TỔNG QUAN
VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR
Chi Stephania Lour được João de Loureiro đặt tên lần đầu tiên vào năm 1790 và sau đó đã được nhiều nhà phân loại thực vật như Hook & Thoms (1855), Benth & Hook (1862), Miers (1866) nghiên cứu và hoàn thiện.
Current classification systems predominantly categorize the genus Stephania Lour within the Menispermaceae family, part of the Ranunculales order However, Thorn uniquely classifies Stephania Lour under the Menispermaceae family but within the Berberidales order.
Các nhà khoa học Việt Nam như Nguyễn Tiến Bân, Lê Khả Kế, Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn đã đồng thuận về hệ thống phân loại của Takhtajan, được chỉnh sửa vào năm 1996, trong đó loại bỏ bậc phân loại phân bộ Menispermineae Họ đã đi đến kết luận rằng chi Stephania Lour có vị trí quan trọng trong hệ thống phân loại thực vật.
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Chi Stephania Lour có quan hệ họ hàng gần gũi với 2 chi khác là Cissampelos
L và Cyclea Arn Ex Wight do cùng là dây leo, có cuống đính vào phiến lá, bộ nhị có các nhị liền nhau thành một trụ, bao phấn hàn liền thành 1 bệ ngang; khác nhau ở chỗ cụm hoa của chi Stephania Lour là xim tán kép, còn của 2 chi Cissampelos L và Cyclea Arn Ex Wight là xim tán đơn (hay ngù) [4], [129], [170], [208]
1.1.2 Phân bố của chi Stephania Lour
1.1.2.1 Phân b ố c ủ a chi Stephania Lour trên th ế gi ớ i
Chi Stephania Lour phân bố khắp thế giới trong đó tập trung nhiều ở các nước vùng nhiệt đới, á nhiệt đới như: Trung Quốc (43 loài), Thái Lan (18 loài), Indonesia
Việt Nam có 22 loài, trong khi các nước châu Phi có 12 loài, Malaysia và Ấn Độ mỗi nước có 11 loài Philippines và Papua New Guinea có 8 loài, Australia có 7 loài, Myanma và Đài Loan mỗi nước có 5 loài Khu vực Himalaya có 3 loài, và Campuchia cũng có 3 loài.
Nhật Bản (2 loài), Sri Lanka (2 loài), Lào (2 loài), Đông Timor (1 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 loài)…
1.1.2.2 Phân b ố c ủ a chi Stephania Lour t ạ i Vi ệ t Nam
Việt Nam có 22 loài Bình vôi, phân bố rộng rãi từ vùng núi cao đến đồng bằng và ven biển, bao gồm cả những loài mọc trên bãi cát Các loài này xuất hiện ở cả ba miền đất nước: miền Bắc (Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình), miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên) và miền Nam (An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu) Thông tin về sự phân bố của một số loài thuộc chi Stephania Lour tại Việt Nam được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour tại Việt Nam
Stt Tên loài Tên Vi ệ t Nam Phân b ố TLTK
Bình vôi núi cao, Bình vôi nhị ngắn
Campuchia Đắc Lắc, Lâm Đồng [11], [13],
Hán phòng kỷ, Bình vôi hoa đầu Quảng Ninh (Cẩm
Phả, Hòn Gai), Hòa Bình (Kỳ Sơn)
Củ dòm, củ gà ấp, bình vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang)
Lào Cai, Yên Bái, Bắc cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ,
Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh
Ngải tượng, củ một, củthiên đầu thống, củ nghếch, củ mối tròn
Hà Giang, Tuyên Quang, Nam Định,
Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo
Stt Tên loài Tên Vi ệ t Nam Phân b ố TLTK
Dây mối, xạ chen Lào Cai, Hà Tây,
Ninh Bình, Đà Nẵng, Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Đồng Nai
Thiên kim đằng, dây lõi tiền
Hà Nội, Nam Định, NghệAn, Đồng Nai
Dây mối, Lõi tiền Vùng đồng bằng và núi thấp [21]
11 S kerrii Craib Bình vôi Việt Nam [204]
Bình vôi Quảng Tây, bình vôi
Quảng Ninh, Hà Nam, Ninh Bình, Hà Tây, Lạng Sơn
S longa Lour Lõi tiền, dây lõi tiền rễ dài Vùng đất thấp từ Cao
Bằng, Lạng Sơn tới Thừa Thiên Huế
15 S oblata Craib Bình vôi Việt Nam [204]
16 S pierrei Diels Bình vôi, dây đồng tiền Bình Định, Phú Yên [28], [41]
Bình vôi Lâm Đồng, Thừa
18 S rotunda Lour Bình vôi Tây Nguyên, Bình
S sinica Diels Bình vôi, bình vôi Trung Quốc, củ một Trung quốc, dây lõi tiền bắc
Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình tới Bà Rịa- Vũng Tàu
Phấn phòng kỷ Lào Cai, Yên Bái, Hà
Bắc, Hà Giang, Hà Tây, Quảng Ninh
Stt Tên loài Tên Vi ệ t Nam Phân b ố TLTK
Bình vôi đỏ, lõi tiền đỏ Các tỉnh phía Nam [21], [38]
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU
1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour
Theo các tài liệu, chi Stephania Lour có các đặc điểm chung sau:
Dây leo có thể sống lâu năm hoặc hàng năm, thường có thân mảnh mai với nhiều đặc điểm khác nhau Thân non thường nhẵn và có màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh thẫm, trong khi thân già có rãnh dọc và mụn cóc sần sùi màu nâu xám hoặc nâu đen Gốc thân phình thành củ với rễ dạng sợi, củ có hình dạng đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình trụ và có thể nặng từ 0,5-70 kg, thậm chí lên tới 170 kg ở một số loài Màu sắc vỏ củ cũng rất phong phú, từ nhẵn đến xù xì, với các màu như nâu sáng nhạt, xám tro hay đen, tùy thuộc vào loài, tuổi cây và điều kiện môi trường Thịt củ có thể nạc hoặc có vằn xơ, với màu sắc thay đổi từ trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt đến đỏ nâu, đỏ tươi.
Lá mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2(-5)-15(-20) cm, hai đầu phình lên
Cuống lá thường được gắn vào phiến lá ở vị trí cách xa mép dưới, với khoảng cách thay đổi tùy thuộc vào từng loài, có thể từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá Phiến lá có thể có độ dày khác nhau, từ mỏng đến dày, và bề mặt nhẵn bóng hoặc có lông Hình dạng phiến lá đa dạng, bao gồm hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng - tam giác, hình tam giác tròn hoặc gần tròn Mép lá có thể nguyên vẹn hoặc chia thùy, và gân lá thường có dạng chân vịt với 8 đến 9 gân.
Lá của cây có từ 10 đến 12 gân xuất phát từ đỉnh cuống lá, với chóp lá có hình dạng nhọn, thuôn hoặc gần tròn Gốc lá thường có hình gần tròn, phẳng hoặc giống hình tim Màu sắc phiến lá thay đổi tùy theo từng loài, có thể là xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc có đốm tía như ở loài S dielsiana.
Hoa của cây có cấu trúc đơn tính khác gốc, với cụm hoa đực và cái thường mọc từ kẽ lá hoặc trên thân cây già không lá Các cụm hoa này có thể có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hoặc hình đầu đến tán ngù, thường có cuống và xếp theo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1 Hoa đực có cấu trúc đối xứng tỏa tròn, với đài 6-8, rời và xếp thành 2 vòng, cánh hoa thường có 3 hoặc 4, hình trứng ngược, màu vàng hoặc trắng xanh Nhị thường có 4, tạo thành ống hình trụ, bao phấn dính nhau thành hình đĩa Hoa cái có thể đối xứng hoặc bất đối xứng, với đài thường 1 và cánh hoa 2, bầu hình trứng và chỉ có 1 lá noãn phát triển thành hạt Vòi nhụy rất ngắn hoặc không có, núm nhụy từ 4-7 chia thùy ngắn hoặc rách, tạo hình dáng như dùi.
Quả hạch có hình dạng gần tròn, hình trứng, hoặc hình trứng ngược với hai bên dẹt Khi trưởng thành, cuống quả thường lệch về một phía, gần với dấu vết của núm nhụy còn lại.
Quả chín có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, với bề mặt nhẵn bóng Hạt có hình dạng giống móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, với lưng mang dải hình móng ngựa và có từ 2 đến 4 dãy dọc các bướu hoặc gờ ngang Giá noãn có thể có lỗ thủng hoặc không, như ở loài S subpeltata Đặc điểm hình thái của hạt là dấu hiệu quan trọng để xác định tên loài Cây mầm có lá mầm tương đương với rễ mầm, được bao quanh bởi nội nhũ.
1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
Tên đồng nghĩa: Clypea venosa Bl [21], [38], [170]
Tên thường dùng: Bình vôi đỏ [38]
Tên khác: Lõi tiền đỏ [38]
Dây leo có củ với mủ đỏ, củ lớn nổi lên mặt đất có đường kính lên tới 40 cm Thân cây màu rơm đỏ, nhẵn và không có lông, khi khô chuyển sang màu lục Lá mọc cách, có phiến hình trứng rộng tam giác với kích thước 6-11(-19) x 12(-20) cm, gốc lá lõm hình tim, ngọn lá nhọn hoặc tù, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy Gân lá màu đỏ, cuống dài 6-8 cm Phát hoa xuất hiện ở nách lá, mang vài tán dày Hoa đực có 6 đài và 3 cánh hoa, trong khi hoa cái có cuống, đài 1 màu cam và 2 cánh hoa Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ, hạt hình trứng bầu, dẹt với 4 hàng gai dọc chiều lưng bụng, mỗi hàng có 12-20 gai nhỏ.
1.2.3 Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang
Tên thường dùng: Bình vôi
Thân leo của cây có hiện tượng hóa gỗ, với phiến lá hình tam giác, dài từ 8-15 cm, hiếm khi đạt 20 cm Chóp lá nhọn hoặc hơi tù, gốc lá tròn hoặc hơi lõm, mép lá nguyên hoặc gợn sóng, không có lông ở cả hai mặt Cuống lá dài hơn hoặc bằng phiến lá, có màu vàng khi khô Cụm hoa đực mọc thành xim tán kép, thường xuất hiện ở thân già không lá hoặc các cành nhỏ, với cuống dài 2,5-5 cm và mang 6-8 xim tán Hoa đực nhỏ, có cuống dài khoảng 2 mm, đài 6 màu lục nhạt xếp 2 vòng, với 3 lá đài vòng ngoài dạng mác và 3 lá đài vòng trong lớn hơn Cánh hoa màu hồng cam, nhỏ hơn lá đài, có hình dạng quạt tròn với hai mép cong vào Nhị dính thành cột cao 1mm, bao phấn hàn liền thành đĩa tròn với vành trắng, đường kính 0,6 mm Hoa cái chưa được quan sát.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR
Các alcaloid đã phân lập từ các loài trong chi Stephania Lour có thể xếp vào 9 nhóm: benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin, aporphin, proaporphin, protoberberin, morphinan, hasubanan, stephaoxocan và eribidin
Các alcaloid thuộc nhóm này có khung chung là benzylisoquinolin, có 13 chất được phân lập từ 7 loài khác nhau
Bảng 1.2 Danh mục các chất thuộc nhóm benzylisoquinolin
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
Nhóm bisbenzylisoquinolin bao gồm 47 alcaloid được phân lập từ 14 loài thực vật, trong đó S tetrandra và S erecta mỗi loài cho ra 14 chất, còn S cepharantha cung cấp 9 chất Nhiều alcaloid trong nhóm này có giá trị dược lý cao, tiêu biểu như cepharanthin, tetrandrin và cycleanin.
Bảng 1.3 Danh mục các chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
3 Cepharanthin (C37H38N2O6) S cepharantha, S brachyandra, S epigaea, S japonica, S erecta, S pierrei
Nhóm aporphin bao gồm 77 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ 33 loài thực vật khác nhau Trong số đó, một số loài nổi bật với số lượng alcaloid được phân lập nhiều, chẳng hạn như S venosa với 20 chất, S cepharantha có 15 chất, S sasakii với 13 chất và S abyssinica với 9 chất.
Bảng 1.4 Danh mục các chất thuộc nhóm aporphin
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
11 Corydin (C20H23NO4) S lincagensis, S macrantha, S zippenlianna, S abyssinica, S dinklagei, S venosa, S viridiflavens
14 Crebanin (C20H21NO4) S abyssinica, S capitata, S cepharantha, S dielsiana, S aculeata, S bancroftii, S deltifolia, S hainanensis, S officinarum, S sasakii, S succifera, S venosa, S yunnanensis, S zippeliana, S brachyandra
21 Dicentrin (C20H21NO4) S dinklagei, S cepharantha, S brachyandra, S dentifolia, S dicentrinifera, S epigaea, S mashanica, S pierrei, S zippeliana, S abyssinica, S venosa
22 Dicentrinon (C19H13NO5) S abyssinica, S zippeliana, S dinklagei
32 Isocorydin (C20H23NO4) S cepharantha, S disciflora, S dolichopoda, S lincagensis, S macrantha, S officinarum, S pierrei, S yunnanensis, S dinklagei, S viridiflavens
36 Liriodenin (C17H19NO3) S sutchuenensis, S sasakii, S dinklagei S venosa
40 Magnoflorin (C20H24NO4) S dielsiana, s japonica, S gracilenta, S cepharantha, S pierrei, S tetrandra
42 Nor-Nuciferin (C18H19NO2) S cepharantha, S sasakii [48]
56 Oxocrebanin (C19H13NO5) S hainanensis, S succifera, S venosa
59 Oxostephanin (C18H11NO4) S zippeliana, S japonica, S dielsiana, S venosa
62 Roemerin (C18H17NO2) S lincagensis, S yunnanensis, S disciflora, S excentrica, s abyssinica, S venosa
67 Stephanin (C19H19NO3) S abyssinica, S aculeata, S brachyandra, S capitata, S cepharantha, S bancroftii, S dielsiana, S epigaea, S japonica, S kwangsiensis, S micrantha, S yunnanensis, S herbacea, S venosa
Nhóm proaporphin có 8 alcaloid đã được phân lập từ9 loài, trong đó loài S venosa là loài chiết được nhiều alcaloid thuộc nhóm này (5 alcaloid)
Bảng 1.5 Danh mục các chất thuộc nhóm proaporphin
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
6 Pronuciferin (C19H21NO3) S cepharantha, S.glabra, S sasakii, S sutchuenensis
7 Stepharin (C18H19NO3) S aculeata, S glabra, S bancroftii, S intermedia, S yunnanensi, S venosa, S viridiflavens
Nhóm protoberberin có 27 alcaloid phân lập từ 22 loài, trong đó một số loài có nhiều alcaloid đã phân lập thuộc nhóm này như: S glabra (13 alcaloid), S venosa
(7 alcaloid), S intermedia (6 alcaloid), S cepharantha, S macrantha, S succifera,
Trong nhóm này có một số alcaloid đã được sử dụng làm thuốc như: L- tetrahydropalmatin, palmatin, stepholidin,
Bảng 1.6 Danh mục các chất thuộc nhóm protoberberin
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
2 Corydalmin (C20H23NO4) S glabra, S succifera, S yuunanensis, S intermedia, S macrantha, S bancroftii, S aculeata, S brachyandra, S venosa
4 Cyclanolin (C20H24O4N + ) S dielsiana, S japonica, S tetrandra, S herbacea, S cephrantha, S venosa
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
14 Palmatin (C20H25N + O4) S glabra, S officinarum, S succifera, S yunnanensis, S kwangsiensis, S macrantha, S cepharantha, S intermedia, S venosa, S viridiflavens
21 Stepholidin (C19H21NO4) S glabra, S macrantha, S brachyandra, S venosa
S aculeata, S glabra, S officinarum, S macrantha, S mashanica, S succifera, S
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK yunnanensis, S intermedia, S dielsiana, S brachyandra, S epigaea, S micrantha, S viridiflavens, S kwangsiensis, S bancroftii, S disciflora, S venosa
Nhóm morphinan có 21 alcaloid được phân lập từ 17 loài thuộc chi Stephania Lour., trong đó loài S cepharantha có nhiều alcaloid (12 alcaloid) được phân lập nhất thuộc nhóm này
Bảng 1.7 Danh mục các chất thuộc nhóm morphinan
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
17 Salutaridin (C19H21NO4) S yunnannensis, S pierrei, S cepharantha
19 Sinoacutin (C19H21NO4) S brachyandra, S cepharantha, S dielsiana, S dicentrinifera, S elegans, S epigaea, S glabra, S gracilenta, S mashanica, S micrantha, S officinarum
Nhóm hasubanan có 49 alcaloid, được phân lập từ 11 loài thuộc chi Stephania Lour., trong đó một số loài có số lượng alcaloid thuộc nhóm này nhiều như: S longa
(21 alcaloid), S japonica (13 alcaloid), S abyssinica (10 alcaloid),
Bảng 1.8 Danh mục các chất thuộc nhóm hasubanan
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin)
Protostephanin (C20H27NO4) phân lập từ loài Stephania japonica [48], [57]
Bảng 1.9 Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan
Stt Tên ch ấ t Loài TLTK
Duanyun Si và cộng sự, năm 2001 [164] đã chiết được 2 biflavonoid là stephaflavon A và stephaflavon B từ loài S tetrandra
Pal Mahesh và cộng sự, 1996 [144] đã chiết được một chất là: 7,4’ Dihydroxyisoflavon-8-C-β-glucopyranosid từ củ loài S glabra
Hai isoflavonoid là genistein, genistin được tìm thấy trong dịch chiết ethanol từ củ 6 tuổi của Stephania venosa (Bl.) Spreng [84]
Various compounds have been isolated from the tubers of species within the genus Stephania Lour, including P-hydroxyphenylethyl p-coumarate, cinnamic acid, β-sitosterol-D-glucose, P-hydroxyphenylethyl ferulate, β-sitosterol (from S longa), and aloe-emodin (from S dinklagei).
THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
1.4.1 Thành phần hóa học loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
Hoạt chất được quan tâm trong loài Stephania venosa (Bl.) Spreng Là các alcaloid Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, từ loài Stephania venosa (Bl.)
Spreng đã phân lập và xác định được 34 alcaloid, thuộc 3 nhóm:
- Nhóm Aporphin (21 chất): Ayuthianin [88], (-)-O-acetyl sukho diamin [148], d-corydin [172], crebanin [67], [114], dehydrocrebanin [67], dicentrin [87], [114],
[111], [160], 4-α-hydroxyushinsunin [61], kamalin [54], [67], liriodenin [68], nantenin [61], O-methylbulbocapnin [139], [191], [193], oxocrebanin [87], oxostephanin [87], oxostephanosin [67], [148], roemerin [61], stephanin [115], [121], sukhodiamin-β-N-oxid [61], sukhodiamin [88], thailandin [64], [67], ushinsunin-β- N-oxid [61], uthongin [87]
- Nhóm Proaporphin (6 chất): (±) N carboxamido stephanin [61], 11,12- dihydrostepharin [61], [67], glaziovin [67], N-methyltetrahydropalmatin [139], O- methylstepharinosin [61], stepharin [61]
- Nhóm Protoberberin (7 chất): Corydalmin, cyclanolin [96], N- methyltetrahydropalmatin [139], L- tetrahydropalmatin [48], [141], [135], palmatin
Nghiên cứu đã phát hiện ra sự hiện diện của một số isoflavonoid, bao gồm genistein và genistin, trong dịch chiết từ củ 6 tuổi của Stephania venosa (Bl.) Spreng, với hàm lượng lần lượt là 8,03 mg và 51,73 mg trên 100 g củ.
Chưa có nghiên cứu nào về phân lập các chất của loài S venosa thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu (Việt Nam)
1.4.2 Thành phần hóa học loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang
Loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang chứa các alcaloid quan trọng Nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập và xác định được 17 alcaloid, thuộc 4 nhóm khác nhau.
- Nhóm aporphin (6 chất): (+)-6R, 6aS-isocorydin Nβ –oxid, (+)-6R, 6aS- corydin Nβ –oxid, (+)-N-methyl-laurotetanin [200], corydin, isocorydin, xylopinin
- Nhóm benzylisoquinolin (7 chất): orientalin [199] (+)-1S, 2R-laudanidin-Nβ- oxid; (+)-1S, 2S-laudanidin-Nα-oxid; (+)-laudanidin; (+)-reticulin; (+)-1S, 2R- reticulin-Nβ-oxid; (+)-1S, 2S-reticulin-Nα-oxid [199], [201]
- Nhóm Protoberberin (3 chất): jatrorrhizin [67], [77], palmatin, L- tetrahydropalmatin [20], [199]
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Vũ Xuân Giang (2003) là công trình đầu tiên phân lập hai alcaloid từ loài S viridiflavens thu hái tại Sơn La, bao gồm L-tetrahydropalmatin và palmatin Định lượng cho thấy tổng hàm lượng alcaloid trong dược liệu khô đạt 2,92%, trong đó l-tetrahydropalmatin chiếm 0,63% trong củ.
Củ loài bình vôi, bao gồm S venosa và S viridiflavens, chứa alcaloid là thành phần hóa học chính, cùng với tinh bột, đường khử, flavonoid và một số acid hữu cơ.
TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
1.5.1 Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
1.5.1.1 Tác d ụ ng sinh h ọ c t ừ d ị ch chi ế t t ổng và các phân đoạ n tinh ch ế t ừ loài Stephania venosa
Loài Stephania venosa (Bl.) Spreng đã được nghiên cứu và chứng minh có nhiều tác dụng hữu ích, bao gồm khả năng giảm lo âu, tác dụng gây độc tế bào, ức chế kết tập tiểu cầu, cũng như các đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và kháng viêm Ngoài ra, loài này còn có ảnh hưởng tích cực đến cơ quan sinh sản.
Tác d ụ ng gi ả m lo âu
Nghiên cứu đã tiến hành cho chuột uống dịch chiết ethanol thô của S venosa với liều lượng 5, 10 và 20 mg/kg cân nặng mỗi ngày trong 2 tuần Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm được đánh giá ngay sau khi uống liều duy nhất, cũng như sau 1 và 2 tuần điều trị thông qua thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao và thử nghiệm bơi cưỡng bức Kết quả cho thấy chỉ có liều 20 mg/kg cân nặng mang lại tác dụng giải lo âu đáng kể ở chuột trong tất cả các thời điểm điều trị, trong khi không ghi nhận tác dụng chống trầm cảm.
Tác d ụ ng gây độ c t ế bào
Dịch chiết nước từ Stephania venosa (Bl.) Spreng có khả năng gây độc tế bào, kích thích quá trình apoptosis, và ngăn chặn sự tăng sinh, xâm lấn, di căn của tế bào.
Dịch chiết nước từ củ S venosa cho thấy khả năng gây độc tế bào và kích thích quá trình chết tế bào ở cả tế bào lympho bình thường và tế bào lympho từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung Hiệu quả tối ưu được ghi nhận khi kết hợp chiếu xạ với 0,5 Gy (60 Co) tia gamma và nồng độ 300 àg/ml S venosa.
Dịch chiết nước từ S venosa có khả năng gây độc tế bào trên các tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi của người (PBMCs) với IC 50 đạt 300 àg/ml Khi thử nghiệm hoạt tính cảm ứng chu trình chết của tế bào PBMCs từ người khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư cổ tử cung ở nồng độ 300 àg/ml, dịch chiết này cho thấy tác dụng tương tự như bức xạ 0,5 Gɤ (60 Co) so với các tế bào không được điều trị Ngoài ra, dịch chiết nước S venosa cũng thể hiện hoạt tính chống tăng sinh tế bào với IC 50 là 40 àg/ml khi sử dụng mô hình khảo nghiệm bằng 3 H-thymidine.
Từ dịch chiết nước, ba chất tinh khiết đã được phân lập, bao gồm palmatin, tetrahydropalmatin và crebanin, trong đó palmatin và crebanin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt trên tế bào MCF7 với IC 50 khoảng 5-6 µg/ml và LC 50 lần lượt là 74,4 và 29,6 µg/ml Tetrahydropalmatin có hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn Dịch chiết ethanol từ củ S venosa cùng với alcaloid aporphin đã cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên tế bào ung thư buồng trứng SKOV3 trong thử nghiệm MTT, với ED 50 là 31 µg/ml Aporphin phân lập từ S venosa cũng cho kết quả gây độc tế bào với ED 50 là 6 µg/ml chỉ đối với tế bào ung thư, không ảnh hưởng đến tế bào lành Dịch chiết ethanol có LC 50 là 90,8 µg/ml, trong khi dịch chiết nước có LC 50 là 184,9 µg/ml, cho thấy hoạt tính giảm 2 lần Dịch chiết ethanol cũng được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư MCF7 với IC 50 là 11,6 µg/ml.
Dịch chiết methanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng cho thấy khả năng chống kết tập tiểu cầu với IC 50 đạt 55,9 µg/ml trong thử nghiệm xác định hoạt động ức chế kết tập tiểu cầu do adenosin diphosphat (ADP) gây ra trên huyết tương người giàu tiểu cầu (PRP).
Dịch chiết phân đoạn ethanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với các vi khuẩn Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus aureus Kết quả cho thấy giá trị MIC của dịch chiết này đối với từng loại vi khuẩn.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ 0,078; 0,625 và 0,078 mg/ml có tác dụng ức chế đối với các chủng vi khuẩn, trong khi phân đoạn n-hexan thể hiện hiệu quả kém hơn, đặc biệt là với E coli, với giá trị MIC lần lượt là 2,5; > 5,0 và 2,5 mg/ml.
Dịch chiết ethanol từ củ S venosa cho thấy khả năng ức chế rõ rệt trên Artemia sp., với giá trị LC50 đạt 260,26 µg/ml Đối với vi khuẩn, liều gây độc là 750 mg/kg.
Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa có tác dụng ức chế nấm Tyrosinase với IC 50 1,74 mg/ml trong thử nghiệm với phương pháp Dopachrome [127]
Tác d ụ ng ch ố ng oxy hóa
Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng cho thấy tác dụng chống oxy hóa với giá trị EC 50 là 4,98 mg/ml trong thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH Ngoài ra, dịch chiết methanol cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa tương tự như dịch chiết ethanol, được chứng minh qua các thử nghiệm DPPH và FRAP, đánh giá khả năng giảm hoạt tính chống oxy hóa của sắt.
Sử dụng đường uống với liều 250 mg/kg trên chuột cho thấy tác dụng kháng viêm rõ rệt, làm giảm phù nề chân chuột do carrageenin gây ra chỉ sau 1 giờ, đạt hiệu quả lên đến 74,3%.
Tác d ụ ng trên cơ qua n sinh s ả n
Theo nghiên cứu của Theo Gomuttapong và cộng sự, dịch chiết ethanol 95% từ củ 6 tuổi của loài S venosa không cho thấy hoạt tính estrogen trên chuột thử nghiệm khi sử dụng đường uống Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết này có dấu hiệu gây độc, đặc biệt là trên chuột đã cắt buồng trứng, với các chỉ số bạch cầu tăng cao.
Tiêm RNA hoặc 5-HT, NMDA vào noãn bào Xenopus và ghi lại phản ứng bằng kỹ thuật điện áp kẹp hai chiều cho thấy dịch chiết nước của
Stephania venosa có khả năng ức chế mạnh mẽ thụ thể 5-HT trên noãn bào Xenopus Giá trị IC50 của dịch chiết cho thấy sự khác biệt rõ rệt khi tế bào trứng được tiêm 5-HT và không được tiêm.
NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là củ, thân, lá, hoa, quả, hạt các cây Bình vôi thu hái tại các địa điểm:
Mẫu M1 được thu hái tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, với các tiêu bản cây được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội dưới mã số “HNIP/18073/14” Ngoài ra, tiêu bản cũng được lưu tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và CN Việt Nam với mã số “HV – Thủy 1”.
Mẫu M2 được thu hái tại Văn Chấn, Yên Bái, với các tiêu bản cây được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội mang mã số “HNIP/18594/20” và “HNIP/18595/20” Ngoài ra, các mẫu này cũng được lưu tại phòng tiêu bản Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số “HV – Thủy 2”.
Từ năm 2014 đến 2019, 12 cá thể mẫu Bình Vôi Bà Rịa – Vũng Tàu và 37 cá thể mẫu Bình Vôi Yên Bái đã được trồng tại Vườn thực vật Trường ĐH Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu tại Ba Trại - Ba Vì nhằm theo dõi sự phát triển, thu hoạch hoa, quả, hạt và đồng nhất điều kiện sinh trưởng Các mẫu còn lại được sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học, với việc chọn củ có khối lượng từ 2 đến
3 kg, trong thời điểm cây không ra hoa, cân và xác định khối lượng củ trước khi nghiên cứu
2.1.2 Động vật và các dòng tếbào ung thư thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả hai giống, trọng lượng 20 2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp
Chuột cống trắng Wistar, giống đực, khỏe mạnh với trọng lượng 120 ± 20g và độ tuổi từ 8-10 tuần, được cung cấp bởi Học Viện Quân Y, đáp ứng tiêu chuẩn thí nghiệm Các động vật thí nghiệm này được nuôi dưỡng ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm, sử dụng thức ăn tiêu chuẩn từ Viện Vệ sinh Dịch tễ và được cung cấp nước tự do ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành thực nghiệm tại phòng nuôi của Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội.
AGS (human stomach gastric adenocarcinoma), HeLa (human prostate carcinoma), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), and MCF7 are important cancer cell lines used in research to study various types of human cancers These cell lines provide valuable insights into cancer biology and are essential for developing new treatment strategies.
(human breast carcinoma - ung thư vú ở người) do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp
Các hóa chất, dung môi và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam IV bao gồm n-butanol, cloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, methanol, kali dihydrophosphat, triethylamin, cùng với oxostephanin được phân lập từ nghiên cứu của Nguyễn Vũ Minh và L-tetrahydropalmatin do Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp với mã số WS 0316141.01, có độ tinh khiết 96,16% C21H25NO4.
Các chất sử dụng trong nghiên cứu tác dụng sinh học:
This article discusses various chemical compounds and reagents, including Trolox from Sigma Aldrich, ascorbic acid from Fisher, and trypsin It also highlights ellipticine and thiobarbituric acid (TBA), both sourced from Sigma Aldrich, along with FeSO4 and H2O2 Additionally, it mentions FBS from GIBCO and Invitrogen, as well as sulforhodamine B (SRB) from Sigma The article further references trichloroacetic acid (TCA) from Fisher/Sigma, acetic acid from Merck, and DPPH from Sigma Aldrich, emphasizing their significance in various scientific applications.
- Quercetin chất chuẩn, độ tinh khiết 94,37%, mã QT104 111016, do Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp
- Indomethacin chất chuẩn, đạt tiêu chuẩn phân tích do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp
- Prednisolon dạng viên nén 5mg sản xuất bởi công ty cổ phần NAHAPHARM
Số đăng kí VD-16472-12, hạn sử dụng 04/05/2022
- Dung môi pha mẫu cao toàn phần dược liệu: Dimethyl sulfoxid do công ty Kanto Chemical Nhật Bản sản xuất, Cat.no 10378 – 01, Lot No 701B1131
- Viên bông khối lượng 20±2 mg đã tiệt trùng
- Đệm phosphat hoặc đệm KCl
- Carrageenin (Carragenan sodium salt, a naturally occurring polysaccharid) của hãng Sigma Aldrich, lọ 250 gam
2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Bộ dụng cụ phân tích hoa bao gồm kính lúp và các dụng cụ cắt, tẩy nhuộm tiêu bản, hỗ trợ nghiên cứu thực vật hiệu quả Kính hiển vi điện tử Kruss (Đức) và kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 (Mỹ) cung cấp khả năng quan sát chi tiết, trong khi tủ sấy giúp bảo quản mẫu vật tốt hơn.
- Nghiên c ứ u hóa h ọ c: Bộ chiết Soxhlet 250ml; Buret; Các dụng cụ thủy tinh
Trong lĩnh vực nghiên cứu hóa học và dược liệu, các thiết bị như cốc có mỏ, bình định mức, máy lắc siêu âm Ultrasonic LC 60H và máy nghiền dược liệu DF-4 đóng vai trò quan trọng Bộ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag, bao gồm máy phun mẫu bán tự động Linomat 5, máy triển khai sắc ký ADC 2 và máy chụp ảnh TLC Visualizer cùng với phần mềm winCATS và VideoScan, giúp tối ưu hóa quy trình phân tích Bản mỏng silicagel 60 F254 từ Merck và máy cất quay cũng là những công cụ không thể thiếu Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, cột Phenomenex Germini, cùng với máy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage, đều được sử dụng tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên Ngoài ra, máy ghi phổ khối lượng AGILENT 1100 LC – MSD Trap và máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR với chất chuẩn nội tetramethyl silan, là những thiết bị tiên tiến hỗ trợ nghiên cứu và phân tích trong lĩnh vực hóa học.
Nghiên cứu tác dụng sinh học sử dụng các thiết bị hiện đại như máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic (Italy), pipette Eppendorf, cân phân tích, máy đọc ELISA 96 giếng của Bio-Rad, kính hiển vi điện tử để nghiên cứu vi thể thận, và máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer No 7250 của Ugo-Basile (Italy).
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu về thực vật
2.2.1.1 Mô t ả đặc điể m hình thái 2 loài nghiên c ứ u
Quan sát và mô tả hình thái thực vật cùng với điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa là bước đầu quan trọng Sau đó, thu hái mẫu cây, làm tiêu bản và chụp ảnh để lưu giữ Sử dụng kính hiển vi soi nổi EZ4, tiến hành phân tích, chụp ảnh và mô tả các bộ phận sinh sản như hoa, quả và hạt để hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh học của cây.
2.2.1.2 Giám đị nh tên khoa h ọ c các m ẫ u nghiên c ứ u
Giám định tên khoa học của cây được thực hiện thông qua việc phân tích đặc điểm hình thái và bộ phận sinh sản, sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Các bước chính trong quy trình giám định bao gồm việc thu thập mẫu, quan sát các đặc điểm hình thái, và phân tích cấu trúc sinh sản để xác định chính xác tên khoa học của cây.
- Dựa trên khóa phân loại chi Stephania Lour của Thực vật chí Trung Quốc
[129], Nguyễn Chiều (Việt Nam) [14] và thực vật chí Thái Lan [170], so sánh với các đặc điểm thực vật đã mô tả để sơ bộ xác định loài
- So sánh với tiêu bản lưu trữ và các tài liệu phân loại thực vật [12], [14], [78],
[129], [170], [176], [207], [208] cùng với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật để kết luận tên khoa học của loài
2.2.1.3 Xác định đặc điể m vi h ọ c 2 loài nghiên c ứ u
Nghiên cứu vi phẫu của thân, cuống lá và lá của hai loài thực vật được thực hiện thông qua phương pháp cắt tẩy nhuộm kép và tạo tiêu bản bằng phương pháp giọt ép Qua đó, các tiêu bản vi phẫu dược liệu đã được thu thập Vị trí cắt vi phẫu được lựa chọn cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và chất lượng của kết quả nghiên cứu.
- Thân: Chọn đoạn thân bánh tẻ, khoảng lóng thứ 4 tính từ ngọn lá, vị trí cắt không được sát mấu
- Cuống lá: Chọn cuống lá của lá bánh tẻ, vị trí cắt ở khoảng giữa của cuống lá
- Lá: Chọn lá bánh tẻ, kích thước trung bình, vị trí cắt ở khoảng 1/3 (về phía cuống lá) giữa vị trí cuống lá gắn vào phiến lá và mép lá
Dược liệu được chế biến bằng cách sấy khô và nghiền mịn bột từ củ và lá của hai loài nghiên cứu, sau đó được rây qua rây 355 Cuối cùng, các tiêu bản bột dược liệu được tạo ra bằng phương pháp giọt ép.
Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh các tiêu bản dưới kính hiển vi Kruss tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội [26], [39], [42]
2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học
Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu có thể thực hiện thông qua các phản ứng hóa học theo tài liệu [19] và [28] Phương pháp sắc ký lớp mỏng cũng được sử dụng để xác định các nhóm chất hữu cơ này.
Tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng bột củ hai loài nghiên cứu theo quy trình sau đây:
Để chiết xuất, cân chính xác 2,0 g bột dược liệu và ngâm trong dung môi MeOH Sau 24 giờ, chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình chiết ngấm kiệt, liên tục bổ sung dung môi và rút dịch chiết với tốc độ 20 giọt/phút Kiểm tra chiết kiệt alcaloid theo phụ lục 12.3 - Dược điển Việt Nam IV Dịch chiết thu được cô đến cắn và hòa tan cắn trong 100 ml MeOH để tạo dung dịch chấm mẫu.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn L-tetrahydropalmatin và oxostephanin có nồng độ 0,03 mg/ml (đối chứng)
- Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng:
+ Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silicagel 60 F254 của hãng Merck Trước khi chấm, bản mỏng được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ
+ Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi khai triển Lựa chọn hệ dung môi thích hợp cho hiệu năng tách tốt nhất
+ Chấm sắc ký: Chấm sắc ký bằng máy Linomat 5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu và chiều dài băng chấm mẫu phù hợp
Để triển khai sắc ký, đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi và đậy kín Sau đó, để yên và quan sát quá trình tách cho đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2 cm, rồi lấy ra và đánh dấu đường dung môi Cuối cùng, để bản mỏng khô tự nhiên trong tủ hốt Quan sát và chụp ảnh bản mỏng dưới ánh sáng trắng cũng như ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
Dựa vào khả năng phân tách của hệ pha động và kích thước Rf của các vết, có thể rút ra kết luận sơ bộ về các vết trong dịch chiết cũng như vết chuẩn đối chứng.
2.2.2.2 Chi ế t xu ấ t và phân l ậ p các h ợ p ch ất trong dượ c li ệ u
Chiết xuất hợp chất từ dược liệu được thực hiện bằng phương pháp ngâm chiết với hỗn hợp MeOH : H2O (85 : 15) ở nhiệt độ phòng trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ Sau đó, tiến hành chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần Các chất trong từng phân đoạn được phân lập bằng cột sắc ký silicagel pha thường, pha đảo và sephadex LH 20 Độ sạch của các mẫu được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, đồng thời sử dụng thuốc thử Dragendorff để hiện màu sắc ký lớp mỏng.
2.2.2.3 Xác đị nh c ấ u trúc hóa h ọ c các h ợ p ch ấ t phân l ậ p
Để xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập, cần sử dụng các phương pháp như điểm chảy, [α D], phổ khối (MS), GC-MS, phổ khối phân giải cao (HR-MS), và cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều Các kết quả thu được sẽ được đối chiếu với các tài liệu đã được công bố trước đó.
2.2.2.4 Định lượ ng alcaloid toàn ph ầ n và L-tetrahydropalmatin trong 2 m ẫ u nghiên c ứ u Định lượ ng alcaloid toàn ph ầ n b ằ n g phương pháp acid – base Định lượng alcaloid toàn phần trong củ của hai loài nghiên cứu theo Dược điển Việt Nam III [8].Định lượng 5 lần, lấy kết quả trung bình Định lượ ng L-tetrahydropalmatin Định lượng L-tetrahydropalmatin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), dựa theo phương pháp trong chuyên luận Bình vôi - DĐVN V [22]
2.2.3 Thửđộc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học
Trong nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học, mẫu cao thử được chuẩn bị bằng cách cắt nhỏ củ hai mẫu nghiên cứu, sấy khô ở nhiệt độ 55°C đến khi hàm ẩm dưới 10%, sau đó xay thành bột thô và xác định hàm ẩm Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%, ngâm trong 24 giờ với tốc độ chảy 1ml/phút, theo tỉ lệ khối lượng dược liệu 20:1 Dịch chiết ethanol được gộp lại và cô thu hồi dung môi bằng dụng cụ cất quay đến tỷ lệ cao 1:1, sau đó cô tiếp trên nồi cách thủy với công suất 800W cho đến khi cao đặc và xác định khối lượng thu được Thông tin về mẫu cao được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thông tin mẫu cao chuẩn bịđể thửđộc tính và đánh giá tác dụng
Mẫu thử Mã cao Loài
Liều dùng quy đổi theo cao
Liều cao dùng quy đổi Chuột nhắt
Bình vôi thu hái tại Bà
4,5548 g dược liệu khô tuyệt đối
Bình vôi thu hái tại Văn
5,5520 g dược liệu khô tuyệt đối
Mẫu cao thử được hòa tan trong DMSO với tỷ lệ 1g cao/1,5 ml DMSO và siêu âm ở 30°C trong 20 phút để đạt được trạng thái tan hoàn toàn Sau đó, hỗn dịch được phân tán vào NaCMC 0,8% với các nồng độ thích hợp Động vật được cho uống hỗn dịch chế phẩm thử qua kim đầu tù theo các liều thử nghiệm đã được thiết kế Chế phẩm thử sau khi pha chế được bảo quản trong tủ lạnh ở 8°C.
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD 50 trên chuột nhắt trắng được thực hiện bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon theo hướng dẫn của WHO và tài liệu của Đỗ Trung Đàm, Đoàn Thị Nhu Nghiên cứu này nhằm đánh giá mức độ độc hại của chất thử nghiệm thông qua đường uống trên mẫu chuột nhắt trắng.
Bộ môn Dược lực, trường ĐH Dược Hà Nội
Trước khi thí nghiệm, chuột được nhịn ăn qua đêm và chia thành các lô 10 con Mỗi lô được cho uống mẫu thử với liều tăng dần để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết chuột Trong 72 giờ sau khi uống thuốc, tình trạng chung của chuột được theo dõi để phát hiện dấu hiệu nhiễm độc như nôn, co giật và kích động, cùng với số lượng chuột chết Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể, từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định kết quả thí nghiệm.
LD50 Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc