Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong cao chiết n hexane lá cây tầm gửi trên cây khế chua

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM7rQÿӅWjL: “Nghiên cứu chiêt tách và xác định thành phần hóa học trong cao chiết n-hexane của lá tầm gửi trên cây khế chua”..

TÆ Ғ M GѬ Ѵ I TRÊN CÂY KHÇ ғ CHUA

.+Ï$/8Ұ17Ӕ71*+,ӊ3

&Ӱ1+Æ1+Ï$+Ӑ&

CHUYÊN NG$ Ғ 1+6Ѭ3+ $ҕ M H2 ғ A

Ĉj1ҹQJ - 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

7rQÿӅWjL: “Nghiên cứu chiêt tách và xác định thành phần hóa học trong cao

chiết n-hexane của lá tầm gửi trên cây khế chua”

+ Thiết bi sặ́c ký ghép khối phổ 7890A/5975C, Agilent technology, USA

(Trung tâm ky thuẫ t tiêu chuậ ̉n đo lương chất lượng 2 – Đà Nẵng)

PGS.TS Lê Tự Hải GS.TS Đao Hùng Cương

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày 22 tháng 04 năm 2018Kết quả điểm đánh giá:…….

&+Ӫ7ӎ&++Ӝ,ĈӖ1*

LӠI CҦ0Ѫ1

Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo GS.TS Đao Hùng Cương đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn và các thầy cô phụ trách

phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã nhiệt

tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong thời gian vừa qua

Bước đầu làm quen với việc nghiên cứu nên bài báo cáo này không tránh

khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp, bổ sung của thầy cô

để em có thể thu nhận thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm cho bản thân sau này

Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô sức khỏe, hạnh phúc và thành công

trong cuộc sống cũng như sự nghiệp giảng dạy của mình Em xin chân thành cảm

ơn

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2018 Sinh viên

Trk Ғ n ThL ThX ҕ c HD ҕ nh ҕ

M8 C L8 ҕ C ҕ

MѪ Ѵ ĈÆ Ғ U 1

&+ѬѪ1* TÐ Ѵ NG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ TẦM GỬI 4

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY TẦM GỬI 4

1.2.1 Tên gọi 4

1.2.2 Mô tả thực vật 4

1.2.3 Phân bố và cách trồng 5

1.3 CÔNG DỤNG VÀ CÁCH SỬ DUNG CÂY TẬ ̀M GỬI 6

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỌ TẦM GỬI 7

1.4.1 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 7

1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 8

&+ѬѪ1* 3+ѬѪ1*3+ $ғ P NGHIÊN CѬ ғ U V$ Ғ THѬ C NGHIÇ ҕ M 10 ҕ 2.1 NGUYÊN LIÊU, DỤ NG CỤ , HỌ ́A CHẤT 10

2.1.1 Nguyên liêu 10 ̣

2.1.2 Thiết bi, dụng cụ , họ ́a chất 10

2.1.3 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiêm 12 ̣

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGÂM DẦM TAO TỘ ̉NG CAO ETHANOL TỪ BÔT ̣ CÂY TẦM GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA……… ………13

2.2.1 Nguyên tắc 13

2.2.2 Cách tiến hành 13

2.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG TỪ TỔNG CAO ETHANOL 13

2.3.1 Nguyên tắc 13

2.3.2 Cách tiến hành 14

2.4 PHÂN LÂP PHÂN ĐỌ ẠN BẰNG SẮC KÝ CÔT VẠ ̀ SẮC KÝ BẢN MỎNG 14

2.4.1 Sắc ký côt 14 ̣

2.4.2 Sắc ký bản mỏng 16

2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN NHÓM CHỨC TRONG

DICH CHIỆ ́T 21

2.6 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC/MS 24 2.6.1 Nguyên tắc 24

2.6.2.Cấu tao thiệ ́t bi 25 ̣

2.6.3 Chương trinh chay GC/MS 26 ̣

&+ѬѪ1* KÇ ғ T QU$ Ѵ V$ Ғ TH$ Ѵ O LUÆ N 288 ҕ 3.1 KẾT QUẢ ĐIỀU CHÉ TỔNG CAO ETHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM CHIẾT 288

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DICH CHIỆ ́T N-HEXAN TỪ CAO TỔNG ETHANOL CỦA LÁ CÂY TẦM GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA 29

3.2.1 Kết quả chiết phân bố lỏng–lỏng tổng cao ethanol băng n-hexan 29

3.2.2 Định tính và định danh thành phần hóa học các chất trong phân đoạn cao hexane tách từ tổng cao ethanol 300

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LÂP PHÂN ĐỌ ẠN CAO N-HEXANE TỪ TỔNG CAO ETHANOL CỦA CÂY TÂM GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA 39

3.3.1 Kết quả chay sặ ́c ký côt cao n-hexane (13,45g) tạ ́ch từ tổng cao ethanol 39 3.3.2 Kết quả chạy sắc ký cột phân đoạn TH.I (3,718g) 422

3.3.3 Định danh thành phần hóa hoc trong phân đọ ạn TH.I1 466

.ӂ7/8Ұ19¬.,ӂ11*+ӎ 499

'$1+0Ө&7¬,/,ӊ87+$0.+Ҧ2 50

DANH M8 C C$ ҕ ғ C CHѬѺ VIÇ ғ T TĂ ғ T

GC : Gas Chromatography

MS : Mass Spectrometry STT : Số thứ tựTCCS : Tiêu chuẩn cơ sởUSA : The United States of America

C : Chloroform

D : Dichloromethane

DANH M8 C C$ ҕ ғ C B$ Ѵ NG S{ ғ

hir u ҕ Tên bD Ѵ ng Trang

2.1 Các hóa chất đã sử dụng 10

3.1 Thể tích dịch chiết ethanol sau khi ngâm chiết 28

3.2 Khối lượng cao thu được sau khi cô quay chân không dịch

3.3 Khối lượng cao thu được sau khi cô quay chân không dịch

3.4 Thành phần nhóm chức trong cao chiết n- hexane 31

3.5 Tổng hợp kết quả định tính thành phần hóa học trong cao

3.6 Thành phần hóa học chính của dịch chiết lá tầm gửi trong

3.7 Thành phần hóa hoc trong phân đọ ạn TH.I1 46

DANH M8 C C$ ҕ ғ C H, Ғ NH S{ ғ

hir u ҕ Tên hÕ Ғ nh Trang

1.1 Lá, hoa, quả của cây Tâm gửi 5

1.2 Cấu trúc quercitrin và querceti 7

1.3 Cấu trúc hơp chậ ́t MM1 và MM2 8

2.1 Cây tầm gửi tươi được thu hái, phơi khô va nghiền bôt ̣ 10

2.2 Thiết bi sặ́c ký ghép khối phổ 7890A/5975C, Agilent technology,

USA

11

2.3 Đèn soi sắc ký bản mỏng model: WFH – 203B 12

2.4 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiêm ̣ 12

2.5 Hôp bạ ̉n mỏng có kích thươc 20 x 20 cm 18

2.6 Bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy18

2.7 Sơ đô thiết bi sặ́c ký khí ghép khối phổ 25

2.8 Chương trinh nhiêt đ̣ộ lò côt ̣ 27

3.1 Mẫu dịch chiết ethanol (5 ml) sau mỗi lần thay dung môi28

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với các dung môi đơn n-hexane,

dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol (từ trái sang phải)

39

3.6 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi diclomethane:

chloroform theo các tỉ lệ 2:8, 4:6, 6:4, 8:2 (từ trái sang phải)

40

3.7 Cột sắc ký (d=4,5cm, h=50cm) va các lọ dung dịch hứng (15ml) 40

3.8 Các vết chất trên bản mỏng của lo 1 đ̣ ên lo 87 ̣ 41

3.9 Các vết chất trên bản mỏng của lo 88 đ̣ ên 183 41

3.10 Các vết chất trên bản mỏng của lo 184 đ̣ ên lo 269 ̣ 41

3.11 Các vết chất trên các bản mỏng của phân đoạn TH.I, TH.II,

42

3.13 Cột sắc ký (d=3,5cm, h=50cm) và các lọ dung dịch hứng (15ml)43

3.14 Các vết chất trên bản mỏng của lo 1 đ̣ ên lo 35 ̣ 44

3.15 Các vết chất trên bản mỏng của lo 36 đ̣ ên 88 44

3.16 Các vết chất trên bản mỏng của lo 89 đ̣ ên lo 115 ̣ 44

3.17 Các vết chất trên các bản mỏng của phân đoạn TH.I1, TH.I2,

TH.I3 (từ trái sang phải)

45

3.18 Sơ đồ phân lập phân đoạn cao n-hexane 45

3.19 Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn TH.I1 từ lá cây tầm gửi46

MѪ Ѵ ĈÆ Ғ U

1 L\ ғ do chR Qÿ ҕ r tD Ғ i

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng nguyên liệu từ thiên nhiên để làm thuốc

chữa bệnh Nguyên liệu từ thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng, mỗi loài cây

có những đặc tính và tác dụng khác nhau Qua nhiều thế kỉ, bằng kinh nghiệm dân gian và dựa trên nhiều thành tựu nghiên cứu khoa học hiện đại, Y dược học cổ

truyền đã xây dựng nên một hệ thống các chế phẩm thảo dược có giá trị to lớn,

chiếm vị trí quan trọng trong nền y học nước ta Đa số các chế phẩm này là hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hóa học mà trong đó hợp chất có hiệu lực chủ yếu

trong quá trình điều trị lại chưa được phân lập và xác định Do đó, hướng nghiên

cứu thành phần hóa học các thảo dược là công việc quan trọng có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn cao hiện nay

Tầm gửi là môt loạ ̀i cây rất quen thuôc vợ ́i con ngươi và nó cũng được sử

dung rộ ng rạ ̃i trong dân gian đê chữa nhiều loai bệ nh khạ ́c nhau Từ nhiều thế kỷ

trươc, tầm gửi được sử dung đ̣ ê chữa tai biến mach mạ ́u, đau đâu và môt sộ ́ bênh ̣

khác, ngoài ra tầm gửi còn được sử dung đ̣ ê chữa ung thư tại các nươc châu Âu [6]

Qua tìm hiểu thì hiên nay trên thệ ́ giới đã có nhiều nghiên cứu về cây tầm gửi ký

sinh trên các loai thự c vậ t khạ ́c nhau như tâm gửi cây mít, tầm gửi cây gao, tậ ̀m gửi

cây nghiến,… Tuy nhiên các công trình nghiên cứu về tầm gửi cây khế vẫn còn han ̣

chế măc dụ ̀ theo kinh nghiêm dân gian thị ̀ tầm gửi cây khế có tác dung chự ̃a sốt, sốt

rét, ho gà Việc nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, ứng dụng các

phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của tâm

gửi cây khế là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và

thực tiễn cao Vì vậy, để lam đa dạng hơn vê nghiên cứu thành phần hóa hoc cụ ̉a

loài cây này, chúng tôi đã chọn đê tài: ³ 1JKLrQFӭXFKL r t tD ғ ch vD Ғ xD ғ Fÿ Lҕ nh thành

SKҫQKyDKӑFFDRFKL r t n-hexane cX Ѵ a lD ғ tk Ғ m gѭ Ѵ i cây khr ғ chua ѫ Ѵ Liên Chir Ѵ XĈ D

Nă Ѻ ng´, với mục tiêu đóng góp một phần tư liệu vào hệ thống các công trình khoa

học về loài cây này

2 MX Fÿ ҕ Õ ch nghiên cѭ ғ u

- Xác định được thành phần hóa hoc cạ ́c chất có trong cao chiết n-hexan của lá

tầm gửi trên cây khế chua

- Phân lâp phân đọ ạn môt sộ́ chất có trong cây tầm gửi trên cây khế chua

- Tham khảo các công trình nghiên cứu trong và ngoài nươc về loài nghiên cứu

- Thu thâp, tộ ̉ng hơp, phân tị ́ch các tài liêu, tư lị ệu về đặc điêm hình thái thưc ̣

vât, nguộ ̀n nguyên liêu, thạ ̀nh phân hóa hoc, ự́ng dung cụ ̉a lá tầm gửi trên cây khếchua

- Tổng hơp tạ ̀i liêu vệ ̀ phương phap lấy mẫu, chiết tách, phân lâp vạ ̀ xác định thành phần hóa hoc cạ ́c chất từ thưc vậ t ̣

b) 3KѭѫQJSK D p nghiên cѭ ғ u thѭ c nghir ҕ m ҕ

- Xử lí mẫu: cây tầm gửi được rửa sach, phơi khô ṿ a xay nhỏ

- Phương phap sắc kí khí – khối phổ liên hơp (GC/MS) dụ ̀ng đê xác định các thành phần có trong dich chiệ ́t khi chiết lỏng – lỏng cao chiết ethanol với dung môi n-hexan

- Phân lâp phân đọ ạn môt sộ́ chất trong dich chiệ ́t lá tầm gửi trên cây khế chua

bằng phương phap sắc ký côt, sặ ́c ký lớp mỏng

5 < ғ nghÕ a khoa hR Ѻ c vD ҕ Ғ thѭ c tir ҕ n cX Ѻ Ѵ Dÿ r tD Ғ i

Cung cấp có thông tin có ý nghia khoa hõ c vệ ̀ thành phần được chiết tách từ loài

Loranthaceae và qua đo nâng cao giá tri ự́ng dung cụ ̉a chúng trong ngành dược liêu ̣

6 B{ ғ cX c khR ҕ ғ a luk n ҕ

Luân văn g̣ ôm 50 trang, 9 bảng, 30 hình, 22 tài liêu tham khạ ̉o Ngoài phần mở

đầu (3 trang) và kết luân, kiệ ́n nghi (3 trang), nộ i dung chị ́nh gồm các phần sau: Chương 1 Tông quan (5 trang)

Chương 2 Nguyên liệu và phương phap nghiên cứu (18 trang)

Chương 3 Kêt quả và thảo luân (20 trang) ̣

TÐ Ѵ NG QUAN

1.1 GIӞI THIӊU Vӄ HӐ TÆ Ғ M GѬ Ѵ I

Ho tậ̀m gửi, tằm gửi, chùm gởi hay chùm gửi (Loranthaceae) là môt họ thự c ̣

vât cọ ́ hoa, được các nhà khoa hoc công nhậ n rộ ng khặ ́p Trên thế giới hiên cọ ́

khoảng 60-68 giống và 700-950 loài tâp trung chụ ̉ yếu ở vùng nhiêt đ̣ơi và vùng cân ̣

nhiêt đ̣ơi [17] , [1] Hầu hết các loài tầm gửi đêu sống bán ký sinh trên những cây

khác ngoai trự ̀ 3 loài sống trên măt đ̣ât là Nuytsia Floribunda – cây giáng sinh của

Australia, Atkinsonia ligustrina – môt loạ ̀i cây bui rậ́t hiếm của dãy núi Blue tai ̣

Australia và môt loạ ̀i ở Nam Mỹ là Gaiadendron punctatum Các loài sống ký sinh

trên cây khác tuy có lá xanh có thể quang hơp đự ợc nhưng cây không vận dung khạ ̉

năng nay mà lai sộ ́ng nhờ ký sinh trên cây khác bằng những rễ mút thoc sâu hụ ́t

nhưa cây chụ ̉ [7]

Ĉ Ҥ,&ѬѪ1*9 ӄ CÂY TÆҒ M GѬ Ѵ I

1.2.1 Tên gӑ i

Tên khoa học: Taxillus chinensis (DC.) Danser

Tên thông thường: Tầm gửi, Mộc vệ trung quốc, Chùm gửi

Theo phân loại thực vật:

Loài cây này là loài thực vật có hoa, bán ký sinh trên các loài khác, chúng có

lá xanh để tự quang hợp và bộ rễ sống bám chặt vào vỏ thân cây chủ để cố định sinh trưởng Cây tầm gửi là cây gỗ, có bụi hoặc cây bụi nhỏ, một vài trường hợp dây leo

Cành: thân gỗ, cành có đôt, không có lông hoăc lông tơ, nḥ anh cây non có

lông vàng sau đo không lông

Lá: lá dày, moc đ̣ôi xứng nhau hoăc so le, cuộ ́ng lá thương không rõ ràng,

phiến lá đơn, hinh bầu duc, gân lạ ́ thương có hình lông chim, lúc non có lông ở gân

[5]

Hoa: Hoa lưỡng tính, ít khi đơn tinh, khoảng 4 – 6 cánh hoa, đôi xứng hai bên

hoăc đ̣ôi xứng tỏa tia, nhi hoa nhiệ ̀u bằng cánh hoa, moc đ̣ôi nhau, vòi nhuỵ ngắn

hoặc không có

Quả: Cây tầm gửi có thể là cây cái (tao quạ ̉ mong) hoặ c cây đ̣ ực (chỉ tao ra ̣

phấn hoa) Quả mong cụ ̉a cây cái thì nhỏ, vỏ thường có chất dính giúp cho việc phát

tán trên thân cây chủ va có màu hơi vang

Rễ: Không rễ hoặc có rễ (đúng hơn là giác mút), nửa ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây chủ, ít khi ký sinh trên rễ của cây chủ

Hat: Hầu hết hạt của các loại tầm gửi đều được phủ bởi 1 lớp chất lỏng sền sệt ̣trên bề mặt, điều này cho phép chúng bám được trên cây chủ, hạt có vỏ ngoài khó

nhìn thấy, nôi nhụ ̃ nhiều, phôi to [13], [17]

Hình ảnh lá, hóa và quả của cây tầm gửi được thể hiên ợ̉ Hình 1.1

Hình 1.1 Lá, hoa, quả của cây Tâm gửi (Nguồn: Internet)

1.2.3 Phân bӕ và cách trӗ ng

Phân bố

Tầm gửi phân bố chủ yếu ở vùng nhiêt đ̣ơi và cân nhiệ t đ̣ơi Ở châu Á, tầm gửi

phân bố chủ yếu ở Bắc Philippin, Malaysia, Trung Quốc và Viêt Nam [15] ̣

Cách trồng

Với việc trồng cây tầm gửi nên được thực hiện vào các tháng mùa xuân (tháng 3-5) là thích hợp nhất cho tầm gửi phát triển.Sau khi trồng thì việc chăm sóc cây

tầm gửi thường có liên quan chặt chẽ với việc chăm sóc cây chủ Chính vì thế tùy

vào từng loại cây chủ bạn trồng tầm gửi mà có chế độ chăm sóc phù hợp sẽ giúp

tầm gửi bên trên phát triển một cách tốt nhất

1.3 CÔNG D8 NG V$ ҕ Ғ C$ ғ CH SѬ Ѵ D8 NG CÂY TÆ ҕ Ғ M GѬ Ѵ I

Hầu hết các bộ phận của tầm gửi đều có công dụng chữa bệnh Trong y học

cổ truyền người ta sử dụng các thành phần của lá tầm gửi để chữa một số bệnh Cây

tầm gửi ký sinh trên các cây chủ khác nhau thì có khả năng chữa các bênh khạ ́c

nhau

- Tầm gửi trên cây dâu tằm: tên thuốc là tang ký sinh có vị đắng, có tác dụng

trừ phong thấp, mạnh gân cốt, dùng khi chức năng can thận kém dẫn đến đau lưng

mỏi gối Dùng riêng bằng cách rửa sạch, phơi khô, chặt thành đoạn, sao vàng, sắc

uống; hoặc phối hợp với các vị thuốc bổ can thận khác như tục đoạn, cẩu tích, đau

xương, tang chi

- Tầm gửi cây chanh dùng trị các chứng ho khan, ho gió, ho có đờm đặc Khi

dùng thường cũng sao chế như tang ký sinh, có thể phối hợp với các vị trị ho khác

như trần bì, tang bạch bì, xạ can, mạch môn dưới dạng thuốc sắc, siro hay viên

ngậm

- Tầm gửi cây na, cây tầm gửi trên cây mít còn dùng trị bệnh sốt rét hoặc

chứng “hàn nhiệt vãng lai”, tức bệnh có lúc sốt, lúc rét Có thể phối hợp với thanh hao, sài hồ, hoàng cầm, thảo quả, binh lang

- Tầm gửi cây dẻ trị thấp khớp, viêm họng, các bệnh dị ứng, bệnh ngoài da

- Tầm gửi trên cây xoan chữa bệnh đường ruột, kiết lỵ, táo bón

- Tầm gửi trên cây cúc tần cho hạt là vị thuốc thỏ ty tử tác dụng bổ thận tráng

dương, chữa di tinh, liệt dương, tiểu dầm : hạt tơ hồng (thỏ ty tử) 8g, thục địa 16g,

lục giác giao, đỗ trọng, mỗi vị 12g, kỷ tử, nhục quế, mỗi vị 10g, sơn thù du, phụ tử chế, đương quy, mỗi vị 8g Ngày một thang, dạng thuốc sắc

- Tầm gửi trên cây gạo có tác dụng tốt để điều trị viêm cầu thận, phù thận, sỏi

thận, chức năng gan yếu, gan nóng; đặc biệt làm tăng khả năng thải độc của gan

trúc đào, thông thiên [12]

1.4 NGHIÊN CӬU Vӄ THÀNH PHҪN HÓA HӐC CӪA HӐ TÆ Ғ M GѬ Ѵ I

1.4.1 Các công trình nghiên cӭu trên thӃ giӟi

Năm 2006, nhóm tác giả người Indonesia gồm Nina Artani, Yelli Ma’arifa và

Muhammad Hanafi đã tách được hợp chất chống oxy hóa là quercitrin (C21H20O11)

và querceti (C15H10O7) từ cao ethanol của cây Tâm gửi Năm nhị Dendrophthoe

pentandra (L.) Miq ký sinh trên cây Khế ( Averrhoa carambola) [19] Cấu trúc của

quercitrin và querceti được thể hiên ợ̉ Hình 1.2

HÕ nh 1.2 Câ Ғ ́u trúc quercitrin và querceti Tháng 3 năm 2011, nhóm tác giả người Indonesia gồm Wahyu Widowati,

Tjandrawati Mozet, Chandra Risdian, Hana Ratnawati, Susy Tjahani, và Ferry

Sandra đã so sánh tính chống oxy hóa và đặc tính ức chế sinh trưởng dòng tế bào ung thư T47D của cao ethanol từ Trầu không Piper betle L., Dừa cạn Catharanthus

roseus (L.) G Don, Tầm gửi Năm nhị Dendrophthoe pentandra L., và Nghệ

Curcuma mangga Val Nhóm nghiên cứu đã sử dụng lá P betle, rễ C roseus, lá và

cành nhỏ của D pentandra ký sinh trên cây xoài, thân rễ (củ) của C mangga làm

vật liệu Kết quả cho thấy P betle là nguồn dược liệu thiên nhiên đầy hứa hẹn về

khả năng chống oxy hóa và ức chế tăng trưởng tế bào ung thư, cao ethanol của C

roseus có thể ức chế tăng trưởng tế bào ung thư nhưng không có hoạt tính chống

oxy hóa, cao 6 ethanol của C mangga không chứa cả hai hoạt tính trên Xét riêng

cao ethanol của Tâm gửi Năm nhị D pentandra, thấy rằng D pentandra có hoạt

tính kháng tế bào ung thư rất thấp, thậm chí không có Kết quả này kiểm chứng nghiên cứu trước đây với nước sắc thô của D pentandra trên đối tượng chuột đã

được xử lý với dimetilaminobenzena (DAB) – chất gây ung thư, kết quả cho thấy

không tác dụng (Windarti, 1990), chất querceti ly trích từ D pentandra cũng không

có hoạt tính kháng ung thư theo phương pháp BST (Brine Shrimp Letahlity Test)

(Dewiyanus, 1996), nhưng cao dichlorometan của D pentandra thử nghiệm trên ấu

trùng tôm A salina trong 24 giờ lại cho kết quả là có hoạt tính kháng tế bào ung thư

(Wahjudi, 1996) Bằng các phương pháp khác nhau, nhóm nghiên cứu cho thấy D

pentandra có hoạt tính chống oxy hóa rất cao, tương đương với acid ascorbic và

querceti [22]

1.4.2 Các công trình nghiên cӭu tҥ i ViӋ t Nam

Những nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, thời gian qua có một số công

trình nghiên cứu về Tầm gửi năm nhị đã được công bố Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Hạt đã tách được 2 hợp chất là β-sitosterol, β-sitosteryl

arachidate từ lá Tầm gửi Năm nhị ký sinh trên cây Mít (Artocarpus heterophyllus

Lamk.) Đây là lần đầu tiên hợp chất β-sitosteryl arachidate được cô lập trong chi

Dendrophthoe [3] Dung dịch của β-sitosteryl arachidate ở nồng độ 10-3 M đến 10

-4 M được biết có tác dụng bảo vệ tế bào MT-4 khỏi sự tấn công của virut HIV [14]

Cấu trúc của β-sitosterol, β-sitosteryl arachidate được thể hiên ợ̉ Hình 1.3

HÕ nh 1.3 Câ Ғ ́u trúc hơp chậ ́t β-sitosterol, β-sitosteryl arachidate

Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và cộng sự nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

loài này; bước đầu cho thấy cao ethyl acetate được điều chế từ Dendrophthoe

pentandra ký sinh trên cây Xoài (Mangifera indica) có hoạt tính kháng khuẩn đối

với Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus kháng methycilin

(MRSA) ATCC 43300 và Bacillus subtilis PY 79 ở nồng độ 1024 µg/ml [8]

Năm 2011, Phạm Văn Ngọt và cộng sự cho biết:

- Nước sắc của loài Tâm gửi Năm nhị ký sinh trên cây Mít, Xoài, Dâu Tằm

không có khả năng kháng Escherichia coli, Klensiella pneumoniae

- Nước sắc loài Tâm gửi Năm nhị ký sinh trên cây Dâu tằm có hoạt tính kháng

Bacillus subillis, Staphylococus aureus ở mức yếu; không có hoạt tính kháng

Pseudomomas aeruginosa

- Nước sắc loài Tâm gửi Năm nhị ký sinh trên cây Mít, Xoài có hoạt tính

kháng khuẩn Bacillus subillis ở mức yếu; kháng Staphylococus aureus và

Pseudomomas aeruginosa ở mức trung bình.

- Cao khô li trích từ loài Tâm gửi Năm nhị kí sinh trên cây Mít, Xoài, Dâu

tằm ở nồng độ 1.000µg/ml đều có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, dòng tế bào ung thư phổi NIC – H460 và tế bào ung thư vú MCF – 7 [4]

&+Ѭ Ѫ1*

3+ѬѪ1*3+ $ғ P NGHIÊN CѬ ғ U V$ Ғ THѬ ҕ C NGHIÇ M ҕ

2.1 NGUYÊN LIÇ U, D8 ҕ NG C8 ҕ , H2 ҕ ғ A CHÆ ғ T

2.1.1 Nguyên lir u ҕ

Cây tầm gửi (họ Loranthaceae) được thu hái tai quậ n Liên Chiệ ̉u, thành phố

Đà Nẵng Nguyên liêu sau khi thu hạ ́i, phơi khô, nghiên bôt đự ợc thể hiên ợ̉ Hình

2.1

HÕ nh 2.1 Cây tâ Ғ ̀m gửi tươi được thu hái, phơi khô va nghiền bôt ̣

Mẫu sau thu hái được rửa sach, đ̣ ê khô trong không khí, nghiền min, bạ ̉o quản

trong bao polyetylene và đựng trong hôp cọ ́ nắp đê nơi râm mat theo quy định bảo quản bôt dự ợc liêu ̣

2.1.2 Thir ғ t bL , dX ҕ ng cX ҕ , hR ҕ ғ a chk ғ t

2.1.2.2 HR ̗ a chk ̗ t

Các hóa chất mua về được sử dung trự c tiệ ́p mà không qua tinh chế hay chưng

cất lai Cạ ́c hóa chất được sử dung trong nghiên cự ́u này được tổng hơp trong Bạ ̉ng

2.1

%ҧQJ Các hóa chất đã sử dụng STT 7rQKyDFKҩW ĈӝWLQKNKLӃW 7LrXFKXҭQ 1JXӗQJӕF

2 Ethyl acetate Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

3 Ethanol 96% Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

4 Diclometan Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

5 Dung dịch H2SO4 (98%) Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

7 Dung dịch HCl đậm đặcTinh khiếtTCCS Trung Quốc

9 Dung dịch NaOHTinh khiếtTCCS Trung Quốc

11 Dung dịch NH4OH Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

12 Vanillin Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

13 Methanol Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

14 Fe2(SO4)3 Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

15 CH3COOH Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

17 Dung dịch Formol 36%Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

18 Na2SO4 rắn Tinh khiếtTCCS Trung Quốc

2.1.2.1 Thir ̗ t bL , dX ̙ ng cX ̙ ̙

Tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh,phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký, ban mỏng và các dụng cụ thí nghiệm khác

Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC – MS 7890A/5975C, Agilent technology,

USA sử dung đự ợc thể hiên ợ̉ Hình 2.2

HÕ nh 2.2 Thiê Ғ ́t bi sặ́c ký ghép khối phổ 7890A/5975C, Agilent technology, USA

Đèn UV bước sóng 254 và 365 nm được thể hiên ợ̉ Hình 2.3

HÕ nh 2.3 Đe Ғ ̀n soi sắc ký bản mỏng model: WFH – 203B

6ѫÿ ӗ nghiên cӭu thѭҕ c nghir m ҕ

Sơ đô nghiên cứu thưc nghiệ m đự ợc trình bày ở Hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiêm ̣

Dịch chiết n-hexane Dịch chiết còn lại

Cô đuổi dung môi Cao hexane Đo GC/MSPhân lập phân đoạn

Xay

3+ѬѪ1*3+ $ғ P NGÂM DÆ Ғ M T$ O TÐ ҕ Ѵ NG CAO ETHANOL TѬҒ BÐ T ҕ

CÂY TÆ Ғ M GѬ Ѵ I TRÊN CÂY KHÇ ғ CHUA

2.2.1 Nguyên tă ғ c

Ngâm chất rắn (đã được nghiền nhỏ) vào dung môi thích hơp ợ̉ nhiêt đ̣ộ và

thời gian xác định Sau đo loc lậ ́y phần dung dich rộ ̀i cô đuôi dung môi ở áp suất

thấp Có thể lăp lạ i vạ ̀i lần đê cơ ban lấy hết lượng chất có khả năng hoa tan trong

dung môi đo [9]

2.2.2 CD ғ ch tir ғ n hD Ғ nh

Lấy 1000 gam bôt khô lạ ́ cây tầm gửi nguyên liêu vạ ̀o bình thủy tinh, cho 8 lít

hệ ethanol-nước tỷ lệ 96 - 4 (w:w) vào, đậy nắp bình thủy tinh và đê yên trong 24

giờ ở nhiêt đ̣ộ phòng, sau đo lắc đêu sau mỗi 15 phút trong vòng 12 giờ đê đam bảo

cho sư khuệ ́ch tán tốt Loc gạ n lậ́y phần dich chiệ ́t rồi tiếp tuc lọ c qua giậ ́y loc trên ̣

phễu Buschle Lăp lạ i 2 lậ ̀n, mỗi lần dùng 7 lít ethanol Gôp cạ ́c dich chiệ ́t và cô

đuôi ethanol ta được cao ethanol của lá tầm gửi trên cây khế chua ở Đà Nẵng

Cân xác định khối lượng cao ethanol thu được và tính % khối lượng cao chiết

ethanol so với khối lượng mẫu ban đâu

 3+ѬѪ1* 3+ $ғ P CHIÇ ғ T PHÂN BÐ ғ L2 Ѵ NG ± L2 Ѵ NG TѬҒ TÐ Ѵ NG CAO

ETHANOL

2.3.1 Nguyên tă ғ c

Nguyên tắc cơ ban của chiết lỏng – lỏng là sư phân bộ ́ của môt chậ ́t tan vào

hai pha lỏng hoàn toàn không hòa tan hoăc họ ̀a tan rất ít vào nhau Hằng số phân bố

của môt chậ ́t tan cho biết khả năng hoa tan của chất này đôi với hai pha lỏng tai thợ ̀i

điêm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K:

K = Ca/Cb

Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tai giai đọ ạn cân bằng

Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tai giai đọ ạn cân bằng

Lưa chọ n dung môi chiệ ́t [9]: dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Có độ tinh khiết cao

- Hòa tan tốt các chất được chiết

- Không tương tác với chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp

- Không hòa tan lẫn với dung môi cũ, nghĩa là có tỉ khối khác nhiều với dung môi cũ.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:

- Ảnh hương của pH

- Vai trò của sự tạo phức

- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan

2.3.2 Cách tiӃ n hành

Lấy 75g cao ethanol đem hoa tan bằng môt lự ợng ethanol tối thiểu, tiếp theo

cho nươc cất vào đê được tổng thể tích 500 ml, lắc kỹ đê cao phân tán đêu trong

nươc rồi sau đo tiến hành chiết lỏng – lỏng với dung môi n-hexane Chiết 3 lần, mỗi

lần 400 ml dung môi Thời gian lắc chiết mỗi lần là 4 giờ, sau đo chuyển lên phễu

chiết chờ tách lớp và chiết riêng phần dung môi Gôp dị ch chiệ ́t 3 lần rồi cô đuôi

dung môi dươi áp suất giảm ta thu được cao n-hexane Cân xác định khối lượng cao

n-hexane thu được và tính % khối lượng cao chiết n-hexane so với khối lượng của

tổng cao ethanol

2.4 PHÂN LÆ 3 3+Æ1 Ĉ2 ҕ $ҕ N BĂ Ғ NG SĂ ғ C K< ғ CÐ ҕ T V$ Ғ SĂ ғ C K< ғ B$ Ѵ N

M2 Ѵ NG

2.4.1 Să ғ c k\ ғ c{ t ҕ

2.4.1.1 ND p chk ̙ ̗ t hk ̗ p thu vD ̖ o c{ t ̙

Chuẩn bi: Sự ̉ dung cộ t sặ́c ký có kích thươc phù hơp vợ ́i lượng cao khảo sát

Lấy cốc 500 ml chứa sẵn dung môi n-hexane, cho từ từ silicagel (đã sấy ở 130oC

trong vòng 6 giờ) vào và khuấy đêu đặn đê đuôi hết bot khị ́ Chú ý, không rót trưc ̣

tiếp dung môi vào chất hấp thu (silicagel) bởi vì chất hấp thu găp dung môi sẹ ̃ phát

nhiêt, cọ ́ thể làm chất hấp thu vón cuc, không đ̣ ông nhất Lượng dung môi sử dung ̣

phải vừa đu đê hỗn hơp không đự ợc quá sêt ̣

Ngâm hỗn hơp khoạ ̉ng 12 giờ hoăc qua đêm đ̣ ê silicagel trương nơ hết trong

n-hexane Trươc khi nhồi côt phạ ̉i quan sát hỗn hơp n-hexane:silicagel, nệ ́u hỗn hơp ̣

không có dang sệ t thị ̀ thêm n-hexane vào đê hỗn hơp trợ ̉ nên sêt, như ṿ ậy khi nhồi

côt hộ̃ n hơp mợ ́i có thể rót chảy xuống côt dệ̃ dàng Dùng kep đ̣ê giữ cho côt thặ ̉ng

đứng trên giá Nới lỏng kep đ̣ê có thể xoay côt theo vọ ̀ng tròn, không nới kep rộ ng ̣

quá đê tránh trương hơp cộ t không đự ợc cố định có khả năng rơi vỡ Cho mẫu bông

nhỏ vào đay côt (trạ ́nh silicagel lot xuộ ́ng bình hứng) [9]

CD ̗ ch tir ̗ n hD ̖ nh

Dùng môt phệ̃ u loc cọ ́ đuôi dai đặt trên đâu côt, cho vạ ̀o côt mộ t lự ợng

n-hexane (có thể dùng n-hexane từ hỗn hơp n-hexane:silicagel đ̣ ã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua bông gòn, giúp cố định bông gòn ở bên trong ở bên dươi côt ̣

n-không bi lệch khọ ̉i đay côt trong lụ ́c cho hỗn hơp n-hexane:silicagel vạ ̀o Mở nhẹkhóa ở bên dươi côt vạ ̀ dùng lo thụ ̉y tinh hứng n-hexane chảy ra bên dươi côt Khi ̣bông gòn đã được cố định, ta văn khọ ́a lai vạ ̀ chú ý trong côt bây giợ ̀ vẫn còn dung

dich n-hexane cao khoạ ̉ng 40 cm so với chiều cao làm viêc cộ t Đ̣ ô nhe tự̀ từ hỗn

hơp dạ ng sệ t vạ ̀o côt Sau khi đ̣ ô môt ị́t hỗn hơp vạ ̀o côt, ta xoay nhẹ cột theo vọ ̀ng

tròn và dùng môt thanh cao su gọ ̃ nhe quanh thạ ̀nh côt tự̀ dươi lên trên đê chất hấp thu nén đêu trong côt vạ ̀ không bi lọ̉ng Tiến hành mở nhe khọ ́a ở bên dươi côt đ̣êdung môi n-hexane tiép tuc chạ ̉y ra từ từ và hứng vào môt lọ thụ ̉y tinh trống đê ởbên dươi côt, tiệ ́n hành liên tuc như ṿ ậy cho đên khi hết hỗn hơp đ̣ê viêc nạ p cộ t ̣

được chăt chẹ , cho thẫ ́y chất hấp thu trong côt cọ́ dang đ̣ ông nhất

Ta phải làm cho măt thoạ ́ng hấp thu (silicagel) ở đâu côt nặ̀m ngang Nếu măt ̣

thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm lên trên phần đâu côt, dụ ̀ng đũa thủy tinh khuấy đao nhe phậ ̀n dung môi gần sát măt thoạ ́ng, làm xáo trôn mộ t phậ ̀n

chất hấp thu ở trên đâu côt Sau đ̣ o đê yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tao nên ̣

măt thoạ ́ng bằng phẳng Đê ổn định côt qua đêm nḥ ăm tránh tình trang nự ́t côt ̣

2.4.1.2 ND p mk ̙ ˾ u vD ̖ o c{ t ̙

Cao nghiên cứu được trôn vợ ́i môt lự ợng silicagel vừa đu rồi cô quay chân

không đên khô hoàn toàn Sau đo lấy ra, nghiền min bặ ̀ng cối chày sứ thu được mẫu cao đã thấm đêu trên bề măt silicagel Cho mậ̃ u cao này vào côt (đ̣ ã nap silicagel) ̣

qua môt phệ̃ u nhỏ môt cạ́ch từ từ đê tránh tao bọ t khị ́ và vón cuc Cộ t sặ́c ký sau khi

nap silicagel đự ợc điêu chỉnh lượng dung môi n-hexane cho phù hơp (đ̣ u thấm ươt

mẫu khô cho vào) Phủ lên trên mẫu môt lợ́p silicagel mỏng nữa và cho môt ị́t dung

môi n-hexane ở trên đâu côt, đ̣ê côt ộ̉n định qua 3 giờ

2.4.1.3 ChD y să ̙ ̗ c k\ ̗ c{ t silicagel ̙

Rửa giải bằng hê dung môi thị ́ch hơp dự a theo kệ ́t quả sắc ký bản mỏng Tốc

độ giải ly thay đôi tùy từng trương hơp cụ thệ̉, thông thương từ 0,5 đên 1,5 ml/phút

- Giải ly sử dung dung môi đơn ṇ ông độ: chỉ sử dung đơn dung môi họ ặc hỗn

hơp dung môi nhưng trong ḥ ỗn hơp tị̉ lê giự ̃a các thành phần không thay đôi, đê giải

ly cho đên khi viêc tạ́ch chất hoàn tất

- Giải ly có nồng độ tăng dân: đôi khi, việc sử dung mộ t dung môi sẹ ̃ chỉ giải

ly ra khỏi côt mộ t sộ́ cấu tử nhất định nào đo và môt sộ́ cấu tử khác có tính phân cưc ̣

hơn vẫn còn ở đâu côt Nệ ́u muốn đuôi chúng ra khỏi côt, phạ ̉i dùng môt dung môi ̣

có lưc mạ nh hơn Trong qụ a trình sắc ký, cần thay đôi nhiều loai dung môi khạ ́c

nhau, có lưc mạ nh tăng ḍ ân đê có thể đuôi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi côt ̣

Muốn tăng tinh phân cưc cho mộ t dung môi nạ ̀o, nhất thiết phải tăng chậm; nếu

tăng tinh phân cưc nhanh, đ̣ ột ngôt sẹ ̃ làm gãy côt Cộ t gạ ̃y làm mất đi sự liên tuc ̣

của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được

- Theo dõi quá trình giải ly: hứng dung dich giạ ̉i ly trong những lo cọ́ đanh số

thứ tư Hự ́ng mỗi lần thể tích như nhau la 15ml dung dich trong nhự ̃ng lo hự́ng

được làm bay hơi con khoảng 5 ml và chấm bản mỏng Những lo cho kệ ́t quả sắc ký

bản mỏng giống nhau được gôp chung thạ ̀nh môt phân đọ ạn

Chon phân đọ ạn có lượng cao nhiều và có hơp chậ ́t cần phân lâp (khi đ̣ ịnh

danh bằng GC/MS) đê tiếp tuc khạ ̉o sát Các phân đoạn có lượng cao ít, kết quả

định danh bằng GC/MS cho nhiều tap chậ ́t, rất khó khảo sát tiếp, vì nếu có cô lâp ̣

được chất tinh khiết se không đ̃ u lượng mẫu đê khảo sát cấu trúc hóa hoc bặ ̀ng

phương phap hóa lý hiên đ̣ại

2.4.2 Să ғ c k\ ғ bD Ѵ n mR Ѵ ng

Phương phap này được Izmailop và Schreiber đê nghi năm 1938, đự ợc Stan

phát triển, hoàn thiên vạ ̀o năm 1955 va có ứng dung rộ ng rạ ̃i

Phương phap sắc ký lớp mỏng được dùng đê định tính, thử độ tinh khiết và đôi

khi đê bán định lượng hoăc đ̣ịnh lượng hoat chậ ́t thuốc Sắc ký lớp mỏng là môt kỵ ̃

thuât tạ́ch các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tinh trên đ̃ ođã đặt hỗn hơp cạ ́c chất cần tách Pha tinh lã ̀ chất hấp phu đựợc chon phụ ̀ hơp theo ̣

từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đông nhất và được cố định trên

các phiến kính hoăc phiệ ́n kim loai Pha đ̣ ộng là môt hệ dung môi đơn họ ặc đa

thành phần được trôn vợ ́i nhau theo tỉ lê quy đ̣ ịnh trong từng chuyên luân Trong ̣

quá trình di chuyển qua lớp hấp phu, cạ́c cấu tử trong hỗn hơp mậ̃ u đưuọc di chuyển

trên lớp mỏng, theo hương pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu

được môt sặ́c ký đô trên lớp mỏng Cơ chê của sư tạ́ch có thể là cơ chê hấp phu, ̣

phân bố, trao đôi ion, sàng loc phân tự ̉ hay sư phộ ́i hơp đ̣ông thời của nhiều cơ chê

tùy thuôc vạ ̀o tính chất của chất làm pha tinh vã ̀ dung môi làm pha động

Đại lượng đặc trưng cho mưc độ di chuyển của chất phân tích là hê sộ́ di

chuyển Rf được tính bằng tỷ lê giự ̃a khoảng cách dich chuyệ ̉n của chất thử và

khoảng cách dich chuyệ ̉n của dung môi:

Rr= a/b Trong đó:

a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu

b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi

của vết, tính bằng cm

Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên Nó cũng được các nhà hóahọc tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được

trong phản ứng

Nhược điểm của kỹ thuật:

- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển

- Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi

- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu

mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn [9]

HÕ nh 2.5 Hô Ғ p bạ ̉n mỏng có kích thươc 20 x 20 cm

- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín được thể hiên ợ̉

Hình 2.6

Hình 2.6 Bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy

- Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20ml hoặc các ống mao quản

- Côt sặ́c ký (d = 4,5 cm, h = 50 cm)

- Côt sặ́c ký (d = 3,5 cm, h = 50 cm)

- Các lo thụ̉y tinh (15 ml)

2.4.2.2 Chuk ˸ n bL bÕ ̙ ̖ nh trir ˸ n khai

Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản

mỏng một ít Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một

khoảng để có thể quan sát bên trong Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5-0,7 cm Dùng môt mặ t kị́nh đông hồ đậy

kín bình triển khai đê dung môi không bay hơi trong qua trình giải ly

2.4.2.3 Chuk ˸ n bL bD ̙ ˸ n mR ˸ ng chD y să ̙ ̗ c k\ ̗

Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 1 × 10 cm Dùng bút chì

mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1 cm, mức tiền tuyến dung

môi cách mép trên bản mỏng 0,5 cm

2.4.2.4 L˱ ̙ a chR n dung môi giD ̙ ˸ i ly

Chọn dung môi triển khai phụ thuộc vào mẫu cần tách Với mẫu chưa biết

thành phần, chưa có tài liệu tham khảo cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi

khác nhau, từ loại không phân cực đến phân cực

¾ Cách xác định nhanh loại dung môi phù hợp với mẫu:

Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng nhau, đều nhau trên cùng một

bản mỏng, các vết chấm cách nhau 1 cm Dùng những vi quản để đưa các dung môi

có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết mẫu một loại dung

môi khác nhau Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo thành vòng tròn Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi Quan sát các vòng tròn đồng tâm: dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi

đó quá phân cực, dung môi nào vẫn nằm tại chỗ là dung môi đó không đủ phân cực

Để dễ quan sát hơn, nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển

khai sắc ký bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân

cực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, methanol Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau rồi nhúng

mỗi tấm vào một bình như đã chuẩn bị Ghi nhận độ di động của các cấu tử trong

mẫu:

+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì

dung môi đó chưa đủ phân cực (dung môi không phù hợp)

+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền

tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực (dung môi không phù hợp)

+ Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết

khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung môi đó phù hợp

+ Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống dung môi đơn không có

những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi

2.4.2.5 Chk ̗ m bD ˸ n mR ˸ ng vD ̖ s˱ ˸ dX ng bÕ ̙ ̖ nh trir ˸ n khai

Trước khi chấm mẫu lên bản phải dùng bút chì vót nhọn vạch đường mức xuất

phát cách đáy khoảng 1cm và vạch đường kết thúc cách đầu bản 0,5cm

Mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1 mg mẫu đặt lên mặt kiếng đồng hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu với vài

giọt dung môi dễ bay hơi như acetone Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào

dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu

nhọn có chứa mẫu lên trên bản mỏng tại một điểm cách đáy khoảng 1 cm (điểm này

phải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn

nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình)

Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏng

để không nhìn thấy lỗ bề mặt Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi về mặt thật nhanh để

dung dịch thấm mẫu vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu,

điểm này sẽ lan to Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh, không lan thành vết chấm to Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần để có vết đậm,

rõ, đường kính không quá 2mm Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung

dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu

Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách

đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm

Khi cho bản mỏng vào dình triển khai thì phải cầm thẳng đưng bản mỏng rồi

mới nhúng vào dung môi trong bình Khi nhúng vào phải cẩn thân đ̣ê 2 canh bên ̣

của bản không cham vạ ̀o thành bình, lúc đo vi trị́ của các vết chấm mẫu nằm trên

cao cách măt thoạ ́ng của dung môi khoảng 0,5 cm

Đậy nắp bình triển khai, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lưc hụ ́t mao dẫn

Theo dõi khi mưc dung môi lên đ̣ ên vach tiệ ̀n tuyến dung môi đã được vach sặ̃ n

trươc đo (cách đâu bản 0,5 cm) thì lấy bản ra khỏi bình, sấy khô bản bằng máy sấy

2.4.2.6 CD ̗ ch hir n hÕ ̙ ̖ nh vr ̗ t să ̗ c k\ ̗ ÿ r xD ̗ Fÿ L̙ nh R f

Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằng các phương pháp hóa học và vật lý phù hợp

Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử

có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường