TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CÂY CHỦNG LACTOBACILLUS PLANTARUM NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

plantarum Lactobacillus plantarum... LAB bao g m kho ng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus và Streptococcus là nh ng chi đi n hình Marcel, 2005... Các enzym đ c t

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T

GVHD: ThS D NGăNH T LINH

SVTH : TR N TH KI U MSSV : 1053012348

KHOÁ: 2010 ậ 2014

Tp.H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

Em xin chân thành g i l i c m n đ n:

Cô D ngăNh t Linh và th y Nguy năV năMinh ậ gi ng viên khoa Công ngh

Sinh h c Tr ng i H c M Tp H chí Minh, cô th y lƠ ng i đư t n tình h ng d n,

t o đi u ki n, truy n đ t ki n th c đ em có th hoàn thành t t đ tài

Chân thành c m n các th y, cô khoa Công ngh Sinh h c tr ng i H c M

Tp H Chí Minh đư t n tình gi ng d y, truy n đ t cho em nh ng ki n th c c b n làm

n n t ng đ em có th hoƠn thƠnh đ tài

Th y anăDuyăPháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Ph m Th Minh Trang, ch Nguy n Th M Linh, anh Nguy nă t Phi lƠ ng i đư truy n đ t nh ng kinh

nghi m, đ ng viên giúp đ em v t qua nh ng khó kh n trong th i gian th c hi n đ

tài

Xin c m n đ n các anh/ ch , các b n và các em Phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh đư giúp đ , đ ng viên em trong th i gian qua

Cu i cùng, con xin g i l i c m n đ n Ba, M , gia đình đư luôn bên c nh ng h

t o đi u ki n t t nh t cho con hoàn thành t t vi c h c t p c a mình

Chân thành c m n!

Bình D ng, ngƠy tháng n m 2014

TR N TH KI U

M C L C

T V Nă 1

CH NGă1:ăăT NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC 5

1.1.1 Gi i thi u 5

1.1.2 Conăđ ng bi năd ng c a vi khu n lactic 7

1.1.3 T ng quan v Lactobacillus plantarum 8

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN C UăTRONGăVẨăNGOẨIăN C V LACTOBACILLUS 10

1.2.1 Các nghiên c u trên th gi i 10

1.2.2 Các nghiên c uătrongăn c 11

1.3 QUY HO CH TH C NGHI M 12

1.3.1 Ph ngăphápăquyăho ch th c nghi m 12

1.3.2 Thí nghi m sàng l c 14

1.3.3 Thí nghi m t iă uăhóa 16

1.4 PH N M M QUY HO CH TH C NGHI M MINITAB 16.2.0 20

CH NGă2:ăV T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 23

2.1 TH IăGIANăVẨă Aă I M NGIÊN C U 24

2.2 V T LI U NGHIÊN C U 24

2.2.1 iăt ng nghiên c u 24

2.2.2 Môiătr ng ậ hóa ch t 24

2.2.3 D ng c 24

2.2.4 Trang thi t b 24

2.3 PH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 25

2.3.1 Ho t hóa ch ng 25

2.3.3 Xây d ngăđ ngăcongăt ngătr ng c a L plantarum NT 1.5 26

2.3.4 Kh o sát nhi tăđ , pH thích h p cho s t ngătr ng c a L plantarum

NT1.5 27

2.3.5 Sàng l c các y u t dinhăd ng 28

2.3.6 Thi t k thí nghi m tìm y u t nhăh ngăđ năquáătrìnhălênămenăt ngă sinh kh i theo thi t k Plackett- Burman 30

2.3.7 Thí nghi m kh iăđ u 32

2.3.8 Tìm kho ng t iă uăc a các y u t nhăh ng chính b ngăph ngă pháp leo d c 32

2.3.9 Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a các y u t nh h ng chính 33

2.3.10 Xácăđ nh th iăgianăt ngătr ng c a ch ng L plantarum NT1.5 trên môiătr ng t iă u 33

CH NGă3:ăK T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34

3.1 K T QU XÂY D NGă NGăT NGăQUANăGI A M Tă T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TR OD 610 35

3.2 K T QU XÂY D NGă NGăCONGăT NGăTR NG C A L PLANTARUM NT 1.5 36

3.3 K T QU KH O SÁT NHI Tă , pH THÍCH H P CHO S T NGă TR NG C A L PLANTARUM NT1.5 38

3.4 K T QU SÀNG L C Y U T DINHăD NG 39

3.4.1 Ngu nănit 39

3.4.2 Ngu n cacbon 41

3.4.3 Ngu n khoáng 42

3.5 K T QU XÁCă NH CÁC Y U T NHăH NG CHÍNH THEO THI T K THÍ NGHI M PLACKETT- BURMAN 44

3.6 K T QU THI T K THÍ NGHI M KH Iă U 48

3.7 K T QU THÍ NGHI M LEO D C 50

3.8 K T QU THÍ NGHI M BOX-BEHNKEN 52

3.9 K T QU KH O SÁT S T NGăTR NG C A L PLANTARUM NT1.5 TRểNăMỌIăTR NG T Iă U 57

4.1 K T LU N 61

4.2 KI N NGH 62

TÀI LI U THAM KH O 63

PH L C 68

DANH M C CH VI T T T ANOVA One-way analysis of variance

L plantarum Lactobacillus plantarum

DANH M C HÌNH NH Hình 1.1 Streptococcus 6 Hình 1.2 Lactobacillus 6 Hình 1.3 Lactobacillus plantarum d i kính hi năviăđi n t (Reichelt J., 2013) 9 Hình 1.6 H păđenătrongăh th ngăđi u khi n m t quá trình 13 Hình 1.8 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box ậ Behnken (Box và Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao di n ph n m m Minitab 16.2.0 22

DANH M C B NG

B ng 2.1 Các ngu nănit ăkh o sát 28

B ng 2.2 Các ngu n cacbon kh o sát 29

B ng 2.3 Các ngu n khoáng kh o sát 30

B ng 3.1: Giá tr đoăOD 610 và m tăđ t bào (Log(N/mL) 35

B ng 3.2 Giá tr OD 610 theo th i gian 36

B ng 3.3 M tăđ t bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) t i m i giá tr nhi tăđ vƠăđ pH kh o sát 38

B ng 3.4 Giá tr log (N/ mL) c a các ngu nănit ăkh o sát 40

B ng 3.5 Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n cacbon kh o sát 41

B ng 3.6 Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n mu i khoáng kh o sát 43

B ng 3.7 M c nhăh ng c a t ng y u t 44

B ng 3.8: K t qu thí nghi m Plackett- Burman 45

B ng 3.10 B ngătínhătoánăb c chuy năđ ng c a các y u t nhăh ng chính 50

B ng 3.11 K t qu thí nghi m leo d c 51

B ng 3.12 B ng giá tr các bi n s thí nghi m Box-Behnken 53

B ng 3.13 B ng bi n s các giá tr thí nghi m Box-Behnken 53

B ng 3.14 K t qu giá tr t iă uăc a các y u t 56

B ng 3.15 Giá tr OD theo th i gian 57

DANH M Că TH

th 3.4 K t qu kh o sát ngu nănit 40

th 3.5 K t qu kh o sát ngu n Cacbon 42

th 3.6 K t qu kh o sát ngu n mu i khoáng 43

th 3.7.ă th các nhăh ng chính (Main Effects Plot) 47

th 3.1ă th đ ng m c bi u di n m i quan h gi a m tăđ t bào v i các c p bi n khác nhau 55

th 3.2ă th b m t bi u di n m i quan h gi a m tăđ t bào v i các c p bi n khác nhau 56

th 3.9ă ngăcongăt ngătr ng c a L plantarum NT 1.5 theo th i gian trênămôiătr ng t iă u 58

T V Nă

Cholesterol trong máu t ng lƠm t ng nguy c b nh tim vƠ đ t qu , m t ph n ba

b nh tim thi u máu c c b là do cholesterol cao Nhìn chung, cholesterol t ng c tính

gây ra 2,6 tri u ca t vong (4,5% c a t ng s ) và 29,7 tri u ng i gánh h u qu T ng

s cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây b nh t t c các n c phát tri n

vƠ đang phát tri n nh lƠ m t y u t nguy c b nh tim thi u máu c c b vƠ đ t qu

(WHO, 2013)

Vi c gi m cholesterol là v n đ r t quan tr ng đ ng n ng a b nh tim m ch (Lim

và cs., 2004) M t trong nh ng gi i pháp đó lƠ nghiên c u vi khu n lactic v a có ho t

tính probiotic và v a có ho t tính làm gi m cholesterol là v n đ thi t th c, đ c nhi u

nhà khoa h c trên th gi i quan tâm và nghiên c u

Trong nh ng n m g n đơy có nhi u nghiên c u ch ng minh enzym th y phân

mu i m t (BSH) t vi khu n lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…)

có tác d ng làm gi m cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005) Ngoài ra, vi khu n lactic còn có kh n ng gi m cholesterol b ng cách h p thu tr c ti p vào màng t bào (Ziarno,

2007)

Ngày nay vi c s n xu t th c ph m ch c n ng ch a vi khu n probiotic nh

Lactobacilli có t m quan tr ng ngƠy cƠng t ng Nh ng vi khu n này có tác d ng

kháng khu n, lƠm t ng giá tr c m quan, dinh d ng và mang l i l i ích s c kh e cho

ng i tiêu dùng (Shahravy, 2012)

Vi khu n Lactobacillus plantarum NT1.5 đư đ c ch ng minh có kh n ng làm

gi m cholesterol thông qua vi c h p th cholesterol qua màng t bào và kh n ng sinh

enzym BSH đ ng th i có ho t tính probiotic nh : kh n ng ch u pH d dày, kháng

mu i m t, kháng khu n,ầ (D ng Nh t Linh, 2013) Vì v y Lactobacillus plantarum

NT1.5 có th đ c ng d ng đ s n xu t các ch ph m probiotic có ho t tính làm gi m

cholesterol

Ngày nay, nhu c u s d ng th c ph m lên men k t h p v i ch ph m sinh h c ngày càng t ng đáp ng nhu c u này, vi c s n xu t l ng l n sinh kh i vi sinh v t đang đ c quan tâm Do đó, nghiên c u phát tri n môi tr ng nuôi c y m i đ t ng

c ng s n xu t sinh kh i có th d n đ n vi c s n xu t probiotic có hi u qu kinh t h n

(Shahravy, 2012)

Vì v y chúng tôi th c hi n đ tài ắT iă uă hóaă môiă tr ng nuôi c y ch ng

Lactobacillus plantarum NT1.5 b ngăph ngăphápăquyăho ch th c nghi m”

 Kh o sát nhi t đ , pH t i u cho s phát tri n c a ch ng L plantarum NT1.5

 Ch n l a ngu n cacbon, nit vƠ các ngu n khoáng

 Xác đ nh các y u t nh h ng chính đ n quá trình t ng sinh kh i c a

Lactobacillus plantarum NT1.5 b ng thi t k Plackett ậ Burman (P - B)

 Xác đ nh giá tr t i u c a các thành ph n dinh d ng vƠ đi u ki n nuôi c y

b ng ph ng pháp Box-Behnken

 Nuôi c y th nghi m

CH NGă1:ă

T NG QUAN TÀI LI U

1.1 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC

1.1.1 Gi i thi u

Vi khu n lactic acid (LAB) là nhóm vi khu n ph bi n trong t nhiên đ c ng

d ng trong nhi u ngành công nghi p, là m t ch ph m sinh h c an toƠn cho con ng i

Vi khu n lactic là nh ng vi khu n Gram d ng, th ng không di đ ng, không

sinh bào t , các ph n ng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm Nh ng vi khu n này có kh n ng sinh t ng h p nhi u h p ch t c n cho s s ng r t y u, cho nên

chúng là nh ng vi sinh v t khuy t d ng đ i v i nhi u lo i acid amin, base nucleotic,

nhi u lo i vitaminầ, bình th ng chúng không có cytochrome Vì v y, chúng đ c

x p vào nhóm vi khu n k khí tùy nghi, ho c g i là vi hi u khí, có kh n ng lên men trong đi u ki n vi hi u khí c ng nh k khí

LAB có liên k t ch t ch v i vi khu n có l i trên niêm m c ru t c a ng i và

đ ng v t LAB bao g m kho ng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,

Pedicoccus và Streptococcus là nh ng chi đi n hình (Marcel, 2005)

Trong đó t bào c a chúng có d ng hình c u nh Streptococcus, Lactococcus,

Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, ho c hình que nh Lactobacillus

b

a

Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus d i kính hi n vi đi n t b: Streptococcus nhu m Gram

Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus d iăKHVăđi n t b:Lactobacillus nhu m Gram

Bifidobacteria c ng đ c xem là m t chi c a lactic acid bacteria do có cùng đ c

đi m tiêu bi u và cách th c lên men đ ng

1.1.2 Conăđ ng bi năd ng c a vi khu n lactic

S phân lo i gi a các chi c a vi khu n lactic d a trên hình thái, cách th c lên

men đ ng, s phát tri n nh ng nhi t đ khác nhau, c u trúc c a s n ph m acid

lactic, kh n ng ch u mu i, ch u acid ho c ki m (Mascel, 2005)

LAB có hai con đ ng lên men đ ng chính (Mascel, 2005):

 Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): s n ph m cu i cùng là acid

lactic hay còn g i lƠ con đ ng lên men lactic đ ng hình

 Con đ ng 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: s n ph m c a quá trình lên

men này ngoài acid lactic còn có ethanol, acetate và CO2 hay còn g i là quá trình lên men d hình

D a vào kh n ng lên men đ ng ng i ta chia LAB thƠnh LAB đ ng hình và

LAB d hình

1.1.2.1 Lên men đ ng hình

Vi khu n lactic lên men đ ng hình g n nh chuy n hóa hoàn toàn đ ng chúng

s d ng thƠnh acid lactic Trong đi u ki n th a glucose và oxy h n ch lên men đ ng hình 1 mol glucose theo con đ ng chuy n hóa EMB (Embden ậ Meyerhoff ậ Parnas)

t o 2 mol pyruvate S cân b ng oxi hóa kh trong t bƠo đ c duy trì thông qua các

quá trình oxi hóa c a NADH, song song đó lƠ s kh pyruvat thành acid lactic Các

ph n ng di n ra trong ph n n n t bào ch t Các enzym đ c tr ng trong quá trình nƠy

là aldolase và triozophosphateisomerase Glucose không ph i lƠ đ ng duy nh t có th

đ c s d ng V i h th ng enzym thích h p, các lo i đ ng khác có th đ c chuy n

đ i thành glucose ho c m t trong nh ng ch t trung gian trong quá trình nh

glucose-6-phosphate (ho c trong tr ng h p đ ng pentose, ribulose-5-phosphate) Kh n ng

s d ng các lo i đ ng khác nhau vi khu n lactic thay đ i theo loƠi i di n cho

ki u lên men này là các gi ng Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và Lactobacillus nhóm I (Desantis và cs., 1989)

1.1.2.2 Lên men d hình

Lên men d hình s d ng con đ ng pentose phosphate, cách g i khác là con

đ ng phosphoketolase pentose M t phân t glucose-6-phosphate ban đ u b kh

hydro thành 6- phosphogloconate vƠ sau đó kh nhóm carboxyl hình thành m t phân t

CO2 K t qu là pentose -5- phosphate b chia ra thành m t glyceraldehyde phosphate (GAP) và m t phân t acetyl phosphate GAP sau đó đ c chuy n hóa thành lactate

nh trong lên men đ ng hình, v i acetyl phosphate b bi n đ i thành ethanol qua ch t

trung gian là acetyl ậ CoA và acetaldehyde V m t lý thuy t, s n ph m cu i cùng (bao

g m ATP) đ c s n xu t có s l ng b ng v i s n ph m t quá trình d hóa m t phân

t glucose Hai enzyme đ c tr ng trong quá trình nƠy lƠ transketolase xúc tác chuy n

hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuy n hóa nhóm 3C Quá trình này x y ra trong cytosol Các LAB lên men d hình b t bu c g m Leuconostoc oenococcus, Weissella và Lactobacillus nhóm III (Desantis và cs., 1989)

1.1.3 T ng quan v Lactobacillus plantarum

1.1.3.2 c đi m chung c a vi khu n Lactobaciillus plantarum

Lactobacillus plantarum là m t trong h n 50 loƠi Lactobacillus Lactobacillus

plantarum là vi khu n gram d ng, catalase âm (Bujalence, 2006), hình tr c không

sinh bào t đ c tìm th y trong h tiêu hóa c a ng i vƠ đ ng v t Vi khu n này l n

đ u tiên đ c tìm th y trong n c b t c a con ng i (Waugh và cs., 2009)

Lactobacillus plantarum là m t lo i vi khu n có kh n ng thích nghi cao, nó có

th t n t i ph m vi nhi t đ r ng l n (t 1-600

C) (Natural New, 2010), k khí tùy nghi Trong chi Lactobacillus, L Plantarum đ c x p vào nhóm vi khu n lên men d

hình, có th s ng trong nhi u môi tr ng nh th t, cá, s a, các quá trình lên men th c

v t, th c v t và trong nhi u lo i pho mát (Kohajdová, 2012)

L plantarum có nhi u đi m khác bi t so v i các loài lactobacillus khác nh ng

đi m sau:

- Có b gen t ng đ i l n nên có th thích ng v i nhi u đi u ki n khác nhau

(Kleerebezem và cs., 2003)

- Có th lên men nhi u lo i đ ng

-Thích nghi cao v i đi u ki n acid, ch u pH th p (Daeschel và Nes 1995)

- Có th chuy n hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs., 2001), phân gi i mu i tanat nh ho t đ ng c a enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004)

Hình 1.3 Lactobacillus plantarum d i kính hi năviăđi n t (Reichelt J., 2013)

1.1.3.3. L i ích c a vi khu n L plantarum

Lactobacillus plantarum có nhi u trong n c b t vƠ đ ng tiêu hóa c a con

ng i Nó th ng đ c s d ng trong các quá trình lên men th c ph m và làm

probiotic Các ch ph m sinh h c s d ng L plantarum ngƠy cƠng đ c công nh n trên

th tr ng

L plantarum có th nâng cao tính toàn v n ru t, ho t đ ng trao đ i ch t c a các

t bƠo đ ng ru t, kích thích ph n ng mi n d ch (Nissen và cs., 2009)

Gi m thi u m t s tri u ch ng r i lo n tiêu hóa khi đi u tr b ng kháng sinh

(Lonnermark và cs., 2009)

Theo nghiên c u c a nhóm Karlsson và c ng s (2009) đ c ti n hành Th y

i n cho th y u ng tr c ti p L plantarum có th t ng tính đa d ng c a h vi sinh v t

Các nghiên c u v vi khu n lactic đư vƠ đang đ c tri n khai r ng rãi trên toàn

th gi i, trong đó đư có r t nhi u công trình nghiên c u v Lactobacillus Tuy nhiên

Vi t Nam, s l ng các nghiên c u v vi khu n lactic còn quá khiêm t n và có r t ít

công trình nghiên c u v t i u hóa môi tr ng nuôi c y Lactobacillus Ph n l n các

nghiên c u v Lactobacillus trong n c ch là nghiên c u c b n v nhóm vi khu n

này nh m c phân l p vƠ đ nh danh, tuy n ch n gi ng có ho t tính t t đ làm

probiotic

1.2.1 Các nghiên c u trên th gi i

N m 2012, Hu vƠ c ng s đư công b nghiên c u v t i u hóa môi tr ng nuôi

c y Lactobacillus plantarum YSQ khi s d ng các s n ph m nông nghi p có giá thành

th p nh b t đ u nành, b t ngô, lúa mì vƠ n c ép cà chua làm ngu n dinh d ng, t

đó lƠm gi m giá thành s n ph m khi lên men theo quy mô l n

N m 2010, Magdalena và c ng s đư công b nghiên c u v t i u hóa các y u t dinh d ng nh ngu n cacbon, nit , mu i khoáng và các y u t t ng tr ng (vitamin

B, axit amin) khi dùng ph ng pháp b m t đáp ng đ t ng sinh kh i vi khu n

Lactobacillus rhamnosus PEN

N m 2006, Altaf vƠ c ng s đư t i u hóa môi tr ng thu acid lactic cho ch ng

Lactobacillus amylophilus GV6 b ng cách s d ng các ngu n cacbon, nit r ti n nh :

b t b p, b t đ u l ng đ thay th cho pepton, glucose trong môi tr ng MRS b ng

ph ng pháp Plackett-Burman vƠ đáp ng b m t (RSM) K t qu cho th y

Lactobacillus amylophilus GV6 đ t đ c hi u su t 78,4% vƠ n ng su t 96% (g acid

lactic/ g tinh b t đ c s d ng)

Farooq và c ng s (2012) đư s d ng m t r đ ng (ph ph m c a quá trình s n

xu t đ ng mía) làm ngu n cacbon trong môi tr ng t i u thu sinh kh i c a vi khu n

Lactobacillus delbrueckii

N m 1995, Oh và c ng s đư công b nghiên c u v các giá tr t i u c a trypton,

cao n m men, glucose, nhi t đ nuôi c y cho s t ng tr ng c a Lactobacillus casei

YIT 9018 K t qu giá tr t i u c a các y u t nh h ng đ n s phát tri n c a L.casei

YIT 9018 nh sau: trypton, 3,04%; cao n m men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhi t đ

nuôi c y là 35oC

N m 2006, Zhong đư công b nghiên c u v t i u hóa môi tr ng nuôi c y

Lactobacillus casei LC2W b ng ph ng pháp b m t đáp ng đ t ng c ng s n xu t

exopolysaccharid K t qu t i u các đi u ki n nuôi c y đ s n xu t exopolysaccharid:

nhi t đ nuôi c y là 32,5°C và th i gian nuôi là 26 gi

1.2.2 Các nghiên c uătrongăn c

N m 1996, Nguy n ng Di p và c ng s đư công b nghiên c u v môi tr ng

nuôi vi khu n lactic t t nh t Môi tr ng đó lƠ s a g y hoàn nguyên v i th i gian lên

men t t nh t là 18-20 gi , b sung gi ng 2-3%

Trong công b nghiên c u c a Nguy n Th H ng Hà và c ng s n m 2003 đư s

d ng hai ch ng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus đ s n xu t ch

ph m probiotic Tìm ra đ c ba môi tr ng thích h p nuôi c y vi khu n Bifidobacteria

bifidum lƠ môi tr ng thyoglycolat, môi tr ng n c chi t gan, môi tr ng n c chi t

th t bò đi u ki n nuôi c y k khí Môi tr ng thích h p cho L acidophilus là môi

tr ng MRS, môi tr ng n c chi t cƠ chua, môi tr ng n c chi t giá, môi tr ng

n c th i c a Công ty s a Vinamilk

1.3 QUY HO CH TH C NGHI M

Quy ho ch th c nghi m là d ng nghiên c u v m i quan h nguyên nhân ậ k t

qu Tr c h t, nhà nghiên c u c n xác đ nh các thông s (hay các bi n) c n và có th

quan tâm r i đ a ra các chi n thu t làm th c nghi m t giai đo n đ u đ n giai đo n k t

thúc c a quá trình nghiên c u đ i t ng (t nh n thông tin mô ph ng đ n vi c t o ra

mô hình toán, xác đ nh các đi u ki n t i u), trong đi u ki n đư ho c ch a hi u bi t

đ y đ v c ch c a đ i t ng (Nguy n V n D và cs., 2011)

1.3.1 Ph ngăphápăquyăho ch th c nghi m

Quy ho ch th c nghi m lƠ c s ph ng pháp lu n c a nghiên c u th c nghi m

hi n đ i ó lƠ ph ng pháp nghiên c u m i, trong đó công c toán h c gi vai trò tích

c c C s toán h c n n t ng c a lý thuy t qui ho ch th c nghi m là toán h c xác su t

th ng kê v i hai l nh v c quan tr ng là phân tích ph ng sai vƠ phơn tích h i qui

(Giang Th Kim Liên, 2009)

1.3.1.1. Khái ni m

Quy ho ch th c nghi m là t p h p các tác đ ng nh m đ a ra chi n thu t làm th c

nghi m t giai đo n đ u đ n giai đo n k t thúc c a quá trình nghiên c u đ i t ng (t

nh n thông tin mô ph ng đ n vi c t o ra mô hình toán, xác đ nh các đi u ki n t i u), trong đi u ki n đư ho c ch a hi u bi t đ y đ v c ch c a đ i t ng (Giang Th Kim

Liên, 2009)

1.3.1.2. i t ng

Là m t quá trình ho c hi n t ng nƠo đó có nh ng tính ch t, đ c đi m ch a bi t

c n nghiên c u Ng i nghiên c u có th ch a hi u bi t đ y đ v đ i t ng, nh ng đư

có m t s thông tin tiên nghi m dù ch là s li t kê s l c nh ng thông tin bi n đ i,

nh h ng đ n tính ch t đ i t ng Có th hình dung chúng nh m t “h p đen” trong

h th ng đi u khi n g m các tín hi u đ u vƠo vƠ đ u ra (Giang Th Kim Liên, 2009)

Hình 1.6 H păđenătrongăh th ngăđi u khi n m t quá trình

Các tín hi u đ u vƠo đ c chia thành ba nhóm: (Giang Th Kim Liên, 2009)

1) Các bi n ki m tra đ c vƠ đi u khi n đ c, mƠ ng i nghiên c u có th

đi u ch nh theo d đ nh, bi u di n b ng vect :

E = [E1, E2, , Ef]

Các tín hi u đ u ra dùng đ đánh giá đ i t ng là vect Y = (y1, y2, , yq)

Chúng th ng đ c g i là các hàm m c tiêu Bi u di n hình h c c a hàm m c tiêu

đ c g i là m t đáp ng (b m t bi u di n) Ph ng pháp toán h c trong x lý s li u

t k ho ch th c nghi m lƠ ph ng pháp th ng kê Vì v y các mô hình bi u di n hàm

m c tiêu chính là các mô hình th ng kê th c nghi m Các mô hình này nh n đ c khi

có công tính nhi u ng u nhiên

1.3.1.3. u đi m v quy ho ch th c nghi m

Quy ho ch th c nghi m đóng vai trò quan tr ng trong khoa h c k thu t Các mô

hình lý thuy t, gi i thu t, quá trình m i luôn đ c ki m nghi m th c tr c khi đem ra

ng d ng H n n a, quy ho ch th c nghi m còn có Ủ ngh a b sung, hoàn ch nh các

k t qu nghiên c u sáng t o lý thuy t đư đ c phát tri n (Giang Th Kim Liên, 2009)

Có th nói, lý thuy t quy ho ch th c nghi m t khi ra đ i đư thu hút s quan tâm

và nh n đ c nhi u đóng góp hoƠn thi n c a các nhà khoa h c Nh ng u đi m rõ r t

c a ph ng pháp này so v i các th c nghi m c đi n là: (Giang Th Kim Liên, 2009)

− Gi m đáng k s l ng thí nghi m c n thi t

− HƠm l ng thông tin nhi u h n rõ r t, nh đánh giá đ c vai trò qua l i gi a

các y u t và nh h ng c a chúng đ n hàm m c tiêu Nh n đ c mô hình toán h c

th ng kê th c nghi m theo các tiêu chu n th ng kê, đánh giá đ c sai s c a quá trình

th c nghi m theo các tiêu chu n th ng kê cho phép xét nh h ng c a các y u t v i

m c đ tin c y c n thi t

− Cho phép xác đ nh đ c đi u ki n t i u đa y u t c a đ i t ng nghiên c u

m t cách khá chính xác b ng các công c toán h c, thay cho cách gi i g n đúng, tìm

t i u c c b nh các th c nghi m th đ ng

1.3.2 Thí nghi m sàng l c

Thí nghi m sàng l c là thí nghi m đ c ti n hành nh m các m c đích sau:

Xác đ nh đơu lƠ y u t nh h ng chính đ n đ i t ng hay quá trình c n kh o sát áng giá m c đ nh h ng c a các y u t

ánh giá m c đ nh h ng t ng tác gi a các y u t

Thí nghi m sàng l c th ng khai thác các d ng thí nghi m toàn ph n 2 m c khi

s y u t thí nghi m không l n ho c thi t k thí nghi m riêng ph n hay thi t k thí nghi m Plackett ậ Burman (P-B)

B t ngu n t ma tr n đ y đ (full - factorial matrices), s d ng gi đ nh r ng t t

c các t ng tác không có d u hi u liên quan đáng k so v i các y u t chính, thi t k

Plackett ậ Burman d a trên ma tr n hai c p cho m i y u t và s a đ i nó đ gi m th t

b i (Plackett và Burman, 1946)

Y u t tác đ ng chính trong thi t k Plackett - Burman thay th t t c các t ng

tác c a m t ma tr n đ y đ Tuy nhiên, đi u nƠy không có ngh a lƠ thông tin v s

t ng tác không th đ c xác đ nh t thi t k Plackett-Burman (Plackett và Burman,

1946)

V i m t thi t k Plackett - Burman g m n thí nghi m (v i n là b i s c a 4, n ≤

100, ngo i tr n = 92 lƠ ch a th xác đ nh) v i s y u t k ≤ (n - 1)

Nh v y thi t k Plackett ậ Burman là thi t k ti t ki m th i gian và s thí

nghi m nh t v i s y u t c n kh o sát là cao nh t Thi t k Plackett ậ Burman là m t

thi t k không th thi u khi đ i t ng đang nghiên c u ch a có nhi u thông tin v các

y u t có kh n ng nh h ng chính đư đ c kh o sát (Plackett và Burman, 1946)

Vi c ch n các ma tr n mà s ph thu c vào s y u t thí nghi m trên c ng v i

các ph ng pháp l a ch n đ xác đ nh sai s thí nghi m

Có nhi u cách đ xác đ nh sai s thí nghi m nh (Plackett vƠ Burman, 1946):

- Ch n đi m trung tâm và cho m t s thí nghi m t i đi m đó

- L p l i toàn b ma tr n thí nghi m

- Th c hi n nhi u phép đo đ c l p trong t h p

 Phân tích k t qu thí nghi m

Sau khi th nghi m đ c ti n hành, d li u t thí nghi m đ c s d ng đ tính

toán các hi u ng vƠ đ xác đ nh Ủ ngh a th ng kê c a nh ng hi u ng (Plackett và

Burman, 1946)

tính toán các hi u ng, nh p các giá tr trung bình vào ma tr n Sau đó, so

sánh s khác bi t gi a các đáp ng trung bình m c cao vƠ đáp ng trung bình m c

th p Các nh h ng c a y u t luôn luôn thay đ i trong các ph n ng khi đi t c p đ

th p đ n c p đ cao (Plackett và Burman, 1946)

Xác đ nh đ c m c đ đ thi t l p các y u t ph thu c vào m c tiêu th nghi m

(Plackett và Burman, 1946):

N u m c đích lƠ đ t i đa hóa m t ph n ng, t t c các y u t có tác đ ng tích

c c s đ c thi t l p đ ho t đ ng m c đ cao và t t c các y u t có tác đ ng tiêu

c c s đ c thi t l p đ ho t đ ng m c th p

N u m c tiêu lƠ đ gi m thi u các ph n ng, t t c các y u t có tác đ ng tích c c

s đ c thi t l p m c th p và t t c đ u có m t tác đ ng tiêu c c s đ c thi t l p

m c cao

N u nh nh h ng c a các y u t đ c ki m tra có Ủ ngh a th ng kê thì y u t

đó lƠ 1 y u t quan tr ngầ

1.3.3 Thí nghi m t iă uăhóa

M t trong nh ng m c đích chính c a nghiên c u th c nghi m trong k thu t là

tìm giá tr c c tr hay tìm vùng t i u cho m t quá trình hay các đi u ki n t i u đ v n

hàng m t h th ng L p các bài toán nghiên c u th c nghi m v v n đ t i u th ng

đ c bi t đ n v i tên g i “ph ng pháp b m t ch tiêu” (Response Surface Method ậ

Mô hình hóa quan h gi a đ i t ng đ u vào và ng x c a đ i t ng nghiên

c u, dùng lƠm c s d đoán hay đi u khi n quá trình hay h th ng

Ti n trình t i u hóa RSM th ng g m 3 giai đo n:

Giai đo n : Thí nghi m kh i đ u

Giai đo n 2: Leo d tìm vùng c c tr

Giai đo n 3: Thí nghi m b m t ch tiêu

1.3.3.1. Thí nghi m kh i đ u

Sau khi ti n hành các thí nghi m sàng l c, ta c n lo i b b t các bi n có nh

h ng không đáng k đ n hàm m c tiêu Ti p t c ti n hành m t s thí nghi m v i các

bi n còn l i, đ ng th i b sung thêm m t s đi m thí nghi m trung tâm nh m đánh giá

m c đ phù h p (Lack-of-fit) c a mô hình h i quy b c nh t đư xơy d ng cho hàm m c

tiêu Vi c đánh giá nh v y đ c g i lƠ “ki m đ nh m c đ không phù h p c a mô hình” Gi thuy t th ng kê đ c phát bi u nh sau:

Gi thuy t đ o: Mô hình kh p v i d li u

Gi thuy t chính: Mô hình không kh p v i d li u

ki m đ nh v m c d phù h p c a mô hình m i bi n trong m t k ho ch c n

nh n 3 m c giá tr

C ng nh các phép ki m đ nh th ng kê khác thông s quan tr ng đ ch p nh n

hay lo i b gi thuy t đ o là giá tr p (p-value) Lý thuy t tính toán th ng kê ch ra nh

N u k t qu thí nghi m kh i đ u cho th y có th mô t hàm m c tiêu b ng m t

hàm h i quy b c nh t, đi u đó ch ng t vùng thí nghi m c a ta còn xa vùng ch a c c

tr (Nguy n V n D và cs., 2011)

tìm đ c vùng ch a c c tr , ta c n thay đ i giá tr các bi n thí nghi m và th c

hi n m t chu i các thí nghi m liên ti p ng v i các giá tr m i c a bi n thí nghi m đ

theo dõi s thay đ i c a hàm m c tiêu Các thí nghi m này g i là các thí nghi m leo

d c/ xu ng d c

ti n nhanh đ n vùng ch a c c tr c a hàm m c tiêu, ta c n xác đ nh đúng

h ng đi u ch nh giá tr các b c thí nghi m

Các b c xác đ nh các thông s leo d c:

B c 1: Ch n tr c m t giá tr gia s cho m t bi n thí nghi m xjnƠo đó Thông

th ng ta ch n bi n d đi u khi n nh t ho c bi n ng v i h s h i quy có giá tr tuy t

Khi c n mô t chính xác quan h gi a hàm m c tiêu và các bi n thí nghi m, ta

ti n hành k ho ch thí nghi m b m t ch tiêu M c đích c a k ho ch này là b sung các đi m thí nghi m nh m có th xây d ng mô hình b c 2 mô t hàm m c tiêu

Thi t k Box-Behnken đ c hai tác gi Box vƠ Behnken đ xu t n m 1960 v i

m c đích thi t k các thí nghi m 3 m c nh m xây d ng b m t ch tiêu Thi t k này

có tính ch t tâm xoay ho c g n nh có tơm xoay (Nguy n V n D và cs., 2011)

S thí nghi m đ c tính theo công th c: (Giang Th Kim Liên., 2009)

N = 2k + 2k + n0Trong đó: N: s thí nghi m

k: s y u t thí nghi m

n: s thí nghi m t i tâm

Hình 1.8 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box ậ Behnken (Box và

1.4 PH N M M QUY HO CH TH C NGHI M MINITAB 16.2.0

Các k t qu nghiên c u c n đ c phân tích và x lí đ thông qua đó, ch ra các ý ngh a c a b ng k t qu V i s tr giúp c a máy tính và các ph n m m chuyên d ng,

thi t k thí nghi m và x lí s li u th c nghi m đư tr nên nh nhƠng vƠ đ n gi n h n

r t nhi u (Nguy n V n D và cs., 2011)

Minitab là m t ph n m m máy tính giúp ta hi u bi t thêm v th ng kê và ti t

ki m th i gian tính toán

Ph n m m nƠy ban đ u đ c thi t k đ ph c v gi ng d y môn th ng kê, sau đó

đư đ c phát tri n thành công c phân tích và trình bày d li u r t hi u qu

Giao di n c a Minitab d ng đ h a, v i các menu và h p tho i r t đ n gi n và

d dùng, v n hƠnh nh m t h p đen, nh n d li u đ u vào và phân tích, x lý theo yêu

c u c a ng i s d ng sau đó hi n th k t qu thông qua các các c a s (Nguy n V n

D và cs., 2011)

− D li u nh p vào có th đ c nh n thông qua nh p li u tr c ti p vào các c a s

b ng tính ho c l y file d li u c a Minitab ho c t các ng d ng b ng tính khác nhExcel hay Lotus thông qua ch c n ng sao chép ậ dán NgoƠi ra Minitab c ng nh n

nh p li u t Session Window thông qua các ngôn ng nh p l nh c a Minitab

− K t qu s là các k t qu b ng s , ch và hình nh đ th thông qua các c a s

Minitab

− Các đ th mô t th ng kê c a Minitab có hình th c trình bày r t rõ ràng, có th

d dàng hi u ch nh theo ý mu n Các đ th nƠy c ng có th k t xu t ra nhi u d ng nh

hi u chnh đ cầ

Hình 1.9 Giao di n ph n m m Minitab 16.2.0

CH NGă2:

PHÁP NGHIÊN C U

2.1 TH IăGIANăVẨă Aă I M NGIÊN C U

Ch ng vi khu n Lactobacillus plantarum NT1.5 đ c cung c p t Phòng thí

nghi m Công ngh Vi sinhậTr ng i H c M Tp H Chí Minh đư đ c ch ng minh

có kh n ng lƠm gi m cholesterol và kh n ng làm probiotic (D ng Nh t Linh và cs.,

 Các lo i đ ng: glucose, sucrose, maltose, m t r đ ng, xylose, manitol

 Cao n m men, pepton, b t đ u nành, b t b p, amonium sulfate ((NH4)2SO4), urê (H2NCONH2)

 Các mu i khoáng: NaCl, K2HPO4.3H2O, KH2SO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, MnSO4.4H2O, CaCO3,

 N c c t, n c mu i sinh lý 0,85 %

2.2.3 D ng c

a petri, ng nghi m, erlen, becher, pipette, pipettman, đ u típ các lo i, , que

c y, lam, lamer, đèn c n, kính hi n vi, gi y đo pH

T ng môi tr ng l ng đư ho t hóa 24-48 gi chúng tôi ti n hành c y ria trên môi tr ng MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), 37o

C, 5%CO2, 48 gi Sau 48 gi ch n nh ng khu n l c riêng l , đi n hình c y trên môi tr ng th ch

đ ng MRSA gi ch ng cho các thí nghi m ti p theo

2.3.2 Xây d ng bi uăđ t ngăquanăgi a giá tr OD và n ngăđ t bào

2.3.2.1 nh l ng t bào b ng ph ng pháp đo OD

Nguyên t c

Khi m t pha l ng có nhi u phân t không tan thì s hình thành m t h huy n phù

vƠ có đ đ c b i các ph n t hi n di n trong môi tr ng l ng làm c n ánh sáng, làm

phân tán chùm ánh sáng t i T bào vi sinh v t là m t th c th nên khi hi n di n trong

môi tr ng c ng lƠm môi tr ng tr nên đ c đ c c a huy n phù t l v i m t đ t

bào Trong m t gi i h n c a đ đ c và m t đ t bào, có th xác l p đ c quan h t l

tuy n tính gi a m t đ t bƠo vƠ đ đ c Do đó, có th đ nh l ng m t đ t bào m t

cách gián ti p thông qua đo đ đ c b ng cách so màu các b c sóng t 550 ậ 610 nm

 Xây d ng đ ng t ng quan gi a OD610 và m t đ t bƠo t ng ng v i các

huy n phù b ng ph n m m Excel c a Microsoft

 Nh n di n khu n l c đ c tr ng vƠ đ m s khu n l c c a ch ng vi khu n

Lactobacillus plantarum NT 1.5 t i m i đ pha loãng: ch n đ pha loãng có s khu n

l c phân b h p lý nh t và trong kho ng 25 ậ 250 khu n l c/ đ a, đ m s khu n l c trên

c 3 đ a l p l i trên cùng đ pha loãng

 Tính s l ng t bào có trong 1 mL m u theo công th c sau:

fi: n ng đ pha loãng có s khu n l c đ c ch n đ m

2.3.3 Xây d ngăđ ngăcongăt ngătr ng c a L plantarum NT 1.5

2.3.3.1. Nguyên t c

S t ng tr ng c a vi sinh v t là s gia t ng s l ng t bào vi sinh v t trong

qu n th và t c đ t ng tr ng là s t ng tr ng c a vi sinh v t trong m t đ n v th i

gian M t qu n th vi sinh v t th ng có nh ng đ c tr ng t ng tr ng riêng khi đ c

nuôi c y trong m t môi tr ng vƠ đi u ki n nh t đ nh

ng thái t ng tr ng c a vi sinh v t b t đ u t m t pha ti m tàng (lag phase) Sau đó, s t ng tr ng b t đ u và s l ng t bƠo t ng l y ti n, giai đo n này g i là

pha log (log phase) Theo th i gian, ngu n dinh d ng trong môi tr ng tr nên c n

ki t cùng v i s tích l y c a đ c ch t S t ng tr ng d ng l i vƠ đi vƠo pha n đ nh

(stationary phase) N u ti p t c nuôi c y, các t bào b t đ u ch t vƠ đi vào pha suy tàn

(death phase) M i lo i vi khu n l i có đ ng cong t ng tr ng riêng, do đó c n ph i

kh o sát đ ng cong t ng tr ng c a ch ng vi khu n đang quan tơm đ xác đ nh đ c

th i gian thu nh n s n ph m thích h p (Nguy n ThƠnh t, 2011)

b ng cách đo OD610đ xác đ nh m t đ t bƠo sau m i th i gian nuôi c y

 S d ng đ ng t ng quan gi a m t đ t bƠo vƠ OD610 đ xác đ nh m t đ

t bƠo t i các giá tr OD610t ng ng t i m i th i đi m kh o sát

 D a vƠo nh ng m c th i gian vƠ m t đ t bƠo, xơy d ng đ ng cong t ng

tr ng c a vi sinh v t b ng ph n m m Excel c a Microsoft

2.3.4 Kh o sát nhi tăđ , pH thích h p cho s t ngătr ng c a L plantarum NT1.5

 M c đích

Xác đ nh đ c nhi t đ vƠ pH thích h p thu đ c nhi u sinh kh i vi khu n

nh t

 Nguyên t c

Ho t đ ng trao đ i ch t c a vi sinh v t là k t qu c a các ph n ng hóa h c Các

ph n ng này ph thu c ch t ch vào nhi t đ , do đó y u t nhi t đ nh h ng sâu s c

đ n quá trình sinh tr ng và phát tri n c a vi sinh v t Vùng sinh tr ng c a vi sinh v t

là vùng gi i h n gi a nhi t đ c c đ i và nhi t đ c c ti u mà vùng này khác nhau gi a

các loài

pH lƠ đ i l ng dùng đ đo đ ho t tính c a ion H+ trong môi tr ng pH nh

h ng đ n ho t đ ng c a vi sinh v t là do s tác đ ng qua l i gi a ion H+

và các enzyme ch a trong thành t bào và màng t bào ch t M i loài vi sinh v t ch thích h p

s ng trong kho ng pH nh t đ nh (Nguy n Lơn D ng vƠ c ng s , 2000)

Môi tr ng ch n l c ngu n Nit t i u g m có ngu n nit c n kh o sát, glucose

20 g/L vƠ các thƠnh ph n còn l i c a môi tr ng MRS nh : tween 80, K2HPO4,

CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O

2.3.5.2. Ngu n cacbon

Các ngu n cacbon đ c kh o sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, m t r

đ ng, b t b p v i kh i l ng kh o sát đ c trình bày trong b ng 2.2 (Altaf và cs.,

2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)

Môi tr ng ch n l c ngu n cacbon t i u g m có ngu n nit t i u, ngu n

cacbon c n kh o sát và các thành ph n còn l i c a môi tr ng MRS: tween 80, MgSO4,

K2HPO4, CH3COONa, MnSO4

2.3.5.3. Ngu n khoáng

Kh o sát các ngu n khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4,

KH2PO4 v i kh i l ng đ c trình bày trong b ng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs.,

Môi tr ng ch n l c ngu n khoáng t i u bao g m ngu n nit t i u (10 g/L),

ngu n cacbon t i u (20 g/L), và ngu n khoáng c n kh o sát

t bƠo/ mL sau đó b sung 1mL d ch khu n vào 20

mL môi tr ng kh o (pH, nhi t đ theo k t qu m c 2.3.4.) trong kho ng th i gian

(theo k t qu m c 2.3.3), 5% CO2

Sau th i gian nuôi c y đo m t đ t bào L plantarum NT 1.5 b ng ph ng pháp

đo đ đ c b c sóng 610 nm

Các th nghi m đ c l p l i 3 l n, k t qu đ c x lỦ th ng kê ANOVA m t y u

t b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ ph n m m Excel K t qu đ c trình bƠy

d i d ng trung bình ± sai s

2.3.6 Thi t k thí nghi m tìm y u t nhă h ngă đ n quá trình lên men

t ngăsinh kh i theo thi t k Plackett- Burman

M c đích

Xác đ nh các y u t quan tr ng nh h ng chính đ n quá trình lên men thu

sinh kh i c a ch ng vi khu n L plantarum NT 1.5

Thi t k thí nghi m Plackett – Burman

Thi t k thí nghi m theo ma tr n Plackett ậ Burman v i các y u t g m có:

ngu n nit , cacbon vƠ các ngu n khoáng đư đ c ch n m c 2.4

M i y u t đ c kh o sát 2 m c đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1)

Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp qui ho ch th c nghi m b ng ph n

m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA đ c tính các giá tr t-value,

B sung 1 mL d ch khu n vƠo 20 mL môi tr ng kh o sát

 Nuôi vi khu n nhi t đ kh o sát theo m c 2.3.4., 5% CO2 Sau th i gian nuôi

c y d ch khu n đ c đo OD610đ xác đ nh m t đ t bào

 M i nghi m th c c a thí nghi m đ c th c hi n v i 3 l n l p l i

 K t qu

 S li u k t qu thí nghi m đ c th ng kê b ng ph n m m Minitab 16.2.0

 nh h ng c a các y u t đ n sinh kh i ch ng vi khu n đ c mô t qua

 D a vào phân tích h i quy, n u m c Ủ ngh a đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u t

đó đ c cho là có nh h ng chính đ n s t ng sinh kh i t bào và v i k t qu thu ti p

t c th c hi n các thí nghi m ti p theo đ xác đ nh giá tr t i u cho s gia t ng sinh

kh i