Nghiên cứu sản xuất cây giống khoai lang hoàng long ipomoea batatas l lam sạch bệnh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những kỹ thuật nuôi cấy hiệu quả nhất hiện nay trong việc tạo ra các giống sạch bệnh vi-rút là nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng hoặc kết hợp với xử lý hoá chất, nhiệt độ..

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

========

LÊ VĂN TÂM

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HOÀNG LONG (IPOMOEA BATATAS L LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LÔNG CHIM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2016

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

========

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HOÀNG LONG (IPOMOEA BATATAS L LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LÔNG CHIM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Quang Dần

Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Đến với Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, chính việc được trực tiếp tiến hành thí nghiệm trong môi trường đầy đủ thiết bị hiện đại, tôi đã học hỏi thêm được nhiều kiến thức

bổ sung cho phần kiến thức lý thuyết của mình Qua đó, bản thân tôi thêm yêu thích thế giới sinh học, có tư duy khoa học tốt hơn và cũng đã trưởng thành nhiều hơn

Để hoàn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi còn nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, gia đình, các tập thể cá nhân và bạn

bè

Nhân dịp này cho phép tôi bày tỏ lời cảm ơn tới:

Th.S Trần Quang Dần, thầy giáo hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ks Trần Thị Quỳnh Nga – Phòng thí nghiệm tổng hợp, Viện KHKT Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc làm quen và phát triển kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của mình

Tập thể các thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – Môi trường đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành chương trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, các anh chị em đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện về thời gian, kinh phí và công sức để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Dù đã có nhiều cố gắng nhưng khoá luận tốt nghiệp của tôi không thể tránh khỏi những hạn chế thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và bạn bè để khoá luận được hoàn chỉnh hơn nữa

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Lê Văn Tâm

DANH MỤC VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4 Diclorophenoxyacetic acid

SPFMV : Sweet potato feathery mottle virus

SPVMV : Sweet potato vein mosaic virus

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây khoai lang Hoàng Long 4

1.1.1. Đặc điểm sinh học 4

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 5

1.1.4. Giá trị của khoai lang Hoàng Long 5

1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 6

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 6

1.2.2 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 9

1.2.3. Điều kiê ̣n nuôi cấy 13

1.2.4 Môi trườ ng nuôi cấy 14

1.3 Giới thiệu về bệnh vi-rút đốm lông chim 18

1.3.1 Giới thiệu về vi-rút đốm lông chim 18

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh và triệu chứng bệnh 18

1.3.2 Hiện trạng nhiễm bệnh vi-rút ở khoai lang 19

1.3.3 Biện pháp phòng trừ 20

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Chọn vật liệu nuôi cấy 26

2.2.2 Khử trùng mẫu cấy 26

2.2.3 Tái sinh và nhân nhanh chồi từ đỉnh sinh trưởng 27

2.2.4 Sàng lọc cây sạch bệnh (trướ c khi chuyển sang giai đoa ̣n nhân nhanh chồi) 27

2.2.5 Tạo cây hoàn chỉnh 28

2.3 Xử lý thống kê 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29

3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng (HgCl2 0,1%) đến mẫu cấy 29

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi 30

3.3 Sàng lọc các dòng khoai lang sạch bệnh 33

3.4. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

30

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2.1 Khoai lang Hoàng Long 25

2.2 Chồi khoai dùng để vào mẫu 25

3.1

Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng trên môi trường MS cơ bản

(A): Đỉnh sinh trưởng mới vào mẫu; Sự tái sinh chồi từ đỉnh

sinh trưởng sau 6 tuần (B) và 10 tuần (C)

30

3.2

Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trên các môi

trường bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau A: không bổ

sung GA3; B: 0,5 ppm; C: 1,0 ppm; D:1,5 ppm; E: 2,0 ppm

32

3.3

Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa các mắt chồi trên môi

trường bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau sau 3 tuần nuôi

cấy CT0: không bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm;

CT3: 1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm

33

3.3

Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi trên môi trường

bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần CT0: không

sạch bệnh; (HL3) dòng bị nhiễm vi-rút; (M) Marker; (ĐC-)

đối chứng âm; (ĐC+) đối chứng dương

34

3.5

Chồi khoai lang in vitro được cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên

môi trường bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần

CT1: không bổ sung IAA; CT2: 0,3 ppm; CT3: 0,5 ppm; CT4:

0,7 ppm; CT5: 1,0 ppm

36

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Giống khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L Lam.) là giống khoai

lang được trồng phổ biến ở Việt Nam và được du nhập từ Trung Quốc vào Viê ̣t Nam năm 1968 Giống do trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP Hồ Chí Minh tuyển cho ̣n, giớ i thiê ̣u và được Bô ̣ Nông nghiê ̣p và Phát triển Nông thôn công nhâ ̣n giống vào năm 1981 [11] Khoai lang Hoàng Long không những là cây lương thực quan trọng cho người, thức ăn cho gia súc mà còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm, như: chế biến rượu, cồn… Tinh bột khoai lang còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm cũng như là nguồn nguyên liệu tốt cho công nghiệp sản xuất enzyme amylase Ngoài ra, khoai lang còn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì

vị [10]

Tuy nhiên, hiện nay sản lượng và chất lượng khoai lang còn thấp và bấp bênh, do nhiều nguyên nhân, như: sử dụng giống thoái hoá, ít quan tâm đến các biện pháp canh tác, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt của thời tiết và sự phá hoại của sâu bệnh hại [9] Giống khoai lang hiện nay ở nhiều vùng canh tác tại các địa phương đang đối mặt với nguy cơ nhiễm bệnh do vi-rút kí sinh, làm ảnh hưởng đến nguồn giống và năng suất cây trồng Hiện nay các bệnh vi-rút chủ yếu trên khoai lang, như: đốm lông chim (SPFMV), khảm tĩnh mạch (SPVMV), tiềm ẩn (SPLV) [13] Theo kết quả điều tra của trường ĐH Nông nghiệp I và Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam (1994), ở nước ta xuất hiện bệnh vi-rút đốm lông chim (SPFMV), một loại vi-rút gây bệnh thuộc nhóm Poty-virút [4] Triệu chứng bệnh thể hiện rõ trên lá,

lá cây bệnh có màu xanh nhạt xen kẽ các vết khảm xanh sẫm, gân lá có màu vàng sáng, phiến lá co hẹp và mép lá có màu xanh vàng Bệnh vi-rút đốm lông chim nhiễm trên các giống khoai Lim, Hoàng Long và Muồng đỏ với tỷ lệ 10-18% [15] Trong những năm vừa qua, diện tích và sản lượng khoai lang ở Việt Nam có xu hướng giảm dần, do phần lớn các giống khoai lang nước ta đang bị nhiễm các bệnh

về vi-rút gây ra làm cho năng suất củ khoai lang chưa được cải thiện nhiều [8] Diện tích trồng khoai lang trong cả nước liên tục giảm, từ 181.200 ha (năm 2006) đến

150.800 ha (năm 2010) và 129.900 ha (năm 2014) [20] Năm 2006, Kokkinos và cs

đã sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để xác định ngưỡng nồng độ các poly-virút SPFMV, SPCV, và CMV phát hiện trong cây khoai lang nhiễm bệnh với cặp mồi CI-F/R [42]

Một trong những kỹ thuật nuôi cấy hiệu quả nhất hiện nay trong việc tạo ra các giống sạch bệnh vi-rút là nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng hoặc kết hợp với

xử lý hoá chất, nhiệt độ Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các bệnh vi-rút, viroid và các tác nhân gây bệnh tương tự vi-rút Chóp đỉnh sinh trưởng được coi là sạch bệnh vi-rút Mẫu mô nuôi cấy càng nhỏ và càng gần đỉnh sinh trưởng thì khả năng sạch bệnh càng lớn, và có sự tương quan tỷ lệ thuận giữa kích thước mẫu với khả năng cây tái sinh sạch bệnh [2] Nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trên các đối tượng cây trồng khác nhau đã thành công và đưa ra được quy trình sản xuất giống sạch bệnh cũng như bảo tồn nguồn gen Việc ứng dụng kỹ thuật này vào trong sản xuất khoai lang sẽ tạo nhiều triển vọng mới trong việc tăng cao năng suất và chất lượng đáp ứng nhu cầu đa dạng của thị trường, phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng và sản xuất nội địa, xuất khẩu ra thế giới trong thời gian tới

Xuất phát từ thực tiễn và các vấn đề nêu trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sản xuất cây giống khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L

Lam.) sa ̣ch bê ̣nh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”

2 Mục tiêu của đề tài

Tạo nguồn giống khoai lang Hoàng Long sa ̣ch bê ̣nh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau:

- Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng thích hợp bằng

dung dịch HgCl2 0,1% đến mẫu nuôi cấy

- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng GA3đến khả năng tái sinh chồi cây khoai lang

- Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi cây khoai lang

- Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA

đến khả năng ra rễ của chồi cây khoai lang

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây khoai lang Hoàng Long

15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ có 5 - 10 rễ được phân hoá thành rễ dày mới có cơ hội hình thành củ, củ bắt đầu phát triển theo chiều dài trước, sau đó mới phát triển theo đường kính và nhanh nhất chỉ khoảng 1 tháng trước khi thu hoạch Củ khoai lang nặng khoảng 60 – 70% trọng lượng toàn cây Thời gian sinh trưởng ngắn 85 - 95 ngày Năng suất củ tươi trung bình 15 - 27 tấn/ha, tỷ lê ̣ chất khô 27-30%, chất lượng củ khá, vỏ củ màu hồng sẫm, thi ̣t củ màu vàng cam, dáng củ đều đe ̣p [12]

Khoai lang Hoàng Long cũng như các giống khoai lang khác, là loài không chịu được sương giá Vì vậy, trong khu vực nhiệt đới khoai lang có thể để ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết, còn ở khu vực ôn đới thì được thu hoạch sớm trước khi sương giá bắt đầu [11]

1.1.2 Phân bố

Khoai lang Hoàng Long phân bố ở một số nước châu Á như Mianma, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Indonexia [11] Tại Việt Nam, loài này chủ yếu được trồng nhiều ở các tỉnh phía bắc và đây là loài đặc sản của tỉnh Ninh Bình, nơi mà giống khoai này được nhập nội từ Trung Quốc vào nước ta năm 1968 và do trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh tuyển chọn và trồng thí điểm [10]

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Khoai lang Hoàng Long có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm

và ra rễ; phân cành và tạo củ; phát triển thân lá; sự phát triển của củ

a Thời kỳ ra rễ và chồi xanh

Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau [10]

b Thời kỳ phân cành và hình thành củ

Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày Các nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bò trải dần trên mặt luống Củ hình thành khoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc điều kiện môi trường Đây là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bó mạch gỗ,

hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ [10]

c Thời kỳ phát triển thân lá

Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 -

85 ngày Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt

và rãnh luống Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể Nhưng những củ đã được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng Một số củ hình thành sớm bắt đầu quá trình tích lũy chất khô [10]

d Thời kỳ phát triển củ

Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 90 - 105 ngày đối với các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam Điều kiện thuận lợi cho quá trình phình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng

ấm, ban đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuối thì năng suất củ khoai lang càng cao Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trong khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần [10]

1.1.4 Giá trị của khoai lang Hoàng Long

Khoai lang không những là cây lương thực quan trọng cho người, thức ăn cho gia súc mà còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm, như: chế biến rượu, cồn… Giống khoai lang Hoàng Long có lớp thịt màu vàng cam sẫm chứa

nhiều vitamin A hơn các giống khác có thịt màu nhạt và việc trồng các giống này được khuyến khích tại châu Phi do thiếu hụt vitamin A là vấn đề nghiêm trọng tại đây [12]

Tinh bột khoai lang còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm, như là nguồn nguyên liệu tốt cho công nghiệp sản xuất enzyme amilase Ngoài ra, khoai lang còn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì vị Mặc dù có vị ngọt nhưng khoai lang trên thực tế là thức ăn tốt cho những người bị tiểu đường do các nghiên cứu sơ bộ trên động vật cho thấy nó hỗ trợ sự ổn định cho nồng độ đường trong máu

và làm giảm sức kháng Insulin [12]

Về thành phần dinh dưỡng, trong 100 g củ khoai lang tươi có 68 g nước, 0,8

g protid; 0,2 g lipid; 28,5 g glucid (24,5 g tinh bột; 4 g glucose) và 1,3 g cellulose,

có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo Ngoài ra trong khoai lang tươi còn nhiều vitamin và muối khoáng (34 mg Canxi; 49,4 mg Photpho; 1 mg Sắt; 0,3 mg β-Caroten; 0,05 mg vitamin B1; 0,05 mg vitamin B2; 0,6 mg vitamin PP; 23 mg vitamin C…) [10]

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

a Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy rằng, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [34]

Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [46]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của

phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn

chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào

riêng rẽ [2]

b Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ

quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất

cả các loa ̣i tế bào đó đều bắt nguồn từ mô ̣t tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai

đoa ̣n đầu, tế bào hợp tử tiếp tu ̣c phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa

mang chứ c năng riêng biê ̣t (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng

tiếp tu ̣c được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đă ̣c hiê ̣u cho các mô, cơ quan có

chứ c năng khác nhau [2]

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô

chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá

của tế bào có thể biểu thị như sau:

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn

giữ nguyên khả năng phân chia Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở

về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là phản phân

hoá tế bào, (ngược lại với quá trình phân hoá tế bào) Tuy nhiên, khi tế bào đã phân

hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả

năng biến đổi của mình Trong điều kiện cần thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại

có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản

phân hoá tế bào, ngược lại với quá trình phân hoá tế bào [2] Quá trình phân hóa và

phản phân hóa tế bào có thể hiển thi ̣ như sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Tế bào giãn

chức năng riêng

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, còn khi tỷ lệ này cân bằng thì sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo [2]

c Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào

Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các công đoạn:

Trong quá trình nguyên phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu Như vậy qua nguyên phân bộ NST trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NST giống bộ NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào con Sở dĩ có hiện tượng này

là do trước mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để

từ mỗi phân tử ADN hình thành 2 phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu Quá trình này được thực hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của NST ở kỳ sau, là cơ sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ thể [24]

Giữa 2 thế hệ cơ thể được hình thành thông qua cơ chế giảm phân đã làm cho

ở thế hệ đời sau có hiện tượng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ Vì vậy việc duy trì các tính trạng mong muốn ở

bố mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ không thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu tính Ngày nay bằng phương pháp sinh sản vô tính, người ta đã khắc phục được nhược điểm này Đặc biệt là nhân

giống vô tính in vitro [24]

Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lấy các bộ phận

sinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin di truyền

giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền giống nhau và giống cơ thể mẹ Như vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di truyền tốt thì các tính trạng đó

sẽ được thể hiện ở mọi cơ thể con [2]

1.2.2 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

a Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực chất là nuôi cấy in vitro với bộ phận

nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng có chứa 1 – 2 lá non Những cây được tạo ra từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có độ đồng đều cao vì chúng được sinh ra từ tế bào ít hoặc chưa bị phân hóa như những tế bào ở nơi khác [2]

Kỹ thuật này dùng các phần rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó Đây cũng là kỹ thuật đầu tiên được dùng để làm sạch vi-rút (virus - free) ở thực vật Việc tạo ra các giống sạch vi-rút là biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là biện pháp phục tráng cho các giống đã bị thoái hóa do vi-rút và các hình thức thâm canh khác Các giả thiết giải thích tế bào sinh trưởng sạch vi-rút, như: Vi-rút vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn nhưng hệ thống này chưa có

ở mô phân sinh do đó vi-rút không thể vào được tế bào mô phân sinh; tại mô phân sinh đỉnh tế bào có tốc độ phân chia cao không đồng nhất với tốc độ nhân bản vật chất di truyền của tế bào vi-rút và khi tế bào mô phân sinh phân chia không sao chép thông tin di truyền của vi-rút; mô phân sinh đỉnh là nơi tổng hợp auxin nên thường có hàm lượng cao, có tác dụng ngăn cản và ức chế sự sao chép vật chất di truyền của vi-rút [2] Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting) [13]

Đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh ngọn) là một đỉnh tròn gồm các tế bào phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1 mm và dài khoảng 0,25 mm Ngoài “nuôi cấy mô phân sinh“ (meristem culture), các thuật ngữ khác như “nuôi cấy đỉnh sinh trưởng“ (meristem-tip culture), “nuôi cấy đỉnh“ (tip culture) hay “nuôi cấy chồi đỉnh“ (shoot tip culture) cũng được sử dụng, trong chừng mực nào đó phụ thuộc vào kích thước khối mô tách ra Thông thường mô phân sinh của thân chính và các chồi

nách được cắt theo các kích thước trên Tuy nhiên, do khả năng tăng trưởng của mô phân sinh rất thấp nên người ta cắt khối mô bao gồm cả đỉnh sinh trưởng và một hoặc hai sơ khởi lá Những đỉnh như vậy dài khoảng 1 mm và có nhiều khả năng để phát triển hơn nhưng lại giảm mức độ sạch vi-rút [18]

b Vật liệu khởi đầu dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệu khởi đầu; nguồn gốc và kích thước của mẫu Để đạt được hiệu quả cao, cần lấy mẫu nuôi cấy từ chồi đang sinh trưởng mạnh hoặc chồi của cây mới ghép [39], [41] Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây non dễ dàng hơn cây trưởng thành, tỷ lệ ra rễ trong trường hợp này đạt 83%, trong khi với cây trưởng thành chỉ đạt 63% (52) Điều kiện nuôi cấy, thời điểm lấy mẫu cũng ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh cây từ đỉnh sinh trưởng Một số loài có ưu thế chồi đỉnh mạnh, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh dễ dàng hơn từ chồi nách, đối với một số loài khác lại thu được kết quả ngược lại [25]

Kích thước mẫu nuôi cấy càng lớn, tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu càng cao, tuy nhiên mẫu càng nhỏ thì khả năng sạch bệnh vi-rút lại cao hơn Do vậy, kích thước mẫu nuôi cấy cần phải xác định bằng thực nghiệm đối với mỗi loài Mẫu nuôi cấy nhỏ nhất chỉ có chóp sinh trưởng và 2 - 3 mầm lá sẽ là lý tưởng để tạo giống sạch bệnh do mô phân sinh đỉnh nằm ở chóp đỉnh chồi, là trung tâm hoạt động sinh trưởng, phân hoá và phát triển của thực vật Ngay dưới mô phân sinh này là các mầm lá Đôi khi kích thước mẫu lớn hơn vẫn đảm bảo sạch bệnh vi-rút, song một số trường hợp khác lại đòi hỏi mẫu nhỏ hơn [41]

Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm Nhưng xét về hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu

Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn)

- Cây phát triển từ chồi nách phát ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh

c Kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng

Mô phân sinh chồi ngọn hoặc chồi bên đuợc bảo vệ triệt để bởi các lá đang phát triển và các vảy bắc đến mức việc khử nhiễm gần như là không cần thiết Để khử trùng nhẹ bề mặt, các chồi và các đoạn thân đã cắt bỏ lá được rửa khoảng vài giây trong cồn 96%, sau đó ngâm trong dung dịch Ca(ClO)2 50 g/l đã được lọc trong 10 – 20 phút và rửa nhẹ vài lần bằng nước vô trùng Ngoài ra, cần có một kính hiển vi với độ phóng đại 20 – 40 lần Sau mỗi lần tách mô phân sinh, kính hiển vi cần được lau sạch [18]

Đặt một hộp 6 – 10 tấm giấy lọc vô trùng ( đã hấp vô trùng) và hai cốc 100

ml ở một bên kính hiển vi Một cốc chứa cồn và cốc còn lại chứa nước vô trùng để nhúng rửa các dụng cụ cắt trước khi lau khô bằng giấy thấm Để tránh nhiễm vi-rút,

vi khuẩn và nấm, cần thường xuyên khử trùng (bằng cồn) phần đầu kim và các lưỡi dao cắt Một tay dùng panh giữ chồi dưới kính hiển vi, một tay cầm kim/dao ấn nhẹ

để cắt bỏ các lá non và sơ khởi lá Sau đó dùng dao để cắt rời phần đỉnh sinh trưởng

lộ ra có hình đỉnh tròn sáng bóng Đỉnh sinh trưởng được chuyển sang môi trường dinh dưỡng trong các ống nghiệm nuôi cấy bằng cách chạm lưỡi dao lên bề mặt thạch và nhấn lên nhẹ nhàng Trong môi trường lỏng, mô phân sinh được đặt trên miếng giấy thấm để một phần được ngập trong dung dịch [37]

Nhiều loại ống nghiệm nuôi cấy với các kích thước khác nhau đã được sử dụng và các nhà nghiên cứu đề nghị dùng loại ống nhỏ có đưởng kính khoảng 10

mm bằng thuỷ tinh boronsilicate (Pyrex) Ống nghiệm nuôi cấy được đậy bằng nắp làm bằng nhựa hoặc nhôm Các nút bông có thể được hơ khử trùng trên ngọn đèn cồn, sau đó được ấn xuống dưới thành miệng ống và dán bên ngoài miệng một lớp

parafin Đối với việc khử trùng nút bông cẩn thận không gây cháy nút, khói có thể

đi vào trong gây độc cho mô phân sinh [18]

d Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sau khi xử lý nhiệt

Mặc dù được nuôi cấy trong môi trường được xem là thuận lợi cho sự phát triển của mô phân sinh, nhưng không nhiều trong số đó phát triển và sạch vi-rút Vì vậy, một số nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý nhiệt các cây vật liệu trước khi tách đỉnh sinh trưởng lớn hơn và nuôi cấy chúng [18]

Những đỉnh sinh trưởng này được cắt với chiều dài khoảng 1 mm và mang hai hay ba sơ khởi lá Người ta cho rằng sự nhân lên của vi-rút bị ức chế trong quá trình xử lý nhiệt Do nhiệt độ có thể ngăn cản quá trình biến dưỡng và làm giảm sự sinh trưởng của mô phân sinh, vì vậy cần tiến hành các thử nghiệm để xác định mô phân sinh có thể được giữ ở nhiệt độ cao trong bao lâu mà vẫn phát triển với số lượng chấp nhận được, nhờ đó ta có thể thu được một tỉ lệ cao nhất các cây còn sống và sạch vi-rút [15] Khi nghiên cứu giống hoa Cúc Blanche, Portevine Supréme, Hakkaart và Quak (1964) nhận thấy những nguyên liệu được xử lý nhiệt trong 10, 20, hay 30 ngày tạo tỉ lệ cây sạch vi-rút tăng dần từ 9 đến khoảng 90% Tuy nhiên, việc xử lý nhiệt trong 40, 50, hay 60 ngày không làm thay đổi tỉ lệ này, nhưng lại làm giảm đáng kể số lượng mô phân sinh phát triển thành cây Tác động

rõ ràng này lên mô phân sinh thay đổi tuỳ theo các giống được nghiên cứu: trong điều kiện tương đồng, giống Migoli tạo ra rất ít cây sau 20 và 30 ngày xử lý nhiệt, nhưng dù sao những cây này cũng sạch vi-rút với tỉ lệ 100% (sau 20 ngày) và 70% (sau 30 ngày) trong khi chỉ có 9% cây sạch bệnh được tạo ra ở những nguyên liệu không được xử lý nhiệt [53]

Một số loài vi-rút cây khoai tây rất khó bị loại bỏ bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng xử lý nhiệt có thể giúp giải quyết vấn đề này MacDonald (1973) đã làm sạch vi-rút X và S khỏi các giống khoai tây “Duke of York“ và

“Royal Kidney“ bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách ra từ chồi trên các củ đã được xử lý nhiệt Các đỉnh sinh trưởng của dâu tây được giữ ở nhiệt độ 35oC trong một tuần hoặc hơn sẽ sinh trưởng nhanh và đạt đến giai đoạn trưởng thành với tỉ lệ cao hơn so với những đỉnh sinh trưởng tách từ những cây không được xử lý Những

cây này cũng đồng thời loại bỏ bệnh nhăn và vàng lá (pallidosis) [15] Việc xử lý nhiệt trước khi nuôi cấy chồi đỉnh đã giúp loại bỏ thành công một số chứng bệnh vi-

rút ở cây Khoai lang (Ipomoea batatas) [49]

Chúng ta có thể kết luận rằng trong những trường hợp mà vi-rút không thể bị loại trừ bằng cách nuôi cấy nuôi cấy đỉnh sinh trưởng như vậy thì có thể cân nhắc

áp dụng các biện pháp xử lý nhiệt trước khi tiến hành tách đỉnh sinh trưởng Quy trình kết hợp này có ích với những cây trồng mà chỉ một tỉ lệ thấp những mẫu cấy nhỏ phát triển một cách chậm chạp thành cây sạch vi-rút như cây hoa Cẩm chướng Đối với những cây này, việc tiền xử lý nhiệt tạo điều kiện cho các mẫu cấy đỉnh sinh trưởng có kích thước lớn (1 – 2 mm) sinh trưởng và phát triển tạo cây con sạch vi-rút dễ dàng hơn so vỡi những mẫu có kích thước nhỏ (0,1 – 0,3 mm) [15]

1.2.3 Điều kiê ̣n nuôi cấy

a Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo điều

kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô

trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [21]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, đèn tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn Riêng với kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng còn sử dụng thêm buồng sinh trưởng để xử lý nhiệt vật liệu nuôi cấy

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 70o, Ca(ClO)2… để khử trùng [21]

Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy [21]

b Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy [21]:

- Ánh sáng:

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986): cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo; ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux (Morein, 1974), ngoài ra

chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu

mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo

Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250C (White, 1973) [21]

1.2.4 Môi trươ ̀ ng nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là điều kiện vô cùng quan trọng, có tính chất quyết định

sự phân hoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh là những nhân tố quyết định

sự thành công hoặc thất bại của quá trình nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy là

nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự phân chia và phân hoá của mô tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy Vì vậy, những môi trường này phải đầy đủ chất dinh dưỡng, các chất cần thiết

Đối với hầu hết các loài thực vật, môi trường nuôi cấy bao gồm các nguyên

tố đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng

và một số chất phụ gia Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng các chất cần thiết cho tế bào sinh trưởng tốt nhất thay đổi tuỳ theo từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy hay từng cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể

Từ những năm 1933, Turkey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS,

+ Các vitamin và amino acid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất kích thích sinh trưởng

a Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ: Mg2+ là một phần của phân tử diệp lục, Ca2+ cấu tạo nên màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzyme cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme

Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thể hoá của thực vật Các yếu tố như: K+, Ca2+ rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào

b Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang

hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của

tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo cacbon hydrat so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [4]

c Các vitamin

Trong quá trình nuôi cấy, cây in vitro có thể tự tổng hợp được một số vitamin

cần thiết nhưng chưa đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng Việc sử dụng các vitamin

khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro [19]

Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc nhóm B như:

- B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong nồi hấp vô trùng (Autoclave), nhưng các chất bị phân hủy này cũng có tác động lên sinh trưởng của mô như chưa phân hủy

- B6 hoặc Pyridoxine

- Biotin

- Pantotheate Canxi

- Myo – inositol

d Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

- Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để

làm rắn hoá môi trường Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6 – 1% đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O2 như nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [2]

- pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6 – 6,0 [19] Nếu pH của môi trường

thấp hơn hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến trạng thái của môi trường nuôi cấy và

sự hoà tan các chất dinh dưỡng

e Vai trò các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất kích thích sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của

tế bào nên chúng được khảo sát hoặc đào thải khá nhanh Ngược lại, các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng thực

tế [18]

- Auxin

Auxin là hợp chất có nhân indole, gồm có 2 loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra ( IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …)

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động hỗ trợ của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bài kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính axít chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là sự tổng hợp ARN ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực được nhìn thấy

rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng

bị oxy hóa do các hoạt động của các enzyme auxin-oxidase, điều này cho thấy nồng

độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng [2]

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh

trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây

Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác

Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để

thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt [2]

1.3 Giới thiệu về bệnh vi-rút đốm lông chim

1.3.1 Giới thiệu về vi-rút đốm lông chim

Vi-rút đốm lông chim (SPFMV: Sweet potato feathery mottle virus) chi

Potyvirus, họ Potyviridae Đây là một trong tổng số khoảng 20 vi-rút gây nhiễm

trên khoai lang trên thế giới gây ra Vi-rút gây bệnh có dạng hình sợi mềm, kích thước 13 x 850 nm Axít nucleic của vi-rút là ARN dạng sợi đơn, trọng lượng phân

tử là 3,7 x 106 có thể hình thành các thể vùi có cánh quạt trong mô cây bệnh [4]