Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân eurycoma longifolia jack

Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân Eurycoma longifolia Jack” nhằm tạo ra cơ sở khoa học cho việc nghiên c

ỌC N N

ỌC SƢ P M KHOA SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân

(Eurycoma longifolia Jack)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hương Giang

Đà Nẵng, tháng 5/ 2013

MỞ ẦU

1 Tính cấp thiết

Từ xa xưa, con người không chỉ biết sử dụng thực vật làm nguồn thực phẩm

mà còn sử dụng chúng để điều trị bệnh tật (Wyk và Wink, 2004) Hàng ngàn năm qua, các loài cây dược liệu là nguồn cung cấp dược phẩm quan trọng nhất nhằm cứu lấy sự sống của các bệnh nhân trên toàn thế giới Theo tổ chức WHO, 80% dân số thế giới tin cậy vào các phương thức chữa bệnh truyền thống bằng cây dược liệu và

¼ các loại thuốc hiện nay đều có chứa các hoạt chất sinh học chiết xuất từ các cây dược liệu [60] Tuy nhiên, hiện nay nguồn khai thác các dược liệu này chủ yếu là từ

tự nhiên, dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên và mất tính đa dạng di truyền các loài thực vật [21] Do đó, việc tìm ra phương thức thay thế để tạo ra nguồn dược liệu ổn định là rất cần thiết

Nuôi cấy tế bào huyền phù thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật Kỹ thuật này với những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn về nguồn dược liệu tự nhiên [6] Nhiều hoạt chất sinh học dùng làm thuốc đã được sản xuất theo phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật chẳng hạn như Berberin của Yamada và Sato (1981), Imperatorin của Tsay và cs (1994),

Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là cây dược liệu quý được biết đến

nhiều ở các nước Đông Nam Á Các bộ phận của cây đã được được sử dụng theo truyền thống để chống sốt rét, cải thiện sinh lý nam giới, chống bệnh tiểu đường, chống viêm loét và kháng khuẩn [51] Tuy nhiên, đây là loài cây thân gỗ, sinh trưởng chậm ngoài tự nhiên, phải trồng mất 5-7 năm mới có thể thu hoạch để dùng làm thuốc Mặt khác, sản lượng của cây mật nhân ở Việt Nam đang suy giảm nhanh chóng do nhu cầu khai thác quá mức, lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng Vì vậy việc nghiên cứu tìm ra phương thức sản xuất sinh khối cây mật nhân nhanh và

ổn định nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu bền vững cho phát triển ngành dược liệu

là vô cùng cấp thiết

Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu

nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)” nhằm tạo

ra cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sản xuất các hoạt chất sinh học thông qua nuôi cấy tế bào trên quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được đường cong sinh trưởng trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân

- Xác định được lượng sinh khối ban đầu thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân trong bình tam giác 250ml trên máy lắc

- Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân trong bình tam giác 250ml trên máy lắc

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát đường cong sinh trưởng nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác, trên máy lắc

- Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối tế bào ban đầu đến khả năng tích luỹ sinh khối của tế bào huyền phù

- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) ở các nồng độ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của tế bào huyền phù cây mật nhân

về mặt di truyền trong thời gian ngắn, tạo ra một lượng lớn sinh khối tế bào phục vụ cho công nghiệp và y dược [1]

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học là tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật Cuối thế kỷ

19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [23]

Tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cs (1958) khi nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định

Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào

đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi Phôi soma

đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza

Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống

và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới [16, 17, 23, 32, 44]

1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật

Mặc dù chỉ mới phát triển ở nửa đầu thế kỉ 20 nhưng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đạt được những thành công vượt bậc [6] Điểm ưu việt của nuôi cấy

tế bào so với cây mọc ngoài tự nhiên là điều kiện vô trùng, sản xuất được các chất

có hoạt tính sinh học trong thời gian ngắn và trên quy mô công nghiệp, đồng thời tránh được các biến động về thời tiết và điều kiện đất đai [56]

1.2.1 Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào là một lĩnh vực của nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng và phân tán trong môi trường lỏng Thường được khởi đầu bằng cách đặt khối mô callus dễ

vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động Nuôi cấy huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật đến cuối cùng là dịch huyền phù [6]

Nuôi cấy huyền phù thường tạo nên sự phân rã tốt hơn với chu kì nuôi cấy kéo dài hơn Nuôi cấy huyền phù có thể được duy trì bằng cách sử dụng phương pháp nuôi cấy từ bình tam giác đến hệ lên men trên quy mô lớn Tế bào ít khi tập hợp thành cụm [31] Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao và r-protein [56], bên cạnh đó nuôi cấy huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus do nuôi cấy huyền phù có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men được ngập chìm trong môi trường lỏng [6]

1.2.2 Sự sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro

Sinh trưởng trong nuôi cấy tế bào thực vật trải qua 4 pha chính [6]:

+ Pha tiềm phát: là thời kì khởi đầu của quá trình nuôi cấy, số lượng tế bào tăng thường bằng 0 hoặc không đáng kể Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên nhưng kích thước tế bào lại tăng trong suốt thời kì này Thời gian pha này tuỳ thuộc vào loại và tuổi của mô cấy, đồng thời còn phụ thuộc vào môi trường và lượng sinh khối ban đầu của quá trình nuôi cấy

+ Pha luỹ thừa: tế bào sinh trưởng và phát triển theo hàm mũ Khi đạt đến mật độ nhất định, số lượng tế bào không tăng nữa, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần và

tế bào đi vào giai đoạn ổn định Thông thường, các hợp chất thứ cấp được tích luỹ ở giai đoạn này

+ Pha cân bằng: tế bào ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng

số tế bào chết đi do đó số lượng tế bào là không đổi Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

+ Pha suy vong: số lượng tế bào giảm mạnh, sự chết xuất hiện do sự suy yếu bảo quản năng lượng của tế bào, do sự tích luỹ các sản phẩm độc tố, trong một số trường hợp không những xảy ra hiện tượng chết mà còn kèm theo sự phân giải tế bào

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào

1.2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro

lấy từ môi trường nuôi cấy Thành phần cấu tạo nên môi trường nuôi cấy được chia thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất ĐHST và các chất khác như agar, agarose (Phytagel và cs) Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều chỉnh của nguồn cacbon, nồng độ photphat, nguồn cung cấp nitơ và các chất ĐHST [56]

+ Nguồn cacbon: các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên

chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon

nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991) Thông thường, saccharose (2-5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong quá trình nuôi cấy Các nguồn cacbon có thể sử dụng là saccharose, glucose, fructose và sorbitol [56]

+ Nguồn nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển

mô Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và NO3- (nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+ Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất

+ Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho(P),

kali (K), canxi (Ca), magiê (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên

30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate

và potassium Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L [7]

Các môi trường khoáng khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5 Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố

rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây [16]

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được vitamin,

nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu

một số vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy Các vitamin inositol, B1 (thiamin) và B6 (pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1

là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng đối với nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng sự có mặt của nó trong môi trường MS [16]

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch

chiết nấm men, được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng

mô sẹo và các cơ quan Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994 Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và ADN Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính auxine, các gluxid của cytokinin [16]

+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại polysacharid

của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy

+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohormon là những chất có tác

dụng ĐHST ở thực vật Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các

chất ĐHST sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy

- Auxine: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA, IAA, NAA, 2,4-D trong nuôi cấy mô thực vật auxine thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [16] Lấy ví dụ cụ thể, 2,4-D được bổ sung với nồng độ cao nhằm thúc đẩy sự tăng sinh của callus [56]

- Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan Các hợp chất thường sử dụng là: KIN, BAP, Zip, Zeatin… Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau Ở nồng độ thấp (10-

- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người

ta thường xử dụng cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [3]

- Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất là GA3 GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973) Ngoài

ra, nó còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây

- Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được

dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy,

khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ [3] ABA được sử dụng để gây phôi soma trong hệ thống nuôi cấy mô thực vật và trong nghiên cứu giống cây tổng hợp Chống thoát hơi nước, tăng thời gian thích ứng với điều kiện khí hậu của cây nuôi cấy mô và làm giảm sự mất nước của lá [55]

- Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn Trong một

số trường hợp, ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này [16]

1.2.3.2 iều kiện nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó

là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ

+ Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu

sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 giờ/ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của

mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng

ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của

mô sẹo Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các

quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy Nhiệt độ cho phép tế bào thực vật có thể

sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro là từ 23°C đến 29°C (Endress

1994; Fowler 1988)

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên

ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô

+ pH môi trường: Các mô tách rời sinh trưởng tốt trên môi trường có pH 5,0

– 7,5 Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6,0) Nói chung pH môi trường được điều chỉnh 0,5 đơn vị cao hơn giá trị mong muốn để bù đắp cho sự thay đổi không thể

điều chỉnh trong quá trình khử trùng [7]

Trên thực tế pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường, Sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây Nếu pH thấp (<4,5) hoặc (>7,0) đều gây ức chế sinh

trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro Độ pH thường được sử dụng

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6

+ Lượng sinh khối ban đầu: Theo Helgeson (1979), khối lượng mẫu ban

đầu đưa vào ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi

cấy in vitro Cần phải có một lượng tế bào tối thiểu ban đầu thích hợp là 3-5g/dm3

hoặc 0,5 – 2,5 × 105 tế bào/ml

1.2.4 Các nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất dƣợc liệu

Các cây dược liệu đang được nghiên cứu tập trung trở lại trên toàn cầu Việc sản xuất cây dược liệu đặc trưng bởi sự an toàn ngược lại với việc sản xuất dược liệu từ hoá chất được biết đến bởi sự không an toàn cho người sử dụng và cho môi trường Hơn 1/3 dân số thế giới dùng các loài thực vật và dịch chiết của các loài

thực vật để nâng cao sức khoẻ Hơn 30% tổng số loài thực vật hiện nay được dùng làm thuốc hiện nay [42] Trong những năm gần đây, việc ứng dụng các thành tựu

công nghệ sinh học trong nhân giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc

quý đang được quan tâm và đã đạt một số kết quả nhất định

1.2.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Ngành công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ra đời hàng năm mang lại lợi ích rất lớn cho các quốc gia trên thế giới Bên cạnh khắc phục được các nhược điểm của canh tác truyền thống, nó còn thể hiện ưu điểm vượt trội: tạo ra lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn, tạo sinh khối

tế bào làm nguyên liệu cho công nghiệp và y dược [1]

Nghiên cứu về Zaleya decandra, một loại cây thân bò có nguồn gốc từ Nam

Phi có chứa nhiều alkaloid có hoạt tính dược liệu như morphine, coideine, papaverine cho thấy rằng callus của tế bào cây này phát triển tốt nhất trên môi trường MS có chứa 1,0 mg/l 2,4-D và 2,0 mg/l TDZ [53] Cây cỏ ban một loại cây

có nguồn gốc từ châu Âu, tên khoa học là Hipericum perforatum với tác dụng đặc

hiệu chữa trị bệnh trầm cảm, chống suy nhược và chống virus hiệu quả đã được nghiên cứu về việc hình thành chồi từ rễ và callus bởi các nhà khoa học người Nhật Bản, qua công trình nghiên cứu này, họ đã chỉ ra rằng callus được hình thành từ chồi lá trên môi trường MS có chứa 0,5 mg/l NAA + 0,1mg/l BA ở 25ºC trong bóng tối Callus sau khi được hình thành chuyển sang môi trường được chiếu sáng 3000 lux, 16 giờ/ngày Rễ sẽ được hình thành từ callus sau 4 tuần [38]

Năm 2007, trên nghiên cứu về callus của loài mộc thông hoa nhỏ có tên khoa

học là Clematis gouriana cho thấy sự phát triển callus mạnh mẽ nhất ở môi trường

MS có chứa 1,0 mg/l BAP và 0,3 mg/l NAA Callus được hình thành lập tức được chuyển sang môi trường MS có chứa 4,0 mg/l FAP + 0,5 mg/l IBA để khối callus

có thể phát sinh loài cây này có tác dụng trị thống phong và quả làm thuốc bổ và lợi tiêu hoá, làm thuốc xổ, làm ra mồ hôi, lợi tiểu và lợi tiêu hoá chồi [50] Cây màng

màng hoa vàng tên khoa học là Cleome viscosa chứa hàm lượng cao beta carotene,

vitamin C và các chất khoáng, có tác dụng chữa các bệnh bạch hầu, đau đầu, nôn mửa, viêm phổi Loài cây này được nghiên cứu nhằm tạo ra nhiều callus cung cấp

cho quá trình tách chiết các hợp chất dược liệu Công trình nghiên cứu năm 2011 cho thấy callus phát triển tốt nhất trên môi trường có chứa 2,0 mg/l IAA, lượng callus phát sinh chiếm 59% số lượng mẫu và đạt khối lượng tươi là 84,1± 0,55 mg [18]

Các nhà khoa học Ấn Độ nghiên cứu trên cây dầu mè Jatropha curcas đã

phát hiện ra callus của loài cây này sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l 2,4 D và 2% CW, callus hình thành và phát triển nhanh chóng sau 7 đến 30 ngày nuôi cấy Trong nuôi cấy huyền phù tế bào dầu mè, lượng sinh khối thu được nhiều nhất là vào ngày thứ 21 trên môi trường có chứa 0,5 mg/l 2,4-D với mật

độ tế bào là 1% Từ ngày thứ 30, sinh khối tế bào giữ ở mức ổn định [51] Vitex negundo được biết đến với tên Việt Nam là cây ngũ trảo là một loại Đông dược có

tác dụng chống khuẩn, giảm đau, kháng viêm và tăng đề kháng Nghiên cứu cho thấy môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l NAA cho phát sinh và tăng sinh callus nhanh nhất Callus sáng màu và bở [29]

Nghiên cứu về nuôi cấy huyền phù cây cam thảo Glycyrrhiza inflata đã khảo

sát được đường cong sinh trưởng trên đối tượng này có sinh khối đạt cực đại tại ngày thứ 21 với sinh khối tươi đạt 50g/ L-1 khi tiến hành chuyển 5g callus vào 80ml môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D, 0,5mg/l NAA, 0,5mg/l 6-BA với tốc độ lắc 120vòng/phút [61] Rahman và cs (2012) đã nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế

bào cây cam thảo dây Abrus precatorius đã chỉ ra rằng, đường cong sinh trưởng

trong nuôi cấy tế bào cây này đạt đỉnh tại thời điểm từ 6-8 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA Loài cây này có tác dụng chữa nóng sốt, chữa say, giải độc cơ thể, rễ được dùng làm thuốc để chữa bệnh lậu, kinh nguyệt quá nhiều [54]

Bên cạnh đó,việc nghiên cứu tế bào cây ma hoàng nhằm tách chiết một loại alkaloid có tên ephedrine cho thấy rằng sinh khối tươi callus được hình thành trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l KIN, lượng ephedrine tách được lên tới 14,06 mg/g callus khô [34]

Cây Amanu (Petiveria alliacea) là một loài cây mọc dại ở vùng rừng rậm

Amazon Cây được sử dụng rộng rãi tại các nước Nam Mỹ trong điều trị các chứng đầy hơi, chống co thắt, chống viêm và nhiễm khuẩn Ngoài ra, cây này còn có tác dụng lợi tiểu, chữa viêm khớp và cả bệnh mất trí nhớ Nghiên cứu nuôi cấy nuôi cấy huyền phù để quan sát hình thái tế bào cho thấy rằng, tế bào nuôi cấy trong môi trường lỏng có màu vàng sáng, các khối tế bào rời rạc ở giai đoạn đầu với kích thước từ 0,5 – 1 mm diameter Đường cong sinh trưởng trên môi trường có chứa 22,6 M 2,4-D cho sinh khối đạt đỉnh sau 6 tuần nuôi cấy [25]

1.2.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được đánh giá là nước đứng thứ 16 trên thế giới về sự phong phú, đa dạng sinh vật, trong đó độ đa dạng về cây cỏ khoảng 10.386 loài thực vật có mạch đã được xác định, dự đoán có thể tới 12.000 loài, trong số này, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% (Trần Công Khánh, 2002) Chính vì vậy mà việc phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào đối với các loài cây dược liệu ngày càng được chú trọng hơn trong thời gian gần đây

Hà thủ ô đỏ là một dược liệu quý được sử dụng như một loại thảo dược mang lại sự trường xuân cho con người Bên cạnh đó, Hà thủ ô đỏ còn có một số công dụng khác: rễ và thân có tính kháng khuẩn, chống xơ cứng động mạch, chống co thắt ruột, sử dụng để cầm máu, dùng làm thành phần của thuốc trợ tim, làm thuốc giảm đau và làm thuốc bổ; lá và rễ dùng làm thuốc bổ gan và thận, chống lão hóa; thân điều trị chứng mất ngủ, suy nhược thần kinh, có thể dùng để trị bệnh nấm ngoài da, toàn cây dùng để giải nhiệt hạ sốt Các hợp chất có giá trị trong cây Hà thủ ô đỏ: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin(Dương Tấn Nhựt, 2006; Đỗ Tất Lợi,

2005) Lin (2003) đã xác định các cây Hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ

các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên Một trong những

kỹ thuật để nhân nhanh số lượng cây này được biết đến là tạo phôi soma Nghiên cứu của Huỳnh Thị Đan San trên loài cây này đã chỉ ra rằng mô sẹo 8 tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung NAA 2mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l chuyển sang môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l (1 tuần) và MS không bổ sung chất điều hòa

sinh trưởng thực vật sau 2 tuần xuất hiện khối phôi hình cầu Tiếp tục chuyển phôi hình cầu sang môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l và 10% CW những phôi hình cầu tiếp tục phát triển qua giai đoạn phôi hình tim và phôi

tử diệp Mô sẹo tăng sinh nhanh trên môi trường có bổ sung 2,0 mg/l NAA và 0,5mg/l BA [11]

Một cây thuốc khác rất quý ở Việt Nam đó là cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) có tác dụng điều trị xung huyết, thấp khớp, đắp mụn nhọt và áp xe Dịch

trinh nữ hoàng cung được dùng để nhỏ chữa đau tai (Võ Văn Chi, 1997) Gần đây, tác dụng chống ung thư của trinh nữ hoàng cung đã được phát hiện làm nó trở thành cây thuốc tiềm năng có giá trị chữa bệnh ung thư Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng mô sẹo hình thành sau khi nuôi cấy từ 7 đến 30 ngày Môi trường cho tỉ lệ tạo mô sẹo đối với

củ cây trinh nữ hoàng cung tốt nhất là MS bổ sung 30g/l saccharose, 7g/l agar và 2,5 mg/l NAA cho tỉ lệ tạo mô sẹo sau 20 ngày đạt tới 93,75% [5]

Với công trình dòng hoá cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro Nguyễn

Thị Kim Uyên và cs (2007) đã nhân giống trên môi trường LV bổ sung BAP, NAA

và 2,4-D riêng rẽ thì không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và 2,4-D lại kích thích tạo rễ Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l và NAA 0,5mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l Qua nghiên cứu cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong điều kiện có chiếu sáng trên môi trường bán rắn và lỏng [25] Năm 2007, công trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào

cây thông đỏ - loài cây quý hiếm có giá trị chiết xuất taxol phòng chống bệnh ung thư cho thấy môi trường nuôi cấy cơ bản WPM bổ sung CW (10%), vitamin B1 (5mg/l),

glycin (5mg/l), saccharose (30g/l), BA (0,1mg/l), NAA (0-1-3-5-7mg/l) Tỷ lệ phát sinh phôi soma cao nhất 93,33% (với mẫu nuôi cấy là thân) và 96,67% (với mẫu nuôi cấy là lá) ở nồng độ NAA (3mg/l), kết quả tương tự 90% (mẫu thân) và 93,33% (mẫu lá) được ghi nhận với nồng độ NAA (5mg/l) Trọng lượng tươi tế bào soma tăng lên cao nhất 2,10g (với mẫu nuôi cấy là thân) và 2,23g (với mẫu nuôi cấy là lá)

ở nồng độ NAA (3,0 mg/l), kết quả được ghi nhận thấp hơn 1,57g (mẫu thân) và

1,67g (mẫu lá) ở nồng độ NAA (5mg/l) [12]

Phạm Thị Bích Ngọc và cs (2008) nghiên cứu sự phát sinh chồi từ mô sẹo

cây dây chiều (Tetracera scandens L.) là một nguồn dược liệu quan trọng, góp phần

điều trị một số bệnh như: phù thận, lợi tiểu, gout…Mô sẹo được tạo ra từ lá trên môi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-Dvà 0,5 mg/l BA Trước khi cảm ứng tạo chồi, mô sẹo được tăng trưởng trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l

GA3 [8]

Cây bèo đất có tên khoa học là Drosera burmani là một loài thảo dược chứa

nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị y dược như: plumbagin, 7-methyljuglone, quercetin, myrictin, trong đó nhóm chức quinone nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư, chữa phong, chống hen suyễn Kết quả nghiên cứu về mô sẹo và dịch huyền phù cho thấy môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là Gamborg’s B5, saccharose 20g/l, casein 100mg/l, PVP 1g/l Hoocmon thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo là 2,4-D 0,2mg/l, NAA 0,2 mg/l Kiểu tăng sinh mô sẹo tối ưu nhất là nuôi cấy huyền phù tế bào và giúp khối

tế bào tăng trưởng mạnh nhất vào ngày thứ 12 [10]

Trầm hương tên khoa học là Aquilaria crassna có tác dụng ức chế sự co bóp

tự chủ của hồi tràng và chống co thắt cơ trơn do histamin và acetylcholin gây ra Ngoài ra, nó thường được dùng điều trị các chứng đau ngực, đau bụng, nấc, nôn, hen suyễn, thận khí hư Khi nuôi cấy tế bào soma trên môi trường lỏng, với sinh khối ban đầu nuôi cấy là 1g/65ml trên môi trường có bổ sung 2,4-D, tế bào soma phát sinh nhanh, có màu trắng trong; môi trường có bổ sung BAP + NAA + KIN + vitamin B5 cho tế bào soma trắc đục sữa [2]

1.3 iới thiệu về cây mật nhân

thành chùm, đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái Hoa nở vào tháng 3 – 4 Đài hoa có 5 – 6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng Tràng hoa 5, cũng có tuyến Bầu có 5 noãn, hơi dính ở gốc Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm, rộng 0,5 – 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt

1.3.2 Phân bố

Mật nhân là một trong những loài thảo mộc nhiệt đới phổ biến, có xuất xứ từ các quốc gia Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia Việt Nam, Campuchia, Myanmar và Thái Lan [24] Mật nhân mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa, dưới tán các cây gỗ lớn [27]

Tại Việt Nam, mật nhân có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn – Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở Tây nguyên Trong đó có cả ở Quảng Nam như các huyện Phước Sơn, Đông Giang, Tây Giang, Nam Giang

1.3.3 Thành phần hoá học

Rất nhiều hợp chất hữu cơ của cây mật nhân đã được tách chiết và mô tả, đặc biệt là các hợp chất từ rễ loài cây này Chúng bao gồm cathin-6-one, alkaloids, β-carboline alkaloids, quassinoids, quassinoid diterpenoids, eurycomaoside, tirucallane -type triterpenes, squalene deri-vatives, biphenylneolignans, eurycolactone, laurycolactone and eurycomalactone [20, 22, 43, 48, 49]

1.3.4 Tác dụng dƣợc lý

Tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng cho sản xuất thuốc chữa bệnh

(Jiwajinda và cs, 2002; Osman và cs, 2003) Lá được sử dụng để điều trị tiêu chảy, sốt, sưng tuyến, chảy máu, bệnh phù, ho dai dẳng, tăng huyết áp, giảm đau trong xương và bệnh sốt rét Vỏ nghiền thành bột được sử dụng để điều trị vết thương, u nhọt, lở loét do bệnh giang mai và đau đầu Rễ được nghiền thành bột hoặc dịch chiết từ rễ được sử dụng như thuốc bổ cho phụ nữ để phục hồi sau khi sinh (Bedir

và cs, 2003) [27]

Các hợp chất như các quassinoids, canthin-6-alkaloids, alkaloids- β- carboline, eurycomaoside, các dẫn xuất của squalene và biphenylneolignans đã

được tìm thấy ở rễ Một số các thành phần này đã được chứng minh là có khả năng gây độc tế bào, chống sốt rét, chống các khối u, hạ sốt (Ismail và cs, 1999; Jagananth và cs, 2000, Jiwajinda và cs, 2002; Abd Razak, 2007) Ngoài ra, các chất chiết xuất từ cây này đã được chứng minh là tăng tính cường dương ở nam giới và kích thích tình dục [30]

Năm 2010, nghiên cứu của Bhat R và Karim AA về đặc điểm thực vật học

và đặc tính dược lý quan trọng của cây mật nhân đã nhận thấy các bộ phận của cây chứa rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau như eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, và pasakbumin-B trong số đó các

alkaloit, quassinoids chiếm một phần lớn Chúng được sử dụng để chống sốt rét,

chống ung thư, tăng khả năng sinh lý ở nam giới, chống bệnh tiểu đường, kháng khuẩn và hạ nhiệt [24]

1.3.5 Các nghiên cứu trên đối tƣợng

Kuo và cs đã nghiên cứu và tách chiết gần 65 hợp chất hữu cơ từ rễ của mật nhân trong đó có các hợp chất như eurycomalide A; eurycomalide B; 13, 21-dihydroxyeurycomanol và 5, 14, 15-trihydroxyklaineanone [45] Trong một nghiên cứu khác, Chan và cs đã phát hiện ra một loại quassinoid glycoside mới có tên eurycomanol-2-O-β-D glycopyranoside có khả năng chống sốt rét [26], còn Tada và

cs đã tách chiết được 4 loại quassinoid có khả năng chống viêm loét [59]

7 loại quassinoid khác được tìm thấy từ lá cây mật nhân Những hợp chất này

có khả năng chống lại các khối u ác tính và kháng khuẩn [40] Hussein và cs (2005)

đã nghiên cứu về sự nhân giống cây mật nhân thông qua sự phát sinh phôi vô tính Kết quả cho thấy, phôi callus có năng suất cao (60%) thu được khi thực hiện phương pháp cắt lá mầm như loại 4 nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có chứa 0,5 mg/l KIN và 1,0 mg/l 2,4-D Số phôi callus cao nhất (45 ± 2) trong môi trường

bổ sung 1,0 g/l than hoạt tính Sau đó chuyển các phôi soma trưởng thành vào trong môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l KIN thì tạo ra 90% cây non tái sinh [36] Nghiên cứu của Rosli và cs về các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất 9-

methoxycanthin-6-one trong nuôi cấy callus Eurycoma longifolia Jack

9-methoxycanthin-6-one là 1 hợp chất có khả năng chống khối u với thành phần môi trường và các yếu tố vật lí khác nhau Kết quả cho thấy, 9 methoxycanthin-6-one được tạo ra nhiều nhất (3,84 mg/g-1 DW khô) trong môi trường ¾ MS cơ bản với hàm lượng đường là 2% (w/v) bổ sung 2,0 mg/l dicamba và điều kiện pH =5.5 (1,53 mg/g-1 DW) Nghiên cứu này cho thấy rằng việc sản xuất thành công của 9-

methoxycanthin-6-1 trong nuôi cấy in vitro có tiềm năng trong sản xuất quy mô lớn

trong hệ lên men [57]

Nghiên cứu của Jiwajinda và cs về các loại quassinoids chống hoạt động thúc đẩy khối u và chống ký sinh trùng từ cây mật nhân Kết quả nghiên cứu cho thấy, 14,15 β-dihydroxyklaineanone (5, IC50 = 5 mM) là hợp chất hoạt động mạnh nhất để ức chế khối u do virus Epstein–Barr Chất 11-Dehydroklaineanone và 15β-O-acetyl-14-hydroxyklaineanone cho hoạt động hiệu quả để chống sốt rét (IC50 =

2 mg / ml) Vì vậy, mật nhân đã được đề xuất là cây thuốc có giá trị dược liệu cao

do sự xuất hiện của một loạt các quassinoids [41] Mahmood và cs đã nghiên cứu xác định và tối ưu hóa auxine phù hợp để kích thích mô sẹo cây mật nhân Việc nuôi cấy kích thích mô sẹo với các bộ phận lá, cuống lá, thân, rễ, rễ sợi, lá mầm và phôi đã thành công khi sử dụng các loại auxine khác nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram và dicamba Kết quả các thí nghiệm sau 1 tháng cho thấy sự hiện diện của 2,4-D là thích hợp nhất [46]

Trong nghiên cứu về sự ra rễ của cây mật nhân in vitro Hussein S và cs đã

tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST và lượng cacbon thích hợp nhất cho việc tạo rễ, kết quả xác định được môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ từ cây mật nhân là MS có bổ sung 50g saccharose và 3mg/l NAA [37]

Panjaitan và cs (2012) đã thành công trong việc nghiên cứu về khả năng bảo

vệ tế bào gan từ dịch chiết tế bào rễ cây mật nhân với dung môi là metanol và nước [52] Khả năng chống bệnh sốt rét của cây mật nhân cũng đã được nghiên cứu bởi các nhà khoa học Nhật Bản khi họ phân tích được 4 loại quassinoid, bổ sung thêm vào danh mục các hoạt chất sinh học có trong cây mật nhân [59] Một nghiên cứu khác lại cho thấy rằng, cây mật nhân có khả năng chống lại chứng căng thẳng thần kinh Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy rằng dịch chiết từ cây mật nhân làm

giảm hưng phấn thần kinh ở chuột, số lần giảm căng thẳng nhiều nhất được xác định khi cho chuột uống dịch chiết của cây mật nhân lên đến 18 ± 0,4 lần Nghiên cứu này mở ra một phương thuốc mới để chữa các chứng bệnh căng thẳng thần kinh

ở người [19]

Chương 2

Ố TƯỢN V P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU

2.1 ối tượng nghiên cứu

Tế bào callus được tạo ra từ rễ của cây mật nhân in vitro

Hình 2.1 Cây mật nhân ngoài tự nhiên

Hình 2.2 Cây Mật nhân in vitro Hình 2.3 Tế bào callus tạo từ rễ cây

mật nhân in vitro

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2012 đến tháng 5/2013 tại phòng

thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học

Sư phạm – Đại học Đà Nẵng