PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI MỘT SỐ CHỦNGNẤM MỐC TỪ BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG

Mãi đến cuối thế kỷXIX khoảng năm 1895, các nhà sinh vật học Pháp: Calmette, Boidin đã phân lập đượcmột loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Mucor rouxii hay Amylomyces.Loài

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG

Người thực hiện : Trần Thị Thu Trang Mã SV: 600978 Khóa : 60

Ngành : Công nghệ sau thu hoạch

Giáo viên hướng dẫn : TS Đinh Thị Hiền

TS Đặng Hồng Ánh

Địa điểm thực tập : Viện Công Nghiệp Thực phẩm

HÀ NỘI - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực.

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Thu Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Hiền - Bộ môn Công nghệ chế biến, khoa Công nghệ Thực phẩm và TS Đặng Hồng Ánh - Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công nghiệp thực phẩm, người đã dành nhiều thời gian, công sức tận tình giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài.

Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể các thầy cô trong Khoa công nghệ thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã truyền đạt những kiến thức bổ ích, quý báu giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường.

Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, các anh chị em, bạn bè đã luôn cảm thông, chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Thu Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG 8

DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ 9

PHẦN I MỞ ĐẦU 10

1.1 Đặt vấn đề 10

1.2 Mục đích 11

1.3 Yêu cầu 11

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

2.1 Tổng quan chung về bánh men rượu 12

2.1.1 Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam 12

2.1.2 Phân loại bánh men rượu 13

2.2 Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống 13

2.2.1 Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu 13

2.2.1.1 Gạo 13

2.2.1.2 Men giống 14

2.2.2 Hệ vi sinh vật trong bánh men 15

2.2.2.1 Nấm men 16

2.2.2.2 Nấm mốc 16

2.2.2.3 Vi khuẩn 17

2.2.3 Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống 17

2.2.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ 18

2.2.3.2 Thuyết minh quy trình 19

2.3 Nấm mốc – Vi sinh vật có khả năng đường hoá 20

2.3.1 Cấu tạo và hình thức sinh sản 21

2.3.1.1 Cấu tạo 21

2.3.1.2 Hình thức sinh sản 21

2.3.2 Một số nấm mốc có khả năng đường hóa trong sản xuất rượu 22

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy 23

2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 23

2.3.3.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 23

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 24

2.3.4.1 Độ ẩm môi trường 24

2.3.4.2 Nhiệt độ nuôi cấy 24

2.3.4.3 Thời gian nuôi 25

2.3.4.4 pH môi trường 25

2.4 Tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng trong sản xuất rượu truyền thống 26

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

3.1 Đối tượng nghiên cứu 27

3.2 Phạm vi nghiên cứu 27

3.2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 27

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 28

3.2.3 Thời gian nghiên cứu 28

3.3 Nội dung nghiên cứu 28

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28

3.4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống 28

3.4.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 29

3.4.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu 30

3.4.1.4 Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 31

3.4.2 Phương pháp phân tích 31

3.4.2.1 Các phương pháp vi sinh 31

3.4.2.2 Các phương pháp hóa sinh 32

3.4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 34

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống 35

4.1.1 Phân lập nấm mốc trong bánh men 35

4.1.2 Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được ……….41

4.2 Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 43

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 43

4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 44

4.2.3 Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 45

4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu 47

4.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men rượu 48

4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua trong quá trình lên men rượu 49

4.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn trong quá trình lên men rượu 50

4.4 Kết quả đánh giá hoạt lực bột mốc thu được 52

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới 12

Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân sinh khối 29

Bảng 3.2: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi lắc nhân sinh khối 30

Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc nhân sinh khối 30

Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu 31

Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ 35

Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên 37

Bảng 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc 41

Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. 43

Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 44

Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 46

Bảng 4.7: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men 48

Bảng 4.8: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua của quá trình lên men 49

Bảng 4.9: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của quá trình lên men 51

Bảng 4.10: Kết quả đánh giá hoạt lực của bột mốc so với bánh men Đức Ngọ gốc về một số chỉ tiêu sau 6 ngày LMD .53

DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ

Hình 2.1:Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002) 18

Hình 4.1: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 38

Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus oryzae 38

Hình 4.3: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Penicilium 39

Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Penicilium 39

Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor 39

Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Mucor 39

Hình 4.7: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Rhizopus 40

Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Rhizopus 40

Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger 40

Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus niger 40

Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae 41

Hình 4.12: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus niger 41

Hình 4.23: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium 42

Hình 4.34: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Mucor 42

Hình 4.45: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus 42

Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 43

Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 45

Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 46

Hình 4.19: Bốn mẫu cơm rượu khi kết bắt đầu quá trình lên men ẩm 47

Hình 4.20: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch .48

Hình 4.21: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men 50

Hình 4.22: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 51

Hình 4.24: Mẫu cơm rượu khi bắt đầu lên men ẩm 52

Hình 4.25: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch .52

PHẦN I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Rượu là đồ uống có từ lâu đời Trong cuộc sống, nếu biết sử dụng hợp lý rượu sẽ rấttốt cho sức khỏe, và cần thiết trong giao tiếp Rượu và các đồ uống có cồn chiếm một vị tríđáng kể trong công nghiệp thực phẩm Chúng đa dạng tùy theo truyền thống và thị hiếu củangười tiêu dùng mà các nhà sản xuất làm ra nhiều loại rượu khác nhau Trong sản xuấtrượu, hệ vi sinh vật trong bánh men đóng vai trò rất quan trọng Chúng góp phần chuyểnhóa các chất từ nguyên liệu thành đường và từ đường thành rượu nhờ quá trình đường hóa

và lên men Chúng cùng với nguyên liệu tạo nên chất lượng rượu

Ở nước ta, nghề nấu rượu thủ công có từ ngàn xưa và chưa có tài liệu nào cho biếtchính xác có từ khi nào Ở miền núi, đồng bào các dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn nấuchín rồi cho lên men, men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá Nếu tiếnhành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất thì sảnphẩm gọi là rượu cần – Một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi Ở đồng bằng, nhân dân biếtlàm men từ bột gạo với các vị thuốc bắc – thường gọi là men thuốc bắc (MTB) để lên menrượu từ các nguyên liệu khác nhau có chứa tinh bột như gạo nếp, gạo tẻ, ngô, sắn, và thuđược loại rượu trắng với chất lượng khác nhau, trong đó có loại rất ngon và nổi tiếng Nhưvậy, nghề làm rượu cổ truyền ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng menbánh hoặc men lá Các men này có khả năng đường hóa tinh bột và lên men thành rượu.Trong các men này là một tập hợp các vi sinh vật có hoạt tính trên Mãi đến cuối thế kỷXIX (khoảng năm 1895), các nhà sinh vật học Pháp: Calmette, Boidin đã phân lập đượcmột loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Mucor rouxii (hay Amylomyces).Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, nhiệt độ tối thích33÷35°C, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năngphân giải tinh bột đật hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men một phần đường thànhrượu

Tuy nhiên, nhiều loại men rượu trên thị trường hiện nay không rõ nguồn gốc xuất

xứ, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, không kiểm soát được hệ vi sinh vật cả vềchủng loại, số lượng và tiềm ẩn nhiều nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng

Bởi vậy, việc nghiên cứu tìm ra một số chủng nấm mốc thuần chủng từ bánh men rượutruyền thống và từ đó ứng dụng sản xuất các chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng làmột nhu cầu thiết yếu và có ý nghĩa quan trọng vào ngành công nghiệp sản xuất rượu.

Từ những lý do trên, được sự đồng ý của Khoa Công nghệ thực phẩm – Học việnNông nghiệp Việt Nam cùng với sự giúp đỡ và hướng dẫn của TS Đinh Thị Hiền và TSĐặng Hồng Ánh – Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, chúng tôi

tiến hành đề tài : “Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men

rượu truyền thống”.

1.2 Mục đích

Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor,

Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền

thống để sản xuất bánh men rượu

1.3 Yêu cầu

Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và

Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống.

Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus

Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc/ nguyên liệu đến sự biến đổi một số

chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu

Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan chung về bánh men rượu

2.1.1 Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới, bánh men rượu truyền thống rất đa dạng và phong phú về chủng loại

Thái Lan có men Loopang dạng bột, Nhật Bản có men Koji dạng hạt, Hàn Quốc có men

Nuruk và Meju dạng bánh lớn, v.v ( Haard, 1999) Men rượu là hỗn hợp các vi sinh vật có

sự tác động tương hỗ trong quá trình lên men được nuôi trên cơ chất là các nguyên liệugiàu tinh bột như bột gạo, ngô, sắn, khoai, v.v

Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới

Tên nước Tên gọi Thành phần Dạng men Hệ vi sinh vật

Hansenula anomala Mucor fragilis Rhizopus

arrhizus

Saccharomyces

(Haard, N F Fermented cereals: a global perspective, 1999)

Nước ta có hai loại bánh men chính là: Bánh men thuốc bắc được sản xuất từ một số

vị thuốc bắc với bột gạo và bánh men lá được sản xuất từ bột gạo và các loại lá, củ, quảrừng theo kinh nghiệm cổ truyền

Men thuốc bắc (MTB) được trộn từ các vị thuốc bắc với bột gạo Bột gạo nghiềnnhỏ, bột thuốc bắc nghiền nhỏ cùng bột bánh men cái, trộn đều (Lương Đức Phẩm, 2012).Trong bánh men thuốc bắc nhờ có các vị thuốc bắc với thành phần hợp lý mà hạn chế được

sự phát triển của các tạp khuẩn từ không khí vào bánh men Mặt khác một số vị thuốc còn

có tác dụng kích thích sự phát triển của nấm men và nấm mốc, nhờ vậy mà quá trình đườnghoá và rượu hoá sau này diễn ra tốt hơn (Lương Đức Phẩm, 2012)

Ở các vùng núi cao men lá thường được sử dụng Lá sử dụng thường là các loại cónhiều tinh dầu và có mùi thơm Tùy thuộc vào từng địa phương mà trong men có các loại lákhác nhau Để làm men lá, người K’Ho Tây Nguyên sử dụng bột thân cây “đòng” và nướcchiết cây “me-kà-zut” trộn với bột gạo (Lương Đức Phẩm, 2012) Vùng tây Nghệ An dùngcác loại lá: lá mít, lá mía, lá nhân và lá quế,… (Lương Đức Phẩm, 2009)

2.1.2 Phân loại bánh men rượu

Từ xa xưa, người ta đã biết sử dụng một thành phần của mẻ lên men trước để chovào mẻ lên men sau, cách làm này nhằm rút ngắn thời gian lên men đồng thời làm giảmnhững hư hỏng xảy ra trong quá trình lên men Ngày nay người ta đã chủ động nuôi cấycác vi sinh vật đã chọn lọc để sản xuất những chế phẩm vi sinh đáp ứng tốt yêu cầu của quátrình lên men rượu Các chế phẩm này gọi là bánh men rượu

Bánh men rượu được sản xuất chủ yếu từ gạo (nguyên liệu chính cung cấp tinh bộttrong sản xuất bánh men) và men giống là các vi sinh vật để tiến hành đường hóa và rượuhóa, người ta cũng có thể trộn chung với các loại vị thuốc thảo mộc khác Tùy từng địaphương, việc sử dụng các vị thuốc là rất khác nhau Tạm thời có thể chia làm 3 loại:

 Bánh men rượu không có thuốc bắc (Bánh men thường)

 Bánh men rượu có thuốc bắc

 Bánh men rượu có lá rừng (Bánh men lá)

2.2 Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống

2.2.1 Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu

2.2.1.1. Gạo

Gạo được chọn làm nguyên liệu chính để cung cấp tinh bột cho sản xuất bánh men.Thành phần hóa học của gạo phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu, phân bón,giống lúa cũng như kỹ thuật chế biến và bảo quản

Theo Lê Vĩnh Thảo và cs (2004), tinh bột gạo thuộc loại tinh bột phức tạp có kíchthước rất nhỏ, thành phần tinh bột gạo tẻ gồm khoảng 17% amylose và 83% amylopectin.Tinh bột gạo có hình đa giác, kích thước nhỏ, trong khoảng 2-10 m Hạt tinh bột gạo cókích thước nhỏ và nằm sát nhau nên quá trình hồ hóa khó khăn hơn, nhiệt độ hồ hóakhoảng 70 - 80oC Tinh bột có 2 loại: Amylose có cấu tạo mạch thẳng và amylopectin cócấu tạo mạch nhánh, tỷ lệ thành phần này liên quan đến độ dẻo của hạt Các loại gạo ViệtNam có hàm lượng amylose thay đổi từ 15 - 35% Ngoài ra trong gạo còn có các thànhphần hóa học như protein chiếm 6 – 8%, lipit khoảng 2,02% phân bố ở lớp vỏ gạo và phôi,

và có một lượng các vitamin đặc biệt là vitamin B như vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt

từ các đường cơ bản Tuy nhiên trong sản xuất bánh men cổ truyền, nếu làm như vậy thìthời gian ủ bánh sẽ kéo dài vì các chủng nấm men, nấm mốc cần thời gian xâm nhập, thíchnghi và phát triển, đồng thời chủng giống cũng sẽ yếu hơn so với việc dùng bánh men cũlàm giống

Trên môi trường nuôi cấy cơ chất là tinh bột gạo và ở điều kiện thích hợp, các chủngnấm men, nấm mốc có khả năng sản sinh ra enzyme amylase để thủy phân tinh bột thànhđường glucose, còn các chủng nấm men rượu sẽ sử dụng đường khử để duy trì quá trìnhsống và phát triển Và sau khi đã đạt đến thời điểm nuôi cấy, đem sấy tới độ ẩm bảo quản

thì các chủng vi sinh vật này sẽ cùng tồn tại trên một môi trường bánh men Thời gian đểmột bánh men giống có khả năng lên men rượu cao phụ thuộc vào nhiều điều kiện khácnhau, tùy thuộc vào các giống vi sinh vật (nấm mốc, nấm men), điều kiện ủ và chế độ sấy

2.2.2 Hệ vi sinh vật trong bánh men

Thực chất bánh men là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khảnăng sinh trưởng tổng hợp enzyme đường hóa và lên men rượu, nói cách khác hệ vi sinhvật trong bánh men rất đa dạng Trong đó, có 3 loại phổ biến nhất: Nấm men, nấm mốc, vikhuẩn (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy giá trị pH bánh men Việt Nam trongkhoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,5%, nấm mốc 3,4×106, nấm men 5,8×107 cfu/gam bánhmen Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào mốc, 51 tế bào nấm men

và 15 tế bào vi khuẩn Các chủng nấm mốc xác định được: Rhizopus oryzae, Mucor

indicus, Mucor circinilloides, Amylomyces rouxii và các chủng nấm men thường gặp: Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Sacchromycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candidas sp (A.H.Rose, 1977) Việc nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm

mốc, nấm men để bổ sung vào sản xuất bánh men nhằm làm giàu các chủng vi sinh vật này

để nâng cao chất lượng và ổn định bánh men là cần thiết

Tiêu chí để tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men như sau:

- Đối với các chủng nấm men:

 Có hoạt lực lên men mạnh, hiệu suất lên men rượu cao, chịu được nồng độ đườngcao

 Chịu được môi trường có nồng độ axit cao

 Tạo hương thơm và sinh ít tạp chất

- Đối với nấm mốc:

 Sinh trưởng tốt trên môi trường nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm

 Có khả năng sinh tổng hợp hệ emzyme amylase cao, trong một thời gian ngắn

 Tạo hương thơm

2.2.2.1 Nấm men

Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào và nhân chuẩn thường sinh sảnbằng cách nảy chồi Hình dạng nấm rất phong phú phụ thuộc vào giống loài, nó có thể dạng

hình cầu, hình trứng hay hình bầu dục, hình tam giác Đối với nấm men trong qua trìnhhoạt động sống, chúng đồng hóa các monosacarit trong điều kiện yếm khí, thải ra môitrường xung quanh sản phẩm dị hóa là rượu etylic và khí cacbonic nhờ tác dụng của phức

hệ các enzyme ( Nguyễn Lân Dũng, 2002) Đây là một trong những đặc trưng quan trọngcủa nấm men đã được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đếnvài trăm triệu tế bào nấm men Gồm 2 chi chủ yếu là:

- Endomycopsis (chủ yếu là Endo Fibuligenes): là nấm men rất giàu enzyme

amylase, glucoamylase Do đó vừa có khả năng rượu hóa vừa có khả năng đường hóa

- Sacharomyces (Chủ yếu là S.Cerevisiae): Đây là loại nấm men đóng vai trò quan

trọng trong quá trình rượu hóa Chúng có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhaunhư glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose và lên men được ở nhiệt độcao (khoảng từ 36 - 40°C), chịu được axit Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm mennày có khả năng lên men các loại nguyên liệu rất khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn vớilượng đường trong dung dịch từ 12 – 14%, có khi 16 – 18% Nồng độ rượu trong dịch lênmen là 10 – 12% Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 – 32°C

Ngoài hai chủng nấm men trên, trong bánh men còn thấy nhiều loại nấm dại khácnhau Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển đường thànhcồn, tuy sự chuyển hóa này còn rất thấp Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịunhiệt độ rất cao, có khi lên tới 60 -65°c và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05 – 1%

2.2.2.2 Nấm mốc

Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc Aspergillus,

Penicillium, Mucor, Rhizopus Các loại nấm mốc này có thành phần và tỷ lệ rất khác nhau

tùy thuộc vào từng loại bánh men, từng vùng sản xuất và từng hộ gia đình Vai trò của nấmmốc trong bánh men rượu chính là nguồn cung cấp enzym amylase Khi các loại nấm mốcnày phát triển trên môi trường với cơ chất là tinh bột thì chúng có khả năng sinh tổng hợp

enzym amylase để thủy phân tinh bột thành đường, nhưng trong đó, Mucor và Rhizopus

thấy phát triển nhiều hơn cả (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.2.3 Vi khuẩn

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản và có kích thước rất nhỏ

Mỗi tế bào vi khuẩn có thể hoạt động sống độc lập (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

Vi khuẩn trong men rượu thường là vi khuẩn lactic và axetic (Lương Đức Phẩm,2012) Sự đa dạng vi khuẩn trong bánh men rượu của Việt Nam đã được nghiên cứu

Chúng chủ yếu thuộc các chi Bacillus, Lactobacillus, Acetobacter, (Thanh et al., 2008).

Chúng có vai trò đảm bảo quá trình lên men thuận lợi hơn, nâng cao được dinh dưỡng chonấm men do vi khuẩn lactic tích tụ các hợp chất nitơ dễ được nấm men đồng hóa và tăngđược hiệu suất tạo thành rượu (Lương Đức Phẩm, 2004) Ngoài ra, các vi khuẩn này nhờkhả năng lên men đường tạo thành các axit hữu cơ như axit lactic, axit axetic, axit pyruvicđóng vai trò tạo nên hương vị cho rượu Khi hàm lượng axit hữu cơ trong rượu ở một hàmlượng nhất địnhh sẽ tạo hương vị và mùi thơm cho rượu, tuy nhiên nếu nồng độ cao sẽ ảnhhưởng tiêu cực đến chất lượng rượu và làm rượu bị chua

2.2.3 Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống

Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam Mỗi địaphương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng Việc sản xuất bánh men chính làsản xuất hỗn hợp các hệ vi sinh vật cần thiết cho quá trình sản xuất rượu Phương phápbánh men có các đặc điểm cơ bản khác với các bánh men khác ở chỗ nấm mốc và nấm menđược nuôi cấy cùng một lúc trên môi trường tinh bột sống

Thực chất bánh men chỉ là nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trên môi trường tinh bộtsống ở trạng thái khô, sau quá trình tạo bánh, ủ và sấy tới độ ẩm bảo quản, các vi sinh vậtđược chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái ngủ nghỉ Chúng sẽ hoạt động trở lạitrong điều kiện môi trường thích hợp, sản sinh và phát triển đồng thời sinh tổng hợp phức

hệ enzyme đường hóa và rượu hóa

2.2.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

Gạo vo sạch, để ráo

Hình 2.1: Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.3.1 Thuyết minh quy trình

Thuốc bắcTạo hình

Ủ

Hong khô

Bánh men thuốcbắc

Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình nghiền và ở quá trình này đã làm mềm hạt gạo đểquá trình nghiền bột được dễ dàng hơn, bột sẽ dẻo và mịn hơn Gạo được ngâm vào trongnước, với lượng nước vừa đủ để ngập hết khối hạt trong thời gian thích hợp để nước thấmđều trong hạt gạo, cần tránh sự sinh trưởng của vi khuẩn trong nguyên liệu.

Cách thực hiện: Gạo sau khi được làm sạch đem ngâm với tỉ lệ nước gạo tương ứng

là 1:2 Thời gian ngâm 1,5 – 2h ở nhiệt độ 28°C

 Nghiền

Mục đích: Giảm kích thước hạt tạo thuận lợi trong quá trình phối trộn cùng mengiống, thuốc bắc và để dễ dàng cho nấm men, nấm mốc tiếp cận với tinh bột Ở đây không

sử dụng nghiền khô nhằm không làm cho nhiệt độ khối bột tăng do ma sát giữa hạt và thiết

bị gây biến tính tinh bột ảnh hưởng đến chất lượng bánh men

Cách thực hiện: Sử dụng máy nghiền cối đá để tiến hành xay Kết thúc quá trìnhnghiền ướt tiến hành lọc bột nhằm mục đích làm giảm độ ẩm của khối bột bởi độ ẩm tốithịnh của nấm mốc là 50 – 55%

 Phối trộn

Mục đích: Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với bột thuốc bắc và mengiống đã được nghiền nhuyễn, theo tỉ lệ nhất định nhằm làm cho nguyên liệu được trộn đềuvới nhau và men giống được tiếp xúc đều với thuốc bắc, tinh bột đảm bảo sự phát triển đềucủa nấm men và nấm mốc trong bánh men

Các biến đổi:

Vật lý: Khối bột, thuốc bắc, men giống được trộn đều vào với nhau.

Sinh học: Nấm men, nấm mốc được tiếp xúc đều với thuốc bắc, tinh bột chúng sử

dụng dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển Khối lượng vi sinh vật tăng lên

Cách thực hiện: Sau khi đã lọc bớt nước từ khối bột rắc đều hỗn hợp men giống vàthuốc bắc với tỉ lệ bột gạo, thuốc bắc và men giống là 100 g gạo : 1g thuốc bắc : 1,5g mengiống rồi trộn đều Tiếp đó thêm nước với tỉ lệ thích hợp để độ ẩm của khối bột khoảng53% Sau đó định hình thành dạng viên, đặt vào các khay

 Ủ

Mục đích: Để cho hệ nấm men, nấm mốc sử dụng dinh dưỡng từ tinh bột, thuốc bắcsinh trưởng và phát triển trong môi trường tối ưu của chúng.

Các biến đổi:

Vật lý: Khối bột nở xốp ra, bề mặt nhăn do độ xốp tăng cộng với sự phát triển của

nấm mốc

Sinh học: Bào tử nấm men, nấm mốc phát triển mạnh mẽ Nhiệt độ tăng lên và sự

phát triển của nấm men, nấm mốc toát ra một mùi thơm rượu dịu nhẹ rất đặc trưng

Cách thực hiện: Sau khi khối bột được tạo hình thành các viên trên các khay đã lóttrấu, chúng ta sử dụng một khay úp lên mặt trên các khay có chứa bột đã tạo hình Tiếp đódùng chăn hoặc sử dụng vải để quấn quanh khối bột nhằm giữ nhiệt cho khối bột để tạomôi trường thích hợp cho nấm men, nấm mốc và đồng thời giữ ẩm cho môi trường Sau đógiữ ấm khối bột ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 24h Các làng nghề truyền thống do ủ thủcông không có định được nhiệt độ nên không thể cố định được thời gian

2.3 Nấm mốc – Vi sinh vật có khả năng đường hoá.

Nấm mốc thuộc về nhiều họ trong nhóm nấm (Fungi) được xếp chung là vi nấm.Chúng là các giống nấm hiển vi, tế bào có hoặc không có vách ngăn, phát triển thành hệ sợi(mixen) Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, sinh trưởng bằngcách đâm sâu vào cơ chất và hút các chất dinh dưỡng ở trong đó (khuẩn ty cơ chất), trongkhi đó một phần hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất ( khuẩn ty khí sinh) Nấmmốc sinh sản bằng khúc sợi nấm hoặc bằng bào tử ( sinh sản vô tính), ngoài ra cũng có thểsinh sản hữu tính Đặc biệt là nấm mốc khi phát triển trên cơ chất (nuôi bề mặt hoặc nuôi

về sâu) luôn tiết ra một lượng lớn enzyme thủy phân nhằm phân cắt các polysaccharite của

cơ chất đó thành các đơn vị mà nấm mốc có thể hấp thu được Chính nhờ đặc tính này, nấm

mốc đã được dùng nhiều trong ngành sản xuất chế phẩm enzyme (amylase, protease,pectinase,…)

2.3.1 Cấu tạo và hình thức sinh sản.

2.3.1.1. Cấu tạo.

Hầu hết màng tế bào nấm có chất kitin, chất dự trữ hydrat carbon của nấm là chấtglycogen Đặc biệt trong tế bào nấm rất giàu các chất có hoạt tính sinh học (enzyme) và rấtgiàu kháng sinh (Nguyễn Đức Lượng, 1996)

Cấu tạo thành tế bào: polisaccharite (80÷90%), lipit (3÷8%), hexozamin (1÷3%),protein (4%), chất màu (melanin)

+ Loại nấm mốc có vách ngăn: Khuẩn ty của loại nấm mốc này được tạo thành domột chuỗi tế bào nối tiếp nhau Ngăn cách hai tế bào là một màng ngăn Mỗi tế bào nấmhầu như có đủ cơ quan của một tế bào trong đó quan trọng là có nhân

+ Loại nấm không có vách ngăn: Đây là những loại nấm đa hạch không có màngngăn

2.3.1.2. Hình thức sinh sản.

- Sinh sản sinh dưỡng:

+ Phát triển bằng khuẩn ty: Khuẩn ty của nấm mốc có thể có một hay nhiều tế bàohình cầu có màng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ Khi gặp điều kiện thuận lợi,các tế bào này sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới

+ Sinh sản bằng hạch nấm: Trong một số loài nấm lại có khả năng tạo thành hạchnấm Bên trong hạch nấm là một tổ chức sợi xốp vfa thường có màu trắng Hạch nấm cóthể giúp cơ thể nấm qua những điều kiện khó khăn Khi gặp điều kiện thuẩn lợi chúng lạiphát triển bình thường

- Sinh sản vô tính: Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thể đượctạo thành từ những phương pháp sau:

+ Do sự cắt đoạn của các sợi nấm

+ Từ tế bào sinh bào tử bằng cách nảy chồi và đồng thời bản than các bào tử sinh ra

ở kiểu này chúng có khả năng nảy chồi để tạo thành bào tử tiếp theo

+ Tạo bào tử bằng cách ngăn vách với tế bào ngay khi bào tử mới hình thành vàhoàn toàn không có khả năng sinh ra được những bào tử tiếp theo

- Sinh sản hữu tính: hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau rồi mọc lên một cơ thể mới(Nguyễn Đức Lượng, 1996).

2.3.2 Một số nấm mốc có khả năng đường hóa trong sản xuất rượu.

- Rhizopus: Có nhiều loài R.japonicus, R.oryzae, R.peka II, R.tonkinensis…

Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng “giả chi” để lan rộng trên bề mặt môi trường Ở chỗ có

giả căn, thân bò tiếp tục phát triển và sinh ra các cuống bào tử nang chứa nhiều bào tử Lúcnon bào tử trắng, lúc già màu đen, bên trong có nhiều bào tử Bào tử hình trứng hay bán

cầu, mặt có nếp nhăn, kích thước 5÷8µm Nhiệt độ phát triển thích hợp 32÷34°C Rhizopus

thường được nuôi trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzymeamylase tương đối hoàn chỉnh Thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương phápamyloza và nuôi cấy nấm mốc lỏng (Nguyễn Lân Dũng, 2002)

- Mucor: Rất giống Rhizopus song có thể phân biệt ở 3 điểm: Mucor không có giả

căn, cuống bào tử nang có thể sinh ra ở bất kì chỗ nào và nang trụ không có hình bán cầu,

không sát nách với vách bào tử nang Trong sản xuất rượu thường có nhiều loại Mucor nhưng ở nước ta thường gặp Mucor rouxii Ở Mucor rouxii, ngoài hệ enzyme amylase còn

có enzyme rượu hóa nên trong điều kiện yếm khí, enzyme của chủng này có thể biến

đường thành rượu Khuẩn ty của Mucor rouxii phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa

hạch, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn Cuống bào tử nang phân nhánh không có thứ tự nhấtđịnh, bào tử nang thường tròn, đường kính 60÷80µm Nang trụ 20÷50µm Bào tử trònđường kính 6÷7µm Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt Bào tử nang từ màutrắng chuyển dần sang màu hơi vàng, đỏ xám, đen, làm cho khuẩn lạc xám dần Chủng

Mucor rouxii thường được dùng cho phương pháp amyloza (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

- Penicillium sp: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn, bộ phận mang

bào tử phân nhánh hình chổi Cuống có thể phân nhánh 1,2,3 tầng trên đó là các thể bìnhrồi đến bào tử đính Có khả năng sinh cellulose

- Aspergillus oryzae: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn Khi mới

phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang lục, khi già có màu vàng hoa cau.Phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng từ 15°C - 40°C, nhiệt độ tối ưu là 30 °C - 32°C.Chúng có khả năng sinh enzyme rất mạnh, trong đó chủ yếu là các loại enzyme amylase,protease, maltase

- Aspergillus niger: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn Khi mới phát

triển hệ sợi có màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen Bào tử của chúng cómàu đen tuyền Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2÷4 nhánh cuống nhỏ rồi mới tiếp đến các đínhbào tử Nấm sợi này có khả năng tạo ra rất nhiều loại enzyme khác nhau như: amylase,maltase, protease, pectinase, cellulose Mốc này có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thíchhợp từ 30÷32°C và phát triển trên môi trường tinh bột

- Aspergillus flavus: là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn Lúc đầukhuẩn lạc có màu vàng sáng, sau chuyển thành màu nâu oliu Kích thước nhỏ hơn

Aspergillus oryzae, các tầng cuống hình chùy mang đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội

về màu xanh lục hơn Mốc này sinh ra các hệ enzyme giống Aspergillus oryzae.

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy.

2.3.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề sâu.

Nấm mốc nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có không khí Khuẩn ty thểhình thành được phân bố và lơ lửng trong môi trường Đặc biệt, trong quá trình nuôi cấy,enzyme amylase được khuếch tán ra môi trường

Trong sản xuất bánh men rượu truyền thống ở nước ta, vì điều kiện sản xuất còn bịhạn chế nên phương pháp nuôi cấy bề mặt sẽ có nhiều ưu điểm hơn cả vì đơn giản, phù hợpvới sản xuất thủ công, yêu cầu kỹ thuật nuôi cấy không đòi hỏi cao, do đó mag phươngpháp này được nhân dân áp dụng là chủ yếu

2.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt.

Trong sản xuất, mốc giống ban đầu trước khi đưa vào môi trường sản xuất cần phảiđược nhân giống Mốc giống được nuôi cấy trên môi trường thạch – malt 7÷8 ngày, sau đóchuyển vào bình tam giác 500ml trên môi trường cám mì (hoặc ngô, tấm gạo,…) đã đượcthanh trùng trong 1 giờ, nuôi ở 30°C trong 3 ngày, sau đó chuyển sang nuôi trên khaynhôm hoặc mành Nuôi mốc trên khay trong các buồng 28÷32°C có thông gió và giữ độ ẩmkhông khí 90÷95% Thời gian nuôi mốc từ 36÷48 giờ và kết thúc khi mốc sinh bào tửnhiều Đây chính là mốc trung gian dùng để cấy trộn vào môi trường sản xuất tiếp theo.Trong quá trình nuôi cần chú ý lật và bẻ nhỏ cám vì hệ sợi mốc phát triển làm cơ chất kếtthành bánh (Lương Đức Phẩm, 1998)

Môi trường nuôi cấy phải có tỉ lượng thích hợp giữa các thành phần, chất lượng đểthu được chế phẩm enzyme thô (glucoamilase) có hoạt lực là cao nhất Đối với một số mụcđích đặc biệt, người ta nuôi nấm mốc trực tiếp trên bề mặt của hạt gạo, hạt mì,… đã đượcthanh trùng hấp chin Nói chung trong tất cả mọi trường hợp, vi sinh vật lấy thức ăn từnhững chất chứa trong môi trường và sử dụng oxy phân tử của không khí để hô hấp Môitrường để nuôi cấy nấm mốc phải có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có cấu trúc tơi xốp trongtrạng thái ẩm và nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc phát triển.

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy.

2.3.4.1. Độ ẩm môi trường.

Trong điều kiện sản xuát độ ẩm ban đầu thích hợp đối với giống Aspergillus là

58÷60% và giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi Độ ẩm tăng quá70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50÷55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và pháttriển của vi sinh vật cũng như việc tạo glucoamilase (Rodzevich, 1973)

2.3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy.

Toàn bộ chu trình phát triển của nấm mốc trên môi trường cám có thể chia thành bathời kì sau:

+ Trong 10÷14 giờ đầu, xảy ra sự trương đính bào tử và bắt đầu mọc nấm Trongthời kì này phòng nuôi cấy cần giữ ở nhiệt độ không dưới 28÷30°C để không kìm hãm sựphát triển ban đầu của nấm mốc

+ Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh Thời kì này kéo dài trong14÷18 giờ Nấm mốc phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hôhấp rất mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều Vì vậy, trong lớp canh trường nhiệt độ tăng lênđến 37÷40°C và có thể còn cao hơn tùy thuộc vào độ dày của lớp Do đó cần phải thôikhông khí điều tiết có nhiệt độ không thấp hơn 28÷29° và có độ ẩm tương đối cực đại

+ Thời kì thứ ba kéo dài trong 10÷20 giờ Trong thời kì này, quá trình trao đối chấtxảy ra không mạnh mẽ lắm và dần dần yếu đi, lượng nhiệt thoát ra bé hơn, nhưng tạo nênenzyme khá mạnh, kéo dài Phụ thuộc vào tính chất sinh lý của chúng và sự kết thúc sinhtổng hợp enzyme, mà có thể ngừng sự phát triển của nấm mốc vào một thời gian bất kỳ.Vậy nhiệt độ tối thích cho sinh tổng hợp amylase trên môi trường rắn là 28÷32°C Nhiệt độ

dưới 24°C hoặc trên 45°C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khảanwng sinh tổng hợp amylase (Đặng Thị Thu, 1989).

2.3.4.3. Thời gian nuôi

Quá trình nuôi nấm mốc thường kéo dài từ 35÷48 giờ tùy thuộc vào thời gian hoànthành việc tạo ra enzyme

Ở một số loài Aspergillus, sự tạo thành lượng enzyme tối đa sẽ trùng với sự bắt đầu

tạo ra đính bào tử, do đó cho ngừng quá trình phát triển vào lúc này là thích hợp nhất.Trong một số trường hợp khác, sự tích lũy enzyme có thể còn tiếp tục kéo dài trong cả thờigian tạo ra đính bào tử một cách mạnh mẽ

Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật vì sự ngừng tổng hợp enzyme

có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào cần thiết Do nhu cầu cầnmốc giống nên khi nuôi, ta chọn thời điểm mà mốc phát triển mạnh nhất để thu được nhiềusinh khối bào tử để khi đưa vào bánh men thì nấm mốc sẽ thích nghi sớm và phát triểnmạnh, ở điều kiện thích hợp sẽ tạo được nhiều glucoamilase có hoạt lực cao như mongmuốn

2.3.4.4. pH môi trường.

Nuôi bằng phương pháp bề mặt thì pH không thay đổi đáng kể trong quá trình nuôi

do môi trường có dung lượng cao và hàm ẩm thấp

Khống chế các điều kiện nuôi cấy thích hợp, nhiệt độ các buồng 28÷32°C có thônggió và giữ độ ẩm không khí 90÷95%, trong quá trình nuôi cấy cần lật và bẻ nhỏ cám vì hệsợi mốc phát triển làm cơ chất kết thành bánh Nuôi tới khi mốc sắp đến giai đoạn tạothành bào tử, độ ẩm canh trường 40÷50% Đem sấy khô không quá 45°C cho tới độ ẩm10÷12% và nghiền nhỏ Đựng mốc trong các bao hoặc thùng kín, bảo quản ở chỗ mát(≤20°C) và để dùng dần

2.4 Tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng trong sản xuất rượu truyền thống.

Trước đây, ở hầu hết các nước rượu được sản xuất theo kinh nghiệm gia truyền, qui

mô sản xuất nhỏ, theo lối thủ công, sử dụng nguồn vi sinh vật hoàn toàn tự nhiên Do đóchất lượng sản phẩm không ổn định, phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện thời tiết, môitrường, kinh nghiệm người sản xuất, không quản lý được nguồn vi sinh vật tự nhiên cho lên

men, điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm không được đáp ứng Quy trình sản xuất tiềm ẩnnhiều mối nguy.

Hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, tại các nước phát triểncác sản phẩm lên men truyền thống đã được duy trì và phát triển một cách bền vững bằngviệc ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật công nghệ vào thực tế sản xuất và quy trìnhsản xuất được kiểm soát một cách chủ động Một trong những kỹ thuật được nhiều nước ápdụng nhất là việc sử dụng giống khởi động thuần chủng

Ở Việt nam, vẫn chưa có một cơ sở sản xuất bánh men rượu truyền thống nào mangtính chất quy mô công nghiệp mà chủ yếu là những hộ kinh doanh nhỏ lẻ, không đảm bảochất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, chất lượng bánh men không ổn định, hiệu quả lênmen không cao

Do đó, việc sử dụng các chế phẩm bánh men vi sinh vật thuần chủng vào sản xuấtkhông chỉ giúp cho quá trình sản xuất dễ cơ giới hóa, dễ kiểm soát, mà còn tạo ra các sảnphẩm chất lượng luôn ổn định, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm mà vẫn duy trì được cácđặc điểm truyền thống của sản phẩm

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu men gốc Đức Ngọ và men Thái Nguyên được lấy từ xưởng sản xuất Bộ mônCông nghệ đồ uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

3.2 Phạm vi nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

 Thiết bị:

- Máy ly tâm.

- Kính hiển vi điện tử Nikon eclipe e800 (Nhật Bản)

- Máy nuôi lắc ổn nhiệt SHELLAB 1575R (Mỹ)

- Nuôi ổn nhiệt Heraus (Đức)

- Nồi hấp khử trùng HIRAYAMA ( HICLAVE HV-110) ( Nhật Bản)

- Tủ cấy vi sinh Sanyo BIOCLEAN BENCH ( Nhật Bản)

- Bình schott, ống nghiệm, đĩa petri, ống falcon

- Lọ nhựa, rổ, khay nhựa

- NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, FeSO4.

 Môi trường cần chuẩn bị:

+ Môi trường Czapeck-dox : NaNO3 - 2g , KH2PO4 - 1g, KCl – 1g, MgSO4.7H2O - 0,5g, FeSO4.7H2O - 0,01g, Agar – 20g , Nước cất – 1000ml, Saccarose – 30g (TCVN 9298:2014)

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ đồ uống –Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

3.2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu đề tài từ 01/2019 đến tháng 5/2019

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergilluscó khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống

Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus,

Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một sốchỉ tiêu của quá trình lên men rượu

Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus ,

Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống.

Men Đức Ngọ và men Thái Nguyên được mang về phòng thí nghiệm tiến hành đem

phân lập chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus trên môi trường Czapeck - dox Tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus

phân giải tinh bột tốt nhất

Các chỉ tiêu theo dõi: Phân lập ra chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium,

Aspergillus đánh giá và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột tốt nhất

bằng vòng thủy phân tinh bột

3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn

Sau khi tiến hành phân lập được chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus Penicillium và

Aspergillus có khả năng đường hóa cao, chúng tôi tiến hành nhân sinh khối nấm mốc.

Tiến hành thí nghiệm: Cấy truyền một ống nghiệm giống mốc đã phân lập được ởtrên vào bình tam giác chứa 100ml môi trường nuôi cấy Czapeck-dox Nuôi lắc rồi đem lytâm 4000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút, thu sinh khối và đem cân lượng sinh khối thuđược Trộn 1 ống sinh khối vừa ly tâm với 100g gạo ta thu được bột mốc Các thông sốđiều kiện nuôi lắc: Số vòng lắc, nhiệt độ, thời gian được thay đổi lần lượt theo từng thínghiệm để nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi lắc đến quá trình nhân sinh khối từchủng nấm mốc đã tuyển chọn

Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân

sinh khối.

Công thức

Thời gian(giờ)

Thời gian(giờ)

Số vòng lắc(vòng/phút)

Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc

nhân sinh khối.

Công thức

Số vòng lắc(vòng/ phút)

Nhiệt độ(°C)

Thời gian (giờ)

Nhiệt độ được chọn ởthí nghiệm bảng 3.2

Thời gian được chọn

ở thí nghiệm bảng

3.1

Chỉ tiêu theo dõi:

- Lượng sinh khối thu được

3.4.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu

đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu.

- Hoạt hóa men khô: 0,5g men : 0,5g Glucose Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30phút

- Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với lượng bột mốc theo các tỷ lệ theocông thức như trong bảng 1, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong

24h đầu, 24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nướcvào bình lên men ở nhiệt độ 28°C

Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Độ cồn của dịch lên men

- Độ chua của dịch lên men

- Hàm lượng chất khô (TSS).

3.4.1.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn.

Mẫu 1 (CT4.1): Hoạt hóa men khô: 1g men : 1g Glucose Nhiệt độ 30°C -33°Ctrong vòng 30 phút

- Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với lượng bột mốc theo các tỷ lệ tìmđược ở thí nghiệm 3, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 24h

đầu, 24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nước vàobình

Mẫu 2 (CT4.2): Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g lượng bánhmen gốc ban đầu, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 24h đầu,

24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Độ cồn của dịch lên men

- Độ chua của dịch lên men

b Phương mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, hình dạng bào tử, đính bào tử của các chủng nấm mốc

Hình dạng khuẩn lạc được quan sát ở mặt trước và mặt sau sau 24 giờ nuôi cấy trênmôi trường Czapeck-dox Hình thái tế bào, khuẩn ty, đính bào tử được quan sát trên kính

hiển vi sau 48 giờ nuôi cấy Phân loại chủng nấm mốc phân lập dựa vào khóa phân loạinấm mốc và tài liệu của Barnett(1973)

c Phương pháp xác định số lượng nấm mốc trong chế phẩm

Số lượng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp trang cấy trên các đĩa peptrivới các môi trường tương ứng Môi trường được chọn có cơ chất đặc hiệu cho loài pháttriển Sau một thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường và dựa vào tỉ

lệ pha loãng cùng thể tích ban đầu đem cấy từ đó suy ra khuẩn lạc có trong 1ml mẫu

Dùng môi trường Czapeck-dox để định lượng nấm mốc

d Giữ giống vi sinh vật

Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường agar đông đặc Cấy truyền vi sinh vậtsang ống nghiệm và để một thời gian ở nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật phát triển Sau đóđem bảo quản ở nhiệt độ lạnh ( khoảng 4℃)

3.4.2.2. Các phương pháp hóa sinh

đó tra bảng (đã được tính sẵn) cho biết độ cồn trong dịch theo thể tích

Cách tiến hành: Đầu tiên đo nhiệt độ sôi của nước cất Chuẩn bị nước làm mát ốngsinh hàn, lắp nhiệt kế vào đầu bình gia nhiệt sao cho đầu trên của thanh gia nhiệt cách bầuthủy phân dưới 1,5 - 2 cm Dùng nước cất hai lần để tráng bình cất Cho nước cất hai lầnvào bình cất sao cho bề mặt lõm của nước cất tiếp xúc với mép trên của vạch định mức (thểtích mẫu khoảng 50 ml) Bật lửa để đốt đèn cồn, sau 6 - 10 phút khi nhiệt độ tăng lên dần

và ổn định thì đọc nhiệt độ sôi và ghi lại, tắt máy và tháo nước ra Tiếp theo tiến hành đonhiệt độ sôi của rượu Tráng bình cất mẫu rượu và thực hiện cất rượu giống như phần cấtnước ở trên

Tính kết quả : Dùng bảng chuẩn tra (kèm theo máy) để xác định độ rượu dựa trênnhiệt độ sôi Cách tra như sau: ta xoay vòng sao cho nhiệt độ sôi của nước cất hai lần trùng

với giá trị độ rượu bằng 0% (v/v) Sau đó từ giá trị nhiệt độ sôi của mẫu rượu đọc trên nhiệt

kế tra bảng suy ra nồng độ rượu theo % (v/v)

b Xác định độ chua của dịch lên men: Phương pháp trung hòa

Nguyên lý: Một độ chua là số ml NaOH có nồng độ 1N cần thiết để trung hòa axit tự

do chưa trong 20ml dịch giấm Nếu số ml NaOH quy về 1N bằng 1, ta nói dịch giấm chín

có độ chua bằng 1 Một độ chua tương đương với 2,45g H2SO4/lit

Tiến hành: Lấy 20ml dung dịch lọc của giấm chín hoặc dịch lên men cho vào bìnhtam giác chứa sẵn 50ml nước cất Tiếp theo dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ đến khi xuấthiện màu hồng nhạt với chất chỉ thị là phenolphtalein

Tính kết quả: Độ chua được tính theo công thức:

Độ chua ¿ n

10 (độ)Trong đó:

n: Là số ml NAOH 0,1N tiêu hao khi định phân 20ml dịch lọc

Trong điều kiện lên men bình thường, độ chua (độ axit) của dịch giấm chín tăng khoảng 0,5 đến 0,7 g/l so với độ chua của dịch đường hóa (Lê Thanh Mai, 2005)

c Xác định nồng độ chất hòa tan (TSS)

Xác định TSS trong thời gian lên men dịch: xác định bằng chiết quang kế tự độngDIGITAL REFACTOMETER – ATAGO (Nhật Bản) 0-53% Brix (± 0.2) theo TCVN7771:2007

Nguyên lý: Dựa vào nguyên lý khúc xạ của ánh sáng: khi ánh sáng đi từ môi trườngkhông khí vào một môi trường chất lỏng, tia sáng sẽ bị lệch đi Dựa trên độ lệch của tiasáng ta có thể xác định được nồng độ chất hòa tan có trong dung dịch

Tiến hành: Nhỏ vài giọt nước cất vào chiết quang kế điện tử, nhấn start chỉnh vềmức 0.0 hàm lượng chất khô Lau sạch nước nhỏ vài giọt mẫu lên chiết quang kế điện tử,nhấn start, đọc số hiện thị trên chiết quang kế

Tính kết quả : Đọc kết quả hiển thị, đó chính là hàm lượng chất khô tính theo % củamẫu đem phân tích

d Xác định khả năng phân giải tinh bột

Xác định bằng đường kính vòng thủy phân tinh bột của các chủng trên môi trườngthạch đĩa có chứa tinh bột.

Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Czapeck (0,5% tinh bột) cho 40 đĩa petri 20ml(800ml) Hấp khử trùng 121℃ trong 30 phút, pH 5.0-5.5

Cho 20ml môi trường trên vào đĩa peptri đã vô trùng, các đĩa petri bằng nhau

Làm nguội, dùng que cấy chấm nhẹ các mẫu mốc vào giữa đĩa petri

Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ Cho thuốc thử và đo đường kínhvòng phân giải

Thuốc thử lugol : 1g I2 và 0,5g KI trong 100ml nước cất, lắc cho tan hết

e Phương pháp trích ly enzyme amylase.

Cân 5 gam sinh khối/ chế phẩm cho vào ống Falcon 50ml, bổ sung thêm 30ml nướccất, nuôi lắc 3 giờ tốc độ 180 vòng/ phút Ly tâm 6000 vòng /phút trong 10 phút Lấy dịch

ở phía trên thu được dịch chiết ly enzym

3.4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Excel và Minitab 18

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chủng giống bánh men là một yếu tố rất quan trọng quyết định đến chất lượng rượu,nồng độ rượu Việc lựa chọn loại bánh men giống là bước đầu tiên vô cùng cần thiết

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai mẫu men Đức Ngọ vàThái Nguyên cho độ rượu tốt và mùi thơm đặc trưng

4.1 Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và

Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống.

4.1.1 Phân lập nấm mốc trong bánh men.

Hệ vi sinh vật trong bánh men rất phong phú bao gồm : nấm mốc, nấm men và vikhuẩn Các chủng nấm mốc trong bánh men đóng vai trò sinh enzyme amylaza để thủyphân tinh bột, lượng đường do enzyme amylaza thủy phân tinh bột tạo ra là yếu tố quantrọng quyết định đến lượng cồn được tạo ra khi lên men Do đó, tôi sẽ tập trung vào phânlập và tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao

Đầu tiên, tiến hành phân lập nấm mốc trong bánh men Sử dụng môi trường tối ưu cho nấm mốc là môi trường Czapeck-dox Khi tách được các khuẩn lạc riêng biệt, nuôi cấy

tạo giống thuần chủng Sau đó tiến hành làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi Kết hợp việc quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào với khóa phân loại để phân loại nấm mốc và tài liệu của Barnett(1973)

Kết quả thu được như sau:

Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ.

STT Kí hiệu Chủng vi

sinh vật Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào

Hệ sợi rất phát triển, ban đầu màu trắng, sau đó sẫm hơn và ngả sang màu đen

Khuẩn ty đơn bào không có vách ngăn, bào tử kín Đầu sợi nấm là cuống bào tử nang Nang bào tử hình cầu, khi thành của nang bào tử nứt ra giải phóng bào tử

Khuẩn ty phân nhánh,

có vách ngăn ngang, bào tử trần, cuống mang bào tử phát triển

từ tế bào chân, phần cuối phồng lên thành 1cái bọng (vesicle), trênbọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh

ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc

3 ĐN05 Nấm mốc Aspergillus

niger

Khuẩn lạc hình tròn, sợi mảnh, ngắn, có

Khuẩn ty phân nhánh,

có vách ngăn ngang,

ĐN07

ĐN08

ĐN09

màu đen bào tử trần, cuống

mang bào tử phát triển

từ tế bào chân, phần cuối phồng lên thành 1cái bọng (vesicle), trênbọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh

ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc

Khuẩn ty đa nhân có vách ngăn, bào tử trần,cuống mang bào tử hình thành ngay lớp thể bình và các bào tử

Khuẩn ty có màu đen, rễ cắm sâu vào

cơ chất, ban đầu có màu trắng, sau đó cómàu đen hoàn toàn

Khuẩn ty đơn bào, hông có vách ngăn, bào tử kín Trên khuẩn

ty hình thành những nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào

cuống mang bào tử hình thành ngay lớp thể bình và các bào tử.

Khuẩn ty có màu đen, rễ cắm sâu vào

cơ chất, ban đầu có màu trắng, sau đó cómàu đen hoàn toàn

Khuẩn ty đơn bào, hông có vách ngăn, bào tử kín Trên khuẩn

ty hình thành những nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào

Khuẩn ty phân nhánh,

có vách ngăn ngang, bào tử trần, cuống mang bào tử phát triển

từ tế bào chân, phần cuối phồng lên thành 1cái bọng (vesicle), trênbọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh

ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc

Nhận xét: Kết thúc quá trình phân lập từ hai mẫu bánh men Đức Ngọ và Thái

Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 1 chủng Mucor, 2 chủng Rhizopus, 8 chủng

Penicilium, 10 chủng Aspergillus oryzae và 5 chủng Aspergillus niger.