Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân eurycoma longifolia jack và khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết của chúng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG *** NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN EURYCOMA LONGIFOLIA JACK VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

***

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY

MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CHÚNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG - Năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

***

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY

MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CHÚNG

N n : CỬ NHÂN SINH - MÔI TRƯỜNG

N ười ướng dẫn: ThS VÕ CHÂU TUẤN

ĐÀ NẴNG - Năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Võ Châu Tuấn - thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Thị Thơ và ThS Nguyễn Thị Duy Nhất, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc trau dồi kiến thức

và kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của mình

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn!

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

C ươn 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật 3

1.1.1 Nuôi cấy callus 3

1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 4

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 5

1.1.4 Nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học 8

1.1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 8

1.1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 9

1.2 Giới thiệu về cây mật nhân 11

1.2.1 Đặc điểm hình thái 11

1.2.2 Phân bố 11

1.2.3 Thành phần hóa học 12

1.2.4 Tác dụng dược lý 12

1.2.5 Các nghiên cứu trên đối tượng 13

1.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của hợp chất từ thực vật 14

C ươn 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy callus 17

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân 17

2.2.2.1 Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng sinh trưởng của tế bào cây mật nhân 17

nhân 18

2.2.2.3 Phương pháp xác định khối lượng tươi và khô của tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 18

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào mật nhân 18

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

C ƣơn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Ảnh hưởng nồng độ sucrose lên khả năng sinh trưởng của tế bào cây mật nhân 20

3.2 Ảnh hưởng của chất ĐHST lên khả năng sinh trưởng của tế bào cây mật nhân nuôi cấy huyền phù 21

3.2.1 Ảnh hưởng NAA và BA 21

3.2.2 Ảnh hưởng NAA và KIN 22

3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào mật nhân 25

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

1 Kết luận 28

2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

DW : dry weight (sinh khối khô)

ĐHST : điều hòa sinh trưởng

GA : gibberellin acid

GAE : gallic acid equivalents

HPLC : high performance liquid chromatography (sắc kí cao áp) IAA : indolacetic acid

IBA : indole 3-butyric acid

KIN : kinetin (6-furfuryl aminopurine)

Hình Tên hình Trang

2.2 Tế bào callus tạo từ rễ cây mật nhân in vitro 16

3.1 Đường cong sinh trưởng của tế bào cây mật nhân trên môi

trường cơ bản MS bổ sung 2,0 mg/L NAA và 2,0 mg/L KIN 23

3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào trên máy lắc 25

3.3

Sinh khối tươi (a) và sinh khối khô (b) của tế bào huyền phù

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L NAA và 2

Bảng Tên bảng Trang

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên khả năng sinh trưởng

3.2 Ảnh hưởng NAA và BA lên khả năng sinh trưởng của tế bào

3.3 Ảnh hưởng NAA và KIN lên khả năng sinh trưởng của tế

3.4 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tế bào mật nhân 25

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hàng ngàn năm qua, các loài cây dược liệu là nguồn cung cấp dược phẩm quan trọng trên toàn thế giới Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% dân số thế giới tin cậy vào các phương thức chữa bệnh truyền thống bằng cây dược liệu

và ¼ các loại thuốc hiện nay đều có chứa các hoạt chất sinh học chiết xuất từ các cây dược liệu [67] Tuy nhiên, các nguồn dược liệu đang sử dụng chủ yếu được khai thác từ tự nhiên Hiện nay, việc khai thác cây dược liệu ngoài tự nhiên để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của con người cùng với những bất lợi của điều kiện môi trường làm cho tài nguyên cây thuốc bị giảm sút nghiêm trọng Do đó, khó đáp ứng được ổn định nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm trong tương lai Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải tìm được các giải pháp nhằm đảm bảo cung cấp ổn định nguồn dược liệu cho con người [20] Công nghệ nuôi cấy

mô và tế bào thực vật nói chung và nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật nói riêng được xem là con đường hữu hiệu để sản xuất các hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp dược phẩm Ưu điểm của nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật là sản xuất lượng sinh khối trong thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu ổn định phục

vụ chiết tách các hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn về nguồn dược liệu tự nhiên [7]

Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là cây dược liệu biết đến nhiều ở

các nước châu Á Các bộ phận của cây đã được sử dụng theo truyền thống để chống sốt rét, cải thiện sinh lý nam giới, chống bệnh tiểu đường, chống viêm loét, kháng khuẩn, hạ đường huyết và sử dụng như một loại thuốc bổ tổng hợp [42], [43]

Mật nhân là loài cây thân gỗ, sinh trưởng chậm ngoài tự nhiên Vì vậy để phục vụ cho mục đích thương mại, hầu hết người ta thu hoạch rễ mật nhân sau 4 năm trồng [24] Hiện nay ở nước ta, nhu cầu sử dụng thực vật làm thuốc để chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh ngày càng tăng, tình trạng khai thác quá mức cây mật nhân cũng đang diễn ra ở nhiều nơi, có thể dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần Do đó việc nghiên cứu tìm ra phương thức sản xuất sinh khối tế

bào cây mật nhân nhanh và ổn định nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu bền vững cho phát triển ngành dược liệu là vô cùng cấp thiết Bên cạnh đó, việc khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết tế bào mật nhân nhằm tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và phân lập các chất có giá trị dược lý trong tế bào cây mật nhân

Xuất phát từ cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy

huyền phù tế bào cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) và khảo sát khả

năn k án k uẩn từ dịch chiết của chúng” nhằm tạo cơ sở khoa học cho các

ứng dụng sản xuất sinh khối tế bào, cung cấp nguyên liệu cho chiết tách các hoạt chất sinh học trong quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu của đề tài

Thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của tế bào mật nhân đồng thời khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tế bào cây mật nhân nuôi cấy huyền phù

3 Ý n ĩa k oa ọc và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp cơ sở khoa học về các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của tế bào cây mật nhân nuôi cấy huyền phù, từ đó làm cơ sở để nghiên cứu nuôi cấy tế bào trên quy mô lớn

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Trên cơ sở khoa học về khả năng sinh trưởng của tế bào mật nhân trong nuôi cấy huyền phù, có thể thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào cây mật nhân trên quy mô lớn trong hệ lên men (Bioreactor), cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục

và ổn định phục vụ sản xuất các hoạt chất sinh học dùng làm thuốc để chăm sóc

và bảo vệ sức khỏe cộng đồng

C ƣơn 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật

1.1.1 Nuôi cấy callus

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa được gọi là callus Callus được tạo ra từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như lá, đoạn thân, rễ,… Ví dụ mô sẹo tạo ra từ lá của chồi hà thủ

ô đỏ (Polygonum multiflorum) in vitro [15]; hay như sự hình thành mô sẹo từ đoạn thân non của cây mỏ quạ (Dischidia rafflesiana) [1]; mô sẹo tạo từ rễ của cây lúa (Oryza sativa) [21],

Nuôi cấy callus đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Callus có thể được sử dụng làm nguyên liệu khởi đầu cho nhiều nghiên cứu như nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất hợp

chất thứ cấp,… [11] Chẳng hạn, nhân giống in vitro lan hồ điệp (Phalaenopsis)

thông qua callus nuôi cấy từ cây lan trưởng thành [36]; callus tạo từ lá của cây

hà thủ ô đỏ in vitro dùng làm nguyên liệu để phát sinh phôi soma trong nghiên cứu nhân giống in vitro của Huỳnh Thị Đan San [15]; Namdeo và cs đã nghiên cứu vi nhân giống cây Ophiorrhiza mungos và sản xuất camptothecin từ nuôi cấy callus, với hàm lượng camptothecin thu được từ callus nuôi cấy in vitro là 0,0768% (trong chồi in vitro là 0,0026% và cây tự nhiên là 0,0030%) [50]

Khả năng sinh trưởng của callus ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau như môi trường khoáng, chất ĐHST,… Nghiên cứu về ảnh hưởng của chất ĐHST lên

khả năng tái sinh in vitro cây cà gai leo (Solanum hainanense) của Huỳnh Văn

Kiệt và cs (2005) cho thấy môi trường bổ sung 8,0 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để tạo callus (76,7% mảnh lá tạo callus) Trên các môi trường có bổ sung 2,0 - 12,0 mg/L 2,4-D callus có hạt nhỏ, rời rạc, mềm, mọng nước, phân chia kém và chuyển sang nâu đen chết sau 6 tuần nuôi cấy Ngược lại môi trường có bổ sung 14,0 - 18,0 mg/L 2,4-D callus có hạt lớn, màu trắng ngà, không mọng nước và vẫn giữ được màu sắc khoảng 10 tuần nuôi cấy [4] Hay nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến sự tăng sinh khối của callus sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis) của Dương Tấn Nhựt và cs (2010) cho thấy môi trường

MS có thành phần đa lượng giảm ½ callus phát triển nhanh hơn, màu trắng và sáng hơn trên môi trường MS và môi trường MS giảm ½ thành phần đa lượng, vi lượng [14]

Trong quá trình nuôi cấy, tế bào callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển [8] Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền thường được lựa chọn làm nguyên liệu nuôi cấy để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp Thông thường sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy

[26]

1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật

Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách đặt khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ để có thể tạo dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất [26] Nuôi cấy huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật và đến cuối cùng là dịch huyền phù [7] Bên cạnh đó, tính đồng nhất của dịch huyền phù tế bào, nguồn nguyên liệu dồi dào, tỷ lệ tăng trưởng và khả năng tái sinh tốt đã tạo điều kiện cho việc ứng dụng nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật phục vụ cho phân tích các quá trình sinh lý phức tạp ở mức độ tế bào và phân tử [49] Sự phân tán của tế bào trong dịch huyền phù tốt hơn với các chu kì nuôi cấy tế bào kéo dài hơn Hiện nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự hiện diện của cả những tế bào đơn và khối tế bào [26] Nuôi cấy huyền phù có thể được duy trì bằng cách sử dụng phương pháp nuôi cấy từ bình tam giác đến

hệ lên men trên quy mô lớn [27] Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như cải thiện điều kiện nuôi cấy [16]

Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật là phương thức được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao [29] Nhân sâm

là một thảo mộc được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh và bồi bổ sức khỏe

ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc từ thời cổ đại Trong những

năm gần đây, nhân sâm được sử dụng như sản phẩm y tế thương mại bao gồm viên nang nhân sâm, đồ uống, mỹ phẩm Nuôi cấy huyền phù tế bào nhân sâm theo quy mô lớn được báo cáo đầu tiên bởi Yasuda và cs (1972) Quá trình nuôi cấy tế bào nhân sâm trên quy mô công nghiệp bắt đầu vào năm 1980 tại Nitto Denko Corporation (Ibaraki, Osaka, Nhật Bản) sử dụng hệ lên men 2000 lít và

20000 lít [53] Hay nghiên cứu của Rahman và cs (2013) về nuôi cấy huyền phù

tế bào cây thầu dầu (Ricinus communis) để sản xuất protein ricin - chất dùng để

diệt tế bào ung thư Mô sẹo cảm ứng trên môi trường bổ sung 2,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA và 2,0 mg/L BAP + 0,8 mg/L NAA được sử dụng để nuôi cấy huyền phù Môi trường lỏng có bổ sung 2,0 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA tế bào sinh trưởng tốt nhất, thời gian tăng trưởng tốt nhất từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6 [55]

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật

Các thông số hóa học và vật lý như thành phần môi trường, chất ĐHST, pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, ánh sáng,… ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999) Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ nuôi cấy có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy [7]

1.1.3.1 Môi trư ờng nuôi cấy

- Nguồn carbon: Hiện nay đường sucrose được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (Fowler 1978; George and Sherrington 1984; Thompson and Thorpe 1987) [37] Sucrose sẽ được enzyme ngoại bào thủy phân tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong quá trình nuôi cấy Ngoài ra nguồn carbon có thể sử dụng là glucose, fructose và sorbitol [29] Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào thực vật cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu Như nghiên cứu của Hakkim và cs (2009) về khả năng sinh trưởng của tế bào cây lá gấm cho thấy nồng độ sucrose 5% thì sinh khối khô đạt cực đại 25,74 g sau 18 ngày nuôi cấy [35]; nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ sucrose 0 - 70 g/L đến khả năng sinh trưởng của tế bào sâm Ngọc Linh cho thấy sinh khối khô đạt cực đại 10,3 g/L tại nồng độ sucrose 50 g/L [65] Ngoài ra nguồn sucrose còn

được chứng minh là ảnh hưởng đến năng suất tích lũy các hợp chất thứ cấp trong

nuôi cấy in vitro Như nghiên cứu của Knobloch và Berlin (1980) về khả năng tích lũy alkaloid indol trong nuôi cấy tế bào cây dừa cạn (Catharanthus roseus),

hàm lượng sucrose tối ưu là 8% trong khoảng nồng độ thử nghiệm 4 - 12% ;

trong nuôi cấy in vitro cây lá gấm (Coleus blumei) nồng độ sucrose 2,5% và

7,5% cho hàm lượng acid rosmarinic 0,8 g/L và 3,3 g/L tương ứng (Misawa, 1985) [57]

- Môi trường cơ bản: Cho đến nay đã có nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật như: môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaier và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),… Trong số đó môi trường Murashige - Skoog (MS) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật [12] Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 0,5 MS; 1 MS; 1,5 MS và 2 MS lên sự tăng trưởng của tế bào sâm Ngọc Linh cho thấy môi trường 1 MS sinh khối tế bào cao nhất đạt 162 g/L sinh khối tươi tương ứng 9,8 g/L sinh khối khô [65] Lian và cs (2002) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 0,5 MS; 1 MS; 1,5 MS và 2 MS đến khả năng sinh trưởng của tế bào nhân sâm Kết quả cho thấy môi trường 0,5

MS tế bào nhân sâm sinh trưởng tốt nhất đạt 224,3 g/L sinh khối tươi (9,9 g khô) [45]

- Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, bột chuối,… Nước dừa được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm

1994 Trong nước dừa thường chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: acid amine, acid hữu cơ, myoinoxitol, các hợp chất có tính auxin, các glucid của cytokinin [20]

- Chất làm đông cứng môi trường: Trong nuôi cấy in vitro, thực vật có thể

phát triển trong điều kiện ngập nước, nhưng không phải tất cả thực vật đều thích

hợp trong nuôi cấy lỏng Ví dụ như sự phát triển của thu hải đường (Begonia)

thích hợp nhất trong môi trường nuôi cấy thạch lỏng hoặc nửa rắn (agar từ 0 - 4

g/L); ngược lại sự phát triển của dâu tây (Fragaria) lại tốt nhất trong môi trường

thạch rắn (agar từ 6 - 12 g/L) [28]

- Các chất ĐHST: hormon thực vật (phytohormon) là một loại hệ thống tín hiệu để phối hợp sự sinh trưởng và phát triển của cây Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: auxin, cytokinin, gibberellin, ethylen, abscisic acid [40] Trong đó hai nhóm chất ĐHST quan trọng là auxin và cytokinin Auxin là phytohormon đầu tiên được phát hiện trong cây được phát hiện vào năm 1934 Nhóm auxin gồm các chất: IAA; NAA; IBA; 2,4-D;… [17] Cytokinin trong cây chủ yếu là chất zeatin Các cytokinin tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là KIN và BA [17] Trong nuôi cấy in vitro, nhiều nghiên cứu cho thấy chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp các chất của các tế bào thực vật cũng như cây hoàn chỉnh Tan và

cs (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST lên cảm ứng callus và nuôi

cấy huyền phù tế bào rau má (Centella asiatica L Urban) Môi trường MS bổ

sung 2,0 mg/L 2,4-D cho tỉ lệ mẫu cảm ứng callus tốt nhất (86,67%), trong khi

đó môi trường nuôi cấy huyền phù MS bổ sung 2,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L KIN

tế bào tăng trưởng tốt nhất (0,27 g/L sinh khối khô) [63] Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D; NAA; BAP; KIN lên quá trình cảm ứng mô sẹo và nuôi cấy huyền

phù tế bào cây anh túc (Papaver bracteatum) cho thấy tỉ lệ cảm ứng tạo mô sẹo

(86,67%) và sinh khối tươi callus cao nhất trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L KIN + 15 mg/L ascorbic acid và môi trường 2,0 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L KIN + 15 mg/L ascorbic acid Trong nuôi cấy huyền phù, môi trường

MS với 1,0 mg/L NAA; 1,0 mg/L BAP và 15 mg/L ascorbic acid cho tỉ lệ sinh trưởng của tế bào tối ưu Trong số các auxin, NAA được đánh giá hiệu quả hơn

so với 2,4-D cho sự sinh trưởng của tế bào anh túc nuôi cấy huyền phù Tuy nhiên, không có ý nghĩ thống kê sự khác nhau giữa KIN và BAP [30]

1.1.3.2 Đi ề u kiệ n nuôi cấ y

- Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng đến mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 - 12 giờ/ngày [57] Ánh sáng kích thích thích

mạnh đến tích lũy anthocyanin trong nuôi cấy tế bào của cà rốt (Daucus carota),

hay ánh sáng ảnh hưởng đến các thành phần của sesquiterpene trong nuôi cấy

mô sẹo cúc la mã (Marticaria chamomilla) (Mulder-Krieger và cs, 1988) Tuy

nhiên trong nuôi cấy mô sẹo của cây chanh (Citrus limon) việc loại trừ ánh sáng

kích thích sự tích lũy monoterpene (Mulder-Krieger và cs, 1988)

- pH môi trường: Độ pH trung bình thường được điều chỉnh từ 5 đến 6 trước khi khử trùng [57] Nói chung pH môi trường thường được điều chỉnh cao hơn giá trị mong muốn để bù đắp sự thay đổi không thể điều chỉnh trong quá trình khử trùng [12] Độ pH trung bình giảm trong thời gian đồng hóa amoniac

và tăng trong quá trình hấp thu nitrat (Donald và Jackman, 1989)

- Nhiệt độ: Mỗi loài thực vật thường thích hợp với một nhiệt độ khác nhau Phạm vi nhiệt độ 17 - 250C thường được sử dụng cho cảm ứng mô sẹo và tăng tốc độ tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào thực vật [57]

- Lượng mẫu ban đầu: Theo Helgeson (1979), khối lượng mẫu ban đầu đưa

vào ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy in

vitro

1.1.4 Nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học

1.1.4.1 Các nghiên cứ u trên thế giớ i

Nuôi cấy huyền phù tế bào 2 loài thông đỏ Taxus baccata var fastigiata và

Taxus wallichiana được thực hiện trong hệ lên men 20 lít trong 28 ngày để xác

định tốc độ tăng trưởng và khả năng tích lũy taxol®

và baccatin III Nuôi cấy tế

bào Taxus wallichiana cho thấy sự tích lũy taxol® và baccatin III lớn hơn nuôi

cấy tế bào Taxus baccata (hệ số tương ứng 2,0 và 1,3), khi cả hai ở trạng thái có

năng suất cao nhất (từ 24 đến 28 ngày) Sản lượng cao nhất của taxol®

(21,04

mg/L) và baccatin III (25,67 mg/L) đạt được cho nuôi cấy tế bào Taxus

wallichiana vượt qua những báo cáo khác về nuôi cấy huyền phù tế bào Taxus

sp Khoảng 40% hàm lượng taxol® và 67% baccatin III được thải ra môi trường ngoại bào [51]

Campothecin là một alkaloid kháng ung thư tiềm năng có trong vỏ và rễ

cây hỷ thụ (Camptotheca acuminate) có nguồn gốc từ Trung Quốc Công trình

nghiên cứu của Sakato và Misawa (1974) đã tạo thành công callus của cây

Camptotheca acuminate trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/L 2,4-D và

1,0 mg/L KIN và nuôi cấy lỏng với sự có mặt của GA và L-tryptophan Hàm

lượng campothecin đạt 0,0025% khối lượng khô [61] Nghiên cứu của Thengane

và cs (2003) cho thấy, khi nuôi cấy tế bào cây Camptotheca acuminate trên môi

trường cơ bản MS có bổ sung 4 mg/L NAA thì sự tích lũy campothecin đạt 0,998 mg/g khối lượng khô [66]

Cây ngải đắng (Artemisia absinthium) được sử dụng như thuốc dễ tiêu hóa,

chất sát khuẩn, chống co thắt, giải nhiệt,… [44] Nuôi cấy callus bằng cách cấy

lá trên môi trường cơ bản MS có bổ sung TDZ (5,0 mg/L) dạng đơn hoặc tổ hợp với một trong hai chất NAA (1,0 mg/L) hoặc IAA (1,0 mg/L) Nuôi cấy huyền phù tế bào trên môi trường lỏng MS cơ bản có bổ sung 1,0 mg/L TDZ và 1,0 mg/L NAA, kết quả cho thấy hàm lượng phenolic tổng đạt 3,57 mg GAE /g (đối chứng 2,75 mg GAE/g), hàm lượng flavonoid tổng đạt 1,89 mg QE /g (đối chứng 1,20 mg/g) và hoạt tính kháng oxy hóa 82,7% (đối chứng 72,3%) Trong

số các hợp chất phenolic, mức tối đa của axit galic 104 g (đối chứng 21,3 g), axit caffeic 27,40 g (đối chứng 28,5 g) và catechin 92,0 g (đối chứng 68,10 g) Kết

quả cũng cho thấy, nuôi cấy huyền phù tế bào cây ngải đắng (Artemisia

absinthium) có khả năng tăng cường sản xuất các hợp chất phenol, do đó hoạt

tính kháng oxy hóa cao hơn so với nuôi cấy callus và cây con ươm từ hạt giống [22]

1.1.4.2 Các nghiên cứ u trong nư ớc

Sâm Ngọc Linh được biết đến như một thảo dược có tác dụng chống ung thư, kích thích hệ miễn dịch, bảo vệ tế bào gan, chống oxy hóa, lão hóa, chống stress và trầm cảm [65] Nghiên cứu của Nguyễn Trung Thành và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào Sâm Ngọc Linh Kết quả cho thấy môi trường cơ bản ½ MS phù hợp cho sản xuất sinh khối và sản xuất ginsenoside Sinh khối khô đạt 9,8 g/L và ginsenoside đạt 6,81 mg/g khối lượng khô Tác dụng của sucrose cũng đã được nghiên cứu trong nuôi cấy huyền phù tế bào Sâm Ngọc Linh Sinh khối khô của tế bào tăng từ 5,4 - 10,3 g/L với sự gia tăng nồng độ sucrose từ 20 - 50 g/L Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside là 30 mM [65] Tiếp tục nghiên cứu của Nguyễn Trung Thành và cs (2008) cũng cho thấy nồng độ 0,5 g/L NH4NO3 cho sinh khối

lớn nhất và hàm lượng ginsenoside đạt cao nhất là 6,5 mg/g khối lượng khô Nồng độ 1,0 g/L KNO3 thích hợp cho sinh trưởng tối đa của tế bào, nhưng nồng

độ 2,0 g/L KNO3 cho sự tích lũy ginsenoside cao hơn đạt 6,1 mg/g khối lượng khô Nồng độ cao MgSO4 là thuận lợi cho cả sự tăng trưởng của tế bào và tích lũy ginsenoside (l5,5 mg/g khối lượng khô) Nồng độ 1,5 g/L CaCl2 gây tích lũy ginsenoside đạt 5,7 mg/g khối lượng khô [64]

Thông đỏ (Taxus wallichiana) là loài cây trong vỏ có chứa nhiều taxol,

được dùng để chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú Theo nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cs đã thiết lập điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo thông đỏ Điều kiện tốt nhất để khởi tạo huyền phù tế bào là môi trường cơ bản B5 có bổ sung 20% nước dừa; 60 g/L sucrose; 4,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L KIN Tuy nhiên, môi trường này không thích hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo

Mô sẹo tái tạo tốt nhất là từ huyền phù 25 ngày trải lên môi trường thạch B5 có

bổ sung 4,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L KIN; 20 g/L sucrose và nuôi cấy trong điều kiện tối Tế bào và mô sẹo thu được từ nghiên cứu này là nguyên liệu cho nuôi cấy trên quy mô lớn, đồng thời phục vụ việc tách chiết và định lượng taxol [13]

Nghệ đen (Curcuma zedoaria) với họat chất sinh học chính là curcumin có

tác dụng chống đông máu và hạ huyết (Vũ Ngọc Lộ, Phan Thị Ánh Tuyết, 1997) Nghiên cứu sản xuất curcumin từ tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L cho thấy: Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù nghệ đen được thiết lập bằng cách chuyển 3 g callus vào bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường cơ bản MS bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA, lắc ở 100 vòng/phút trong 10 ngày Chuyển 200 g sinh khối tế bào thu từ nuôi cấy lắc vào hệ lên men

10 L chứa cùng loại môi trường để sản xuất sinh khối tế bào Sinh khối tế bào đạt cực đại là 603,00 g khối lượng tươi (53,25 g khối lượng khô) sau 14 ngày nuôi cấy [19]

Rau má (Centella asiatica) là một loại thuốc thảo dược truyền thống đã

được chứng minh là có tác dụng dược lý giúp da lành vết thương và có thể là tác nhân tiềm năng điều trị lành vết thương biểu mô và giác mạc [60] Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên cứu tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây rau má Kết quả cho thấy, môi trường cơ bản MS có

bổ sung 1,0 mg/L NAA và 2,0 mg/L BAP thích hợp cho cảm ứng callus, môi trường có 1,5 mg/L NAA và 0,5 mg/L KIN kích thích callus sinh trưởng mạnh Hàm lượng asiaticoside tích luỹ cao nhất trong callus là 3,12 mg/g tương đương với 0,31% khôi lượng khô [9] Tiếp tục công trình nghiên cứu sản xuất asiaticoside từ tế bào rau má trong hệ lên men đã cho thấy sinh khối tế bào đạt giá trị tối đa 128,09 g trọng lượng tươi (13,35 g trọng lượng khô) với tốc độ khuấy 120 vòng/ phút, tốc độ sục khí 2,5 lít/phút, kích cỡ mẫu ban đầu 100 g và duy trì ở nhiệt độ nuôi cấy 250C.Tuy nhiên, hàm lượng asiaticoside cao nhất khi nuôi cấy ở kích cỡ mẫu 50 g [47]

1.2 Giới thiệu về cây mật nhân

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae), bộ Sapindales Mật nhân là loài cây gỗ nhỏ, cao từ 2 - 8 m, cá

biệt có cây cao hơn Thân nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ, mọc so

le Mỗi lá kép gồm 21 - 41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc

lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lông màu xám [34] Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành, cuống có lông màu rỉ sắt Hoa màu vàng hoặc đỏ nâu mọc thành chùm, đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái Hoa ở vào tháng 3 - 4 Đài hoa có 5 - 6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng Tràng hoa 5, cũng có tuyến, bầu có 5 noãn hơi dính ở gốc Quả hạch, hình trứng dài 1 - 2 cm, rộng 0,5 - 1 cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt [33]

1.2.2 Phân bố

Mật nhân là một trong những loài thảo mộc nhiệt đới phổ biến, có xuất xứ

từ các quốc gia Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Campuchia, Myanmar và Thái Lan [24] Mật nhân mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa [43], [59] Ở Việt Nam, mật nhân có mặt ở vườn quốc gia Bái Long Tử, khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở Tây Nguyên Trong đó có ở Quảng Nam như các huyện Phước Sơn, Đông Giang, Tây Giang, Nam Giang

1.2.3 Thành phần hóa học

Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố các hợp chất được tách chiết từ rễ của loài cây này Các hợp chất chủ yếu của cây mật nhân thuộc các nhóm chất như alkaloids, quassinoids, squalene,… Trong đó, alkaloids bao gồm: canthin-6-one; 9,10-dimethoxycanthin-6-one; 5,9-dimethoxycanthin-6-one; 9-methoxy-3-methylcanthin-5,6-dione; β-carboline alkaloids; Quassinoids: eurycomanol; eurycomanol-2-O-β-D-glycopyranoside; longilactone; 6-dehydrolongilactone; 11-dehydroklaineanone; 15β-hydroxyklaineanone; 14,15β-dihydroxyklaineanone;… và nhóm squalene: eurylene; 14-deacetyleurylene; longilene peroxide; teurilene [25], [48], [58], [38], [68]

1.2.4 Tác dụng dược lý

Từ lâu, mật nhân được biết đến như là một nhân sâm của Maylasia cũng như nhiều nước Đông Nam Á Nhiều nghiên cứu cho thấy, các bộ phận của cây này rất giàu các hợp chất hoạt tính sinh học như eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone và pasakbumin-B Trong đó phần lớn là các alkaloids và quassinoids Các bộ phận của cây có tác dụng giúp nam giới tăng cường chức năng sinh lý và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và chống lão hóa Tuy nhiên, tác dụng nổi bật nhất của cây mật nhân là khả năng tăng cường sức khỏe tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosteron) một cách tự nhiên,… [24], [25], [31]

Hầu hết các bộ phận như lá, vỏ, quả, rễ của cây mật nhân đều có tác dụng điều trị bệnh Mật nhân có vị đắng, tính mát, khi đi vào kinh, can, thận có tác dụng bổ dưỡng cho người bị khí huyết hư, gân xương đau nhức, tê chân tay, rối loạn tiêu hóa, đau nhức ngực do khí ứ không thông Lá cây dùng đun nước để trị ghẻ chốc Rễ mật nhân còn dùng để trị chứng ăn không tiêu, tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng ở ruột Mật nhân có khả năng chữa trị bệnh sốt rét, kiết lỵ, làm chất đông máu, giảm khả năng mất máu do chấn thương, chống sưng phù, tăng huyết áp, viêm loét,… [44] Ngoài ra, mật nhân còn sử dụng để chữa trị bệnh loãng xương hay các bệnh về tim mạch do thiếu androgen, testosteron [52]

1.2.5 Các nghiên cứu trên đối tượng

Ở cây mật nhân, nghiên cứu về thành phần hóa học của nó được nhiều nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm, chẳng hạn: Chan và cs (1989) đã phân lập từ

rễ mật nhân một loại quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-2-O-β-D glycopyranoside, có khả năng chống sốt rét [25] Tiếp đến 3 loại quassinoid mới: eurycolactone D, eurycolactone E và eurycolactone F cũng đã được Ang và cs (2001) phân lập từ rễ mật nhân ngoài tự nhiên [23] Kuo và cs (2004) nghiên cứu

và tách chiết gần 65 hợp chất từ rễ, trong đó có các chất chủ yếu như eurycomalide A; eurycomalide B; 13β-21-dihydroxyeurycomanol và 5α-14β-15β-trihydroklaineanone [43] Từ lá cây mật nhân ngoài tự nhiên, Jiwajinda và

cs (2002) cũng đã phân lập được 7 chất quassinoid gồm longilactone, dehydrolongilactone, 11-dehydroklaineanone, 12-epi-11-dehydroklaineanone, 15β-hydroxyklaineanone, 14,15β-dihydroxyklaineanone, 15β-O-acetyl-14-hydroxyklaineanone [62]

6-Bên cạnh các nghiên cứu về tách chiết các hợp chất từ cây mật nhân, một

số nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng đã được công bố, chẳng hạn nghiên cứu cải

thiện khả năng sản xuất 9-methoxycanthin-6-one (hợp chất chống ung thư tiềm năng) từ nuôi cấy callus mật nhân Sản xuất 9-methoxycanthin-6-one cao hơn ở

mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường ¼ MS (3,84 mg/g); nồng độ fructose 2% thúc đẩy sản xuất 9-methoxycanthin-6-one (4,59 mg/g); bổ sung 2 mg/L dicamba cũng tăng sản xuất 9-methoxycanthin-6-one với 12,3 mg/g Nghiên cứu này đã mở ra tiềm năng sản xuất 9-methoxycanthin-6-one trên quy mô lớn bằng công nghệ bioreactor [59] Theo kết quả nghiên cứu của Chan và cs (2009), môi trường cơ bản MS bổ sung 100 mg/L chitosan làm tăng đáng kể sinh khối tế bào, trong khi đó lượng 150 mg/L chitosan kích thích sản xuất 9-hydroxycanthin-6-one nhưng không sản xuất 9-methyoxycanthin-6-one, việc bổ sung 2 mg/L và 20 mg/L NaH2PO4 kích thích tăng cao nhất sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid tương ứng Tuy nhiên, bổ sung Na2CO3 và PVP đã ức chế sinh trưởng tế bào và không tăng sản xuất alkaloid [41]

Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hoạt chất của cây mật nhân Chẳng hạn, nghiên cứu của Phạm Thị Như Hồng (2006) về thành phần

hóa học của cây mật nhân bằng phương pháp sắc ký như sắc ký cột trên silica gel

đã xác định được các hợp chất thuộc nhóm triterpen: 5-O-metylpiscidinol A, tirucallan-7,24-dien-3-on và epi-sapeline là hợp chất quassonoid tương ứng với hai chất quassin và 18-hydroxyquassin [3] Tuy nhiên, cho đến nay, nghiên cứu

về nhân giống in vitro và nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân hầu như chưa

có công trình nào công bố, mặc dù đây là hướng công nghệ có tiềm năng lớn trong bảo tồn, phát triển bền vững các nguồn gen dược liệu quý mà các nước trên thế giới đã rất quan tâm và có nhiều thành công

1.3 Những nghiên cứu về khả năn kháng khuẩn của hợp chất từ thực vật

Hiện nay, dịch bệnh do vi sinh vật gây ra đang trở thành vấn đề lớn trên toàn thế giới Thảo dược đang ngày càng chứng minh vai trò quan trọng của mình trong sử dụng làm thuốc chữa các bệnh do vi sinh vật gây ra Các hợp chất

có nguồn gốc từ thực vật được xem như là một giải pháp an toàn sinh học thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp Khoảng 28% sản phẩm thuốc trên thị trường hiện nay có nguồn gốc từ thiên nhiên [39]

Nhiều công trình nghiên cứu công bố cho thấy hiệu quả sử dụng dịch chiết

từ thực vật để kháng lại các chủng vi sinh vật Như công trình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược Ấn Độ cho thấy chiết xuất chloroform,

methanol của cây phượng vĩ (Delonix elata) và chiết xuất methanol của Mollugo

cerviana có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) và vi khuẩn gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) với nồng độ diệt khuẩn tối

thiểu (MBC) từ 1,5 - 100 mg/mL Chiết xuất methanol của Merremia tridentata

chỉ chống lại vi khuẩn gram dương với MBC từ 12,5 - 100 mg/mL Chiết xuất

của Enicostemma axillare và Solanum incanum cho thấy có hoạt tính với chủng

B subtilis với MBC 100 mg/L [54] Nghiên cứu của Flores và cs (2012) về khả

năng kháng khuẩn đối với Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Vibrio

cholerae của chiết xuất methanol và nước của Oenothera rosea cho thấy chiết

xuất methanol và nước ức chế đáng kể đên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn thử nghiệm Chiết xuất dung môi methanol và dung môi nước gây ức chế

55%, 66%, 87% và 54%, 69%, 88% lần lượt đối với các chủng E coli, S