lớn trong ứng dụng thực tế ở Việt Nam hiện nay [18]

Từ những công trình khoa học trên đây cho thấy, các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất protein đơn bào chỉ tập trung chủ yếu ở tảo và nấm men mà có rất ít

công trình khai thác về vi khuẩn, đặc biệt là VK Methylobacterium extorquens Bên

cạnh đó, cho đến nay, vẫn chưa có công bố cụ thể nào về nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn Carbon và Nitơ khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp

protein của VK nói chung và chủng VK Methylobacterium extorquens nói riêng

Chính vì vậy, nghiên cứu tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng nuôi cấy chủng VK này là một hướng đi đúng có tính cấp thiết với mục đích nâng cao hiệu suất thu hồi sinh SCP

từ đó tạo nguồn nguyên liệu dồi dào phục vụ sản xuất thức ăn thủy hải sản ở nước ta

20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens phân lập từ lá lúa (Oryza sativa

L.) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại Học Sư Phạm – Đại Học Đà Nẵng

2.2 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại Học Sư Phạm – Đại Học Đà Nẵng

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Carbon (Natriacetate, D – Glucose, Formaldehyde), nguồn Nitơ (Urê, Peptone, Cao nấm men, Kali nitrate và Amoni

sulfate) đến khả năng sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn M extorquens

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp tỉ lệ của nguồn Carbon và Nitơ đến khả năng

sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn M extorquens

2.4 Phương pháp thực hiện đề tài

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau (hình 2.1):

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hoạt hóa giống

Nuôi cấy tăng sinh

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh trưởng

Đánh giá khả năng sinh tổng hợp protein của VK M extorquens

Xác định hàm lượng protein tổng số của M extorquens trên môi trường tối ưu

21

2.4.2 Hoạt hóa chủng vi khuẩn M extorquens

Phương pháp hoạt hóa giống dựa trên đặc điểm hình dạng, màu sắc và đặc điểm

sinh hóa của vi khuẩn M extorquens, tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm ở

nhiệt độ 300C, pH=7 bao gồm các bước sau:

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường MMS, tiến hành lấy dung dịch sinh khối của vi

khuẩn M extorquens cho vào các ống nghiệm đã chứa môi trường MMS

- Bước 2: Cho các ống nghiệm vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong vòng 3 – 4 ngày

- Bước 3: Hút sinh khối đã nuôi cấy trong ống nghiệm, tiến hành cấy vào môi trường MMS lỏng rồi đem đi nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút trong vòng 3 ngày

- Bước 4: Hút sinh khối, cấy trang trên môi trường MMS thạch Sau đó cho vào tủ

ấm ở nhiệt độ 300C trong vòng 3 – 4 ngày

- Bước 5: Lấy khuẩn lạc đơn từ đĩa cấy trang tiến hành cấy ria trên môi trường MMS thạch (bao gồm đĩa và ống nghiệm) Sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong vòng 3 – 4 ngày

Giống sau nuôi cấy được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm

Hình 2.2 VK M extorquens cấy ria trên đĩa thạch sau 3 ngày nuôi cấy

Hình 2.3 VK M.extorquens cấy ria trên ống nghiệm sau 3 ngày nuôi cấy

22

2.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn M extorquens

a Nguồn Carbon

Tiến hành: môi trường được pha chế trước khi cấy chủng vi khuẩn bao gồm:

dung dịch muối khoáng MMS bổ sung dung dịch chứa nguồn carbon (Methanol, Natri acetate, D – glucose và Formaldehyde) có nồng độ lần lượt là 0,1%; 0,5%; 1%; 1,5% Chỉnh pH môi trường về 7,0±0,2 bằng dung dịch KOH 1N hay HCl 1N Tất cả các dung dịch đều được hấp vô trùng trong 20 phút ở 1210C M extorquens được cấy vào

bình 250 ml chứa 50 ml môi trường Kết quả được ghi nhận sau 72 giờ ở nhiệt độ

300C, lắc 150 vòng/phút

b Nguồn Nitơ

Tiến hành: môi trường được pha chế trước khi cấy chủng vi khuẩn bao gồm:

dung dịch muối khoáng MMS bổ sung dung dịch chứa nguồn nitơ (ure, peptone, cao nấm men, kali nitrate và amoni sulfate) có nồng độ lần lượt là 0,1%; 0,5%; 1%; 1,5% Chỉnh pH môi trường về 7,0±0,2 bằng dung dịch KOH 1N hay HCl 1N Tất cả các dung dịch đều được hấp vô trùng trong 20 phút ở 1210C M extorquens được cấy vào

bình 250 ml chứa 50 ml môi trường Kết quả được ghi nhận sau 72 giờ ở nhiệt độ

300C, lắc 150 vòng/phút

c Ảnh hưởng kết hợp tỉ lệ giữa nguồn Carbon và nguồn Nitơ

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protein trong môi trường thu được sau khi nuôi

cấy VK Methythobacterium extorquens có sự bổ sung phối hợp giữa nguồn Carbon tốt

nhất ở thí nghiệm a và nguồn Nitơ tốt nhất ở thí nghiệm b

Tiến hành: môi trường được pha chế trước khi cấy chủng vi khuẩn bao gồm:

dung dịch muối khoáng MMS bổ sung dung dịch chứa nguồn Carbon và nguồn Nitơ với các nồng độ khác nhau Chỉnh pH môi trường về 7,0±0,2 bằng dung dịch KOH 1N

hay HCl 1N Tất cả các dung dịch đều được hấp vô trùng M extorquens được cấy vào

bình 250 ml chứa 50 ml môi trường Kết quả được ghi nhận sau 72 giờ ở nhiệt độ

300C, lắc 150 vòng/phút

2.4.4 Xác định mật độ

Tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của M extorquens bằng cách nuôi cấy ở

150 vòng/phút Sau 4 ngày nuôi lắc, tiến hành đếm số lượng CFU theo công thức:

23

(CFU/ml) Trong đó:

Mi: tổng số CFU trong 1 ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng;

Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa;

Di: độ pha loãng mẫu;

V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

2.4.5 Xác định hàm lượng sinh khối protein

a) Định lượng protein theo phương pháp Kjeldahl

Hàm lượng nitơ tổng trong sinh khối khô tế bào được xác định theo phương pháp Kjeldahl và hàm lượng protein thô được tính bằng cách lấy giá trị nitơ tổng số có trong

100 g tế bào khô nhân với hệ số 6,25

Nguyên lý: Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do Định lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N

Cách tiến hành:

- Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội

Chú ý: Quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành trong tử hút Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp

- Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình Kjeldahl

để tráng rồi cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl và phễu vài lần rồi cho vào bình định mức và cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% và vài giọt phenoltalein vào bình định mức, sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml

Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10ml acid Boric, sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch acid Boric

Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng đạt khoảng 150ml

- Chuẩn độ: Lấy bình hứng ra và đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N

24

Tính kết quả:

Hàm lượng protein thô =

b) Định lượng protein theo phương pháp Lowry

Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden – phosphowolframate (thuốc thử Folin – Ciocalteau) với phức hợp đồng – protein Phức màu xanh tạo thành tiến hành đo ở bước sóng 675 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein Dựa vào đồ thị chuẩn protein (dùng tinh thể albumin) ta tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

Cách tiến hành:

 Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml

 Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 1/10N thành 100ml

 Dung dịch B: cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Citrate Natri 1% tạo thành 100ml

 Thêm 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở 5 phút

 Thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc trong 5 – 10 phút, sau đó thêm nước cất cho đủ 5ml