Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao chiết từ rễ cây nhó đông morinda longissima y z ruan trên chuột nhắt trắng mus musculus var swiss

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ======== LÊ NGUYỄN BẢO NGỌC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY NHÓ ĐÔNG Morinda longissima Y.Z.Ruan TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Mus musculus Var..

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

========

LÊ NGUYỄN BẢO NGỌC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT

TỪ RỄ CÂY NHÓ ĐÔNG (Morinda longissima Y.Z.Ruan) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Var Swiss)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2016

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

========

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT

TỪ RỄ CÂY NHÓ ĐÔNG (Morinda longissima Y.Z.Ruan) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Var Swiss)

của ThS NCS Nguyễn Công Thùy Trâm

Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đà Nẵng, ngày 27 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

LÊ NGUYỄN BẢO NGỌC

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến ThS NCS Nguyễn Công Thùy Trâm – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong khoa Sinh - Môi trường

đã tận tình giảng dạy và tạo nhiều điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua

Đà Nẵng, ngày 27 tháng 04 năm 2015

Sinh viên

LÊ NGUYỄN BẢO NGỌC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Gan và các bệnh lý về gan 3

1.1.1 Cấu tạo và chức năng gan 3

1.1.2 Các bệnh lý về gan 5

1.2 Các hoạt chất sinh học có tác dụng bảo vệ gan 8

1.3 Các phép thử hoạt tính sinh học trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các hợp chất 9

1.4 Cây nhó đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan) 11

1.4.1 Đặc điểm thực vật học 11

1.4.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu thực vật 14

2.1.2 Nguyên liệu động vật 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp xác định mẫu 15

2.3.2 Phương pháp chiết dịch nghiên cứu 15

2.3.3 Phương pháp thử độc tính cấp 15

2.3.4 Phương pháp gây độc gan trên chuột 16

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính bảo vệ gan 16

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Kết quả khảo sát nồng độ CCl 4 thích hợp để gây độc gan chuột 19

3.2 Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ML trên chuột thử nghiệm 20 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết từ rễ cây Nhó đông đến các thông số enzyme AST, ALT trong huyết thanh của chuột gây nhiễm độc bằng CCl 4 22

3.4 Kết quả quan sát trực quan gan chuột ở các nhóm thực nghiệm 25

3.5 Kết quả xác định hàm lượng MDA trong đồng thể gan chuột gây độc bằng CCl 4 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

1 Kết luận 31

2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ALT Alanin aminotransferase

Số hiệu bảng Tên bảng Trang

3.1 Kết quả gây độc của CCl4 trên nhóm chuột thử

3.2 Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ML

3.5 Kết quả xác định hàm lượng MDA trong đồng thể

Số hiệu hình Tên hình Trang

Biểu đồ 3.1 Nồng độ enzyme AST, ALT trong huyết thanh của

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Gan là cơ quan tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể người

và động vật Gan đảm nhận nhiều chức năng khác nhau nhưng chức năng chính là giải độc các chất nội sinh và ngoại sinh tạo ra Trong các trường hợp bệnh lý hay

sự quá tải các chất độc trong gan, các tế bào gan sẽ bị hủy hoại làm suy giảm chức năng gan gây nên các tổn thương không hồi phục như viêm gan, xơ gan, ung thư gan [44]

Bệnh gan là một trong những bệnh thường gặp trong cộng đồng Ở Việt Nam

số người bị bệnh gan chiếm tỉ lệ cao Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới - WHO, tỉ lệ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) chiếm từ 10 - 20% dân

số, tức 10 – 16 triệu người, một điều đáng lo ngại hơn khi tổng số trường hợp bị

xơ gan ở Việt Nam có tới 80% ca có nguyên nhân từ viêm gan B [37], [44] Mỗi năm có trên 10.000 người chết do biến chứng xơ gan và ung thư gan [14], [37] Hiện nay, các nước trên thế giới đang đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào chế và sản xuất các loại thuốc bảo vệ gan có nguồn gốc thảo dược thay thế cho các thuốc tổng hợp nhằm giảm các tác dụng phụ không mong muốn do các thuốc này gây ra

và giảm giá thành trong quá trình điều trị bệnh[3], [35] Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, nước ta có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển nguồn tài nguyên thực vật, đặc biệt là các loại thảo dược quý hiếm, trong đó có Nhó đông Cây Nhó

đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan) là một cây thuốc được người dân ở Sơn La

sử dụng điều trị rối loạn tiêu hóa, giải độc, kháng viêm và các bệnh về gan cho hiệu quả tốt [36] Kết quả của các công trình nghiên cứu được công bố gần đây xác định được một số thành phần hóa học trong cây Nhó đông, tuy nhiên vẫn chưa

có nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài cây này

Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành chọn đề tài: “ Nghiên cứu tác

dụng bảo vệ gan của cao chiết từ rễ cây Nhó đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan) trên chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Swiss)

2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu chức năng bảo vệ gan của cao chiết từ rễ cây Nhó đông trên chuột nhắt trắng

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các số liệu về hoạt tính bảo vệ gan từ cao chiết rễ cây Nhó đông, đây là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung nguồn nguyên liệu dược liệu sử dụng trong hỗ trợ và điều trị gan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gan và các bệnh lý về gan

1.1.1 Cấu tạo và chức năng gan

Gan là một cơ quan nội tạng lớn nhất trong cơ thể và đồng thời là tuyến tiêu hóa lớn nhất trong cơ thể Gan chiếm khoảng 3% khối lượng cơ thể, gan người trưởng thành thường nặng 1,4 - 1,6 kilogam, mềm, có màu đỏ sẫm [6]

Gan nằm ngay dưới cơ hoành, bên phải của ổ bụng Gan nằm về phía bên phải của dạ dày (bao tử) và tạo nên giường túi mật Gan được cung cấp máu bởi hai mạch chính ở thùy phải: động mạch gan và tĩnh mạch cửa (tĩnh mạch gánh) Động mạch gan thường bắt nguồn từ động mạch thân tạng Tĩnh mạch cửa dẫn lưu máu

từ lách,tụy và ruột non nhờ đó mà gan có thể tiếp cận được nguồn dinh dưỡng cũng như các sản phẩm phụ của quá trình tiêu hóa thức ăn Các tĩnh mạch gan dẫn lưu máu từ gan và đổ trực tiếp vào tĩnh mạch chủ dưới [44]

Gan được chia làm 4 thùy chính và khoảng 50.000 – 100.000 đơn vị chức năng được gọi là tiểu thùy Các tiểu thùy hình trụ có đường kính tối đa là 2 milimet (mm) và chiều dài vài mm Mỗi tiểu thùy gan có cấu trúc hình đa giác, ở giữa hình

đa giác là tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Từ đây, các tế bào gan xếp thành bè gồm

2 hàng liền nhau tỏa ra phía ngoại vi như hình nan hoa và gọi là bè Remak Giữa

2 hàng tế bào gan của bè Remak có các đường ống nhỏ gọi là ống mật vi ti Giữa các bè có xoang mạch nhận máu từ cả động mạch gan và tĩnh mạch cửa rồi đổ về tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Vách của xoang mạch được lót bởi một lớp tế bào nội mô không liên tục, có nhiều lỗ thủng, xen vào lớp tế bào nội mô này là các đại thực bào hình sao được gọi là tế bào Kupffer [32], [77]

Giữa các tế bào gan và lớp tế bào nội mô xoang mạch có một khoảng gọi là khoảng Disse, đây là nơi xuất phát hệ bạch huyết trong gan và cũng qua đây tế bào

gan trao đổi chất với xoang mạch Tổng diện tích tiếp xúc giữa tế bào gan và huyết tương trong xoang mạch rất lớn Ở các góc của tiểu thùy, nơi 3 tiểu thùy tiếp xúc nhau, có khoảng cửa hay là khoảng Kiernan gồm các thành phần: 1 nhánh của tĩnh mạch cửa, 1 nhánh của động mạch gan, những sợi thần kinh, đường bạch huyết và một ống mật nhận mật từ các ống mật vi ti của bè Remak

Hệ thống mạch máu và ống mật nằm ở phía trong gan Mỗi tiểu thùy được cung cấp máu từ các nhánh nhở của động mạch gan và tĩnh mạch cửa thông qua các kênh nhỏ được gọi là võng huyết quản Các võng huyết quản cùng đổ về trung tâm của tiểu thùy để hình thành tĩnh mạch “dẫn lưu” Vòng huyết quản có vai trò như hệ thống vi tuần hoàn của gan Võng huyết quản có cá khe hở được hình thành từng cụm giữa huyết quản Cụm tế bào mỏng, độ dày khoảng 1 – 2 lớp tế bào quanh tĩnh mạch trung tâm của tiểu thùy gan [76]

Gan được cấu trúc chủ yếu từ tế bào gan Tế bào gan khoảng 70 – 80% số lượng tế bào có trong gan và thực hiện hầu hết các chức năng của gan như chuyển hóa glucid, lipid, protein và dự trữ các chất dinh dưỡng, giải độc trong máu trước khi chất độc tham gia vào vòng tuần hoàn khắp cơ thể và sản xuất mật Mật tập trung tại tiểu quản và dẫn lưu qua ống mật vào túi mật [18] Bên cạnh tế bào gan còn có môt số loại tế bào khác với các chức năng khác nhau

Tế bào Kupffer - tế bào miễn dịch nằm trong huyết quản chiếm khoảng 80 – 90% loại tế bào thực bào mô Tế bào Kupffer khi tiếp xúc với vi khuẩn, các vi sinh vật các mảnh vụ nội độc tố vi khuẩn sẽ tiêu diệt chúng thông qua quá trình thực bào, do đó tế bào này đóng vai trò phòng bệnh [77]

Tế bào hình sao HSC đóng vai trò dự trữ mỡ và cũng là nơi dự trữ vitamin A đầu tiên của cơ thể Lượng vitamin A được dự trữ ở đây đủ cho cơ thể duy trì trong

10 tháng mà không cần bổ sung chất này từ bên ngoài Tế bào hình sao đóng vai

trò duy trì chất nền ngoại bào trong gan bằng việc điều chỉnh cân bằng giữa tổng hợp và phá hủy

Tế bào nội mô của võng huyết quản bên cạnh chức năng tạo thành chất lót vách của võng huyết quản còn có vai trò làm sạch những phân tử protein seho từ máu và tọa ra những hợp chất kích thích sự tăng sinh tế bào [6]

1.1.2 Các bệnh lý về gan

Gan là một trong những cơ quan có vai trò quan trọng nhất trong quá trình chuyển hóa vật chất của cơ thể Gan tham gia vào quá trình giải độc gây ra bởi các yếu tố nội sinh và ngoại sinh Khi có sự dư thừa quá mức các chất gây độc trong gan hay trong trường hợp bệnh lý, các tế bào gan sẽ bị tổn thương không phục hồi như mất chức năng giải độc, viêm gan, xơ gan, ung thư gan [30]… Trong số đó, viêm gan là một trong những bệnh lý có tần suất xuất hiện cao nhất trong những bệnh về gan [32], [44]

a Viêm gan do virus

Viêm gan do virus là một bệnh truyền nhiễm do một trong nhiều loại virus hướng gan gây ra Hiện nay đã phát hiện được 7 loại virus gây bệnh: A, B, C, D,

E, G, TTV; trong đó 5 loại gây bệnh chính là A, B, C, D, E , [7], [15]

Kéo dài hoặc mạn tính

Kéo dài hoặc mạn tính

Ngắn

Cơ chế gây bệnh viêm gan do virus liên quan đến quá trình đáp ứng miễn dịch, trong đó đáp ứng chủ yếu qua trung gian tế bào và sự tăng sinh gốc tự do tạo ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến tổn thương gan và hủy hoại tế bào gan [15], [45]

b Viêm gan do thuốc [23], [83]

Paracetamol (PAR) có cường độ và thời gian tác dụng tương tự như Aspirin

về giảm đau và hạ sốt Thông thường, PAR chỉ định cho những người không dùng được Aspirin do loét tiêu hóa, rối loạn đông máu

Khi dùng PAR ở liều cao (trên 10g), sau thời gian tiềm tàng 24 giờ, xuất hiện hoại tử tế bào gan có thể tiến triển đến chết sau 5 – 6 ngày

Nguyên nhân là PAR bị oxy hóa ở gan cho N-acetyl parabenzoquinoneimin (NAPQI) Với liều lượng dùng PAR cao, NAPQI quá thừa sẽ gắn vào protein của

tế bào gan và gây hoại tử tế bào [67]

Bảng 1.2 Những thuốc gây ngộ độc gan

Cocaine Tâm thần Viêm gan cấp

c Viêm gan do chất độc

 Viêm gan do Aflatoxin

Aflatoxin được tìm thấy trong nấm Aspergillu flavus, A.parasiticus,

A.fumigatus Aflatoxin là một độc tố bền vững với nhiệt vì vậy biện pháp đun sôi

thông thường không có tác dụng đối với độc tố này [65]

Trong các aflatoxin B, B2, G1, G2, độc tính mạnh nhất là B1 [69], tiếp theo là G1, B2 và cuối cùng là G2 Aflatoxin có thể làm tổn thương gen p53, gen có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển tế bào quá mức Aflatoxin không những gây ảnh hưởng đến gan mà còn gây ảnh hưởng đến phổi, thận, mạc treo, túi mật…

Cho chuột ăn 10mg/kg thức ăn trong vòng 2 tuần đến 3 tuần sẽ gây ung thư gan chuột Đối với người, ăn khoảng 0.05mg đến 0.1mg aflatoxin trong 10 tháng

sẽ gây loét mô gan

 Viêm gan do rượu

Viêm gan do rượu là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến xơ gan Rượu có tác động trực tiếp lẫn gián tiếp lên gan Đầu tiên là tác động gián tiếp do chất độc acetaldehyde là chủ yếu Acetaldehyde gây ra nguy hiểm cho màng tế bào do liên kết với nhóm sulhydryl và amino tạo thành acetaldehyde – protein cản trở chức năng của tế bào Tác động trực tiếp của rượu ảnh hưởng đến sự phân bào và sự tổng hợp protein [6]

 Viêm gan do CCl4

CCl4 là chất sát trùng liều tối đa 2.5g/lần/ngày Bản thân CCl4 không có độc tính mà sản phẩm chuyển hóa của nó mới có độc tính Khi hít hay uống phải, CCl4

sẽ theo máu đến gan và chuyển hóa thành CCl3(tricloromethyl), Cl thông qua

hệ thống enzyme cytochrome P450 Các gốc tự do này sẽ tác động lấy proton của các acid béo trên màng tế bào Điều này làm quá trình peoxit hóa lipid tăng lên mạnh mẽ, gây tổn thương màng và viêm hoại tử gan [71]

Tác dụng gây hoại tử gan của CCl4 được giải thích qua những dãy phản ứng sau:

CCl4 CCl3+ ClCCl3 CCl2+ ClCCl2 CCl+ Cl

1.2 Các hoạt chất sinh học có tác dụng bảo vệ gan

Hiện nay nhu cầu sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày càng tăng, nhất là ở các quốc gia đang phát triển, trong đó có Việt Nam [12] Những loại thuốc này có ưu điểm là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong

cơ thể Ở nước ta, dược liệu chữa bệnh gan được tìm thấy rất nhiều Các nhà khoa học đã phân lập và thử nghiệm một số hợp chất có khả năng chống oxy hóa, bảo

vệ gan như Flavonoid, Silymarin, Curcuminoid, Phenol

Flavonoid là một chất chống oxy hóa, có khả năng dập tắt các gốc tự do như

HO, ROO, làm giảm quá trình peroxy hóa màng tế bào Hoạt tính của flavonoid nhờ cấu trúc hóa học của nó gồm vòng thơm, hệ nối đôi liên hợp carbonyl, nhóm

OH phenol [25], [58]

Silymarin được chiết xuất từ dược liệu được sử dụng điều trị các rối loạn về gan Silymarin tham gia bảo vệ tế bào gan thông qua các cơ chế: khả năng chống oxy hóa của các gốc tự do (chủ yếu hoạt động hướng về HO và HOCl) và điều chỉnh chức năng miễn dịch bằng cách thúc đẩy hoạt động sản sinh cytokine, giảm hoạt tính enzym CY3A4 – là isozym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa nhiều loại thuốc khác nhau của hệ thống enzyme chytochrom P450 của tế bào gan [30], [85]

Curcuminoid là một chất chống oxy hóa, bảo vệ và phục hồi tổn thương gan cấp thông qua hai cơ chế Hợp chất này ức chế isoenzym của CYP (CYP2E1), ngăn chặn quá trình chuyển hoá PAR thành chất độc NAPQI và CCl4 thành CCl3 đồng thời ức chế quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan Hoạt tính chống oxy hóa là do cấu trúc có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa mạch [55], [60]

1.3 Các phép thử hoạt tính sinh học trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các hợp chất

Để xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất sau khi tách chiết, người ta sử dụng các phép thử hoạt tính sinh học sau:

Phép thử in vitro nhằm thực hiện một quá trình hoặc một phản ứng ttrong ống

nghiệm, trong đĩa nuôi cấy bên ngoài cơ thể sống và được thực hiện trong môi trường giả dịch thể người

Phép thử ex vivo được thực hiện trong hoặc trên mô sống còn nguyên chức

năng tách ra từ một cá thể sinh vật, tiến hành trong môi trường ngoại cảnh với sự thay đổi tối thiểu so với môi trường tự nhiên bên trong cơ thể

Phép thử in vivo là những nghiên cứu tiến hành trên các động vật thí nghiệm

ở trạng thái sinh lý bình thường của nó Thử nghiệm in vivo thường được dùng hơn so với in vitro do quan sát được tác động tổng thể của một thí nghiệm trên cơ

thể sống Động vật thí nghiệm thường được sử dụng trong phép thử này là chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng là loài gặm nhấm nhỏ, thuộc họ Chuột (Muridae), bộ Gặm nhấm (Rodentia), lớp Thú (Mammalia) Chuột là động vật có vú, tương đối

dễ dàng để duy trì và xử lý, sinh sản nhanh chóng và có sư tương đồng cao với con người Trình tự gen chuột đã được xác định và nhiều đoạn gen chuột có đồng đẳng với gen của con người Kết quả giải mã bộ gen người và chuột cho thấy cả hai đều có khoảng 30.000 gen và khoảng 80% các gen trong người cũng là gen tìm thấy trong chuột Ngoài ra, chuột có giá thành tương đối thấp và dễ dàng duy trì nên chuột có nhiều ưu thế để sử dụng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu Chuột nhắt có thể sinh sản nhanh chóng nên có thể quan sát nhiều thế hệ chuột trong một thời gian tương đối ngắn [48]

Trong phép thử này có thể gây viêm gan bằng nhiều các như dùng hóa chất CCl4, PAR, Chloroform…[14] trong đó mô hình CCl4 được sử dụng nhiều do ít tốn thời gian và viêm gan do virus có cơ chế rất gần với viêm gan do nhiễm độc hoá chất này [44] Khi CCl4 đến gan thì CYP450 sẽ chuyển hóa thành CCl3(tricloromethyl), Cl tác động đến các acid béo trên màng tế bào tạo ra quá trình peroxy hóa gây tổn thương tế bào gan Khi những tế bào gan bị phá hủy thì enzyme AST (GOT) và ALT (GPT) sẽ được giải phóng vào máu, cho nên trong máu luôn tồn tại một lượng enzyme gan nhất định Định lượng các enzyme này để đánh giá tình trạng hoại tử tế bào gan [40]

1.4 Cây Nhó đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan)

Theo hệ thống phân loại thực vật:

1.4.1 Đặc điểm thực vật học

Nhó đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan) thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), là

một cây bụi, cao 2 - 4m, thân gỗ và rễ có màu vàng Thân hình trụ, mọc thẳng, cành non có 4 cạnh, màu lục nhạt Lá mọc đối hình bầu dục thuôn hoặc hình mác, dài 12- 18cm, rộng 6 - 10cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt lúc non gần như nhẵn, khi già mặt dưới có ít nhómng ngắn mềm, gần giữa nổi rõ, cuống lá dài 2 - 3cm,

lá kèm gần hình tim nguyên hoặc chia thùy Cụm hoa mọc ở đầu cành hay kẽ lá thành đầu có cuống dài 2 - 2,5cm, hoa nhỏ, màu trắng sít nhau, ở gốc mỗi hóa có

1 - 2 hàng phiến bao hình dùi; đài lúc đầu rời nhau sau hàn liền; tràng có 4 - 5 cánh hợp thành ống dài 2,5 - 3cm; nhị 4 - 5 đính ở khoảng 2/5 phần trên của ống tràng, chỉ nhị ngắn; bầu 4 ô Quả nạc gồm nhiều quả mọng nhỏ [36], [70]

Mùa hoa thường vào tháng 4 - 6, mùa quả tháng 7 - 12 Cây mọc hoang rải rác

ở ven rừng thứ sinh hoặc ở trên nương rẫy cũ với độ cao dưới 800m, thường gặp

ở Sơn La, Lào Cai

1.4.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Năm 2002, Nguyễn Mạnh Hùng và cs đã nghiên cứu thành phần hóa học của

rễ cây Nhó đông và phân lập được 7 hợp chất: 3-phenylethanoid glucosides như

acteoside (1), isoacteoside (2),và cistanoside-E (3), 3 mono-anthraquinones như morindone-5-methyl ether (4), morindone-6-methyl ether (5), 1-hydroxy-2-

methyl-6-methoxyanthraquinone (6), và flavonoid quercetin (7) [11]

Năm 2005, nghiên cứu về thực vật, hóa học cây nhó đông của Phạm Minh

Hưng đã xác định được tên khoa học của cây Nhó đông ở Việt Nam là Morinda

longissima Y.Z.Ruan, chỉ rõ vùng phân bố và các đặc điểm sinh thái của cây

Nghiên cứu kết luận được rễ, thân và lá cây nhó đông đều có chứa anthranoid, coumarin, carotenoid, phytosterol, đường khử tự do và acid hữu cơ, trong đó anthranoid và coumarin được xem là thành phần hóa học chính và có hàm lượng cao trong cây Khi nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ cây, tác giả đã phân lập được 4 chất: CP1, CP2, CP3, CP4 Các kết quả phân tích phổ UV, IR, MS, NMR, phần mềm mô phỏng phổ khối và phần mềm dự đoán cấu trúc cho thấy các chất CP1, CP2, CP3, CP4 lần lượt là 2 – beta – sitosterol, scopoletin [22], emodin

và 1,3-dihydroxy-4-ethoxy methyl anthraquinon

Các nghiên cứu đã chỉ ra đặc điểm sinh thái và thành phần hóa học của cây Nhó đông Tuy nhiên chưa có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài này

Nhó đông có nhiều công dụng khác nhau Trong một số bài thuốc dân gian, bộ phận dùng làm thuốc của cây nhó đông là rễ, thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa thu, đào về, rửa sạch, phơi hoặc sấy khô Dược liệu có vị đắng, màu vàng, tính bình, không độc, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, kiện tỳ, hoạt huyết, tiêu viêm, tán ứ, chữa viêm gan, vàng da, xơ gan, được dùng dưới các dạng thuốc sau: Nước sắc: dược liệu Nhó đông 20 - 30g, thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm 2 lần trong ngày

Cao mềm: lấy 1kg rễ nhó đông, thái mỏng đổ nước xâm xấp, nấu kiệt làm 2 lần Lần thứ nhất nấu trong 6 - 8 giờ, rút nước Lần thứ hai trong 3 - 4 giờ Trộn hai nước lại cô nhỏ lửa thành cao mềm Ngày uống 3 lần, mỗi lần 3 - 4g

Ngoài ra, còn dùng dạng cốm được bào chế từ cao nhó đông trộn với đường Thuốc giúp người bệnh ăn ngủ tốt, hết vàng da, vàng mắt, đầy bụng Đồng bào

ở xã Chiềng An, thị xã Sơn La còn dùng rễ hoặc thân già (phần sát gốc rễ của cây nhó đông phối hợp với rễ cây hé mọ (Psychotria) để chữa viêm đại tràng cho kết quả tốt

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu thực vật

Rễ cây Nhó đông (Morinda longissima Y.Z.Ruan) được thu hái tại Sơn La

2.1.2 Nguyên liệu động vật

Chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Swiss) có khối lượng từ 20-25 gram được

cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương và được nuôi trong cùng một điều kiện Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do

2.1.3 Hóa chất

Ethanol 96% (EtOH), TCA (tricloacetic acid), TBA (thiobarbituric acid),

Tris- HCl, CCl4 (carbon tetrachloride) do hãng Sigma cung cấp, Silymarin và các hóa chất thông thường khác

2.1.4 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được tiến hành trên rễ cây nhó đông thu hái tại Sơn La, Lai Châu Hoạt tính bảo vệ gan của rễ cây nhó đông được đánh giá thông qua các phép

thử hoạt tính in vivo tại phòng thí nghiệm Di truyền – Giải phẫu – Sinh lý động

vật thuộc khoa Sinh- Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

2.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát nồng độ gây độc gan cấp của CCl4 trên chuột nhắt trắng

Đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết ethanol từ rễ cây nhó đông trên

mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng CCl4 thông qua các chỉ số như: nồng độ enzyme AST, ALT trong máu, hàm lượng MDA trong tế bào gan và phân tích hình ảnh đại thể gan

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định mẫu thực vật

Mẫu được xác định bằng phương pháp so sánh hình thái giải phẫu

Mẫu tiêu bản khô được lưu giữ tại phòng Hoạt chất Sinh học - viện Hóa Học các hợp chất thiên nhiên - viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam

2.3.2 Phương pháp chiết dịch nghiên cứu

Rễ cây Nhó đông được rửa sạch, loại bỏ tạp, xay nhỏ và sử dụng làm nguyên liệu tách chiết

0,5kg rễ cây được ngâm trong 4,5L dung môi ethanolở nhiệt độ phòng Loại

bỏ dung môi bằng cô quay chân không thu 20g cao chiết ML

2.3.3 Phương pháp thử độc tính cấp

Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành [8] Cụ thể là cao chiết được pha ở nồng độ gốc 20 gram/ml (có thể đạt được do mẫu cao chiết) nhằm khảo sát độc tính cấp 30 chuột chia thành 5 nhóm (6 con chuột/nhóm) gồm 1 nhóm đối chứng sinh lí, 4 nhóm thí nghiệm và bị bỏ đói hoàn toàn 16h trước khi cho uống mẫu Mẫu chiết được cho uống với liều cao nhất có thể và giảm dần, cụ thể là 10; 5; 2,5 và 1,25 gram/kg thể trọng Sau khi cho uống cao chiết với một liều duy nhất từ 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng nhóm và tính giá trị LD50

Xác định LD50 được tiến hành theo phương pháp của Karber như sau:

LD 50 = LD - Σab/n

Trong đó: LD 50 là liều chết 50% động vật thí nghiệm;

LD là liều gây chết 100% động vật thí nghiệm;

n là số động vật trong một nhóm;

a là sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp;

b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp

Đồng thời, chuột chết sẽ được mổ để xét nghiệm đại thể

2.3.4 Phương pháp gây độc gan trên chuột

18 con chuột được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 6 con Tiêm CCl4 (pha trong dầu olive nồng độ 10%) vào bắp chân chuột ở các nhóm tương ứng với các nồng

độ 0,2; 0,5 và 1 ml/kg thể trọng Sau khi tiêm, chuột được tiếp tục chăm sóc trong điều kiện bình thường Quan sát và theo dõi, ghi nhận hành vi, biểu hiện sống chết của chuột trong các nhóm ngay sau khi gây độc và sau 48 giờ

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính bảo vệ gan

Xác định hoạt tính bảo vệ gan được thực hiện theo phương pháp của Ferreira với một số thay đổi phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm 30 con chuột được chia thành 5 nhóm (6 chuột/nhóm), cụ thể như sau:

Nhóm đối chứng tham khảo Uống thuốc Silymarin (liều 0,05g/ kgP/ ngày)

và tiêm CCl4 Nhóm cao chiết ML

Nhóm cao chiết ML

Những con chuột thí nghiệm được uống nước cất hoặc Silymarin hoặc cao chiết tại thời điểm cố định (buổi sáng) hàng ngày, uống trong 9 ngày Vào ngày thứ 7 của quá trình thử nghiệm, những con chuột ở tất cả các nhóm (trừ nhóm đối chứng sinh lý) được tiêm CCl4 liều 0,5 ml/kg thể trọng (kgP) ở dạng tiêm bắp CCl4 được pha loãng trong dầu olive nguyên chất ở nồng độ 10% Sau khi kết thúc