Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng Streptomyces sp.. Nhiều kỹ thuật, công nghệ đã được áp dụ

NGUYỄN VĂN NGUYỆN

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM

NGUYỄN VĂN NGUYỆN

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Trịnh Khắc Quang

2 PGS TS Phạm Anh Tuấn

HÀ NỘI – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Khắc Quang, PGS.TS Phạm Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các anh/chị đồng nghiệp Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm, Bộ môn Cây ăn quả đã rất nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Lãnh đạo và các cán bộ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu rau quả, Ban thông tin và đào tạo VAAS đã luôn động viên, tạo điều kiện và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, ủy viên phản biện, ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc và tham gia hội đồng chấm luận án này

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình nội, ngoại, vợ, con tôi và bạn bè

đã động viên, cổ vũ, khích lệ trong suốt quá trình thực hiện luận án

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả tươi 5

1.1.1 Trên thế giới 5

1.1.2 Ở Việt Nam 5

1.1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam (Citrus sinensis) 6

1.1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối tiêu (Musa cavendish) 7

1.2 Đặc điểm quá trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa của quả trước và sau thu hoạch 9

1.3 Tác động của ethylene nội sinh đến quá trình sinh trưởng, phát triển và lão hóa của quả 9

1.4 Các nghiên cứu ức chế hoạt động của ethylene nội sinh trước và sau thu hoạch12 1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp 13

1.4.1.1 Kìm hãm enzyme ACS 13

1.4.1.2 Ức chế enzyme ACO 13

1.4.1.3 Cạnh tranh cơ chất SAM 14

1.4.2 Kìm hãm các thụ thể nhận biết ethylene 14

1.4.3 Loại bỏ ethylene 15

1.4.3.1 Hấp phụ 15

1.4.3.2 Oxy hóa 15

1.4.3.3 Xúc tác phân hủy 16

1.4.3.4 Bộ lọc sinh học 16

1.5 Hoạt chất AVG 18

1.5.1 Cấu tạo phân tử AVG 18

1.5.2 Tính chất hóa lý của AVG 19

1.5.3 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene của AVG 19

1.5.3.1 ACS và các tác nhân kìm hãm ACS 19

1.5.3.2 Cơ chế ức chế ACS của AVG 20

1.6 Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG 21

1.6.1 Sản xuất AVG bằng xạ khuẩn Streptomyces spp 21

1.6.1.1 Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces spp 21

1.6.1.2 Lên men xạ khuẩn Streptomyces spp để sản xuất AVG 25

1.6.1.3 Tách và tinh sạch AVG 25

1.6.1.4 Công nghệ tạo chế phẩm AVG 27

1.6.2 Sản xuất AVG bằng tổng hợp hóa học 29

1.6.3 Kỹ thuật tạo các sản phẩm điều hòa sinh trưởng 29

1.7 Các công trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG 30

1.7.1 Giai đoạn trước thu hoạch 30

1.7.1.1 Trên thế giới 30

1.7.1.2 Ở Việt Nam 31

1.7.2 Giai đoạn sau thu hoạch 32

1.7.2.1 Trên thế giới 32

1.7.2.2 Ở Việt Nam 32

1.8 Những ý kiến rút ra từ tổng quan 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Vật liệu nghiên cứu 35

2.1.1 Vật liệu 35

2.1.2 Môi trường, hóa chất 35

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu chung 36

2.2.1.1 Phân tích hàm lượng AVG bằng HPLC 36

2.2.1.2 Xác định pH dịch lỏng 37

2.2.1.3 Xác định sinh khối chủng xạ khuẩn trong dịch lên men 37

2.2.1.4 Xác định hàm lượng chất khô tổng số trong dịch lỏng 37

Nhỏ 1 giọt mẫu dịch kiểm tra vào lăng kính của khúc xạ kế 37

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung 37

2.2.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng Streptomyces sp có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG 37

2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng Streptomyces sp đã lựa chọn 40

2.2.2.3 Nghiên cứu làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hoãn quá trình chín quả 43

2.2.2.4 Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG 49

2.2.3 Các phương pháp xử lý số liệu 53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn Streptomyces sp có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG 54

3.1.1 Kết quả phân lập chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp AVG 54

3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng S6 57

3.1.2 Định tên chủng S6 58

3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng S6 60

3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 60

3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 61

3.2.3 Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng 62

3.2.4 Ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng 63

3.2.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống 64

3.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ 66

3.2.7 Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan (DO) 67

3.2.8 Ảnh hưởng của pH môi trường 68

3.2.9 Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 69

3.2.10 Tối ưu hóa một số thông số kỹ thuật cho lên men sinh tổng hợp AVG bằng chủng S6 71

3.3 Làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG 77

3.3.1 Làm sạch dịch chứa AVG bằng li tâm 77

3.3.2 Tinh sạch dịch chứa AVG sau li tâm bằng trao đổi ion 78

3.3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lưu dịch chứa AVG và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp phụ AVG trên cột trao đổi ion 78

3.3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lưu và tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG từ cột trao đổi ion 79

3.3.2.3 Ảnh hưởng của pH dịch cấp đến khả năng hấp phụ AVG của cột trao đổi ion 81

3.3.2.4 Ảnh hưởng của pH dịch rửa giải đến hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao đổi ion 83

3.3.2.5 Mức độ tinh sạch AVG của dịch thu hồi sau trao đổi ion 83

3.3.2.6 Tăng cường tinh sạch AVG bằng nhiều cột trao đổi ion 84

3.3.3 Cô đặc dịch sau tinh sạch bằng trao đổi ion 87

3.3.4 Thực nghiệm lên men, tinh sạch và cô đặc dịch chứa AVG ở quy mô lên men 100 lít/mẻ 88

3.3.5 Tạo chế phẩm AVG 90

3.3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào của không khí sấy đến hiệu suất thu hồi của chế phẩm AVG 90

3.3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu ra của không khí sấy đến hiệu suất thu hồi của chế phẩm AVG 91

3.3.5.3 Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG 92

3.3.6 Chất lượng của chế phẩm AVG 94

3.3.6.1 Các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG 94

3.3.6.2 Các chỉ tiêu sinh học của chế phẩm AVG 95

3.3.6.3 Khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene trên quả tươi của chế phẩm AVG trong điều kiện thí nghiệm 97

3.3.7 Quy trình tạo chế phẩm AVG 98

3.4 Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG 100

3.4.1 Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) 100

3.4.1.1 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam 100

3.4.1.2 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu cảm quan của cam 102

3.4.1.3 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến sinh trưởng và phát triển của cây cam104 3.4.2 Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) 106

3.4.2.1 Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch chuối 106

3.4.2.2 Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian bảo quản chuối 110

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 119

PHỤ LỤC 139

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic axit

ACO : 1-aminocyclopropane-1-Carboxylic axit oxidase

ACS : Aminocyclopropane-1-cacboxylic axit synthase

AOAC : Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hoá phân

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic axit

EIN : Ethylene insensitive (thụ thể chống nhạy cảm ethylene)

ERS : Ethylene response sensor (thụ thể cảm biến phản ứng ethylene)

ETR : Ethylene response (thụ thể phản ứng ethylene)

GDP : Gross domestic product (tổng sản phẩm quốc nội)

HEPES : 4-2-hydroxyetyl-1-piperazine etan sulfonic axit

HPLC : High performance liquid chromatography

LD50 : Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)

LeETR : Ethylene receptor family from tomato (họ thụ thể ethylene cà chua)

LSD : Least significant difference (khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa)

MES : 2-(N-morpholino) etan sulfonic axit

MOPS : 3-(N-morpholino) propan sulfonic axit

OECD : Organisation for economic co-operation and development (Tổ chức hợp

tác và phát triển Kinh tế)

ppm : Parts per million (một phần triệu)

sp : Species (một loài, chủng thuộc chi)

SPE : Solid-phase extraction (chiết pha rắn)

spp : Several species (một số loài thuộc chi)

TAPS : 3-{[tri (hidroxymetyl) methyl] amino}propan sulfonic axit TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TSS : Total soluble solids (chất khô hòa tan tổng số)

UV : Ultra violet (tia cực tím)

VSTP : Vệ sinh thực phẩm

DANH MỤC BẢNG

TT

bảng

3.1 Khả năng ức chế xạ khuẩn S cellulosae VTCC 41913 của dịch lên

men một số chủng có đặc điểm tương tự xạ khuẩn đã phân lập

54

3.3 Kết quả thực nghiệm theo mô hình 72 3.4 Kết quả phân tích ANOVA mô hình 73

3.6 Ảnh hưởng của tốc độ li tâm đến khả năng loại bỏ xác tế bào và độ

tinh sạch của AVG trong dịch lên men chủng S6

77

3.7 Ảnh hưởng của thời gian lưu và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp

phụ AVG trên cột trao đổi ion

79

3.8 Ảnh hưởng của tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG từ

cột trao đổi ion

3.20 Chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG 94

3.21 Khả năng ức chế xạ khuẩn S cellulosae VTCC 41913 của chế

phẩm AVG

95

3.22 Chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm AVG 96 3.23 Một số chỉ tiêu kim loại nặng của chế phẩm AVG 96 3.24 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam 101 3.25 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến cảm quan của cam 103 3.26 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến thân tán của cây cam 105 3.27 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu về lộc đông cây

3.2 Khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng xạ khuẩn phân lập

được trên môi trường Gause II

55

3.3 Sắc ký đồ AVG chuẩn (Sigma)-HPLC, C18 56 3.4 Sắc ký đồ AVG sinh tổng hợp từ chủng S6-HPLC, C18 56 3.5 Ảnh khuẩn lạc sau 7 (a), 14 (b), 21 (c) ngày nuôi cấy và ảnh bào tử

của chủng S6 (d)

57

3.6 Kết quả nhân bản đoạn gen 16S rARN của chủng S6 58 3.7 Vị trí phân loại của chủng S6 và các loài có họ hàng gần 59 3.8 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 60 3.9 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 62 3.10 Ảnh hưởng của một số nguyên tố vi lượng đến khả năng sinh tổng

AVG

76

3.20 Dịch tháo sau cột trong các điều kiện pH dịch lên men khác nhau 81 3.21 Sắc ký đồ chuẩn AVG 100ppm, cột Amino_axit_Xbrige 85 3.22 Sắc ký đồ dịch lên men sau li tâm, cột Amino_axit_Xbrige 86 3.23 Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 1, cột

Điều kiện tự nhiên thuận lợi, người dân có trình độ canh tác cao, Việt Nam

có nhiều lợi thế để phát triển ngành rau quả Với diện tích và sản lượng rau quả không ngừng tăng qua các năm, đạt khoảng 1,8 triệu ha và 27 triệu tấn năm 2019, trong đó nhóm cây ăn quả đạt 1049,6 nghìn ha với sản lượng khoảng 10 triệu tấn/năm, tăng 5,7% so với năm 2018 (Tổng cục Thống kê, Hiệp hội rau quả Việt Nam, 2019) Tuy nhiên, do sản lượng lớn, thu hoạch tập trung, thời hạn sử dụng ngắn, tỉ lệ chế biến thấp, trên 90% rau quả được tiêu thụ ở dạng tươi trong khi công nghệ bảo quản hạn chế gây nhiều khó khăn cho người dân, doanh nghiệp trong tiêu thụ các sản phẩm rau quả, tiềm ẩn nguy cơ an toàn thực phẩm Mặc dù nhiều biện pháp đã được áp dụng, tổn thất sau thu hoạch rau quả ở nước ta vẫn ở mức cao, 20-25% Để khai thác, phát huy tiềm năng và lợi thế của rau quả Việt Nam, ngoài việc triển khai đồng bộ các giải pháp hiện có, cần nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ mới, tiên tiến theo chuỗi giá trị từ sản xuất đến bảo quản chế biến và tiêu thụ sản phẩm Trong đó, việc nghiên cứu ứng dụng các các công nghệ thân thiện môi trường nhằm nâng cao giá trị, giảm tổn thất sau thu hoạch và tồn dư hóa chất độc hại trên rau quả là thực sự cần thiết

Trên thế giới, để kéo dài thời hạn sử dụng của rau quả, hạn chế tổn thất, nhiều chế phẩm sinh học và hóa học an toàn đã được nghiên cứu Trong đó, hoạt chất

aminoethoxyvinylglycine (AVG) tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces spp đã được

chứng minh là an toàn và có hiệu quả cao trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo

quản nhiều loại quả tươi nhờ khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene-một phytohormon có hiệu ứng thúc đẩy quá trình chín và hư hỏng của quả trước và sau thu hoạch [30], [149] Trước những hiệu quả và tính an toàn của hoạt chất AVG, hãng Valent BioSciences Corporation (Úc) đã phát triển và sản xuất thành công sản phẩm Retain và được ứng dụng khá phổ biến hiện nay ở nhiều nước phát triển cho trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản nhiều loại quả tươi

Để tăng cường năng lực cung cấp AVG đáp ứng nhu cầu thực tiễn, một số nghiên cứu tổng hợp AVG bằng phương pháp hóa học đã được nghiên cứu Tuy nhiên, kỹ thuật hiện tại cho thấy có quá nhiều dung môi và hóa chất độc hại phải sử dụng, quy trình tổng hợp và tinh sạch phức tạp, tốn kém cùng với hiệu suất tổng hợp còn quá thấp, 1-6% [93] Do đó, phương pháp sinh học vẫn là hướng nghiên cứu chính hiện nay được sử dụng để sản xuất AVG Nhu cầu sản phẩm như Retain hiện tại là không nhỏ không chỉ ở trong nước mà cả trên thế giới, trong khi đó, nước

ta có khí hậu nhiệt đới với nguồn giống vi sinh vật rất phong phú và đa dạng, rất thuận lợi cho nghiên cứu, sản xuất các sản phẩm chứa hoạt chất sinh học như AVG Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn cùng tiềm năng của Việt Nam, trên cơ sở kế thừa và

phát triển hướng nghiên cứu sinh học, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu sinh: “Nghiên

cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp có khả năng

ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch”

2 Mục đích của đề tài

Phân lập, tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp có khả

năng sinh tổng hợp AVG từ đất trồng cây ăn quả của Việt Nam và xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao sử dụng cho trì hoãn sự chín của quả, đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm

Đánh giá được khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu quả

trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish)

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng Streptomyces spp có khả năng sinh tổng hợp AVG trong đất

trồng cây ăn quả của Việt Nam Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men,

thu hồi và tạo chế phẩm AVG Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo

được trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish)

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

4.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch- Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, vùng trồng cam tại Hưng Yên, vùng trồng chuối tiêu hồng tại Thái Nguyên

4.2 Thời gian nghiên cứu: từ 10/10/2013-10/10/2019

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp cơ sở khoa học, các dữ liệu liên quan đến các chủng xạ khuẩn

Streptomyces spp sinh tổng hợp AVG phân lập được từ đất tại một số vùng trồng

cây ăn quả của Việt Nam, môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy, lên men,

kỹ thuật tách chiết, thu hồi và tạo chế phẩm AVG Kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt chất AVG

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp

của Việt Nam góp phần bổ sung, hỗ trợ hiệu quả cho các giải pháp hiện có để tăng sản lượng, chất lượng của các loại quả tươi, tiến tới thay thế và loại bỏ từng phần các hợp chất bảo quản có nguồn gốc hóa học độc hại

5.3 Tính mới của luận án

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu sản xuất chế phẩm AVG từ xạ

khuẩn Streptomyces sp phân lập từ đất tại Việt Nam ứng dụng trong kéo dài thời

gian thu hoạch và bảo quản quả tươi;

Xây dựng được quy trình công nghệ lên men, sinh tổng hợp AVG từ xạ

khuẩn Streptomyces sp S6, tinh sạch hoạt chất AVG từ dịch lên men, tạo được chế

phẩm AVG đạt hàm lượng hoạt chất 10% tính theo khối lượng; Quy trình này có thể áp dụng ở quy mô thích hợp để sản xuất ra chế phẩm AVG đáp ứng cho nhu cầu cấp bách của sản xuất nông nghiệp ở nước ta;

Xây dựng được 02 quy trình sử dụng chế phẩm AVG tạo ra: (i) để kéo dài

thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên, (ii) để kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái

Nguyên Chế phẩm AVG đảm bảo chất lượng và ATTP Mặt khác, sử dụng chế phẩm AVG không ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất của cây trồng, chất lượng của quả

6 Bố cục của Luận án

Luận án gồm 118 trang (không kể phụ lục và tài liệu tham khảo), 29 bảng, 39 hình và 185 tài liệu tham khảo, được trình bày gồm 3 chương, 6 phần chính: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (30 trang); Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (62 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả tươi

1.1.1 Trên thế giới

Quả tươi chứa nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin, đường, axit hữu

cơ, chất xơ, chất chống oxy hóa và khoáng chất cần thiết cho sức khỏe con người [66] Với những giá trị và lợi ích mà quả tươi mang lại, nhu cầu về quả tươi trên thế giới ngày càng cao và không ngừng phát triển Tiêu thụ quốc tế đã tăng khoảng 40%, châu Á tăng khoảng 50% trong giai đoạn từ 2005 đến 2016 [62] Với dân số gần 8 tỷ người năm 2019 và dự kiến sẽ vượt quá 10 tỷ người vào năm 2050 [61], áp lực sản xuất thực phẩm trên toàn thế giới trong đó có quả tươi ngày càng lớn và có nguy cơ thiếu hụt Tuy nhiên, tổn thất sau thu hoạch quả tươi trên toàn cầu vẫn cao, trung bình 15-38% [52], trong đó ở các nước đang phát triển khoảng 24-45% và các nước phát triển khoảng 2-20% [159]

Trong sản xuất quả tươi, các nước Đông Nam Á là các nhà sản xuất chính, đóng góp tới 66% tổng sản lượng quả tươi toàn cầu [18] Nhưng với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, đặc tính suy giảm nhanh chóng và nghiêm trọng chất lượng sau khi thu hoạch, hạn chế về công nghệ bảo quản lả những rào cản thương mại quốc tế lớn nhất của quả tươi Đông Nam Á [177] Giảm thiểu tổn thất thông qua kéo dài thời hạn sử dụng là một cách hiệu quả để tăng sản lượng Giảm tổn thất quả tươi được coi là một yêu cầu chiến lược, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á [101]

1.1.2 Ở Việt Nam

Việt Nam là nước đang phát triển thuộc Đông Nam Á Những năm gần đây, ngành rau quả đã có những bước phát triển đáng ghi nhận ở tất cả các khâu, từ chọn tạo giống, kỹ thuật canh tác đến sau thu hoạch và tiêu thụ với diện tích và sản lượng liên tục tăng qua các năm, đạt 1049,6 nghìn ha, tăng 59,6 nghìn ha so với năm 2018 [13], [14] Trong đó, nhiều nhóm cây ăn quả có sản lượng cao như chuối 2100 nghìn tấn [16], cam 960,9 nghìn tấn,; bưởi 779,3 nghìn tấn, xoài đạt 814,8 nghìn tấn, thanh long 1.242,5 nghìn tấn [14].

Sản lượng lớn nhưng tổn thất sau thu hoạch quả tươi hàng năm ở Việt Nam cũng rất cao, ước tính khoảng 20-25%, tương đương 2,0-2,5 triệu tấn Trong đó, 90% quả tươi được tiêu thụ trong nước và chỉ khoảng 10% được chế biến và xuất khẩu [52] Tổn thất lớn, xuất khẩu chiếm tỉ trọng thấp, giá cả không ổn định và nguyên nhân chính vẫn là hạn chế về công nghệ từ sản xuất đến bảo quản và kết quả

là quả thường không có được chất lượng đảm bảo trong thời gian cần thiết để chế biến, tiêu thụ Đặc tính chín tập trung của quả là một trong các nguyên nhân xuất phát cho các tổn thất và thiệt hại này [117] Nhiều kỹ thuật, công nghệ đã được áp dụng để rải vụ, bảo quản sau thu hoạch như tăng cường chăm sóc để kéo dài thời gian sinh trưởng quả, đưa các giống chín sớm, chín muộn vào sản xuất, sử dụng các biện pháp để kéo dài thời gian tồn trữ quả tươi như nhiệt độ thấp độ ẩm cao, khí quyển điều chỉnh, sử dụng các hợp chất hóa học đã đóng góp một phần không nhỏ trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi Tuy nhiên, các giải pháp trên vẫn chưa khai thác được hết các tiềm năng duy trì chất lượng của quả và công nghệ sinh học là giải pháp hiện đang được thế giới quan tâm [172], trong đó, sử dụng các hoạt chất sinh học an toàn kết hợp với các biện pháp truyền thống đang được thế giới tích cực nghiên cứu để tăng cường hơn nữa thời gian duy trì chất lượng quả tươi, phục vụ nội tiêu và xuất khẩu

1.1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam (Citrus sinensis)

Cam (Citrus sinensis) là loại quả đóng góp phần lớn vào sản lượng quả có

múi trên thế giới với tỉ lệ gần 70% [21] Cam có thể phát triển tốt ở cả khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, trên nhiều loại đất bao gồm phù sa, đất cát và đất cát đỏ [169] Chất lượng quả được thể hiện qua các đặc điểm vật lý như kích thước, hình dạng, màu sắc, kết cấu và các thành phần hóa học như hàm lượng đường, axit, hương vị, vitamin C Cam chứa hàm lượng nước cao (85-90%), lượng chất khô hòa tan tổng

số (TSS) khoảng 10-20% trong đó 70-80% là carbohydrate, còn lại là axit hữu cơ, protein, lipit và muối khoáng Tuy là loại quả không có hô hấp đột biến, sản xuất ethylene với lượng nhỏ, 0,13-0,32ppm, độ nhạy không cao và ethylene không kiểm soát toàn bộ quá trình chín nhưng các nghiên cứu cho thấy ethylene liên quan đến

sự thoái hóa của diệp lục và tăng hình thành caroten, một lượng nhỏ ethylene

0,1ppm cũng làm tăng hô hấp của quả Trong quá trình chín, các quá trình diễn ra là

độ axit giảm với chủ yếu là axit citric và sự tăng hàm lượng đường, tỉ lệ TSS/axit là chỉ số phổ biến sử dụng để đánh giá độ trưởng thành của quả [43], [88] Ethylene đóng vai trò quan trọng trong thay đổi màu sắc trái cây, hương vị, thành phần hóa học và kết cấu trong trái cây có múi, tăng nếp nhăn và độ cứng vỏ quả, tăng lượng pectin hòa tan và kích thích sự lão hóa sớm của các mô quả [78]

Tại Việt Nam, cam được trồng ở nhiều vùng trên cả nước với diện tích và sản lượng cam ngày càng tăng, từ 66,8 nghìn ha, 566,1 nghìn tấn năm 2015, 110 nghìn ha, 948,1 nghìn tấn năm 2017 và khoảng 120 nghìn ha, 976 nghìn tấn năm

2018 [16] Tuy nhiên, năng lực tiêu thụ trong nước có giới hạn, xuất khẩu và chế biến còn chiếm tỉ trọng thấp dẫn đến dư thừa cục bộ làm suy giảm giá trị của quả Nếu không thu hoạch, quả sau khi chín quá sẽ tự rụng sinh lý hoặc suy thoái chất lượng Một số giống chín sớm và chín muộn đã giúp giải quyết một phần của vấn đề rải vụ nhưng chưa triệt để, việc chuyển đổi cây trồng cũng còn nhiều khó khăn do vấn đề thời gian, kinh tế trong khi thị trường lại luôn biến động Nhiều biện pháp bảo quản sau thu hoạch cũng đã được nghiên cứu, áp dụng như bảo quản lạnh, bảo quản bằng các sản phẩm tạo màng, hóa chất… Tuy nhiên, một phần do chi phí đầu

tư cho các phương pháp này còn cao, chưa phù hợp với đại đa số sản xuất nhỏ lẻ ở nước ta, một phần do đặc điểm sinh lý cam là không chín sau thu hoạch, chất lượng dinh dưỡng và chất lượng cảm quan thường suy giảm sau quá trình bảo quản gây khó khăn trong tiêu thụ tươi hoặc chế biến Trước thực trạng trên, nhu cầu một sản phẩm có thể kéo dài thời gian thu hoạch trên cây, giúp rải vụ và không ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây hiệu quả như chế phẩm AVG là không nhỏ

1.1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối tiêu (Musa cavendish)

Chuối là quả hô hấp đột biến và ethylene đóng vai trò quan trọng trong kích thích sự chín và lão hóa của chuối cả trước và sau thu hoạch [80] Quá trình chín của chuối có thể được chia thành ba giai đoạn riêng biệt là giai đoạn tiền hô hấp (giai đoạn chuối xanh), giai đoạn hô hấp, chín và cuối cùng là giai đoạn ăn được và lão hóa Các thay đổi sinh lý, sinh hóa, cảm quan diễn ra trong suốt quá trình chín

và cuối cùng là làm mềm và ăn được [110] Chuối có mức sinh tổng hợp ethylene

nội sinh không cao, 0,05-2,1ppm nhưng độ nhạy với ethylene là rất cao, với 1ppm đã kích thích sự chín [43] Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, ngoài giống, phương pháp canh tác, phân bón, thuốc trừ sâu thì điều kiện thời tiết như nhiệt độ quá cao, khô hoặc ngập nước quá mức cũng ảnh hưởng nhiều đến tăng trưởng, thời điểm thu hoạch và khả năng bảo quản của chuối sau thu hoạch [27]

0,1-Chuối có thể phát triển ở nhiệt độ 15-38oC, phát triển tốt ở nhiệt độ trên 24oC

và phát triển tối ưu ở 27oC, lượng mưa trung bình 100mm mỗi tháng và không quá

3 tháng ở mùa khô Chuối có thể trồng nhiều vụ quanh năm và được thu hoạch chủ yếu dựa trên màu vỏ, hình dáng hoặc tuổi của quả [27] Tuổi của chuối là khoảng thời gian tính từ lúc ra hoa hoặc bẻ hoa Thời điểm thu hoạch phụ thuộc vào nhu cầu thị trường hoặc yêu cầu của thời gian bảo quản sau thu hoạch Để tiêu thụ ngay, chuối có thể thu hoạch tại thời điểm trưởng thành đầy đủ nhưng nếu cần thời gian 3-

4 tuần để xuất khẩu, chuối cần thu hoạch ở độ trưởng thành 75-80% Tuy nhiên, thu hoạch quả sớm có thể ảnh hưởng đến chất lượng chín thương mại của chuối [71]

Để điều khiển thời gian thu hoạch cũng như tốc độ chín của chuối, kiểm soát ethylene có ý nghĩa đặc biệt quan trọng So với các loại quả khác, chuối thường có

tỉ lệ tổn thất cao hơn, có thể đến 50% ở các nước đang phát triển nếu không tiêu thụ kịp hoặc sử dụng các biện pháp trước và sau thu hoạch không đúng cách [97]

Tại Việt Nam, diện tích và sản lượng chuối đặc biệt là chuối tiêu luôn đứng đầu trong các loại cây ăn quả từ năm 2015 và liên tục tăng qua các năm, với khoảng

133 nghìn ha và 1943,4 nghìn tấn năm 2015, 140,2 nghìn ha và 2066,2 nghìn tấn năm 2017 và khoảng 2100 nghìn tấn năm 2018 [20] Những năm gần đây, ngoài tiêu thụ nội địa, chuối và các sản phẩm từ chuối (puree) đã được xuất khẩu Mặc dù nhiều biện pháp đã được nghiên cứu, áp dụng như các biện pháp chăm sóc [27], bao gói, sử dụng giống nuôi cấy mô để chủ động về thời gian thu hoạch, nhiều biện pháp vật lý, hóa học [32], [68], [69] để bảo quản nhưng thực tế tổn thất sau thu hoạch của chuối ở nước ta vẫn còn cao, 25-30%, chưa khai thác được hết tiềm năng giá trị của cây chuối [97] Để nâng cao giá trị và giảm tổn thất sau thu hoạch, tăng khả năng tiêu thụ chuối ở nước ta, nghiên cứu sử dụng các biện pháp sinh học như

AVG để kéo dài thời gian thu hoạch và hỗ trợ bảo quản chuối cùng các phương pháp đã có cũng thực sự cần thiết

1.2 Đặc điểm quá trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa của quả trước và sau thu hoạch

Chu trình Calvin là chu trình cơ bản nhất xảy ra trong tất cả các loài thực vật, trong đó đồng hóa và dị hóa là hai quá trình chính Quá trình tổng hợp các chất đặc trưng đồng thời tích lũy năng lượng thường được gọi là đồng hóa và quá trình phân giải các chất đồng thời giải phóng năng lượng gọi là dị hóa [37] Quả là một phần của cây nên các biến đổi sinh lý, sinh hóa trong quá trình sinh trưởng và phát triển của quả cũng không nằm ngoài các quá trình này

Sinh trưởng là sự tạo mới các cấu trúc một cách không thuận nghịch của tế bào, mô, toàn cây và kết quả dẫn đến sự tăng về số lượng, kích thước, thể tích, sinh khối dẫn đến sự tăng về lượng Phát triển là quá trình biến đổi về chất bên trong tế bào, mô và toàn cây dẫn đến sự thay đổi về hình thái và chức năng Tuy nhiên, hai quá trình này diễn ra song song nên khó phân biệt được ranh giới Trong thực tế, sinh trưởng và phát triển thường biểu hiện đan xen nhau và rất khó tách bạch [10] Như vậy, sinh trưởng có thể coi là quá trình đồng hóa và phát triển là quá trình dị hóa của của thực vật Đối với cây ăn quả, khi còn trên cây, hoạt động đồng hóa và

dị hóa diễn ra trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của quả Tuy nhiên, sau khi thu hoạch, hầu như trong quả không còn hoạt động đồng hóa vì quả đã bị tách ra khỏi nguồn cung cấp dinh dưỡng của cây Do đó hoạt động còn lại chỉ là dị hóa mà cuối cùng sẽ dẫn đến quá trình chín, lão hóa và hư hỏng của quả Biểu hiện của dị hóa xảy ra ở quả là oxy, carbohydrate bị tiêu thụ, sản sinh ra hơi nước, CO2 và khí ethylene - một phytohormone quan trọng và điển hình của thực vật [148]

1.3 Tác động của ethylene nội sinh đến quá trình sinh trưởng, phát triển

và lão hóa của quả

Tác động sinh học của ethylene (C2H4) đến sinh trưởng và phát triển của cây được khám phá đầu tiên năm 1901 bởi Neljubov và sau đó bởi Denny khi nghiên cứu ảnh hưởng của ethylene đến sự thay đổi màu của quả chanh Các nghiên cứu cho thấy, ethylene liên quan trong hầu hết các giai đoạn trong quá trình sinh trưởng,

phát triển của thực vật bậc cao như nảy mầm của hạt, rụng lá, quả, chín và lão hóa của quả [17], biến đổi màu sắc trái cây, độ cứng, chất bay hơi, tinh bột, đường và axit hữu cơ trong quá trình chín quả [36], [48], [138]

Sinh tổng hợp ethylene được mô tả bởi Yang và Hoffman (1984) [180], trong

đó methionine được chuyển đổi thành S-adenosylmethionine (SAM) bởi enzyme SAM synthetase, SAM chuyển đổi thành 1-axit aminocyclopropane-1carboxylic (ACC) và 5’-methylthioadenosine (MTA) bởi enzyme ACC synthase (ACS) ACC

bị oxy hóa bởi ACC oxydase (ACO) để sản xuất ethylene, CO2 và hydro cyanide (HCN) MTA được tái chế trở lại để sản xuất methionine thông qua chu trình Yang Khí HCN được khử độc bởi enzyme-cyanoalanine synthase [172]

Hình 1.1 Chu trình Yang [180]

Quả được phân loại thành hai nhóm là quả có hô hấp đột biến (climacteric)

và quả không hô hấp đột biến (non climacteric) Quả không có hô hấp đột biến thường sản xuất một lượng nhỏ CO2 và ethylene trong quá trình chín [137], tốc độ làm mềm xảy ra rất chậm Hầu hết các loại quả này chỉ có thể chín hoàn toàn khi vẫn còn trên cây Sau khi thu hoạch, quá trình chín chậm hoặc không chín Các quả loại không có hô hấp đột biến thường không chín dưới tác động của ethylene ngoại sinh ngoại trừ sự xuống cấp của diệp lục trong một số loại quả như cam, quýt và dứa [103]

Với quả hô hấp đột biến, ethylene nội sinh và hô hấp tăng ở mức logarit trong quá trình chín Loại quả này có thể chín cả trên cây và sau thu hoạch Tiếp xúc với ethylene ngoại sinh có thể kích hoạt quả tự động sản xuất ethylene nội sinh [70] Theo McMurchie và cộng sự (1972) [119], trong quả hô hấp đột biến tồn tại một hệ thống sản xuất ethylene chung được gọi là “hệ thống I” và “hệ thống II” hoạt động làm tăng tốc quá trình chín Hoạt động của ethylene bị kìm hãm trong suốt hệ thống I khi quả chưa trưởng thành [36], [173] Tuy nhiên, khi quả có hô hấp đột biến trưởng thành hoặc được tiếp xúc với ethylene ngoại sinh, hệ thống II được quan sát với sự gia tăng mạnh mẽ sản xuất ethylene nội sinh [119] Sau khi quả đạt tốc độ sản xuất ethylene tối đa, hoạt động sản xuất ethylene của hệ thống II kết thúc, lượng ethylene tạo ra giảm dần và làm chậm quá trình lão hóa như quan sát trong quá trình chín cà chua [172] Theo Barry và cộng sự (2007) [36], ethylene đóng vai trò điều tiết trong quá trình chín của quả và có tương tác phức tạp với các yếu tố khác trong quá trình chín và lão hóa của quả

Hình 1.2 Sơ đồ nguyên lý sinh tổng hợp và truyền tín hiệu ethylene [25], [99]

Ngoài sự tăng tốc của ethylene trong quá trình hô hấp, sản xuất ethylene cũng có thể tăng lên đáng kể do stress sinh học và phi sinh học như ánh sáng, tổn thương, côn trùng và sâu bệnh, mầm bệnh, nhiệt độ, phóng xạ, hạn hán, hóa chất, carbon dioxide, ozone, oxit nitric và các chất ô nhiễm khác [125], [158], [180] Các chất chuyển hóa như polyamines (spermine, spermidine và putrescine) [126], axit

salicylic [76] và đường [83], [179] cũng ảnh hưởng đến sản xuất ethylene trong quá trình chín trái cây Các kích thích tố thực vật khác như axit indole-3-acetic [51], axit jasmonic [185], abscisic axit [77], cytokinin [100] và brassinosteroid [164] cũng ảnh hưởng đến sản xuất ethylene trong quá trình chín

Sự chín của quả được lập trình di truyền với quy trình phức tạp liên quan đến

những thay đổi về kết cấu, màu sắc, mùi thơm và hương vị [25] Loài Arabidopsis

và cà chua đã được nghiên cứu rộng rãi để hiểu vai trò của enzyme ACS và ACO trong quá trình tổng hợp ethylene [138] 09 gen ACS (ACS1 A, ACS1 B, ACS2-ACS8) và 06 gen ACO (ACO1-ACO6) đã được xác định trong quá trình chín cà chua [106] Theo Nakatsuka và cộng sự (1998) [129] khi nghiên cứu trên cà chua, trong giai đoạn đầu của quá trình hô hấp, sản xuất ethylene được điều hòa bởi mức

độ thấp của ACS1 A, ACS3 và mức độ cao bởi gen ACS6 Hoạt động ACS được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi các hormon thực vật khác như các auxin [182]

Các gen ACO được biểu hiện khác nhau như trong quá trình chín của cà chua Theo Barry và cộng sự (1996) [35], các gen ACO1 và ACO3 hoạt động trong quá trình lão hóa của quả trong khi ACO1 được biểu hiện trong quá trình cảm ứng vết thương Trong một số cây trồng, gen ACO là được tìm thấy cũng bị ảnh hưởng bởi các phytohormon khác như các auxin, axit gibberellic [147]

Để thực hiện được các chức năng sinh lý, các nghiên cứu cho thấy, các thụ thể truyền tín hiệu ethylene đóng vai trò vô cùng quan trọng Đánh giá về các thụ thể ethylene được mô tả khá chi tiết bởi Kumar và cộng sự (2014) [99], Merchante

và cộng sự (2013) [122], theo đó các phân tử ethylene liên kết với các thụ thể ethylene (ETR) trên màng của mạng lưới nội chất và nhận biết này tạo ra một loạt

các phản ứng Theo Hall và cộng sự (2000) [72], loài Arabidopsis gồm 5 thụ thể là

ETR1, ERS1, ETR2, ERS2 và EIN4 Cà chua có bảy thụ thể ethylene từ LeETR1 đến LeETR7 [132]

1.4 Các nghiên cứu ức chế hoạt động của ethylene nội sinh trước và sau thu hoạch

Dựa trên con đường sinh tổng hợp và hoạt động của ethylene có thể thấy, để kìm hãm hoạt động của ethylene nội sinh trong quả cần ức chế quá trình sinh tổng

hợp ethylene hoặc ức chế hoạt động của ethylene như loại bỏ ethylene hoặc kìm hãm hoạt động của các thụ thể truyền tín hiệu của ethylene Do đó, các phương pháp được sử dụng cả trước và sau thu hoạch đều cơ bản dựa trên nguyên lý này

1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp

Theo Martínez-Romero và cộng sự (2007) [117], ACC là tiền chất quan trọng cho sản xuất ethylene, tiền chất này được tạo ra bởi cả enzyme ACS và ACO Các nghiên cứu gần đây cho thấy, AVG và axit aminooxyacetic (AOA) là các chất

có khả năng ức chế ACS, trong khi Co2+, α-aminoisobutyric axit (AIB), ethanol và acetaldehyde có thể ức chế ACO Tỉ lệ CO2 cao cũng đã được chứng minh là có khả năng ức chế hiệu quả cả hai enzyme ACS và ACO giúp kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch [17], [118], [180] Phương pháp xử lý nhiệt trước bảo quản cũng có thể kìm hãm hoạt động của ACS và ACO mặc dù ACS ít nhạy với nhiệt hơn [108]

1.4.1.1 Kìm hãm enzyme ACS

AVG là hoạt chất sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn Streptomyces được nghiên cứu

rất nhiều trong những năm gần đây Sản phẩm thương mại ReTain® (Valent BioSciences Corporation), chứa 15% hoạt chất AVG được đăng ký, khuyến cáo sử dụng trên một số loại quả tươi tại Mỹ và nhiều nước phát triển Qua các nghiên cứu, AVG được chứng minh là có hiệu quả trong ứng dụng cả trước và sau thu hoạch AVG thường được áp dụng một vài tuần trước khi thu hoạch giúp kéo dài thời gian thu hoạch và tăng cường chất lượng cảm quan, kéo dài thời gian lưu trữ sau thu hoạch của táo, mận, đào, lê và nhiều loại quả khác AVG giúp ức chế hoặc trì hoãn sản xuất ethylene của quả, trì hoãn quá trình làm mềm, suy thoái tinh bột và tích lũy đường hòa tan, giảm độ axit và este bay hơi tạo ra liên quan đến hương vị [41], [50], [130], [155], [167] Những kết quả tương tự đã được quan sát khi AVG được

áp dụng cho bảo quản quả sau thu hoạch [44], [67], [87], [136], [149]

1.4.1.2 Ức chế enzyme ACO

Sinh tổng hợp các chất thơm dễ bay hơi diễn ra trong suốt quá trình quả chín trên cây có liên quan đến việc sản xuất các sản phẩm chuyển hóa chất kỵ khí, như acetaldehyde và ethanol [98], đây là cơ sở cho việc áp dụng các chất này để duy trì chất lượng quả sau thu hoạch Ứng dụng acetaldehyd, ethanol cho một số loại quả

sau thu hoạch cho thấy cả hai chất giúp giảm và trì hoãn làm mềm, giảm suy thoái diệp lục và lượng lycopene tổng hợp bằng cách ức chế sinh tổng hợp ethylene thông qua sự ức chế hoạt động ACO [140], [157], [163] Tuy nhiên, acetaldehyd gần đây

đã được thêm vào danh sách các chất gây ung thư, do đó việc sử dụng acetaldehyd thương mại là rất hạn chế Do đó gần đây, các nghiên cứu tập trung nhiều hơn vào ethanol [139] Hơi ethanol giúp tăng thời gian bảo quản cà chua 1,5 - 2 lần thông qua màu sắc [145] Tuy nhiên, ứng dụng ethanol đã thất bại trong việc trì hoãn quá trình chín chuối vì nó không thấm được qua vỏ Không có kết luận chung nào được rút ra từ phương pháp xử lý ethanol, vì phản ứng của trái cây phụ thuộc vào quá nhiều các biến số như loài, giống, giai đoạn chín, nồng độ, thời gian xử lý… làm hạn chế khả năng thương mại của phương pháp này [32]

Các nghiên cứu khác cũng cho thấy một số kim loại nặng như asen (As3+), coban (Co2+) có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene do chúng có khả năng ức chế hoạt động của ACO [59] từ đó trì hoãn quá trình chín của một số loại quả như táo [166], và cà chua [31] Tuy nhiên, các hợp chất này kim loại nặng là độc hại và không được phép sử dụng trong thực phẩm

1.4.1.3 Cạnh tranh cơ chất SAM

Các polyamines (PAs) như putrescine (Put), spermidine (Spd) và spermine (Spm) là hợp chất tự nhiên trong hầu hết các sinh vật sống (cả thực vật và động vật), nơi chúng thực hiện một loạt các vai trò sinh lý PAs có khả năng cạnh tranh với ethylene trong việc sử dụng cơ chất SAM [171] Các nghiên cứu cho thấy ứng dụng PAs ngoại sinh ở thời điểm sinh trưởng (trước thu hoạch) có thể trì hoãn việc làm mềm trái cây và giảm sản xuất ethylene trong quả mơ [135], đào [41] và mận [167] Tuy nhiên, ứng dụng chính của PAs là sau thu hoạch Việc áp dụng PAs sau thu hoạch giúp ức chế sản xuất ethylene trong quả bơ, lê và cà chua [90] mặc dù theo Wang và cộng sự (1993) [175], không tìm thấy sự ức chế ethylene sau khi xử lý PAs trên táo

1.4.2 Kìm hãm các thụ thể nhận biết ethylene

Các ion bạc (bạc thiosulfate) hoặc diazocyclopentadiene đều có thể ức chế hoạt động của ethylene thông qua ức chế các thụ thể nhận biết ethylene Tuy nhiên,

chúng không được sử dụng vì bạc là kim loại nặng và cũng được coi là chất gây ô nhiễm tiềm năng trong khi diazocyclopentadiene là chất nổ nếu ở nồng độ cao [160]

Chất đối kháng với ethylene mạnh nhất hiện nay là 1-methylcylopropene MCP) 1-MCP có ái lực liên kết với thụ thể ethylene gấp 10 lần so với ethylene, độ hoạt động cao hơn ở nồng độ thấp hơn nhiều [40], [151], [161] 1-MCP có khả năng duy trì chất lượng quả tươi sau thu hoạch cả loại hô hấp đột biến và không hô hấp đột biến [40], [176] Tuy nhiên, khi ứng dụng 1-MCP trên chuối, một số rối loạn sinh lý đã xảy ra như vỏ khó bóc, tăng các chấn thương lạnh và giảm hương thơm [69], [84]

1.4.3 Loại bỏ ethylene

1.4.3.1 Hấp phụ

Hấp phụ ethylene giúp giảm bớt lượng ethylene ngoại sinh, từ đó giúp kéo dài thời gian bảo quản Ba dạng than hoạt tính đã được nghiên cứu là dạng hạt, dạng bột và dạng sợi Kết quả nghiên cứu khả năng hấp phụ ethylene cho thấy, dạng hạt cho kết quả hấp phụ tốt hơn (trên 80%), dạng sợi (70%) và khả năng hấp phụ không phụ thuộc vào nhiệt độ trong khoảng 2-10oC Một chất hấp phụ mạnh ethylene khác

là zeolit cũng thường được sử dụng Hiệu quả hấp phụ có thể lớn hơn khi các chất hấp phụ được sử dụng kết hợp với các chất oxy hóa ethylene [22], [47] Tuy nhiên, phương pháp này không áp dụng được trước thu hoạch

1.4.3.2 Oxy hóa

Kali permanganate (KMnO4) có thể oxy hóa ethylene thành CO2 và nước Các nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm này trên hồng [23], nho [183], bơ [184] và xoài [79] giúp loại bỏ ethylene từ đó trì hoãn quá trình chín quả Tuy nhiên KMnO4

không được sử dụng riêng vì độc tính cao mà thường được phối trộn và cách ly trong các chất hấp phụ

Ozon cũng có khả năng oxy hóa ethylene Tuy nhiên, sử dụng ozon ở nồng

độ cao có thể gây ra các tổn hại nghiêm trọng cho chất lượng quả [162] Sử dụng ozon là khá phức tạp vì tính ổn định thấp, ozon có thể nhanh chóng chuyển thành

O2 trong một thời gian rất ngắn, khó có thể duy trì nồng độ ổn định trong kho hoặc

trong bao bì Ozon cũng là một loại khí độc, nồng độ lớn hơn 1700 μl/l có thể gây

tử vong sau vài phút [112] do đó việc ứng dụng ozon trong bảo quản quả cũng là rất hạn chế

Trong trường hợp của TiO2, phản ứng xúc tác chuyển hóa ethylene chỉ có thể được kích hoạt bởi tia UV (300–370nm) hoặc đèn cực tím Sử dụng TiO2 cho hiệu quả cao, chi phí thấp nhưng nhược điểm là phải có tia UV trong khi tia UV có thể gây rối loạn sinh lý, ảnh hưởng đến duy trì chất lượng của quả [114]

1.4.3.4 Bộ lọc sinh học

Tất cả các công nghệ loại bỏ ethylene ở trên là phương pháp hóa học, một công nghệ sử dụng xúc tác sinh học đang được nghiên cứu Các bộ lọc sinh học này được dựa trên trên các vi khuẩn oxy hóa ethylene Theo kết quả nghiên cứu của

Kim (2003) và (2006) [95], [96], bộ lọc sinh học sử dụng Bacillus hoặc

Pseudomonas chứa than hoạt tính có khả năng đạt được hiệu quả loại bỏ ethylene

lên đến 100% Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu trong lĩnh vực này, đặc biệt là về hiệu quả của các hệ thống này trong việc giảm ethylene được sản sinh liên tục trong quá trình bảo quản quả [117]

Nhiều biện pháp khác cũng đã được nghiên cứu để kìm hãm tác động của ethylene Trước thu hoạch, các chất kích thích sinh trưởng như salicylic axit (SA), auxin, gibberellic axit (GA3), cytokinin đã được nghiên cứu để làm chậm quá trình chín và lão hóa của quả Một số chất như jasmonate axit (JA) và methyl jasmonate (MeJA), oxalic axit (OA) để kìm hãm tác động của các tác nhân sinh học và phi sinh học, nitric oxide (NO) để giảm hoạt động của ACS và ACO cũng đã được

nghiên cứu Kết quả cho thấy, các tác nhân này cũng có những hiệu quả nhất định trong kìm hãm sinh tổng hợp hoặc ức chế hoạt động của ethylene Tuy nhiên, chúng được đánh giá là không đặc hiệu, ít có mối tương quan chặt chẽ nào được tìm thấy giữa các hoạt chất này và tốc độ chín của quả như trong trường hợp của GA3 [57] Bên cạnh đó, các tác nhân này cũng còn nhiều các nhược điểm như việc sử dụng auxin ở nồng độ cao có thể đẩy nhanh quá trình sản xuất ethylene và từ đó có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa [34] Sử dụng MeJA ở nồng độ không hợp lý lại có thể

là chất kích thích sinh tổng hợp ethylene [94], sử dụng OA ở nồng độ cao hơn khả năng chịu đựng của tế bào có thể gây tác dụng ngược là làm chết cây hoặc tăng tốc

độ nhiễm bệnh gây hư hỏng quả [102] Độc tính của SA cũng đã được ghi nhận, SA

có thể gây ra các bệnh về da liễu thậm chí có thể gây tử vong cho người sử dụng [109], OA có thể gây bỏng, buồn nôn, viêm dạ dày, ruột và nôn mửa, sốc hoặc co giật OA đặc biệt độc khi ăn, một lượng nhỏ 5 đến 15 gram (71 mg/kg) có thể gây

tử vong cho người [102]

Sau thu hoạch, một số nghiên cứu như sử dụng 2,5-norbornadiene, diazocyclopentadiene để ngăn chặn kết hợp giữa ethylene và thụ thể từ đó giúp kéo dài thời gian bảo quản Tuy nhiên, 2,5-norbornadiene có mùi khó chịu và có thể dẫn đến ung thư, diazocyclopentadiene là một chất có nguy cơ nổ trong điều kiện ánh sáng mạnh, do đó, thương mại ứng các chất này còn hạn chế [89] Các phương pháp truyền thống để ức chế sinh tổng hợp, kìm hãm hoạt động ethylene là nhiệt độ thấp,

độ ẩm cao và khí quyển điều chỉnh (Controlled atmosphere-CA) Ở nhiệt độ phòng,

hô hấp trái cây được duy trì ở mức bình thường và giảm ở các nhiệt độ thấp hơn Tuy nhiên, nhiệt độ quá thấp có thể gây tổn thương lạnh gây hư hỏng quả Bản chất của công nghệ CA là kiểm soát nồng độ O2 trong môi trường lưu trữ để việc kích hoạt ACC oxydase bị chậm lại, do đó, thời hạn sử dụng của trái cây có thể được kéo dài Thông thường, 2%-3% hàm lượng O2 và 5%-15% hàm lượng CO2 thường được

sử dụng trong kho CA [89] Tuy nhiên, biện pháp này cần chi phí đầu tư cơ sở hạ tầng lớn, khó áp dụng trong điều kiện sản xuất nhỏ lẻ

Ngoài sử dụng các phương pháp trên, lượng ethylene tạo ra có thể được điều khiển bằng cách “đóng” hoặc làm giảm sự tạo ethylene trong quả bằng công nghệ

gen như ức chế sự biểu hiện của enzyme ACS bằng một antisense hoặc một đoạn của bản sao gen synthase được chuyển vào genome của thực vật, chuyển gen ACC diaminase làm giảm lượng ACC để tạo ethylene Chuyển gen SAM hydrolase từ

trực khuẩn E.coli T3, trong đó SAM được chuyển hóa thành homoserine làm giảm

tiền chất của ethylene hoặc ức chế sự biểu hiện của gen ACO thông qua công nghệ anti-sense giảm sự điều khiển gen ACO dẫn đến ức chế sự hình thành ethylene, từ

đó làm chậm sự chín của quả [41] Tuy nhiên các kỹ thuật này khá phức tạp nên hiện mức độ phổ biến chưa cao, chưa kể việc biến đổi gen có thể ảnh hưởng đến chất lượng của quả hoặc không được nhiều nước chấp nhận

Như vậy, để kìm hãm tác động của ethylene, AVG là hoạt chất có đặc điểm khác biệt so với các biện pháp khác là có thể ứng dụng hiệu quả và an toàn cho cả trước và sau thu hoạch, trong khi các chất có tác động hiệu quả khác chủ yếu thích hợp trong bảo quản quả sau thu hoạch Không những thế, cơ chế tác động của AVG

là ức chế enzyme ACS, khá khác biệt so với các chất và các phương pháp còn lại, không mâu thuẫn khi sử dụng cùng các chất hoặc phương pháp khác Tính chất này giúp AVG ngoài khả năng ức chế ethylene độc lập, nó còn có tiềm năng rất cao trong hỗ trợ các phương pháp còn lại trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi sau thu hoạch

1.5 Hoạt chất AVG

AVG ((S)-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic axit) là một loại amino axit, thuộc nhóm hợp chất tự nhiên vinylglycine thu được trong quá trình lên

men xạ khuẩn Streptomyces AVG được phát hiện và công bố chính thức trên US

Patent 3,751,459 năm 1973 nhờ khả năng kháng mạnh mẽ với nồng độ rất thấp

(mM) nhiều loại vi sinh vật như E coli, Bacillus simplex, Staphylococcus aureus,

Streptomyces cellulosae, Bacillus cereus [38], Erwinia amylovora [30]

1.5.1 Cấu tạo phân tử AVG

AVG có công thức phân tử là C6H12N2O3 với cấu tạo phân tử là NH2-CH2

-CH2-O-CH=CH-CH(NH2)-COOH, khối lượng phân tử là 160,173 g/mol, khối lượng đồng vị đơn là 160,084793 Dalton AVG có nhiều tên gọi khác nhau với tên

hệ thống là (2S,3E)-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic axit và một số tên khác

như: (2S,3E)-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic axit [ACD/IUPAC Name]; (2S,3E)-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic axit [ACD/Index Name]; Acide AVG; aviglycine …

1.5.2 Tính chất hóa lý của AVG

AVG là một bazơ amino axit nên mang đầy đủ các tính chất của một phân tử amino axit Với pKa axit là 2,30, pKa bazơ 9,54 và điểm đẳng điện là 9,10, phân tử AVG đa số mang điện tích dương ở pH≤2,30 và đa số mang điện tích âm ở pH≥9,54 Theo công bố, tại pH ≤ 6,5, độ hòa tan của AVG đạt tới 8337 mg/ml, độ

pH cho độ hòa tan thấp nhất là tại pH 9,2 với 152mg/ml, do đó, sử dụng pH để có thể kết tủa được AVG là rất khó nhưng lại là tính chất thuận lợi để có thể áp dụng loại bỏ các tạp chất khác bằng pH mà không kết tủa AVG, từ đó tinh sạch AVG Đây là cơ sở quan trọng cho các thí nghiệm tách và tinh sạch hoạt chất AVG từ dịch

lên men xạ khuẩn Streptomyces spp (https://chemicalize.com/#/calculation)

1.5.3 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene của AVG

1.5.3.1 ACS và các tác nhân kìm hãm ACS

ACS thuộc họ protein chứa nhóm pyridoxal-5’-phosphate (PLP) cofactor, được biết đến như những enzyme phụ thuộc PLP Các enzyme này bao gồm các tính chất như phản ứng chuyển hóa một nhóm amino thành ketoaxit, từ đó hình thành các amino axit mới (transamination) hoặc xúc tác loại bỏ một nhóm amino axit ra khỏi phân tử (deamination), phản ứng mà nhóm carboxylic axit được sản xuất bởi xử lý vật chất với carbon dioxit (carboxylation) và một loại phản ứng hữu

cơ, trong đó hai nhóm thế được loại bỏ khỏi một phân tử trong cơ chế một hoặc hai bước (elimination hoặc replacement) [115]

Mặc dù đa dạng về trình tự và các hoạt động xúc tác, cấu trúc tinh thể của các enzyme phụ thuộc PLP lại có sự bảo tồn nổi bật trong lõi xúc tác ACS chuyển hóa Adomet thành ACC thông qua phản ứng loại bỏ carbon β, γ [104] Theo Alexander và cộng sự, (1994) [24], Christen và cộng sự, (1985) [49], sắp xếp thứ tự chuỗi phân tử của ACS và các enzyme phụ thuộc PLP cho thấy ACS hầu hết tương

tự như aspartate aminotransferases và tyrosine aminotransferases Trong hầu hết các loài thực vật, ACS được mã hóa bởi các họ gen khác nhau được điều chỉnh bằng các

yếu tố môi trường và các nhân tố phát triển khác nhau như ở loài Arabidopsis, có 8

gen mã hóa ACS hoạt động và một gen bổ sung mã hóa một xúc tác bất hoạt enzyme, ACS1 [105], [178]

+ Các tác nhân kìm hãm hoạt động của ACS:

Hoạt động ACS có thể được điều chỉnh đảo ngược bởi các chất khác nhau liên kết với con đường tái tạo methionine, quá trình trao đổi chất của SAM, tổng hợp polyamine và các chất tương tự hóa học của SAM hoặc các chất ức chế các enzym liên kết phosphate pyridoxal [82] Các chất tương tự như hydroxylamine hoặc vinylglycine là các chất ức chế tiềm năng hoạt động của các enzyme PLP-dependent trong các thí nghiệm và thực tế Các chất hydroxylamine tương tự bất hoạt enzyme tạo ra các oxime ổn định với PLP Rhizobitoxine, AVG và MVG là các chất có cấu trúc tương tự vinylglycine Trong đó, Rhizobitoxine được tổng hợp

bởi cây họ đậu Bradyrhizobium elkanii và vi khuẩn gây bệnh thực vật Burkholderia

andropogonis và cũng có thể kìm hãm ACS trong con đường sinh tổng hợp

methionine và ethylene tương ứng Tuy nhiên, trong các vinylglycine thử nghiệm thì AVG là có khả năng ức chế ACS mạnh mẽ nhất [82]

1.5.3.2 Cơ chế ức chế ACS của AVG

Theo Capitani và cộng sự (2005) [46], AVG có khả năng tác động trực tiếp lên nhóm chức pyridoxal photphat của enzyme ACS, kết hợp với enzyme ACS tạo phức ACS-AVG, từ đó bất hoạt enzyme ACS:

Hình 1.3 Cơ chế ức chế hoạt động enzyme ACS nhờ phản ứng tạo phức

của AVG Theo đó, để xác định quá trình tương tác giữa ACS và AVG, thí nghiệm được bố trí với ACS, AVG trong dung dịch đệm pH 6,3 đệm chứa MES, MOPS, 4-hydroxy-N-methylpiperidine và 10% glycerol ở 25oC ACS được hấp thụ ở bước sóng 421nm Kết quả trên máy đo quang phổ Agilent Technologies 8453 UV-visible cho thấy sự hình thành ketimine ở bước sóng 341nm Tiến hành xác định sự hình thành ketimine ở bước sóng 341nm với hỗn hợp AVG, TAPS, pH 8,5,10% glycerol, EDTA, DTT và PLP, kết quả cho thấy phức ketimine giữa AVG và ACS tăng khi nồng độ AVG tăng

Theo Yasuta và cộng sự (1999) [181], khả năng ức chế ACS của AVG cũng

được xác định qua hàm lượng ACC tạo thành bằng cách oxy hóa tạo ethylene Hoạt động ACS được đo bằng cách ủ (30oC, 15 phút) một hỗn hợp phản ứng có chứa ACS, SAM, pyridoxal phosphate, albumin huyết thanh bò và đệm HEPES-KOH,

pH 8,5 với các nồng độ khác nhau của AVG Kết quả cho thấy, hoạt tính của ACS giảm khi nồng độ AVG tăng và gần như hoàn toàn ACS bị bất hoạt với nồng độ AVG trong hỗn hợp là 2µM/0,4ml hỗn hợp phản ứng

1.6 Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG

1.6.1 Sản xuất AVG bằng xạ khuẩn Streptomyces spp

1.6.1.1 Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces spp

+ Phân loại và phân bố:

Chi Streptomyces là giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt tên năm

1943, đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10µm, khuẩn lạc thường không lớn, có đường kính khoảng 1-5mm Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ty khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kị nước Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn thậm chí cả trong

cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật [26], [174]

+ Sinh trưởng:

Theo Hasani và cộng sự (2014) [73], Streptomyces spp là vi sinh vật hiếu

khí và chúng cần nguồn carbon, nguồn nitơ, các muối khoáng để phát triển

Streptomyces spp có thể phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác

nhau như Muller-Hinton agar, trypticase soy agar và nutrient agar với calcium

chloride Các đặc điểm sinh trưởng của Streptomyces spp cho thấy phần lớn các chủng Streptomyces spp là ưa ấm và phát triển ở nhiệt độ 10-37oC nhưng có ba loài

chịu nhiệt là S thermonitrificans, S thermovulgaris và S thermoflavus phát triển ở

nhiệt độ 45-55oC Các chủng Streptomyces spp phát triển trong pH 6,5-8,0, có khả

năng chịu hạn và cũng rất nhạy cảm với nước

Theo Tawfik và cộng sự (1991) [165] khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt

độ, thông khí, các nguồn carbon, nitơ khác nhau đến sinh trưởng của hai chủng S

aureofaciens MY18 và S roseviolaceus MR13 Kết quả cho thấy, chủng MY18

không phát triển ở nhiệt độ 15oC và 45oC, sinh khối đạt cao nhất ở nhiệt độ 25oC và

30oC (511 và 543mg/100ml) trong khi chủng MR13 có thể phát triển được ở tất cả các nhiệt độ khảo sát, 15-45oC và sinh khối đạt cao nhất ở nhiệt độ 30oC, đạt 234mg/100ml Về ảnh hưởng của độ thông khí, kết quả cho thấy chủng phát triển tốt hơn đáng kể ở điều kiện lắc so với điều kiện tĩnh Nghiên cứu với việc bổ sung các nguồn carbon khác nhau, kết quả cho thấy cả 02 chủng phát triển kém với sucrose và đạt sinh khối cao nhất với tinh bột sau 11 ngày nuôi cấy Khảo sát với các nguồn nitơ khác nhau, kết quả cho thấy cả hai chủng phát triển kém với ure và phát triển tốt khi nguồn nitơ là peptone

Theo Mariadhas và cộng sự (2014) [116], khi nghiên cứu tối ưu hóa dinh

dưỡng và các điều kiện lên men các chủng Streptomyces spp là ERI-1, ERI-3 và

ERI-26 Kết quả cho thấy, glucose và ammonium nitrate được xác định là nguồn cacbon và nitrogen tốt nhất, tương ứng cho sự tăng trưởng và sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn với pH trung bình 7,0 và nhiệt độ lên men là 30oC Trong một nghiên cứu khác, khi nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện dinh dưỡng đến sinh

trưởng của chủng Streptomyces antibioticus, kết quả cũng cho thấy, chủng S

antibioticus có thế phát triển trên nhiều nguồn carbon như glucose, glycerol,

trehalose, tinh bột và nguồn nitơ là axit aspartic [121] Như vậy, các nghiên cứu cho

thấy xạ khuẩn Streptomyces spp là các chủng vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm, phát triển

tốt ở nhiệt độ 25-30oC, có thể đồng hóa được nhiều nguồn carbon, nitơ khác nhau

pH phát triển từ 5-10 nhưng thường phát triển tốt ở khoảng pH 7 với sự có mặt của các nguyên tố khoáng

+ Trao đổi chất:

Cũng như hầu hết các vi sinh vật khác, trong quá trình sinh trưởng và phát

triển, xạ khuẩn Streptomyces spp cũng tạo ra hai loại sản phẩm trao đổi chất chủ yếu

là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là sản phẩm liên quan trực tiếp tới sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của chủng, các sản phẩm này thường thực hiện chức năng sinh lý của tế bào Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là các hợp chất không tham gia trực tiếp vào sự tăng trưởng, phát triển hoặc sinh sản bình thường của tế bào sinh vật Do đó, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp khác với các sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là chúng không cần thiết cho sự tăng trưởng, sản xuất phụ thuộc vào điều kiện như môi trường lên men và chủng thường sản xuất một nhóm các chất liên quan chặt chẽ về cấu trúc phân tử và với số lượng lớn [39], [57], [86]

Streptomyces spp có khả năng tạo ra vô số các chất chuyển hóa đa dạng và

phức tạp Các amino axit được hình thành ở nửa đầu của quá trình sinh trưởng và trao đổi chất trong chu kỳ sống của chủng Khi không có amino axit trong môi

trường, sự phát triển của Streptomyces spp gần như không xảy ra [75] Theo

El-Mansi và cộng sự (2012) [60], các nghiên cứu đã khẳng định rằng amino axit là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp của vi sinh vật và hình thành ngay lập tức trước khi hình thành các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp [123]

Theo Maheshwari và cộng sự (2010) [113], xạ khuẩn sau khi cấy vào môi trường dinh dưỡng phù hợp, trong pha log (pha phát triển nhanh, trophophase), nhiều sản phẩm trao đổi chất sẽ ngay lập tức được sản xuất và chúng được gọi là các sản phẩm trao đổi chất chính (sản phẩm trao đổi chất sơ cấp) Các sản phẩm này bao gồm các enzyme, các amino axit, các protein, carbonhydate, lipit, các vitamin cần cho sự phát triển của chủng và các alcohol, các axit hữu cơ cung cấp năng lượng cho trao đổi chất Trong khi đó, các sản phẩm thứ cấp như các chất kháng

sinh, độc tố, chất màu lại không sản xuất trong pha log mà chúng hình thành trong pha ổn định (idiophase) Các sản phẩm này bắt đầu hình thành khi sự phát triển bị giới hạn bởi sự cạn kiệt một số nguồn dinh dưỡng chính như carbon, nitơ, phosphate

Theo Hodgson (2000) [75], chuyển hóa sơ cấp trong hoạt động sinh trưởng

của các chủng Streptomyces spp bao gồm các phản ứng dị hóa và đồng hóa trong

quá trình phát triển sinh khối, là các phản ứng sử dụng năng lượng để tổng hợp các protein, nucleic axit, lipit, các polysaccharide và rất nhiều các amino axit như họ các amino axit thơm phenylalanine, tyrosine, p-aminobenzoate, tryptophan, histidine, các axit amin họ glutamate như proline, arginine, các amino axit chứa chuỗi và nhánh như isoleucine, valine, các amino axit họ aspartate như lysine, threonine, các amino axit họ pyruvate như alanine, các amino axit họ serine như serine, glycine, cysteine và các amino axit chứa lưu huỳnh như cysteine, methionine, S-adenosyl methionine

+ Khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG của xạ khuẩn Streptomyces spp.:

Theo Fernández và cộng sự (2004) [65], các gen hom (thrA), thrB và thrC

mã hóa homoserine dehydrogenase, homoserine kinase (HK) và threonine synthase

đã được nghiên cứu trên chủng xạ khuẩn Streptomyces sp NRRL 5331 nhằm xác

định vai trò của các gen trên trong sinh tổng hợp của AVG Tiến hành đột biến định hướng một trong ba gen, kết quả cho thấy gen thrC không có ảnh hưởng đến sản xuất của AVG, trong khi sự gián đoạn của thrB chặn HK hoạt động và giảm đáng

kể năng suất của chất chuyển hóa AVG, có thể là do sự tích tụ Sự gián đoạn gen hom khiến sự sinh tổng hợp AVG hoàn toàn bị chặn AVG cũng đã được chứng

minh là một sản phẩm ngoại bào của xạ khuẩn Streptomyces sp NRRL 5331 Về

năng lực sinh tổng hợp AVG, số tài liệu công bố về khả năng này của các chủng

Streptomyces spp là khá hạn chế ngoài công bố của Fernández (2002) [64] Theo

đó, chủng Streptomyces sp NRRL 5331 có khả năng sản xuất 80µg/ml (1,25µg

AVG/g chất khô trong môi trường (YEPEG) được tìm thấy ở 48 giờ sau lên men trong nửa sau của giai đoạn sinh trưởng theo cấp số nhân và giảm nhanh sau đó

1.6.1.2 Lên men xạ khuẩn Streptomyces spp để sản xuất AVG

Có khá ít thông tin về quy trình lên men các chủng Streptomyces spp để sinh tổng hợp AVG Tuy nhiên, theo Berger và cộng sự (1973) [38], chủng Streptomyces

sp X-11085 phân lập từ ở Arlington, bang California được bổ sung vào bộ sưu tập

NRRL của Hoa Kỳ dưới tên Streptomyces sp NRRL 5331 và sử dụng cho nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất AVG Trong quy trình này, bào tử chủng Streptomyces

sp X-11085 từ môi trường dinh dưỡng được cấy vào 2 bình tam giác, mỗi bình dung tích 6 lít chứa 2 lít môi trường dịch Trypticase soy (Baltimore Biological Laboratories) Lên men ở 28oC trong 72 giờ trên máy lắc ở tốc độ 240 vòng/phút 4 lít môi trường được bổ sung vào tank dung tích 380 lít chứa 227 lít dịch môi trường

có thành phần như sau (g/l): cerelose (corn products) - 10,0; bacto-peptone (Difco) - 5,0 g/l; bacto-yeast extract: - 3,0; ferrous ammonium sulfate-hexahydrate - 0,03; pH của môi trường là 6,8 được điều chỉnh trước khi thanh trùng Lên men ở 28oC, tốc

độ cấp khí 85 l/ph và khuấy ở 200 vòng/phút Bổ sung chất chống tạo bọt Dow Corning AF Sau 41 giờ kết thúc quá trình lên men, tách loại bỏ xác tế bào bằng li tâm để thu dịch nổi chứa AVG

NH4OH 1,0 M Dịch sau rửa giải được cô cạn và điều chỉnh pH về 3,3 bằng HCl

Bổ sung than hoạt tính Norite A sau đó dịch được lọc qua Celite Hyflo có rải than hoạt tính Norite A thu dịch lọc Rửa AVG còn bám trên giấy lọc và tất cả dịch lọc được cô cạn Bổ sung dung môi ethanol/H2O/NH4OH có tỉ lệ 85/15/5 và chuyển dịch sang cột Merck silica gel, 0,05-0,2 mm Cô cạn dịch thu được và chuyển vào cột trao đổi ion chứa nhựa AG50WX4 (50-100 mesh, H+ form) Sau khi rửa cột với nước và dung dịch pyridine 10%, AVG được rửa giải bằng NH4OH 1,5 M Dịch rửa