Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời kalanchoe pinnata ở xã hoà liên huyện hoà vang thành phố đà nẵng

Để góp phần vào nguồn tư liệu về loài cây sống đời cũng như phát triển những tác dụng chữa bệnh tuyệt vời của nó, tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sốn

1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TRONG LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) Ở XÃ HOÀ LIÊN, HUYỆN HOÀ

VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SU PHẠM

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

Sinh viên thực hiện : Trương Văn Cương – 08SHH

Đà Nẵng - Năm 2012

2

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây sống đời, tên khoa học là Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers, họ

Crassulaceae, có các tên gọi khác như cây thuốc bỏng, trường sinh, diệp sinh căn

Nó vừa là cây cảnh, vừa là một cây thuốc được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền không chỉ ở Việt Nam mà cả trên thế giới Có thể sử dụng tất cả bộ phận của cây sống đời nhưng chủ yếu là dùng lá Cây sống đời phân bố ở khu vực châu Á, Thái Bình Dương, Caribe Nó cũng phân bố rộng rãi ở Việt Nam Cây sống đời dễ trồng, là cây mọc hoang dã, chỉ cần bẻ hoặc cắt một lá già cắm xuống đất là được Cây sống đời có tác dụng chữa các bệnh tiêu thũng, giảm đau, sinh cơ, viêm phế quản, viêm khớp, bóng nước, bỏng và các công dụng như kháng khuẩn, làm lành các vết thương, lỡ loét, viêm tấy, cầm máu, ức chế miễn dịch, bảo vệ gan, thận,

an thần, chống tác nhân gây đột biến, làm thuốc giải độc

Trên thế giới các loài thuộc chi Kalanchoe rất được chú trọng nghiên cứu trong các lĩnh vực: chiết tách, xác định thành phần các hợp chất hữu cơ, nghiên cứu tính kháng khuẩn chống độc tế bào…[12] Ở nước ta cho đến nay chưa có nghiên cứu nào mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng, công nghệ khai thác các hợp chất hoá học có trong lá sống đời Để góp phần vào nguồn tư liệu về loài cây sống đời cũng như phát triển những tác dụng chữa bệnh tuyệt vời của nó,

tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xác định axit hữu cơ trong lá cây sống đời

(Kalanchoe pinnata) ở xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng ”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần axit hữu cơ trong lá cây sống đời Từ đó đóng góp vào nguồn thông tin, tư liệu khoa học về cấy sống đời, tạo cơ

sở khoa học phát huy những tác dụng chữa bệnh của nó

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: lá cây sống đời hái ở xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Phạm vi nghiên cứu:

3

+ Xác định một số chỉ số như độ ẩm, hàm lượng tro của lá tươi

+ So sánh, xác định tổng lượng axit chiết được bằng các dung môi khác nhau

từ các phương pháp chiết khác nhau

+ Định danh một số axit bằng phổ GC-MS

+ Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết lá tươi

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước

- Trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồng nghiệp

4.2 Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu;

- Phương pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học: xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng, xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu;

- Phương pháp chiết: ngâm kiệt, chưng ninh, chiết soxhlet bằng các dung môi

có độ phân cực khác nhau;

- Phương pháp chuẩn độ axit – bazơ để định lượng các axit hữu cơ phân cực;

- Phương pháp xác định thành phần hóa học, định danh và xác định cấu trúc các cấu tử chính bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS);

- Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết lá tươi

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thông tin khoa học về thành phần axit và công dụng phối hợp của nó trong lá cây sống đời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây sống đời và làm tư liệu cho những nghiên cứu sau này

4

6 Cấu trúc luận văn

Luận văn này có 46 trang trong đó phần mở đầu 3 trang, kết luận kiến nghị 1 trang, tài liệu tham khảo có 3 trang Luận văn có 7 bảng, 28 hình và đồ thị Nội dung chia thành 3 chương:

Chương 1: Tổng quan (12 trang)

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (5 trang)

Chương 3: Kết quả và thảo luận (22 trang)

5

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CÂY SỐNG ĐỜI

- Cây sống đời hay còn gọi là cây bỏng, lá bông, trường sinh, diệp sinh căn, đà bất tử , vừa là cây cảnh, vừa là một cây thuốc chữa bệnh hàng ngày đơn giản và hiệu quả

- Tên Khoa học: Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers 1805 (CCVN, 1:967) [2]

- Cây sống đời thuộc:

1.3 ĐẶC ĐIỂM CÂY SỐNG ĐỜI

Cây sống đời dễ trồng, là cây mọc hoang dã, chỉ cần bẻ hoặc cắt một lá già cắm xuống đất là được và hoa của cây sống đời màu tím hồng khá đẹp nên sống đời được trồng nhiều làm cây cảnh và được trồng trong chậu hoa nhỏ và dùng để trang trí trong nhà

6

Cây sống đời có thân thảo rỗng, cao 0,5-1 mét; có hai loại lá: một loại lá to và một loại lá nhỏ Lá mọc đối thành hình chữ thập, lá dày có khí nguyên; mép lá có răng cưa tù, to, mặt lá bóng có cuống dài từ 2-5 cm Hoa mọc ở ngọn hoặc kẽ lá, màu tím hồng, rủ chúc xuống như đèn lồng Hoa nở vào tháng 3-5, có quả vào tháng 4-6 [28]

Cây sống đời có vị nhạt, hơi chua chua, chát chát, rất dễ uống khi ốm đau lại

có tính mát, rất tốt dùng trong tiêu thũng, chỉ thống, sinh cơ Sống đời còn dùng làm thuốc giải độc và chữa bỏng

1.4 CÔNG DỤNG CÂY SỐNG ĐỜI

Các nước trên thế giới đã sử dụng cây sống đời từ lâu với nhiều mục đích

phong phú Tại Brazil sử dụng chữa áp-xe, các bệnh vòm họng, viêm phế quản,

viêm khớp, bóng nước, bỏng, những cục chai, viêm kết mạc, ho, viêm da, bệnh da liễu, đau tai, eczema, phù, sốt, bệnh tăng nhãn áp, nhức đầu, nhiễm trùng, viêm, côn trùng đốt, các vấn đề đường ruột, ngứa, sỏi thận, rối loạn bạch huyết, lở loét miệng căng thẳng, nhiễm trùng hô hấp, bệnh thấp khớp, vấn đề về da, đau răng, bệnh lao, ung thư, loét, suy tiết niệu, mụn cơm, ho gà, vết thương, và sử dụng như thuốc an thần Tại Ecuador người bản địa sử dụng nước tách từ lá cho xương bị gãy, vết bầm

tím bên trong, sử dụng chữa nhức mỏi, tiêu chảy, các vấn đề về da Tại Ấn Độ sử

dụng chữa cảm giác khó chịu bụng, sôi, vết bầm tím, bệnh tả, cầm máu sát trùng vết cắt, bệnh tiểu đường, tiêu chảy, kiết lỵ, đầy hơi, nhức đầu, sỏi thận, khó tiêu, côn

trùng cắn, ghẻ, lở loét, suy tiết niệu, vết thương Tại Mexico sử dụng chữa các bệnh

nhiễm trùng mắt, nhức đầu, viêm nhiễm, rối loạn kinh nguyệt, nổi mụn, vết thương Tại Nicaragua sử dụng chữa đau nhức, bỏng, cảm lạnh, ho, sốt, nhức đầu, đau, nhiễm trùng đường hô hấp Tại Nigeria sử dụng chữa ho, đau tai, eczema, viêm, nổi mụn Tại Peru sử dụng chữa các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, bóng nước, gãy xương, viêm phế quản, ung thư (ung thư hạch), viêm kết mạc, ho, đau tai, nhiễm trùng mắt, động kinh, viêm quầng, sốt, khí đốt, nhức đầu, ợ nóng, viêm, các vấn đề

đường ruột, đau nửa đầu, buồn nôn, vấn đề về da, lở loét, viêm niệu đạo Tại Nam

Mỹ sử dụng chữa bệnh suyễn, đau tai, đau đầu, ức chế các khối u Tại Mỹ sử dụng

chữa thủy đậu, sốt, đau bụng… Những loài khác nhau của cây sống đời được sử

7

dụng nhiều trong y học tại Đông Dương và quần đảo Philippines Lá và vỏ cây là thuốc bổ đắng, chất làm se cho ruột, giảm đau, tống hơi trong ruột, hữu ích trong điều trị tiêu chảy và ói mửa Nó được ứng dụng để chữa trị bên ngoài lẫn bên trong, điều trị cho tất cả các loại đau và viêm, nhiễm vi khuẩn, virus và bệnh nấm, nhiễm trùng, leishmaniasis, đau tai, nhiễm trùng hô hấp trên, viêm loét dạ dày, cảm cúm, sốt, điều trị vết cắt, vết thương, trĩ, chứng rong kinh, sự đổi màu của da, bóng nước, loét tróc vảy, mắt, bỏng, tiêu chảy, kiết lỵ, đau đầu, ói mửa, viêm cấp tính và viêm phế quản [15]

Ở Việt Nam, lá cây sống đời cũng được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian:

- Say rượu: Ăn 10 lá sống đời, sau 10 phút sẽ khỏi say

- Viêm họng: Ăn 10 lá sống đời, chia làm 10 lần trong ngày (sáng 4 lá, chiều

4 lá, tối 2 lá) Nên nhai ngậm và nuốt cả bã Dùng trong 3 ngày là khỏi

- Mất sữa: Sáng và chiều mỗi lần ăn 8 lá sống đời, sau 2 ngày sẽ có sữa

- Mất ngủ: Chiều và tối ăn mỗi lần 8 lá sống đời, giấc ngủ sẽ đến sớm

- Viêm xoang mũi: Giã nát 2 lá sống đời, lấy nước thấm vào bông, nút hố mũi bên viêm Ngày làm 4-5 lần Nếu viêm cả 2 bên thì sáng nút một bên chiều nút một bên

- Trĩ nội: Mỗi ngày dùng 10 lá sống đời (sáng 4 lá, chiều 4 lá, tối 2 lá) nhai nuốt bớt nước, bã bỏ vào gạc vải, đắp lên hậu môn Trước khi đắp thuốc phải làm vệ sinh hậu môn bằng nước pha muối Sau 20-45 ngày sẽ khỏi

- Kiết lỵ (viêm đại tràng): Mỗi ngày ăn 20 lá sống đời (sáng 8 lá, chiều 8 lá, tối 4 lá) Trẻ 5-10 tuổi dùng liều bằng nửa người lớn Ăn 5 ngày là khỏi

1.5 CÁC TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CÂY SỐNG ĐỜI

Cây sống đời từ lâu đã được biết đến như cây thuốc và được đánh giá cao trên thế giới như là một nguồn phong phú của khả năng trị bách bệnh Phần lá và phần rễ đều có tác dụng chữa trị cao [20] Sống đời Kalanchoe giàu ancaloit, triterpenes, glycosides, flavonoid, steroid và chất béo Đặc biệt lá có chứa một nhóm các hóa chất gọi là bufadienolides Nó có cấu trúc và hoạt động tương tự như hai glycosides tim khác, digoxin và digitoxin (thuốc dùng để điều trị lâm sàng của suy tim sung

8

huyết và điều kiện liên quan) Gần đây các nhà hóa học Nhật Bản phát hiện khả năng kháng khuẩn gây bệnh sốt rét ở lá sống đời tuy nhiên vẫn chưa chứng minh

thành phần nào có tác dụng chính trong công dụng này

Nhiều bài thuốc cổ truyền của Kalanchoe Pinnata đã được giải thích bởi các

nghiên cứu lâm sàng được tiến hành cho đến nay Nó được sử dụng làm thuốc giảm đau, chống dị ứng, chống phản vệ (làm giảm phản ứng dị ứng), chống viêm, antitumorous, antiulcerous, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng histamine, kháng siêu

vi, trầm cảm hệ thần kinh trung ương, giải nhiệt (giảm sốt) gastroprotective (bảo vệ

dạ dày), ức chế miễn dịch (ngăn chặn một số tế bào miễn dịch), immunomodulator (điều biến một số tế bào miễn dịch overactive), vết thương do côn trùng, giãn cơ,

thuốc an thần [27]

1 Kháng khuẩn: Sự hiện diện của các hợp chất phenolic chỉ ra rằng cây sống

đời có khả năng chống vi khuẩn Lá và nước ép lá tươi đã được chứng minh vai trò quan trọng trong hoạt động kháng khuẩn đối với Staphylococcus, E coli, Shigella, Bacillus và Pseudomonas [11];

2 Chống ung thư: Các lá có chứa một nhóm chất gọi là bufadienolides Nó

có cấu trúc và tác động tương tự như hai glycoside tim khác là digoxin và digitoxin

(thuốc được sử dụng để điều trị lâm sàng của suy tim sung huyết và một số bệnh liên quan)

Bufadienolides của Kalanchoe đã chứng minh trong nghiên cứu lâm sàng có tính kháng khuẩn, phòng ngừa ung thư [21] Bersaldegenin-1,3,5-orthoacetate ức chế sự tăng trưởng một số tế bào ung thư;

3 Chống giun kí sinh: Trích xuất nước ép lá Kalanchoe đã được chứng minh

ngăn ngừa và điều trị leishmaniasis (một bệnh ký sinh trùng phổ biến ở các nước nhiệt đới được truyền qua vết thương hở) ở cả người và động vật [16];

4 Chống côn trùng: Bryophyllin A cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại ấu

trùng côn trùng của tằm [22];

5 Chống dị ứng: Công dụng truyền thống của Kalanchoe trong trị bệnh hô

hấp và ho có thể được giải thích bằng các nghiên cứu chứng minh rằng nước ép lá

có tiềm năng chống histamine và chống dị ứng Trong một nghiên cứu (với chuột và

9

lợn guinea) nước ép lá đã có thể bảo vệ chống lại các chất hóa học gây ra phản ứng phản vệ và tử vong do chọn lọc ngăn chặn các thụ thể histamine trong phổi;

6 Chống viêm: Các nghiên cứu trên cơ thể đã khẳng định rằng Kalanchoe có

thể làm giảm sốt, kháng viêm, giảm đau và tác dụng giãn cơ Hiệu ứng chống viêm của nó đã được giải thích một phần do tăng khả năng hệ miễn dịch [24];

7 An thần: Trong các nghiên cứu trên động vật kalanchoe cung cấp trích xuất

an thần Công dụng này do một phần trích xuất lá làm tăng nồng độ của một chất truyền thần kinh trong não gọi là GABA (gamma aminobutyric axit) [13];

8 Phòng, chống loét: Trích xuất lá bảo vệ chuột khỏi loét, gây cảm ứng như

căng thẳng, aspirin, ethanol và histamine và giảm căng thẳng Hyper [16] Các lá cây

có chứa hydroxyproline chữa lành những vết thương [18];

9 Chất chống oxi hóa: Lá cây có chứa hợp chất phenolic như axit phenolic

và Quercetin là chất chống oxy hóa [9], [24];

10 Chống kí sinh trùng sốt rét: Những nghiên cứu gần đây tập trung làm

sáng tỏ khả năng chữa bệnh sốt rét của lá sống đời, tuy nhiên vẫn chưa cho kết quả

rõ ràng nhất thành phần nào có công dụng chính cho tác dụng này [8], [23]

11 Chống tác nhân gây đột biến: Obaseiki-et al Ebor điều tra rằng lá chiết

bằng dung môi hữu cơ đã hoạt động ức chế đột biến gây ra bởi hoạt động của ethyl methanesulfonate TA100 S typhimurium hoặc TA1002 và cũng hoạt động chống lại tác động ngược gây ra bởi 4nitro-phenylenediamine-o và 2-aminofluorene tại TA98

12 Bảo vệ gan và thận: Nước ép của lá tươi được sử dụng rất hiệu quả để

điều trị vàng da ở khu vực Bundelkhand của Ấn Độ Có tác dụng bảo vệ hiệu quả trong việc giảm gentamicin gây ra ở thận chuột, nó có thể bao gồm chất chống oxy

hóa và các hoạt động khử các gốc oxi hoá

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CỦA CHI

KALANCHOE

Cho đến nay trên thế giới tìm ra khoảng 33 chi Kalanchoe trong đó có gần

1400 loài Riêng Việt Nam có trên 10 loài thuộc chi Kalanchoe Toàn cây được sử dụng nhưng lá được dùng phổ biến hơn cả

10

Thành phần hóa học của lá có các hợp chất phenolic bao gồm axit p-cumaric, syringic, axit caffeic, p-hydroxybenzoic Các axit như axit malic, isocitric, citric, succinic, fumaric, pyruvic, oxalacetic, lactic, oxalic và một số axit hữu cơ khác Ngoài ra còn có các glucosid flavonoic như quercetin 3-diarabinosid, kaempferol 3-glucosid [27]

Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tác giả làm rõ thành phần cách trích xuất

và công dụng một số axit có trong lá cây sống đời

Công dụng nhóm axit trong bảo quản thực phẩm và diệt khuẩn bởi vì các hiệu ứng của chúng với vi khuẩn Nguyên tắc cơ bản quan trọng về cơ chế hoạt động của các axit hữu cơ với vi khuẩn là axit hữu cơ không phân li có thể xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn và làm gián đoạn sinh lý bình thường của một số loại vi khuẩn mà chúng ta gọi là nhạy cảm với pH, có nghĩa là chúng không thể chịu được một sự thay đổi pH lớn bên trong và ngoài cơ thể Trong số đó có vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp C.perfringens, Listeria monocytogenes, và Campylobacter Khi khuếch tán thụ động của các axit hữu cơ vào các vi khuẩn, nơi

mà độ pH là gần hoặc trên trung tính, các axit sẽ phân li và giảm pH bên trong vi khuẩn, sẽ làm giảm hoặc ngừng sự phát triển của vi khuẩn Mặt khác, phần anion của các axit hữu cơ không thể thoát khỏi các vi khuẩn trong mẫu phân ly của nó sẽ tích tụ trong các vi khuẩn và phá vỡ nhiều chức năng trao đổi chất, dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu, không tương thích với sự tồn tại của vi khuẩn

Dựa vào cấu tạo gốc R gắn vào -COOH có thể chia axit thành các nhóm sau:

1.6.1 Nhóm axit phenolic

Hợp chất phenolic là một lớp các hợp chất hữu cơ bao gồm một nhóm hidroxyl (-OH) gắn với một nhóm hydrocacbon thơm Mặc dù tương tự như các hợp chất ancol nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có do nhóm hidroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no Chúng có tính axit tương đối cao

do vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử ôxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử ôxy này với nguyên tử hiđrô trong nhóm hidroxyl Tính axit của nhóm hidroxyl trong các phenol nói chung nằm trong khoảng trung gian giữa các rượu và các axit cacboxylic (pKa của chúng thông thường nằm trong khoảng 10 - 12)

11

Axit phenolic bao gồm nhóm hydroxyl gắn trực tiếp trên cacbon thơm và gốc axit cacboxylic Trong thực vật nó tồn tại dạng đơn chất, este, ete… Chúng tạo thành một nhóm đa dạng bao gồm các axit hydroxybenzoic phân phối rộng rãi và hydroxycinnamic Hợp chất axit hydroxycinnamic dạng thường gặp nhất là este đơn giản với hydroxy axit cacboxylic hoặc glucose Hợp chất axit hydroxybenzoic có mặt chủ yếu ở các hình thức glucosides

Axit phenolic là chất chuyển hóa thực vật Hợp chất phenolic rất cần thiết cho sự tăng trưởng và sinh sản của thực vật, và được sản xuất như một phản ứng bảo vệ thực vật “bị thương” chống lại tác nhân gây bệnh Gần đây các nhà khoa học quan tâm đến axit phenolic bắt nguồn từ vai trò bảo vệ tiềm năng của nó, thông qua uống nước ép trái cây và rau quả tươi, chống lại các bệnh gây ra bởi tác nhân oxy hóa như: bệnh tim mạch vành, đột quỵ, và ung thư [9]

1.6.1.1 Axit caffeic

Danh pháp: 3 - (3,4-dihydroxyphenyl

2-propenoic axit)

Công thức cấu tạo: công thức phân tử

C9H8O4, cấu tạo như (Hình 1.2) là một

hydroxycinamic axit, một hợp chất hữu cơ tự nhiên, rắn, màu vàng Nó bao gồm tính chất nhóm chức phenolic và acrylic Nó được tìm thấy trong nhiều thực vật vì

nó là một trung gian quan trọng trong sự sinh tổng hợp lignin, một trong những nguồn gốc của sinh khối

Hóa sinh axit caffeic: được kiểm nghiệm như một chất có khả năng điều hòa

hệ miễn dịch và khả năng ức chế chất oxi hóa gây ung thư Axit Caffeic tốt hơn các chất chống oxy hóa khác, bằng chứng việc giảm sản xuất aflatoxin hơn 95 % [16] Trong nghiên cứu tương tự, khi có liều lượng cao chất chống oxy hóa kết hợp với axit caffeic, cho thấy sự sụt giảm đáng kể trong sự tăng trưởng của các khối u ruột

12

phenyl) prop-2-enoic

Công thức cấu tạo: Công thức phân tử C10H10O4 Công thức cấu tạo như

(Hình 1.3) Axit ferulic tinh khiết là một chất bột màu vàng Axit Ferulic thuộc về

nhóm axit hydroxycinnamic Đặc biệt cấu trúc hóa học tương tự curcumin một hợp

chất chiết từ nghệ vàng có hoạt tính chống ung thư rất cao

Hóa sinh axit ferulic: Giống như nhiều hợp chất phenolic khác nó là một

chất chống oxi hóa đã được thử nghiệm trong ống nghiệm (nghĩa rằng nó phản ứng với các gốc tự do ví dụ các gốc tự do chứa oxi (ROS) ROS và các gốc tự do liên quan đến phá hủy hay thay đổi cấu trúc DNA, ung thư, tăng tốc lão hóa tế bào [19] Axit ferulic có thể có hoạt động kháng u trực tiếp chống lại ung thư vú và ung thư

gan [6]

Nếu sử dụng kết hợp axit ascorbic, vitamin E và axit ferulic có thể làm giảm

sự lão hóa da do căng thẳng và tái tạo da do tái tạo colagen [10] Axit ferulic được đánh giá cao như một tiền chất sản xuất hương liệu tổng hợp vanillin

1.6.1.3 Axit protocatechuic

Danh pháp: Axit 3,4-đihydroxybenzoic

Công thức cấu tạo: Axit Protocatechuic (PCA)

Công thức phân tử C7H6O4 công thức cấu tạo như (Hình

1.4) Nó là một loại axit phenolic Nó có tác dụng lên cả tế

bào bình thường và ung thư được nghiên cứu trong ống

nghiệm [14]

PCA đã được báo cáo để kích thích quá trình apoptosis của các tế bào bạch cầu của con người, cũng như HSG1 tế bào ác tính từ khoang miệng của con người [7] Nhưng PCA được tìm thấy có tác dụng hỗn hợp các khối u da chuột TPA gây ra [17] Tùy thuộc vào số lượng PCA và thời gian trước khi ứng dụng, PCA có thể làm giảm hoặc tăng cường khối u phát triển [23] PCA đã được báo cáo để tăng sự phát triển và ức chế quá trình apoptosis của tế bào thần kinh gốc

1.6.2 Axit béo

Axit béo là axit cacboxylic có mạch dài hydrocacbon (số Cacbon từ 12 đến 22) và gốc - COOH Công thức chung là R-(CH2)n-COOH Phản ứng với glycerol

Hình 1.4 Axit protocatechuic

13

để tạo thành lipid (chất béo hoà tan trong các thành phần của tế bào sống) Một số axit béo đã tìm thấy trong chi Kalanchoe là axit panmitic, axit arachidic, axit Behenic

Axit Arachidic, công thức phân tử C20H40O2, công thức cấu tạo:

CH3(CH2)18COOH Nó được sử dụng như một chất bôi trơn và là một chất nhũ hóa trong các chế phẩm công nghiệp Ngoài ra được sử dụng trong sản xuất dược phẩm,

xà phòng, mỹ phẩm, và đóng gói thực phẩm, được sử dụng như một chất làm mềm

và phân tán

Axit Behenic công thức phân tử: C22H44O2, công thức cấu tạo:

CH3(CH2)20COOH Nó thường được sử dụng làm kem dưỡng ẩm và làm mềm tóc Axit behenic cũng được sử dụng trong các loại dầu bôi trơn như chất hãm bốc hơi dung môi trong tẩy sơn Amide chống bọt trong sản xuất chất tẩy rửa, đánh bóng sàn và giảm sự chảy nhão của nến

Axit Panmitic công thức phân tử C16H32O2, công thức cấu tạo:

CH3(CH2)14COOH Thường sử dụng làm xà phòng, dầu nhờn, dầu thực phẩm Nó là một chất kích thích giúp ăn ngon miệng Trong cơ thể, axit béo bão hòa làm tăng huyết thanh lipoprotein dẫn đến cholesterol trong máu cao tuy nhiên axit béo thiết yếu được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chất nội tiết tố, như điều chỉnh một loạt các chức năng, bao gồm áp lực máu, đông máu, nồng độ lipid máu, đáp ứng miễn dịch, và phản ứng viêm nhiễm trùng vết thương

Khai thác axit béo: dựa vào tính chất không tan trong nước nhưng tan nhiều

trong dung môi không phân cực như ete dầu hỏa, hexan… Trong thực vật axit béo

có thể tồn tại dạng tự do hoặc dạng este Do đó ta sử dụng dung môi không phân cực chiết tách axit béo ở dạng tự do cũng như dạng este ra khỏi lá Sau đó sử dụng kiềm (KOH) chiết lại axit, este này đi vào pha nước dưới dạng muối Kali Sử dụng axit mạnh như H2SO4 đặc hoặc HCl đặc tách ra dưới dạng axit tự do không tan trong nước

1.6.3 Axit hữu cơ phân cực

Một số axit hữu cơ phân cực đã được tìm thấy trong lá sống đời là: Axit malic, axit citric, axit isocitric

14

1.6.3.1 Axit malic

Công thức phân tử: C4H6O5

Danh pháp: 2-hydroxibutan-1,4-dioic, công

thức cấu tạo như (Hình 1.5).Có vai trò quan trọng giúp

cây quang hợp trong bóng tối Ban ngày axit này sẽ

giúp cây quang hợp trong bóng tối và giảm dần, về đêm

cây sẽ tổng hợp lại axit này nên ta thường thấy buổi sáng lá sẽ rất chua và về chiều khi lượng axit này cạn lá sẽ hết chua và có vị chát Hóa sinh axit malic có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, bảo vệ gan, thận, tim mạch Ngoài ra còn có tác dụng tẩy

mờ vết thâm trên da do ánh sáng Trong công nghiệp thực phẩm axit malic thường được dùng tạo dư vị chua cho thực phẩm

1.6.3.2 Axit citric

Danh pháp: axit 3-hydroxipent-1,3,5-trioic

Axit citric có công thức phân tử: C6H8O7

Công thức cấu tạo như (Hình 1.6) Là một axit hữu

cơ yếu Nó sử dụng như một chất bảo quản tự nhiên

và cũng được sử dụng để bổ sung vị chua cho thực phẩm hay các loại nước ngọt Trong hóa sinh học, nó là tác nhân trung gian quan trọng trong chu trình axit citric

và vì thế nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần như mọi sinh vật Nó cũng được coi là tác nhân làm sạch về mặt môi trường và đóng vai trò của chất chống oxi hóa

Làm mềm nước: Khả năng của axit citric trong chelat các kim loại làm cho

nó trở thành hữu ích trong xà phòng và các loại bột giặt Bằng sự chelat hóa các kim loại trong nước cứng, nó làm cho các chất tẩy rửa này tạo bọt và làm việc tốt hơn

mà không cần phải làm mềm nước Theo kiểu tương tự, axit citric được dùng để tái sinh các vật liệu trao đổi ion dùng trong các chất làm mềm nước bởi nó kết tủa các ion kim loại đã tích lũy như là các phức chất citrat

Công dụng khác: Axit citric được sử dụng trong công nghệ sinh học và công

nghiệp dược phẩm để thụ động hóa các hệ thống ống dẫn cần độ tinh khiết cao (thay cho việc sử dụng axit nitric) Axit nitric bị coi là nguy hiểm và khó xử lý khi sử dụng cho mục đích này, trong khi axit citric thì không

Hình 1.5 Axit malic

Hình 1.6 Axit citric

15

Axit citric là thành phần hoạt hóa trong một số dung dịch tẩy rửa vệ sinh nhà bếp và phòng tắm Dung dịch với hàm lượng 6% axit citric sẽ loại bỏ các vết bẩn do nước cứng từ thủy tinh mà không cần phải lau chùi Trong công nghiệp nó được dùng để đánh tan lớp gỉ trên bề mặt thép

Axit citric được sử dụng phổ biến như là chất đệm để làm tăng độ hòa tan của heroin nâu Các túi nhỏ chứa axit citric sử dụng một lần cũng được sử dụng như

là tác nhân xui khiến để buộc những người dùng heroin phải đổi các kim bẩn của mình lấy các kim tiêm sạch nhằm làm giảm khả năng lan truyền AIDS và bệnh viêm gan Các chất axit hóa khác sử dụng cho heroin nâu là axit ascorbic, axit axetic

và axit lactic; khi không có chúng, những người sử dụng ma túy thường thay thế chúng bằng nước chanh hay dấm

Axit citric là một trong các hóa chất cần thiết để tổng hợp HMTD, một chất

nổ nhạy nhiệt, nhạy ma sát và nhạy va chạm tương tự như axeton peroxit

Axit citric cũng dùng nhiều trong sản xuất rượu vang như là chất thay thế hay bổ sung khi các loại quả chứa ít hay không có độ chua tự nhiên được sử dụng

Nó chủ yếu được sử dụng cho các loại rượu vang rẻ tiền do giá thành thấp của sản xuất

Khi sử dụng với tóc, axit citric mở lớp ngoài cùng (còn gọi là lớp cutin) ra Khi lớp cutin mở ra, nó cho phép có sự thâm nhập vào sâu hơn của các chất vào chân tóc Nó có thể được sử dụng trong một số loại dầu gội đầu để rửa sạch các chất sáp và thuốc nhuộm từ tóc

Axit citric cũng được sử dụng như là nước rửa lần hai (sau nước hiện hình) trong xử lý phim chụp ảnh trước khi dùng nước định hình Nước rửa đầu tiên thường hơi kiềm nên nước rửa có tính axit nhẹ sẽ trung hòa nó, làm tăng hiệu quả của việc rửa ảnh so với dùng nước thường

Axit citric cũng được dùng như là một trong các thành phần hoạt hóa trong sản xuất các mô kháng virus Axit citric cũng được sử dụng như là tác nhân làm chín chính trong các công đoạn đầu tiên trong sản xuất phó mát mozzarella

Vài lưu ý khi sử dụng: Axit citric được hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc

tế công nhận là an toàn để sử dụng trong thực phẩm Tuy nhiên, việc tiếp xúc với

16

axit citric khô hay đậm đặc có thể gây ra kích ứng da và mắt, vì thế bảo hộ lao động nên được sử dụng khi tiếp xúc với axit citric Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn hại men răng Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác Đôi khi hàm lượng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó mở lớp cutin của tóc Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc bị bạc màu.[26]

17

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Lá sống đời được hái tại xã Hòa Liên, huyện Hòa

lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối lượng của sản phẩm đem cân

dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phân tích.[1]

Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng:

- Chọn mẫu và gia công mẫu

- Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dưới trạng thái tinh khiết hoá học Tuy nhiên trong nhiều trường hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do đó chất cần xác định thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất có thành phần xác định Để làm được điều đó ta thực hiện như sau: đưa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch (làm phản ứng kết tủa hay điện phân)

- Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy ) rồi đem cân để tính kết quả

Áp dụng phương pháp trọng lượng để xác định các yếu tố sau:

2.2.1.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lượng không đổi

Độ ẩm % () của nguyên liệu ẩm:

100 m

m m

18

Trong đó, m0 : khối lượng tươi trước khi sấy

m1 : khối lượng lá sau khi sấy

2.2.1.2 Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu

Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung trong lò nung ở khoảng 8000C

Trong đó: m0 : khối lượng lá khô trước khi tro hoá (g)

m1 : khối lượng tro (g)

2.2.1.3 Xác định khối lượng các axit béo

Dựa trên cơ sở các axit béo không tan trong nước nên sẽ bị tách ra khỏi dung môi là nước và ta đem cân lượng axit béo đó

2.2.2 Phương pháp chiết tách

2.2.2.1 Chiết đơn giản một lần

Chiết đơn giản một lần nhiệt độ thường hay còn gọi chưng ninh, ngâm kiệt Khi sử dụng nhiệt độ cao ta đun nóng hợp chất với dung môi trong bình cầu có sinh hàn hồi lưu, lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi chắt Khi thao tác với những lượng chất nhỏ, ta dùng ống nghiệm có lắp sinh hàn ngón tay hoặc lắp ống sinh hàn không khí.[3]

Trong đề tài này phương pháp chưng ninh được sử dụng đối với lá sống đời tươi trong dung môi nước

Phương pháp ngâm kiệt: đối với lá sống đời khô trong dung môi ete

2.2.2.2 Chiết đơn giản, nhiều lần

Chiết nhiều lần có ưu điểm chiết kiệt hơn 1 lần Trong trường

hợp này ta thường sử dụng ống Soxhlet Nó bao gồm một bình cầu,

một thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lưu Dung môi ở trong

bình cầu được làm bốc hơi từng phần, dung môi được ngưng tụ nhỏ

vào chất được chiết đựng trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó lại

chảy vào bình Trong quá trình đó cấu tử cần được tách được làm

giàu thêm trong dung môi ở bình cầu

Hình 2.2 Soxhlet

19

Trong luận văn này phương pháp chiết Soxhlet được sử dụng đối với lá sống đời khô dung môi CHCl3 và lá sống đời tươi dung môi C2H5OH

2.2.3 Phương pháp chuẩn độ axit – bazơ

Nguyên tắc: Xác định hàm lượng axit tổng số trong lá sống đời theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88 [1] Nhỏ dung dịch NaOH 0,1N từ buret xuống dung dịch cần xác định đã tẩy màu và một ít phenolphtalein cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững

2.2.4 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)

 Định nghĩa

Cơ sở để tách sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha Một pha tĩnh

có bề mặt tiếp xúc lớn và pha động là khí thấm qua bề mặt pha tĩnh đó Nếu pha tĩnh là rắn gọi là sắc kí khí rắn (gas solid chromatography – GSC), quá trình này chủ yếu là hấp phụ Nếu pha tĩnh là lỏng có sắc kí khí – lỏng (gas liquid chromatography – GLC), chất lỏng bọc quanh một chất rắn trơ gọi là chất mang tạo nên một lớp phim mỏng Cơ sở cho sự tách ở đây chính là phân bố của mẫu trong

và ngoài lớp phim mỏng.[4]

 Ứng dụng

- Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C Không biến đổi cấu trúc khi nhiệt lên đến dưới 3000C;

- Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp;

- Được ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau

 Chu trình hoạt động

Mẫu (sample) phân tích được chạy theo chu trình Hình 2.3

- Đưa vào bộ phận nạp mẫu (heated injector)

- Di chuyển qua một cột phân tách (seperating column) nhờ một dòng khí mang trơ (inert carrier gas)

- Phát hiện và ghi lại dưới dạng các peaks khi các cấu tử đi ra khỏi cột

Có nhiều cột tách khác nhau thỏa mãn mục đích nghiên cứu khác nhau

- Cột nhồi (packed column): Chất hấp phụ nhồi vào cột Sử dụng cho lượng

mẫu lớn Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh Trong cột nhồi kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải Kích thước hạt nhỏ cải thiện hiệu quả cột

- Cột mao quản (open-tubular): Pha tĩnh phủ vào mặt trong cột Sử dụng

dung lượng thấp mẫu Cột mao quản có độ phân giải cao hơn, thời gian ngắn hơn độ nhạy cao hơn cột nhồi Tuy nhiên cột mao quản nạp mẫu khó khăn

* Detector khối phổ (MS)

Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính, định lượng cho các chất sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng Chất nghiên cứu được ion hoá trong pha khí

21

ngưng tụ dưới chân không bằng những phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e

gọi là khối phổ đồ Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong

đó cường độ các vạch được đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường độ cao nhất Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát.[3]

22

Chuẩn độ bằng NaOH 0,01N

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

3.1.1 Xử lý nguyên liệu, xác định tổng axit trong lá sống đời tươi, khô bằng phương pháp chuẩn độ và cân

Tẩy màu bằng than hoạt tính

Xác định axit phân cực

Xác định axit phân cực

+ KOH 0,1N, đun 2 giờ, ngâm 1 ngày

Lọc lấy dịch

Axit hóa HCl đặc

Xác định axit béo

độ ẩm

23

Lá khô

Ngâm kiệt, ete dầu

hỏa, 10 ngày đêm,

nhiệt độ phòng

Chiết kiệt bằng KOH 0,5N

Axit hóa bằng HCl đặc

Xác định axit phân cực

Chiết kiệt bằng KOH 0,5N

Lắc kĩ với CHCl3 nhằm chuyển RCOOH vào CHCl3

Đuổi hết dung môi CHCl3 Hòa cặn vào H2O cất

Xác định axit béo

Chuẩn độ phần dịch

Axit hóa bằng HCl đậm đặc dư

Chiết kiệt bằng etyl axetat

Chạy phổ GC-MS- Mẫu 2

Dịch chiết chưng ninh với H2O

Kháng vi khuẩn, kháng nấm

Chống oxi hóa Peroxydaza

25

3.2 TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM

3.2.1 Thu nguyên liệu

Cây được lấy tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

Cách lấy lá: chọn lá còn nguyên không bị dập, rách Lá còn mọng nước, lá màu xanh thẫm, mép và cuống lá màu tím Hái lá vào buổi sáng sớm

Bảo quản: Lá đựng trong thùng giấy, không ẩm ướt và khi chuyên chở tránh

va đập mạnh làm dập lá

3.2.2 Xử lí nguyên liệu

Lá tươi: Nguyên liệu được chuẩn bị trước

mỗi lần chiết Thu hái lá vào buổi sáng sớm, lá

tươi, màu xanh thẫm, bỏ lá vàng úa và chọn

những lá có kích cỡ và màu sắc gần như nhau

Loại bỏ sơ bộ những tạp chất bằng cách cho lá

vào một chậu rửa lớn và cho nước vào ngập lá Dùng tay vuốt trên từng mặt lá, rửa lại 3 lần rồi vớt lá ra rổ có lỗ to để rút hết nước Lá tươi sau khi rửa sạch thì được cắt nhỏ dọc theo sống lá tạo mẫu hình sợi để khi chiết dịch ra triệt để hơn

Lá khô: Nguyên liệu ban đầu là lá tươi đã rửa

sạch Sấy khô trong 800C ở 10 phút để loại men, sau

đó sấy ở 600C cho đến khô Làm nguội trong bình

hút ẩm Bảo quản trong hộp nhựa cho những lần

Cách tiến hành: Để xác định độ ẩm trong lá sống đời thì sau khi thu hái về

ngoài việc loại bỏ những lá bị hư tổn, ta chỉ chọn những lá già vừa phải, không quá non, có màu xanh thẫm

Hình 3.1 Lá sống đời tươi, cắt nhỏ

Hình 3.2 Bột lá sống đời sấy khô, xay nhỏ

3.2.3.2 Xác định hàm lượng tro trong lá sống đời

Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích

Cách tiến hành: Cân khoảng 5g lá đã được sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô

và biết chính xác khối lượng Cho cốc sứ có chứa lá vào lò nung và tăng dần nhiệt

độ, nhiệt độ nung sau cùng ở 800oC Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, ta thấy lá

đã được tro hoá gần như hoàn toàn Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lượng Sau cân 30 phút ta tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá Hàm lượng tro trong lá khô được tính theo công thức ở mục 2.2.1.2

3.2.4 Xác định tổng lượng axit hữu cơ

Lá tươi: Để tăng diện tích tiếp xúc của lá với dung môi cho quá trình chiết tách đạt hiệu suất cao, lá được rửa sạch, để ráo tự nhiên, cắt khúc, chẻ nhỏ dọc theo sống lá tạo mẫu hình sợi Vì lá tươi rất mọng nước nên sau khi cắt sợi ta giã dập bằng chày sứ Làm như vậy thì chiết được hầu hết các chất trong lá

Lá khô: Lá tươi sau khi tuyển chọn, làm sạch, sấy trong tủ sấy ở nhiệt 800C trong vòng 10 phút để khử hết men, sau đó sấy ở 600C trong vòng khoảng 72 giờ cho đến khi lá khô, giòn tan Làm nguội trong bình hút ẩm, bảo quản trong bình khô, kín gió

27

3.2.4.1 Chiết Soxhlet trong dung môi C 2 H 5 OH

Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá tươi đã rửa sạch để ráo nước tự nhiên, lá được cắt sợi, gói vào giấy lọc, cho vào phần thân Soxhlet Cho 200ml

C2H5OH vào bình cầu, lắp sinh hàn cẩn thận, chiết trong 8 giờ, bằng bếp điện Thu

được dịch màu xanh đậm và bã màu trắng (Hình 3.3)

Dịch chiết được cô cạn bay bớt dung môi, sau đó thêm H2O cất cho đạt thể tích khoảng 150ml và khoảng 4g bột mịn than hoạt tính đã hoạt hóa ở 500C trong 6 giờ Ngâm hỗn hợp trên trong nước ấm khoảng 30 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1, than hoạt tính được rửa lại 2 lần bằng nước cất để thu hồi hết axit

Kết quả dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn (Hình

3.4) Dịch chiết được trộn chung và định mức thể tích xác định 200ml Chuẩn độ

dịch trên với NaOH 0,01N để xác định axit phân cực

Bã sau khi chiết với cồn, ngâm trong 50ml dung dịch KOH 0,1N khuấy đều, đun trong 2 giờ rồi ngâm trong 1 ngày đêm Lọc bỏ bã bằng giấy lọc, cô cạn còn khoảng 20ml, để nguội Axit hóa bằng HCl đậm đặc đến dư Làm lạnh, để qua đêm, lọc trên phễu buchner sử dụng giấy lọc Whatman No1, rửa kết tủa bằng nước lạnh, làm khô, cân xác định được khối lượng axit béo

Hình 3.3 Bã rắn, dịch trước tẩy màu Hình 3.4 Dịch chiết sau khi tẩy màu

28

3.2.4.2 Chưng ninh trong H 2 O

Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá tươi đã rửa sạch để ráo tự nhiên, lá được cắt sợi dọc theo sống lá, giã dập cho vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô Thêm 200ml H2O cất, lắp sinh hàn hồi lưu, chưng ninh trong 8 giờ ở nhiệt

độ 900C bằng bếp điện, lọc thu lấy dịch chiết Ta được dịch màu vàng nâu (Hình

3.5) và bã

Dịch chiết thêm khoảng 4g than hoạt tính đã hoạt hóa Ngâm hỗn hợp trên trong nước ấm khoảng 30 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1, than hoạt tính được rửa lại 02 lần để thu hồi hết axit Kết quả dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn Dịch chiết được trộn chung và định mức thể tích xác định 200ml Chuẩn độ dịch trên với NaOH 0,01N nhằm xác định axit phân

cực mạnh (Hình 3.6)

Bã được ngâm trong 50ml dung dịch KOH 0,1N khuấy đều, đun trong 2 giờ, nhiệt khoảng 600C rồi ngâm trong 1 ngày đêm Sau đó lọc bằng giấy lọc Cô cạn còn khoảng 30ml, để nguội, thêm HCl đặc đến dư vào Làm lạnh, để qua đêm, lọc trên phễu buchne sử dụng giấy lọc Whatman No1, rửa kết tủa bằng nước lạnh, làm khô, cân xác định được khối lượng axit béo

Hình 3.5 Dịch sau chưng ninh Hình 3.6 Dịch axit chuẩn độ bằng NaOH