XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TANNINS TỔNG TRONGTHỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT ĐO QUANG

Ngày nay, để xác định hàm lượng của các chất trong nhiều loài thựcvật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại như quang phổ UV - Vis, HPLC,quang phổ đạo hàm… đã được áp dụng vào việc p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TANNINS TỔNG TRONG

THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT ĐO QUANG

với TS Trần Quang Hải - giảng viên khoa Hóa - Trường Đại học Công

Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Tiến Đạt - Trung

tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thứckinh nghiệm quý báu cho em

Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựatinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn

Trong quá trình làm báo cáo này mặc dù đã được sự giúp đỡ tận tình vàhết sức cố gắng nhưng do trình độ và thời gian nghiên cứu còn hạn chế nênkhông thể tránh được những thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận được ýkiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020 Sinh viên

Phạm Thị Hoa

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ TANIN 2

1.1.1 Khái niệm, tính chất 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.2.1 Tanin thủy phân 2

1.1.2.2 Tanin ngưng tụ 5

1.1.2 Hoạt tính sinh học của tanin 7

1.1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn 7

1.1.2.2 Hoạt tính kháng vi-rút 8

1.1.2.3 Hoạt tính chống viêm 8

1.1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa 8

1.1.3 Một số phương pháp định lượng tanin 9

1.1.3.1 Phương pháp chuẩn độ 9

1.1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 10

1.1.3.3 Phương pháp đo quang 11

1.2 CÁC THỰC VẬT CHỨA NHIỀU TANIN 12

1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN 14

1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang 14

1.3.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS 14

1.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy đo quang phổ 15

1.3.1.3 Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis 17

1.3.1.4 Phương pháp định lượng 18

pháp đo quang 21

1.4 GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 22

1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 22

1.4.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 24

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 26

2.1.1 Hóa chất 26

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị 26

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29

2.3 CHUẨN BỊ DÃY DUNG DỊCH CHUẨN 30

2.4 CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH 31

2.5 CHUẨN BỊ MẪU KHẢO SÁT GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP 31

2.6 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN ĐO QUANG 33

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 34

3.3 KẾT QUẢ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP 36

3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG TỔNG TANIN NGƯNG TỤ TRONG MỘT SỐ MẪU CAO CHIẾT TRÀ HOA VÀNG 38

KẾT LUẬN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid

AOAC: Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of

Official Analytical Chemists)

MeOH: Methanol

Hình 1.1: Liên kết hidro giữa tanin với protein 2

Hình 1.2: Cấu tạo của axit gallic, axit m - digallic và axit m - trigallic 3

Hình 1.3: Cấu tạo của axit ellagic và corilagin 4

Hình 1.4: Cấu tạo của các flavanol 5

Hình 1.5: Cấu tạo của epigallocatechin gallate 6

Hình 1.6: Cấu tạo của epicatechin gallate 7

Hình 1.7: Cấu tạo của gallocatechin gallate 7

Hình 1.8: Một số loài thực vật chứa nhiều tanin 13

Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ 17

Hình 1.10: Dạng đồ thị của phương pháp đường chuẩn 19

Hình 1.11: Đồ thị đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn 21

Hình 1.12: Nguyên lý phản ứng giữa tanin ngưng tụ với thuốc thử 22

Hình 2.1: Hệ thống máy đo quang UV - Vis 27

Hình 2.2: Hệ thống máy cô quay chân không 27

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình chiết mẫu lá trà hoa vàng 29

Hình 3.1: Phổ hấp thụ của proanthocyanidin A2 33

Hình 3.2: Đường chuẩn của proanthocyanidin A2 35

Bảng 1.1: Hàm lượng tanin trong một số loài thưc vật 13

Bảng 1.2: Dãy dung dịch chuẩn của phương pháp thêm chuẩn 20

Bảng 2: Bảng dãy đường chuẩn của proanthocyanidin A2 30

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quy trình định lượng 35

Bảng 3.2: Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 37

Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng 38

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước có thảm thực vật đa dạng và phong phú vớinhiều loài thực vật, được sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổdưỡng nâng cao sức khỏe cho con người Có nhiều loài thực vật được ví như

là một loại dược liệu được dùng phổ biến trong y học dân gian làm thuốc Cácnghiên cứu cho thấy, tanin có trong nhiều loài thực vật như: ổi, chè xanh,măng cụt Tanin có nhiều hoạt tính sinh học như: hoạt tính kháng khuẩn,kháng nấm, chống khối u, kháng virut nên nó được ứng dụng khá rộng rãitrong y học hiện đại ngày nay

Ngày nay, để xác định hàm lượng của các chất trong nhiều loài thựcvật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại như quang phổ UV - Vis, HPLC,quang phổ đạo hàm… đã được áp dụng vào việc phân tích Trong đó, quangphổ UV - Vis là phương pháp được sử dụng rộng rãi vì nó có độ nhạy cao,phân tích thuận tiện

Song song với việc tìm ra các kĩ thuật mới thì việc kiểm tra lại giá trịcủa phương pháp phân tích với mục đích đảm bảo độ chính xác, độ tin cậycủa số liệu phân tích và tăng tính ứng dụng của phương pháp đó trong thực

tiễn cũng rất quan trọng Vì vậy, tôi chọn đề tài “Xây dựng phương pháp

định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang’’.

Mục tiêu của đề tài: Xây dựng phương pháp và định lượng tanin tổngtrong một số mẫu cao chiết từ thực vật bằng phương pháp đo quang phổ

Nội dung nghiên cứu:

- Xây dựng phương pháp định lượng tanin tổng trong thực vật bằngphương pháp đo quang phổ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giớihạn định lượng (LOQ) của phương pháp

- Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng tanin tổngtrong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng

Hình 1.1: Liên kết hidro giữa tanin với protein

* Tính chất:

Tanin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong dung môi phâncực như cồn, aceton, methanol, propylene glycon, glycerin etylacetat …không tan trong các dung môi kém phân cực như: hexan, benzen, dầu hỏa …

1.1.2 Phân loại

Dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia tanin làm 2 loại chính: tanin thủyphân và tanin ngưng tụ

1.1.2.1 Tanin thủy phân [1]

Tanin thủy phân được còn được gọi là tanin pyrogallic Loại này cónhững đặc điểm sau: Khi thủy phân bằng axit hoặc bằng enzym tanase thì giảiphóng ra phần đường và phần không đường Phần đường thường là glucose,

HO

OH

OO

COOH

OHOH

HO

HO

OH

OHO

OH

O HO

đôi khi gặp đường đặc biệt ví dụ đường hamamelose Phần không phải đường

là các axit Axit hay gặp là axit gallic Các axit gallic nối với nhau theo dâynối depsid để tạo thành axit m-digallic, m-trigallic v.v Phần đường và phầnkhông phải đường nối với nhau theo dây nối este (không phải dây nối acetal)nên người ta coi tanin loại này là những pseudo - glycosid

Hình 1.2: Cấu tạo của axit gallic, axit m - digallic và axit m - trigallic

Tính chất đặc trưng của tanin loại này là:

+ Khi cất khô ở 180 - 200°C sẽ thu được pyrogallol là chủ yếu

+ Khi đun nóng với HCl sẽ cho axit gallic hoặc axit ellargic

+ Cho kết tủa bông với chì axetat 10 %

OHO

O

O

O O

OH OH

HO

OH

OH

OH

+ Cho kết tủa màu xanh đen với muối sắt (III)

+ Thường dễ tan trong nước

* Ví dụ về cấu trúc của các tanin thủy phân, được phân lập trong thựcvật:

Năm 2005, Masturah Markom và các cộng sự đã nghiên cứu phân lậpđược 3 loại của tanin thủy phân: axit gallic, axit ellagic, corilagin trong cây

Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria) [17].

axit ellagic

corilagin

O

OH

OHOH

Hình 1.3: Cấu tạo của axit ellagic và corilagin

1.1.2.2 Tanin ngưng tụ [1]

Tanin ngưng tụ hay còn được gọi là tanin không thuỷ phân được, taninpyrocatechic hay phlobatanin Các chất thuộc nhóm này là nhữngpolyflavonoid thường được tạo thành do sự ngưng tụ từ các đơn vị flavan -3-

ol hoặc flavan-3,4- diol

Tanin nhóm này có những đặc điểm sau:

- Dưới tác dụng của axit hoặc enzym dễ tạo thành chất đỏ tanin hayphlobaphen Phlobaphen rất ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng hiệphoá kèm theo oxy hoá, do đó tanin nhóm này còn được gọi là phlobatanin.Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như vỏ Canh ki na, vỏ Quế

- Khi cất khô thu được pyrocatechin là chính

- Cho kết tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III)

- Cho kết tủa bông với nước brom

- Khó tan trong nước hơn tanin pyrogallic

Tanin ngưng tụ hay gặp trong các chi Acacia, Camellia, Cinchona,Cinnamomum, Rheum, Salix

flavan - 3 - ol flavan - 3,4 - diol

Hình 1.4: Cấu tạo của các flavanol

* Ví dụ về cấu trúc của các tanin ngưng tụ, được phân lập trong thựcvật:

Năm 2000, Kang J H và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập EGCG

(epigallocatechin gallate) có trong trà xanh (Camellia sinensis), ban đầu loại

bỏ caffein bằng chloroform Sau đó sử dụng hai cột sắc ký lỏng áp suất cao(HPLC) chuẩn bị rửa giải bằng hệ dung môi (axit axetic: acetonitril: nước) đểthu được EGCG với độ tinh khiết hơn 98% [24]

Hình 1.5: Cấu tạo của epigallocatechin gallate

Năm 2001, Xueli Cao và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập được haichất: GCG (Gallocatechin gallate), ECG (Epicatechin gallate) từ trà xanh

(Camellia sinensis) bằng cách sử dụng sắc ký phân bố ngược dòng với hai

hỗn hợp dung môi (ethyl acetate: ethanol: nước; hexane: ethyl acetate: nước).[25]

Hình 1.6: Cấu tạo của epicatechin gallate

Hình 1.7: Cấu tạo của gallocatechin gallate

1.1.2 Hoạt tính sinh học của tanin

Theo các nghiên cứu khoa học của nước ngoài thì tanin là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học

1.1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Các hoạt tính kháng khuẩn của tanin đã được công nhận từ trước đây vàđộc tính của tanin đối với vi khuẩn, nấm và nấm men đã được nhà khoa họcScalbert nghiên cứu [6] Các cơ chế được đề xuất cho đến nay để giải thích

hoạt tính kháng khuẩn của tanin bao gồm ức chế các enzym của vi khuẩnngoại bào, tác động trực tiếp lên quá trình chuyển hóa của vi khuẩn thông qua

sự ức chế quá trình photphoryl oxy hóa, sự khử ion kim loại gây ra sự thayđổi hình thái của tế bào và tăng tính thấm của màng [7] Các bằng chứng đãchỉ ra rằng màng tế bào vi sinh vật là nơi chủ yếu tác động ức chế của tanin[8] Do tính kết tủa với protein là một tính chất phổ biến cho tất cả các tanin,cho nên hoạt tính kháng vi khuẩn của các loài vi sinh vật có liên quan chặtchẽ đến thành phần hóa học và cấu trúc của tanin

1.1.2.2 Hoạt tính kháng vi-rút

Tanin đã được các nhà nghiên cứu chứng minh có hoạt tính đáng kểchống lại một số loại vi- rút, như vi- rút gây suy giảm miễn dịch ở người(HIV), vi- rút adeno và norovirus [9] Vào năm 1991, tác giả G.T Tan và cáccộng sự đã chứng minh tanin gây tác dụng ức chế HIV-1 bằng cách sao chépngược vi- rút [10] Đến năm 2011, S Ciesek và các cộng sự cũng đã chứngminh epigallocatechin trong trà xanh ức chế được sự xâm nhập của vi- rútviêm gan C [11] Tanin có nhiều hoạt tính kháng vi- rút khác nhau tùy thuộcvào thành phần và cấu trúc hóa học

1.1.2.3 Hoạt tính chống viêm

Tanin có các hoạt tính chống viêm khác nhau Các nghiên cứu in vitrocủa tác giả X Terra và các cộng sự năm 2007, đã chỉ ra rằng tanin từ hạt nholàm giảm bệnh viêm thấp khớp [12] Đến năm 2014, M Park và các cộng sựchứng minh tanin ngưng tụ chiết xuất từ hạt mâm xôi đen có khả năng chốngviêm, ức chế tế bào RAW 264.7 do lipopolysacarit gây ra trong quá trình sảnxuất NO một chất trung gian gây viêm [13]

1.1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa

Các hợp chất phenolic đã được các nhà khoa học nghiên cứu là chấtchống oxy hóa hiệu quả [14] Tanin với hầu hết là các nhóm hydroxyl sẽ dễ bịoxy hóa nhất, do đó chúng sẽ có hoạt tính chống oxy hóa lớn nhất [15] Hoạt

tính chống oxy hóa của tanin được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế đểngăn ngừa các bệnh về tim mạch, bệnh ung thư, bệnh loãng xương [16]

1.1.3 Một số phương pháp định lượng tanin

Có nhiều nhà khoa học trên thế giới tiến hành nghiên cứu để xác địnhhàm lượng tanin trong nhiều đối tượng thực vật khác nhau Sử dụng một sốphương pháp như: chuẩn độ, đo quang, sắc ký lỏng hiệu năng cao…

1.1.3.1 Phương pháp chuẩn độ [23]

Theo phương pháp của AOAC (1980), để định lượng tanin, phươngpháp được thực hiện như sau: Lấy 5 ml dịch chiết được hòa tan với 12,5 mldung dịch indigo-carmin và 375 ml nước Hỗn hợp được chuẩn độ với dung

tanin bao gồm cả các thành phần khác (Y) Để xác định thành phần kháckhông phải tanin (X), lấy 50ml dung dịch chiết với 25 ml dung dịch gellatin.Hỗn hợp được làm ấm cho đến khi gellatin được hòa tan hoàn toàn sau đóđược làm lạnh và định mức đến vạch với dung dịch muối bão hòa, thêm 50 mldung dịch axit và NaCl bão hòa và 5 g bột cao lanh Hỗn hợp được lắc 15phút và lọc qua màng lọc whatman 1 Lấy 12,5 ml dịch lọc trộn với 12,5 mlthể tích dung dịch indigo carmin và 375 ml nước Chuẩn độ với dung dịch

theo giá trị của Y và X:

1mL dung dịch axit oxalic 0,1N = 0,0042 g tanin

Năm 2015, tác giả Jyotismita Khasnabis và các cộng sự đã tiến hànhxác định hàm lượng tanin trong các loại trà khác nhau bằng phương pháp

chiết được lọc qua màng Whatman.1 và được ly tâm với tốc độ 10000

chuẩn độ với dung dịch KMnO4 với chất chỉ thị indigo-cacmin Hàm lượngtanin trong các loại trà được xác định: mẫu trà đen có hàm lượng tanin là13,36%, trà xanh có hàm lượng tanin là 2,65%, trà ô long có hàm lượng8,66% [18]

Năm 2009, Maria Atanassova và Valentina Christova-Bagdassarian đãtiến hành xác định hàm lượng tanin trong các loại thực vật khác nhau bằngphương pháp chuẩn độ Các loại mẫu được chiết trong nước cất khử ion trongthời gian 4 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết, dịch lọc thu

lượng tanin của các loại thực vật lần lượt là: táo (0,58%), cherry ngọt(1,25%), quả mộc qua (0,67%), hồ tiêu đỏ (0,69%) [26]

1.1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [3]

Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, có 4 phương pháp địnhlượng thường dùng:

Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó

cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau

đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặcchiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫuthử

Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử nhữnglượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điềukiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội Từ những dữ kiện về: diện tích(hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫuthử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trongmẫu thử một cách chính xác

Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết củacác chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiếnhành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫu 9

thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăngcủa diện tích hoặc chiều cao pic

Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chấttrong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích piccủa nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ

Tác giả Trupti P Durgawale và các cộng sự đã sử dụng phương phápHPLC để xác định hàm lượng tanin trong loài cây họ Đậu vào năm 2016.Công trình nghiên cứu sử dụng cột sắc kí C18, hỗn hợp methanol và nướctheo tỉ lệ thể tích 50:50 làm dung môi pha động với pH = 4,5, tốc độ pha động

là 1,0 ml/phút tại bước sóng 270 nm Tổng thời gian chạy là 12 phút Kết quảthu được thời gian lưu là 3,1 phút Phương pháp này đã được xác nhận vàtuyến tính của axit tannic trong phạm vi nồng độ 0-60 mg/ml [19]

Tác giả Tushar Dhanani và các cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC

- PDA để xác định hàm lượng của 5 loại tanin thủy phân: axit gallic (GA),axit corilagin (CL), axit chebulagic (CB), axit ellagic (EA) và axit chebulinic(CN) trong vỏ quả cây chiêu liêu vào năm 2014 Công trình sử dụng cột sắc

ký C18, hỗn hợp dung môi ACN (acetonitril) và TFA (0,05%) trong nước, tốc

độ pha động là 1,0 ml/phút tại bước sóng 270 nm Kết quả thu được thời gianlưu của 5 loại tanin thủy phân lần lượt là: GA (2,91 phút), CL (12,09 phút),

CB (16,12 phút), EA (17,66 phút), CN (18,59 phút) LOD (giới hạn phát hiện)của GA, CL, CB, EA và CN lần lượt là 1,0; 0,5; 1,0; 0,5 và 1,0 µg/ml LOQ(giới hạn định lượng) của GA, CL, CB, EA và CN lần lượt là 2,5; 1,0; 2,5; 1,0and 2,5 µg/ml [22]

1.1.3.3 Phương pháp đo quang

Tác giả Philip-Edouard Shay và các cộng sự sử dụng phương pháp đo

độ hấp thụ quang với thuốc thử butanol - HCl - sắt để xác định hàm lượngtanin ngưng tụ trong các loài thực vật năm 2017 Mẫu khô được chiết bằngdung môi methanol (300mL) và được axit hóa bằng axit trifluoroacetic (TFA)0,05% Các bước được tóm tắt như sau: 500 µl dịch mẫu chứa tanin ngưng tụ

cho tác dụng với 2000µl dung dịch thuốc thử butanol - HCl cho thêm 67mL

2,5h ở nhiệt độ 70°C Màu của phản ứng được phát hiện trên máy quang phổ

ở bước sóng 550 nm Hàm lượng tanin ngưng tụ được định lượng dựa trên độhấp thụ quang thu được của mẫu thí nghiệm đối chiếu với đường chuẩnproanthocyanidin [20]

Tác giả Oi-Wah Lau, Shiu-Fai Luk and Hsiao-Lan Huang đã tiến hànhxác định tanin mẫu chè vào năm 1989 Mẫu được chiết trong nước ở nhiệt độ

-phenanthrolin ở pH 4,4 tạo thành một phức màu Đo độ hấp thụ quang củadung dịch tại bước sóng 540 nm và xây dựng đường chuẩn trong khoảng 0-5,5 µg/mL của axit tanic với độ dốc 0,213 A/ppm Hàm lượng tanin trong chèxác định được là 9,45% [21]

1.2 CÁC THỰC VẬT CHỨA NHIỀU TANIN

Tanin là nhóm các hợp chất phân bố phổ biến trong thực vật bậc cao ởnhững cây hai lá mầm, các họ thực vật hay gặp giàu tanin:

+ Rau răm (polygonaceae)

Bảng 1.1: Hàm lượng tanin trong một số loài thưc vật [5]

Vỏ quả (cây măng

1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN

1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang [2]

Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang họcdựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sáthoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó

1.3.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS

Phổ hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS (190 - 800 nm) là phổ hấp thụcủa các chất tan ở trạng thái dung dịch đồng thể của chất trong một dung môinhất định như nước, methanol, benzen, toluen, chloroform, hay một số chất

mà phân tử của nó trong điều kiện bình thường nó tồn tại ở trạng thái hơi như

phải thực hiện các công việc sau đây:

 Chuẩn bị dung dịch mẫu:

Nếu các chất phân tích có hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này taphải hòa tan nó vào trong một dung môi phù hợp, tạo ra dung dịch trong vàđồng thể, như một số chất hữu cơ: Benzen, phenol, nitrophenol, naphthalen,

Những chất không có phổ hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này chủyếu là các ion kim loại, hay các anion, chúng ta phải cho các chất này tácdụng với một thuốc thử R nào đó trong một dung môi và ở điều kiện thíchhợp để tạo ra một hợp chất phức bền có khả năng hấp thụ quang UV-VISnhạy, sau đó đo phổ của dung dịch phức thu được

Nếu mẫu phân tích là chất khí: Chúng ta phải chứa mẫu vào trong mộtống cuvet đóng kín để đặt vào buồng đo phổ Hay bơm dòng khí mẫu quacuvet trong khi đo với một tốc độ hằng định (phương pháp đo dòng chảy)

 Đo phổ:

Cho mẫu vào cuvet và chiếu chùm sáng kích thích  phù hợp vào cuvet

tích hay sản phẩm phức của nó hấp thụ tia bức xạ , để tạo ra phổ hấp thụquang UV-VIS của nó Vì thế chất phân tích (mẫu phân tích) cần được đựngvào ống đo hay cuvet có bề dày nhất định (L = 0,5 đến 2 cm).

 Ghi đo phổ:

Thu chùm sáng đi qua cuvet, phân ly phổ đó và chọn một tia sáng  ở

vị trí hấp thụ cực đại của băng phổ của chất phân tích và đo cường độ hấp thụ

ghi cả một vùng phổ mong muốn

 Hiện thị phồ, kết quả đo:

nhiều công cụ khác nhau, như đồng hồ đo năng lượng hấp thụ, máy tự ghi để

máy hiện số (digital), hay ghi vào đĩa của máy tính, sau đó xử lý tiếp bằng cácchương trình theo yêu cầu cần kết quả đo ở dạng nào (độ hấp thụ quang A, độ

1.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy đo quang phổ

+ Máy trang bị ghi nhận và chỉ thị kết quả đo phổ

Ngoài ra, máy đo phổ còn được trang bị thêm các thiết bị như:

+ Bộ lấy mẫu tự động;

+ Hệ máy tính và phần mềm (hệ UV- VIS) hoàn chỉnh;

+ Các chương trình thuật toán.

 Nguồn sáng:

Trong các máy đo phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS (phép đo quanghấp thụ) người ta thường dùng loại đèn nguồn là D2-Lamp (đèn hồ quanghydro), W-Lamp (đèn sợi điểm Wolfram)

 Bộ phận tạo tia sáng đơn sắc:

Để tạo được tia sáng đơn sắc (hay chính xác là vùng sáng có vùng phổhẹp) trong máy đo quang người ta thường dùng lăng kính, cách tử hay kínhlọc sáng

 Cuvet:

Cuvet là dụng cụ chứa dung dịch phân tích hoặc dung môi Trong thực

tế ta thường gặp cuvet hình trụ đáy vuông Có các chất liệu hay sử dụng làcuvet nhựa, thủy tinh hoặc thạch anh Khi đo ở vùng phổ khả kiến nên chọncuvet nhựa hay thủy tinh, nhưng khi đo ở vùng phổ tử ngoại thì nhất thiết phảidùng cuvet thạch anh vì thủy tinh hấp thụ tia tử ngoại Không sử dụng cuvetnhựa khi đo với dung môi hữu cơ Khi làm việc với các dung môi bay hơiphải đậy nắp cuvet

 Tế bào nhân quang điện:

Tế bào quang điện là bộ phận biến quang năng thành điện năng rồichuyển vào bộ phận ghi đo

 Detector:

Detector là bộ phận thu nhận chùm sáng và chuyển chúng thành tínhiệu điện để đo cường độ chùm sáng đó Các tín hiệu ghi, đo được xử lý vàcho ra kết quả giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của dung dịch Ngày nayhầu hết các máy đo quang loại tốt đều có bộ phận ghi đo được kết nối với máytính

b) Nguyên lý hoạt động:

Các đèn phát ra nguồn sáng chiếu vào hệ thống thấu kính (hệ gương hộitụ) tạo ra chùm sáng trắng đi qua khe hẹp vào bộ phận tán sắc Khi chùm sángtrắng chiếu vào lăng kính ngay lập tức nó bị tán sắc thành các tia sáng đơn sắcchiếu về mọi phía Tia sáng phản xạ qua các thấu kính gương phẳng ra khỏibuồng tán sắc đến bộ phận phân chia chùm sáng, bộ phận này sẽ hướng chùmsáng đến các cuvet đựng mẫu nghiên cứu Detector sẽ tiếp nhận và phân tíchcác chùm sáng qua cuvet, chuyển tín hiệu ánh sáng thành tín hiệu điện và chohiện lên máy tính kết quả đo.

Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ

1.3.1.3 Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis

Phương pháp đo quang UV-Vis đã và đang được ứng dụng rất phổ biến

Vì nó là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và máy móc lại không đắt tiền,phù hợp cho việc phân tích định lượng nhiều chất với hàm lượng nhỏ, ví dụnhư:

- Để xác định các chất:

+ Phân tích các chất hữu cơ;

+ Phân tích thuốc, dược phẩm, sản phẩm nông nghiệp;

+ Phân tích các ion kim loại trong các đối tượng mẫu khác nhau

- Xác định thành phần phức chất, độ phân ly, hằng số phân ly.

- Xác định hằng số bền của phức chất

- Xác định nhóm chức trong phân tử chất

Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis là: Trong y học, dược,trong nông nghiệp, thực phẩm, phân tích nước, phân tích môi trường, côngnghiệp hóa học Song phương pháp đo phổ UV-Vis có độ chọn lọc kém Vìmột thuốc thử có thể tác dụng được với nhiều ion kim loại cùng cho phứcmàu có cực đại hấp thụ trùng nhau, hay gần nhau

1.3.1.4 Phương pháp định lượng

Trong phương pháp đo quang phổ, phương pháp thường dùng để địnhlượng là: phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn

a) Phương pháp đường chuẩn:

* Cơ sở định lượng của phương pháp:

Dựa vào phương trình định luật Lambert - Beer:

Trong đó: A là độ hấp thụ quang của dung dịch cần đo,  là hệ số hấp thụ phân

tử, C là nồng độ chất, L là bề dày của lớp dung dịch (bề dày của cuvet)

* Cách tiến hành:

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn và các mẫu phân tích: Chuẩn bị mộtdãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác (thông thường chuẩn bị với 5 nồng

điều kiện với mẫu phân tích, như chất nền, môi trường pH,

- Chọn các điều kiện đo phổ: Nghiên cứu chọn điều kiện phù hợp nhất

để đo phổ UV-VIS của chất phân tích trong dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân

- Đo phổ các mẫu chuẩn và mẫu phân tích: Đo phổ hấp thụ quang VIS của dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân tích theo các điều kiện đã chọn