Tính hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm

Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn bằng calcium ionomycin trong các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm sửdụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Thái Nguyên - 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Mã số ngành: 84.20.20.1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

• •

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS DƯƠNG VĂN CƯỜNG

Thái Nguyên -2020

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Tính hiệu quả của

kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm” là trung thực, hoàn toàn

thực hiện tại Khoa Hỗ trợ sinh sản - Bệnh viện A Thái Nguyên Ngoài ra, trongbài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn

PGS.TS Dương Văn Cường đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt

quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Bệnh viện A Thái Nguyên, Khoa Hỗ trợ sinh sản cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn

thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập vàthực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Học Viên

2.6.53. RNA thông tin

2.6.62. Chọc hút mào tinh hoàn

2.6.82 2.6.83

2.6.84. DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

2.6.85. • ' •

2.6.86 2.6.87

2.6.88. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

2.6.89 Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng phương pháp hoạt hóa

noãn bằng calcium ionomycin trong các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm sửdụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) do tinh trùng ít,yếu và dị dạng nặng, tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật

2.6.90 Phương pháp: Nghiên cứu so sánh hai giá trị trung bình Noãn được

chia thành 2 nhóm: Nhóm 1 gồm 30 bệnh nhân được thực hiện hỗ trợ hoạt hóanoãn (AOA) bằng calcium ionomycin 10 iiM sau khi ICSI và nhóm 2 là nhómđối chứng (nghiên cứu hồi cứu) không thực hiện AOA sau ICSI Tỉ lệ thụ tinh, tỉ

lệ tạo phôi có chất lượng khá/tốt, tỉ lệ lên phôi ngày 5 và tỉ lệ có thai được sosánh giữa hai nhóm

2.6.91 Kết quả: Nhóm 1 (ICSI + AOA) có 284 noãn từ 30 chu kỳ điều trị

ICSI do bất thường tinh trùng nặng từ tháng 8 /2019 đến tháng 8/2020, nhóm 2(ICSI) có 1445 noãn từ 176 chu kỳ đã điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên Có

sự gia tăng đáng kể về tỉ lệ thụ tinh ở nhóm 1 so với nhóm 2 (93% so với 89%,P<0,05), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

2.6.92 Các tỉ lệ khác có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai

nhóm

2.6.93 Kết luận: Phương pháp AOA có thể là tăng tỉ lệ thụ tinh của phương

pháp ISCI đối với các trường hợp bất thường tinh trùng nặng

2.6.94. MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

2.6.95 Năm 1978, sự kiện em bé thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên ra đời

đánh dấu bước ngoặt trong ngành y học thế giới [44] Đến nay, ước tính đã cóhơn 8 triệu trẻ em ra đời từ IVF, hàng năm trên toàn thế giới có hơn 2 triệu trườnghợp IVF và các kỹ thuật tương đương được thực hiện Ở các nước phát triển, có

từ 1-5% trẻ em ra đời từ IVF Người ta ước tính mỗi năm số trường hợp thực hiệnIVF trên thế giới tăng khoảng 10%

2.6.96 Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - Invitro Fertilizaton) ra đời kết hợp

với Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI - Intra cytoplasmic SpermInjection) đã giúp tỉ lệ thành công của IVF tăng đáng kể Đây là một kỹ thuật rấthiệu quả được sử dụng ở các cặp vợ chồng được chẩn đoán có bất thường tinhtrùng nghiêm trọng

2.6.97 Mặc dù tỷ lệ thành công cao, thất bại thụ tinh sau ICSI vẫn xảy ra ở

1- 3% các cặp vợ chồng Tỉ lệ thụ tinh thường dao động trong khoảng 70-80%,trong đó có các chu kì thất bại thụ tinh hoàn toàn Kết quả này có thể do noãnkhông được hoạt hóa hay bất thường nhiễm sắc thể (NST) của noãn hoặc tinhtrùng Sau ICSI, noãn không thụ tinh có thể chứa đầu tinh trùng còn cô đặc, tinhtrùng còn nguyên hay bị đẩy ra khỏi noãn, tình trạng này phải chiếm 12% trongtổng số noãn không thụ tinh Ngoài ra khoảng 7% noãn trưởng thành chứa đầutinh trùng có nhân chưa được giải nén, DNA của tinh trùng hiện diện ở trạng tháiNST chưa trưởng thành, còn cô đặc Chỉ có một vài xét nghiệm chẩn đoán hiện

có sẵn để đánh giá lý do thất bại trong thụ tinh ICSI Việc thất bại thụ tinh dẫnđến giảm số lượng hoặc không có phôi để chuyển là một thử thách cho nhữngbệnh nhân thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm

2.6.98 Những tinh trùng bất thường nặng, cụ thể là trường hợp chỉ có vài

tinh trùng trong mẫu (cryptozoospermia) hay tinh trùng đầu tròn(globozoospermia) không có thể cực đầu, dẫn đến trong quá trình di chuyển dễ

11

thất thoát zeta (PLCZ) làm giảm khả năng hoạt hóa noãn từ đó dẫn đến noãnkhông thể vượt qua giai đoạn nghỉ trong phân bào, kết quả là thất bại thụ tinh

[39] Để giải quyết vấn đề thất bại trong việc hoạt hóa noãn, người ta đã nghiêncứu nhiều phương pháp để khởi phát quá trình hoạt hóa noãn Hoạt hóa noãn(AOA - Assisted oocyte activation) đang ngày càng được áp dụng trong sinh sản

có sự trợ giúp của con người để khôi phục tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ mang thai ở cáccặp vợ chồng có tiền sử thất bại trong thụ tinh ICSI [22], [52] Từ cuối nhữngnăm 1990 [35], nhiều trung tâm đã thực hiện AOA trong nhóm bệnh nhân hiếmgặp này, cho tỉ lệ của thụ tinh và tỷ lệ mang thai khả quan hơn ở nhiều cặp vợchồng

2.6.99 Hiện nay, nhiều phương pháp hoạt hóa noãn nhân tạo khác nhau

được sử dụng như hoạt hóa bằng dòng điện, vật lý hay hóa học Trong đó,phương pháp phổ biến nhất là hoạt hóa noãn sử dụng chất hóa học, bao gồmcalcium ionophores, như ionomycin và calcimycin (A23197), hoặc là tổ hợpprotein tổng hợp như 6- dimethylaminopurine (6-DMAP)

2.6.100 Bên cạnh việc thiếu hụt PLCZ dẫn đến không thể hoạt hóa noãn, vẫn

còn nhiều nguyên nhân khác dẫn đến giảm tỉ lệ thụ tinh Vì vậy, việc hoạt hóanoãn nhân tạo được cho rằng không phải phù hợp với tất cả trường hợp thất bạithụ tinh, mà chỉ có hiệu quả với trường hợp tiền sử thất bại thụ tinh do tinh trùngbất thường nặng không thể hoạt hóa noãn [14], [48]

2.6.101 Sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn hiện nay được cho là phương

án tối ưu nhất đối với những trường hợp bất thường tinh trùng nặng nhằm cảithiện tỉ lệ thụ tinh sau ICSI Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều bằng chứng khoa học

về tính an toàn và hiệu quả về sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn nhân tạo nên

kỹ thuật này vẫn chưa thể được coi là một phương pháp điều trị thường quy

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

2.6.102 Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa noãn bằng hóa

12

học trong thụ tinh ống nghiệm.

2.2 Mục tiêu cụ thể

2.6.103 Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa noãn bằng

ionomycin tới tỉ lệ thụ tinh, chất lượng phôi ngày 3, tỉ lệ lên phôi ngày 5, chấtlượng phôi ngày 5 và tỉ lệ có thai của các trường hợp làm thụ tinh trong ốngnghiệm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

2.6.104 Cung cấp thêm cơ sở khoa học cho áp dụng kỹ thuật hoạt hóa noãn

trên các trường hợp bệnh nhân vô sinh hiếm muộn bất thường tinh trùng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

2.6.105 Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tư vấn, áp dụng từ đó nâng

cao được tỉ lệ thụ tinh, có thai cho bệnh nhân đến khám và điều trị

2.6.106.đối với những bệnh nhân bất thường tinh trùng Xây dựng quy trình chuẩn để áp dụng thường quy

13

2.6.107. CHƯƠNG 1

2.6.108. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cở sở khoa học của vấn đề nghiên cứu

1.1.1 Thụ tinh tự nhiên

2.6.109 Sự thụ tinh là hiện tượng kết hợp giữa tinh trùng và noãn để tạo

thành hợp tử có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội Trong invivo, quá trình thụ tinhthường xảy ra ở 1/3 ngoài của vòi trứng Sự thụ tinh diễn ra bên trong ống sinhdục nữ phụ thuộc vào hai cấu trúc: cực đầu của tinh trùng và màng trong suốt củanoãn Ba sự kiện chính liên quan đến sự tương tác của tinh trùng và noãn gồm: 1)tinh trùng gắn vào màng trong suốt; 2) tinh trùng xảy ra phản ứng cực đầu, phóngthích các enzyme phân hủy và lộ ra màng cực đầu bên trong; 3) màng tinh trùngtương tác với màng bào tương của noãn và hai màng hòa vào nhau [49]

2.6.110 Để phát triển đầy đủ các đặc điểm cần thiết cho quá trình thụ tinh,

sau khi xuất tinh tinh trùng cần di chuyển đến hệ thống ống sinh dục nữ để trảiqua các biến đổi về phân tử, sinh hóa và sinh lý [38] Các thay đổi được khởi phátbởi các tín hiệu từ môi trường, sự tương tác của tinh trùng với noãn và các yếu tốngoại bào Sự biến đổi của tinh trùng bao gồm biến đổi trong độ di động, hoạthóa, phản ứng cực đầu, sự xâm nhập vào màng trong suốt, gắn kết với noãn và sựhòa màng Ở người, sự thụ tinh có thể chia làm 6 giai đoạn:

2.6.111. - Tiếp xúc giữa tinh trùng và màng trong suốt

2.6.112. - Phản ứng cực đầu

2.6.113. - Xâm nhập qua màng trong suốt

2.6.114. - Hòa màng bào tương của noãn

2.6.115. - Hoạt hóa noãn

2.6.116. - Sự hình thành và hòa nhập ở hai tiền nhân

1.1.2 Tiếp xúc màng trong suốt

2.6.117 Sự gắn sơ cấp đầu là tương tác vật lý đầu tiên của các giao tử liên

quan đến nhận diện đặc trưng loài của cấu trúc và phân tử Theo nguyên tắc, một

phân tử trên tinh trùng sẽ nhận diện và gắn với phân tử bổ sung trên vỏ của noãn.Cấu trúc chính liên quan đến sự gắn kết giữa các giao tử tương tự ở tinh trùng củacác loài khác nhưng có sự khác biệt ở noãn Cơ chế nhận diện giao tử ở động vật

có vú dựa trên tương tác protein - carbohydrate giữa tinh trùng và noãn

2.6.118 Màng trong suốt (ZP - Zona pellucida) được cấu tạo chủ yếu bởi các

glycoprotein, đây là một cấu trúc đàn hồi được hình thành bởi mạng lưới sợi và

tơ trong đó bao gồm 4 lớp glycoprotein là ZP1, ZP2, ZP3 và ZP4 ZP3 chính lànơi tinh trùng sẽ gắn kết và có nhiệm vụ khởi phát phản ứng cực đầu [25], [24],[58] ZP1, ZP3, ZP4 có vai trò hoạt hóa tinh trùng và khởi phát phản ứng cựcđầu Sau khi xảy ra phản ứng cực đầu, ZP2 sẽ thay thế ZP3 tiếp tục giữ cho tinhtrùng gắn kết vào, để từ đó tinh trùng dễ dàng chui qua màng trong suốt để vàokhoang quanh noãn Trong khi đó, ZP1 chủ yếu là cầu nối để kết nối ZP2 và ZP3với nhau

2.6.119 Nhiều nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc và gắn kết với ZP3 của tinh

trùng có tính đặc hiệu loài, nghĩa là chỉ có tinh trùng và màng trong suốt của noãncùng loài mới gắn kết được với nhau [43] Như vậy, chức năng đầu tiên rất quantrọng của màng trong suốt, đó là thực hiện vai trò như một rào cản hữu hiệu ngănchặn hiện tượng đa thụ tinh

1.1.3 Phản ứng cực đầu

2.6.120 Thể cực đầu (acrosome) nằm ở phần đầu của tinh trùng, chiếm 1/2

đến 2/3 thể tích đầu tinh trùng Thể cực đầu tương đối rộng, có nguồn gốc từ thểgolgi và là một tiểu thể giống lysosome Đây là nơi chưa những enzyme quantrọng giúp cho tinh trùng có hể tiêu hủy và xuyên qua màng trong suốt để vàonoãn Thể cực đầu có 2 lớp màng, màng ngoài nằm ngoài ngay dưới màng bàotương và màng trong áp sát vào màng nhân tinh trùng, nơi chứa thông tin ditruyền

2.6.121 Khi tinh trùng vừa gắn với ZP3, phản ứng cực đầu sẽ xảy ra Đây là

một phản ứng quan trọng cần thiết cho sự thụ tinh của tinh trùng vì chỉ những

tinh trùng nào đã xảy ra phản ứng cực đầu mới có thể xâm nhập qua màng trongsuốt và hòa nhập với màng bào tương noãn Tuy nhiên, để phản ứng cực đầu cóthể xảy ra, tinh trùng cần trải qua quá trình hoạt hóa trước đó Đây là quá trìnhnhằm làm thay đổi cấu trúc và tính bền vững của tế bào tinh trùng và là tiền đềcho phản ứng cực đầu xảy ra Trong in-vitro, hoạt hóa có thể xảy ra trong quátrình chuẩn bị tinh trùng Khi phản ứng cực đầu được khởi phát, màng ngoài củacực đầu sẽ hòa với bào tương của tinh trùng, giúp giải phóng các enzyme bêntrong cực đầu Trong số đó quan trọng nhất là hyaluronidase và acrosin Acrosinđược dự trữ dưới dạng tiền enzyme là pro-acrosin được chuyển hóa sang dạnghoạt động khi được phóng thích nhờ phản ứng cực đầu Cả hai enzyme này đềuđóng vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của tinh trùng vào lớp vỏ quanh noãn,nhưng cơ chế thực sự mà chúng đóng góp vào việc này chưa được xác định rõ,bởi lẽ mạng lưới của tế bào hạt chủ yếu chứa carbonhydrate hơn là acidhyaluronic, và các enzyme khác khác của cực đầu như aryl sulphatase có thểcũng có vai trò kết hợp giúp tinh trùng xâm nhập vào noãn Vì vậy, cần có thêmnhiều nghiên cứu để xác định vai trò của các enzyme được phóng thích trongphản ứng cực đầu.

2.6.122.

2.6.123. Hình 1.1 Phản ứng cực đầu [16]

2.6.124 Phản ứng cực đầu xảy ra với sự tham gia của ba thành phần chính là

calcium ion (Ca2+), sự hoạt hóa phospholipase và enzyme protein kinase [45].

ZP3 ban đầu sẽ kích hoạt tyrosine kinase (dẫn đến sự gia tăng phosphoryl hóaprotein tyrosine) và sự tự phosphoryl hóa cụ thể G-protein dẫn truyền tính hiệutương tác với các enzyme gắn kết màng như phospholipase C và adenylatecylase Sự hoạt hóa hai enzyme dẫn đến sự gia tăng tín hiệu truyền tin thứ hai làcAMP, inositol triphosphate (IP3) và diacylglycerol Hậu quả của sự gia tăng tínhiệu truyền thứ hai là sự hoạt hóa protein kinase như cAMP-dependent kinase và

Ca2+ phospholipid dependent kinase với sự phosphoryl hóa protein IP3 có thểlàm tăng nồng độ Ca2+ nội bào bằng cách phóng thích các Ca2+ từ nguồn dự trữ

Ca2+ nội bào Sự gia tăng Ca2+ nội bào là hậu quả của sự kích thích thụ thể ZP3 dodòng nhập vào từ môi trường ngoài, phụ thuộc và sự hoạt hóa protein G, quakênh Ca2+ và kèm theo sự xâm nhập của ion hydro dẫn đến sự gia tăng pH nộibào Sự gia tăng nồng độ Ca2+ cùng với nồng độ pH nội bào dẫn đến phản ứngcực đầu Người ta thấy rằng phản ứng cực đầu xảy ra trong suốt thời gian nồng

độ Ca2+ tăng

1.1.4 Xuyên màng trong suốt

2.6.125 Sau khi phản ứng cực đầu xảy ra, tinh trùng vẫn gắn với màng trong

suốt tại vị trí ZP2, tiếp theo tinh trùng sẽ phải xuyên qua màng trong suốt để đến

và hòa màng với màng bào tương noãn Sự xâm nhập qua màng trong suốt xảy rasau khi tinh trùng trải qua hiện tượng tăng động và ly giải bằng enzyme Hoạtđộng ly giải bằng enzyme được thực hiện bởi một enzyme protease của thể cựcđầu gọi là acrosin Nơi gắn kết của tinh trùng với ZP2 được cho là có vai trò tạo

ra một vị thế chắc chắn để tại đó tinh trùng chui qua màng trong suốt bằng mộtđường hẹp tạo với bề mặt màng một góc 45 độ nhưng đôi khi cũng có thể xuyênvuông góc hoặc song song với bề mặt màng

1.1.5 Sự hòa nhập tinh trùng và noãn

2.6.126 Quá trình hòa màng giữa các giao tử phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và

Ca2+ Sự dung hợp xảy ra do dự hỗ trợ của các protein màng Trong quá trình xâm

nhập vào màng trong suốt, tinh trùng mất dần cực đầu và chỉ màng cực đầu bêntrong là trực tiếp tương tác với màng trong suốt [9].

2.6.127 Bề mặt của màng noãn được cấu tạo bởi các vi lông mao ngắn, có

khoảng cách đều nhau tạo thuận lợi cho sự dung hợp ở người, vi lông mao hiệndiện trên toàn bộ bề mặt noãn và không phân cực ở giai đoạn này Màng bàotương tinh trùng còn lại hòa với màng bào tương noãn và đánh dấu điểm xâmnhập Tinh trùng thụ tinh tiếp tục di chuyển một đoạn khoảng 20 giây sau khi gắnvào bề mặt noãn [9]

1.1.6 Hoạt hóa noãn

2.6.128 Sự trưởng thành tế bào chất: để có thể thụ tinh thành công va phát

triển phôi ở giai đoạn sớm, noãn cần trưởng thành tế bào chất Quá trình này songsong diễn ra với quá trình hoạt hóa tinh trùng gồm [9]:

- Nhân tố điều chỉnh pha M ( M - phase promoting factor - MPF) được biểuhiện ở mức độ cao

- Tăng nồng độ các nhân tố hiện diện trong noãn như c-mos, mitogenactivate protein kinase (MAPK) và hoạt động của p34cdc2

- Trục xuất thể cực thứ nhất

- Hầu hết quá trình phiên mã kết thúc trước GVBD và chuyển sang dự trữmRNA (Messenger Ribonucleic acid)

2.6.129 Các nhân tố hoạt hóa noãn:

2.6.130 Trong quá trình thụ tinh, sự xâm nhập tinh trùng vào noãn ngoài việc

cung cấp các thành phần di truyền, còn gây một loạt các phản ứng sinh lý giúpnoãn tiếp tục hoàn tất quá trình giảm phân và chuẩn bị cho quá trình hình thànhphôi sau đó Hiện tượng này gọi là hoạt hóa noãn

2.6.131 Sự kiện đầu tiên của quá trình hoạt hóa noãn là sự tăng các ion

xuyên màng bào tương Ở người, tinh trùng tạo ra một dòng điện bên ngoài bằngcách hoạt hóa kênh K+ được điều khiển qua cổng Ca2+

2.6.133. Hình 1.2 Quá trình hoạt hóa noãn của tinh trùng [22]

2.6.134.

2.6.135 Có ba giả thuyết cho sự hoạt hóa noãn, trong đó giả thuyết dựa trên

sự khuếch tán các phân tử hiện diện trong bào tương tinh trùng được ủng hộ hơn

cả Các phân tử này sẽ được chuyển vào bào tương noãn khi dung hợp và kíchhoạt các sự kiện hoạt hóa [11] Giả thuyết trên được gọi là mô hình yếu tố hòatan

2.6.136 Đóng vai trò trung tâm trong sự huy động và phóng thích Ca2+ của

sự thụ tinh là phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2) Sự gia tăng Ca2+ nộibào tự do gần như là tín hiệu kích hoạt chuỗi các sự kiện dẫn đến sự hoạt hóanoãn Kết quả của quá trình hoạt hóa noãn là noãn vượt qua được giai đoạn block

và phản ứng vỏ xảy ra Khi vừa xảy ra hiện tượng phóng noãn, noãn vẫn cònđang ở giai đoạn trung kì của giảm phân II Sự xâm nhập của tinh trùng sẽ khởiphát hàng loạt các hiện tượng nội bào giúp noãn hoàn tất giảm phân II để chuẩn

bị hòa nhập nhân với tinh trùng [6] Trong vòng 1 đến 3 phút sau khi tinh trùngxâm nhập, trong tế bào có sự gia tăng nồng độ Ca2+ nhờ vào sự phóng thích cácnguồn dự trữ Ca2+ từ lưới nội bào tương, với vị trí gia tăng đầu tiên là điểm tinhtrùng xâm nhập Các đợt tăng Ca2+ thoáng qua đầu tiên sẽ được nối tiếp bởi hàngloạt những đợt tăng Ca2+ tiếp theo ngắn hơn nhưng có cường độ cao, tạo nênnhững đợt sóng dao động Ca2+ Khi quá trình thụ tinh đang tiếp diễn, cường độ và

tần số các đợt sóng Ca2+ này giảm dần nhưng độ dài của chúng lại tăng lên chođến khi hoàn toàn ngưng hẳn [23] Sự khởi phát các sóng Ca2+ từ kho dự trữ nộibào được cho là nhờ sự kích hoạt của IP3 - một chất được xúc tác qua enzymephospholipase C đặc hiệu của tinh trùng, enzyme này được gọi là PLC zeta(PLCZ), hiện diện ở phần vỏ xung quanh nhân của tinh trùng [39] EnzymePLCZ chịu trách nhiệm cho sự ly giải PIP2 ở màng Noãn được kích thích điệntích nhờ kênh ion trên màng bào tương Sự thay đổi điện tích của màng bàotương là sự kiện quan trọng trong quá trình hoạt hóa noãn [50].

2.6.137.

2.6.138. Hình 1.3 Các đợt tăng Ca2+ sau khi tinh trùng xâm nhập [19]

2.6.139.

1.2.7 Phản ứng vỏ và các cơ chế ngăn chặn đa thụ tinh

2.6.140 Các đợt sóng dao động Ca2+ còn tạo ra phản ứng vỏ và nhiều phảnứng khác để ngăn chặn hiện tượng đa thụ tinh Hiện tượng này gồm 2 pha: (1)pha nhanh và (2) pha chậm Ở pha nhanh, khi tinh trùng vừa xâm nhập vào màngtrong suốt, sẽ xuất hiện sự biến đổi điện thế dọc theo màng bào tương noãn Sựbiến đổi điện thế nhanh chóng trong vòng một phần nghìn giây ngay khi có sựxâm nhập của tinh trùng đầu tiên, kéo dài khoảng 60 giây và có tác dụng ngănchặn sự xâm nhập của tinh trùng thứ hai Sau 60 giây, điện thế màng sẽ khôi phụclại như trước khi thụ tinh Sau pha nhanh, pha chậm diễn ra để tiếp tục duy trìngăn chặn đa thụ tinh nhờ sự biến đổi của màng trong suốt (phản ứng vỏ) và sựtái cấu trúc của lớp chất nền bao bên ngoài của noãn Biến đổi này phải diễn ratrước khi điện thế màng không còn tác dụng ngăn chặn sự xâm nhập của tinh

2.6.141 Phản ứng vỏ giúp ngăn chặn hiện tượng đa thụ tinh, diễn ra như sau:

ở mặt trong của màng trong suốt có chứa những hạt vỏ có chứa các túi bài tiếtbên trong

2.6.142. Các hạt vỏ được tổng hợp trong quá trình tạo noãn và được phóngthích cùng với hiện tượng phóng noãn Khi tín hiệu dẫn truyền Ca2+ xảy ra, cáchạt vỏ sẽ nhanh chóng phóng thích các thành phần bên trong ra môi trường Cácthành phần này làm thay đổi tính chất của mặt trong màng trong suốt, làm màngtrong suốt trở nên cứng chắc hơn, làm ngăn cản sự xuyên màng của các tinh trùngkhác

2.6.143 Đối với những tinh trùng đã xuyên màng trong suốt, hiện tượng đa

thụ tinh sẽ được ngăn chặn nhờ sự tái cấu trúc của lớp vỏ ngoài của noãn Lớp vỏngoài của noãn được cấu tạo từ 2 nhóm protein: nhóm cơ bản gồm 25 loạiglycoprotein chính có nguồn gốc từ lớp noãn hoàng của noãn chưa thụ tinh Ngaykhi thụ tinh xảy ra, một nhóm các protein khác gồm khoảng 12 loại có nguồn gốc

từ hạt vỏ sẽ được bài tiết Các protein này sẽ nhanh chóng gắn lên lớp noãnhoàng, cũng nhóm protein cơ bản biến đổi lớp chất nền quanh noãn thành lớp vỏngoài bảo vệ giúp ngăn chặn sự xâm nhập tiếp theo của tinh trùng

1.2.8 Sự hình thành và hòa nhập của hai tiền nhân

2.6.144 Sau khi noãn bào được hoạt hóa, quá trình giảm phân của noãn sẽ

được tiếp tục đến kỳ sau (anaphase), dẫn đến sự tống xuất thể cực thứ hai và sựthành lập tiền nhân cái Sự thành lập tiền nhân đực thường xảy ra chậm hơn dotinh trùng phải trải qua một số thay đổi trong cấu trúc ở phần đầu, dưới tác độngcủa một số chất có trong bào tương noãn

2.6.145 Ở tinh trùng trưởng thành, nhiễm sắc thể tinh trùng ở dạng nén chặt

do có nhiều cầu nối disulfide (-SS-) giữa các protamin với DNA (khác vớihistone ở các tế bào khác) Ngay sau khi đầu tinh trùng vào noãn, màng nhân tinhtrùng tăng tính thấm, phình to và các yếu tố ở bào tương noãn bào tác động cácthành phần bên trong nhân tinh trùng Các cầu nối disulfide ở các protamin bị

khử thành nối sulfhydryl (-SH), các protamin nhanh chóng tách rời và nhiễm sắcthể tinh trùng duỗi ra bên trong nhân (tiền nhân đực), sau đó histone sẽ gắn vàonhiễm sắc thể tinh trùng Ngoài ra, tinh trùng còn cung cấp trung thể, hình thànhnên các vi sợi tơ Dưới sự hỗ trợ của các sợi tơ, cả hai tiền nhân đều trải qua cửđộng giống như xoay tròn trong bào tương noãn và dần tiến đến gần nhau về phíatrung tâm của noãn đã thụ tinh, cho đến khi sát vào nhau Đồng thời, chromatincủa tiền nhân và các thể tiền hạt nhân (nucleolar precursor bodies - NPBs) đượchình thành nhờ những đợt sóng tổng hợp RNA (Ribonucleic acid) sớm Sự tiếpxúc của cả hai tiền nhân được thực hiện qua trung gian các vi thể được thành lập

từ trung thể của tinh trùng Khi sự biệt hóa tiền nhân hoàn tất, màng nhân rã ra và

cả chất liệu di truyền của hai tiền nhân hợp lại với nhau Quá trình này gọi là sựhòa nhập nhân Sau đó quá trình phân chia của hợp tử bắt đầu để hình thành phôi

2.6.146.

2.6.147. Hình 1.4 Noãn thụ tinh

2.6.148.

2.6.149 Noãn thụ tinh có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền nhân (pronuclei

-PN) có màng bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trungtâm của noãn Mỗi PN có số lượng và kích thước của các thể hạt nhân (NPB -nucleolar precursor body) tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giaonhau của màng 2PN

1.2 Thụ tinh trong ống nghiệm

1.2.1 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

2.6.150 Giới thiệu kỹ thuật ICSI

2.6.151 Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - Invitro Fertilization) là sự kết hợp

giữa noãn và tinh trùng trong ống nghiệm để tạo thành phôi

2.6.152 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được Palermo

và cs báo cáo thành công lần đầu tiên trên người vào năm 1992, đánh dấu mộtbước tiến quan trọng trong việc điều trị vô sinh nam ICSI là phương pháp tiêmmột tinh trùng duy nhất vào bào tương noãn để chúng thụ tinh và phát triển thànhphôi Sau đó phôi được chuyển vào tử cung người mẹ để tiếp tục phát triển bìnhthường Theo Nagy và cs (1995), sự ra đời của kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bàotương noãn (ICSI) đã giúp cho những bệnh nhân nam gặp các bất thường tinhtrùng như mật độ tinh trùng thấp, độ di động kém, hình dạng tinh trùng bấtthường, được điều trị vô sinh một cách hiệu quả [30]

2.6.153 Trong quá trình ICSI, một tinh trùng duy nhất được tiêm trực tiếp

vào bào tương của một tế bào noãn trưởng thành thông qua quá trình vi mô Đây

là một phương pháp hiệu quả để hỗ trợ sinh sản ở nam giới có các thông số tinhdịch dưới mức tối ưu, điển hình là tinh trùng phẫu thuật thủ thuật (PESA -percutaneous epididymal sperm aspiration hay TESE - testicular spermextraction), yếu ít - yếu - dị dạng (OAT - oligoasthenoteratozoospermia) hoặc ởcác cặp vợ chồng có tỷ lệ thụ tinh thấp sau IVF cổ điển Những lần mang thai đầutiên sau ICSI đã được báo cáo vào đầu những năm 1990 [35] Với sự ra đời củaICSI, hầu như bất kỳ loại tinh trùng nào cũng có thể thụ tinh tế bào noãn, giúpcho đây trở thành phương pháp điều trị vô sinh nam thành công nhất Tỷ lệ thụtinh lên tới 80% và tỷ lệ mang thai lâm sàng lên tới 45% được theo dõi sau ICSI

Tỷ lệ thành công sau này đã làm giảm nhu cầu xin tinh trùng hiến tặng ở các cặp

vợ chồng bị vô sinh nam nghiêm trọng [36]

2.6.154 Tinh trùng dùng cho ICSI có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau

như tinh dịch (xuất tinh tự nhiên) hay sử dụng các thủ thuật để lấy tinh trùng ởmào tinh, mô tinh hoàn Vì tinh trùng được tiêm trực tiếp vào bào tương noãn,

nên các bước có tác dụng chọn lọc tinh trùng trong thụ tinh tự nhiên đều được bỏqua như tinh trùng di chuyển trong cơ quan sinh dục nữ, tinh trùng gắn với màngtrong suốt, tinh trùng tiếp xúc với màng bào tương và giải phóng DNA vào bàotương noãn Tinh trùng được chọn cho ICSI chủ yếu là tinh trùng có hình dạngbình thường và khả năng di động cao.

2.6.155. TINH TRÙNG

2.6.156.

2.6.158 2.6.159.Hình 1.5 Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

2.6.160 Tinh trùng sau khi được thu nhận sẽ được lọc rửa, chọn một tinh

trùng di động trong môi trường và thực hiện bất động tinh trùng bằng cách dùngkim tiêm chà vào đuôi tinh trùng hoặc hút nhả vài lần Thao tác này sẽ làm tổnthương màng tinh trùng giúp cho việc giải phóng các yếu tố của tinh trùng vàobào tương noãn dễ dàng hơn [1] Các yếu tố tinh trùng chủ yếu là những proteinnhạy cảm với nhiệt độ và chỉ có hiệu quả sinh học khi tinh trùng đã được tiêmvào bào tương noãn Sau khi tinh trùng được tiêm vào noãn, trong noãn có sự giatăng nồng độ Ca2+ nhờ vào sự phóng thích các nguồn dự trữ Ca2+ từ lưới nội chất,với vị trí gia tăng đầu tiên là điểm tinh trùng xâm nhập Sự thay đổi nồng độ nồng

độ Ca2+ thành các đợt sóng dao động Ca2+ được kích hoạt bởi inositoltrisphosphate (IP3) nhờ các enzyme phospholipase C đặc hiệu hiện diện ở phần

vỏ xung quanh nhân tinh trùng (cơ chế chất truyền tin thứ hai) [24], [25] Theocon đường truyền tín hiệu nội bào này, noãn sẽ được hoạt hóa và hình thành mộtloạt phản ứng sinh hóa trong bào tương noãn Kết quả là nhân tinh trùng được

giải nén, hình thành tiền nhân và đẩy thể cực thứ hai ra khoang quanh noãn Tiềnnhân đực và tiền nhân cái tiến lại gần nhau, phân chia và tạo thành hợp tử Sau

đó, hợp tử tiếp tục phát triển tạo thành phôi trước khi được chuyển vào tử cungngười mẹ

2.6.161 Đánh giả kết quả sau khi tiến hành ICSI

2.6.162 Đánh giá kết quả thụ tinh [3]

2.6.163 Noãn được xem là thụ tinh bình thường khi xuất hiện 2 tiền nhân:

một tiền nhân đực và một tiền nhân cái Thông thường, cả hai tiền nhân xuất hiệncùng thời gian trong khoảng 17 ± 1 giờ sau khi tiến hành tiêm tinh trùng vào bàotương noãn Noãn thụ tinh bình thường có hình cầu, màng zona pellucida cònnguyên vẹn, có hai thể cực và hai tiền nhân, kích thước tiền nhân gần bằng nhau,nằm sát nhau ở vùng trung tâm của noãn Tiền nhân có số lượng và kích thướccủa các thể hạt nhân tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhaucủa màng hai tiền nhân Những noãn có tiền nhân cách xa nhau, quá khác biệtnhau về kích thước hoặc có thể hạt nhân quá nhỏ được xem là bất thường Noãnkhông thụ tinh thì bào tương thường trơn, có thể có màu nâu, đen hay thoái hóa

và biến dạng

2.6.164 Đánh giá chất lượng phôi [3]

2.6.165 Sau khi thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình nguyên phân nhiều lần và

tạo thành phôi Quá trình này tương tự như quá trình nguyên phân ở tế bào sinhdưỡng Khoảng 23 - 29 giờ sau khi ICSI, hợp tử bắt đầu phân chia lần thứ nhấttạo ra phôi hai tế bào Đây chính là tín hiệu chứng tỏ sự phát triển của phôi Việcđánh giá phôi ngày 3 dựa trên hình thái phôi theo các tiêu chuẩn như số lượngphôi bào, độ đồng đều của tế bào, tỷ lệ mảnh vỡ và tình trạng đa nhân của phôibào

2.6.166 Nồng độ p-hCG trong chẩn đoán thai

2.6.167 Sau khi được chuyển vào tử cung của người mẹ, phôi bắt đầu làm tổ

và phát triển thành thai Các thành phần trong tử cung người mẹ kết hợp với một

số tế bào của thai sẽ hình thành nhau thai nhằm cung cấp chất dinh dưỡng chothai từ máu mẹ Hợp bào nuôi thai sẽ tiết ra hormone hCG (human ChorionicGonadotropin) đi vào máu của mẹ để duy trì hoàng thể, cho phép tổng hợpprogesterone, estrogen nhằm duy trì và hỗ trợ sự phát trển của lớp nội mạc tửcung P-hCG là một tiểu đơn vị của hCG và là dấu hiệu để chẩn đoán thai sớm.Xét nghiệm nồng độ P- hCG trong máu người phụ nữ đạt trên 5 mIU/mL thìngười phụ nữ này được xem là đã mang thai.

2.6.168 Chẩn đoán thai lâm sàng

2.6.169 Vào tuần thứ 8 sau khi tiến hành ICSI, người mẹ sẽ được siêu âm để

chẩn đoán thai lâm sàng Siêu âm là phương pháp chẩn đoán bên ngoài thông quahình ảnh không gây tổn thương, không đau đớn, thao tác đơn giản và có thể lặplại nhiều lần Hình ảnh siêu âm có thể quan sát chân thực độ lớn của tử cung,hình thái bào thai, vị trí và nhịp đập của tim thai Đến cuối tuần thứ 6, tim bàothai bắt đầu đập nhịp nhàng, và tiếp đó, tay chân của thai nhi cũng dần dần hìnhthành Như vậy, kết quả thai lâm sàng được xem là dương tính khi kết quả siêu

âm có tim thai

1.2.2 Hoạt hóa noãn nhân tạo

2.6.170 Mặc dù tỷ lệ thành công cao của ICSI, nhưng thất bại thụ tinh toàn

bộ vẫn xảy ra trong 1 - 3% số chu kỳ ICSI sau khi tiêm tinh trùng [28] Thất bạitrong việc kích hoạt tế bào noãn được coi là nguyên nhân chính gây ra sự thất bạitrong thụ tinh sau ICSI thông thường [32], [46] Trong IVF, một nhóm bệnh nhânđặc biệt thường phải đối mặt với tình trạng thất bại thụ tinh sau ICSI như tinhtrùng ít, yếu và dị dạng (OAT - oligoasthenoteratozoospermia) nặng và tinh trùngđầu tròn (globozoospermia: tinh trùng có đầu tròn, ít hoặc không có acrosome).Những dạng tinh trùng này thường chứa rất ít PLCZ so với những tinh trùng cóhình dạng bình thường [22], [41], [48]

2.6.171 Đối với những trường hợp noãn không có hiện tượng thụ tinh sau

khi tiêm tinh trùng do thất bại trong quá trình hoạt hóa noãn, người ta đã nghĩ đến

cách khởi động quá trình này một cách nhân tạo Nhiều phương pháp hoạt hóanoãn nhân tạo (AOA - artificial oocyte activation) khác nhau đã được áp dụng tạinhiều trung tâm IVF trên thế giới Hai phương pháp AOA được biết đến nhiềunhất hiện nay là AOA bằng dòng điện và AOA hóa học Với phương pháp AOAbằng dòng điện, một dòng điện rất nhỏ được sử dụng để kích thích noãn sau ICSI,điện trường sẽ tạo thành những lỗ nhỏ trên màng bào tương noãn và nhờ đó sẽkích thích tạo dòng Ca2+ bên trong noãn Phương pháp này từng được áp dụngthành công trên noãn bò và noãn người [26] Với phương pháp AOA bằng hóahọc, những hợp chất hóa học (như calcium ionophore A213187, ionomycin,purimycin, strontium chloride, ) có thể được sử dụng để tạo ra sự gia tăng nồng

độ Ca2+ và khởi động phản ứng hoạt hóa noãn Những thành phần này sẽ xúc tiến

sự giải phóng Ca2+ nội bào từ các nguồn dự trữ của tế bào cho đến khi cạn, điềunày sẽ tạo thuận lợi cho Ca2+ ngoại bào tràn vào Nhờ đó mà nồng độ Ca2+ bêntrong tế bào tăng lên, và kết quả là hoạt hóa noãn xảy ra

1.3 Tổng quan kết quả nghiên cứu tại Việt Nam và thế giới

2.6.172 Hiện nay, ở một số trung tâm trên thế giới, AOA còn được mở rộng

chỉ định đối với những trường hợp tinh trùng thu từ phẫu thuật (PESA percutaneous epididymal sperm aspiration hay TESE - testicular spermextraction) Cho đến nay, đa số các nghiên cứu về áp dụng AOA trong kỹ thuậtICSI là các báo cáo ca, loạt ca hoặc không đối chứng Một vài nghiên cứu là ngẫunhiên có đối chứng, trong đó cho thấy AOA có thể có hiệu quả cải thiện kết quảICSI đối với các trường hợp tinh trùng bất thường [31], [55] Tại Việt Nam, kỹthuật ICSI được áp dụng thành công từ năm 1998 và đã trở thành kỹ thuật phổbiến tại tất cả các trung tâm IVF ở Việt Nam AOA được thực hiện cho một sốtrường hợp tinh trùng bất thường hoàn toàn dạng đầu tròn hoặc bất động toàn bộ

-và đã cho kết quả điều trị khả quan Năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn Thị ThuLan và cs thực hiện tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản An Sinh, bệnh viện An Sinhnghiên cứu trên 101 chu kỳ ICSI có bất thường tinh trùng nặng Kết quả tỉ lệ thụtinh ở nhóm thực hiện AOA cao hơn với nhóm đối chứng và sự khác biệt này có

ý nghĩa thống kê (80,8% so với 74,3%, p<0,05) Tuy nhiên, về tỉ lệ thoái hóa, tỉ lệphôi khá và tốt lại không có sự khác biệt giữa hai nhóm [2] Những số liệu trêncho thấy AOA có thể giúp tinh trùng vượt qua khiếm khuyết do bất thường nặng,cho phép noãn hoàn tất quá trình giảm phân, kết quả làm tăng tỉ lệ thụ tinh đángkể.

2.6.173 Năm 2012, nhóm tác giả Ebner và cs đánh giá kết quả ICSI sử dụng

tinh trùng từ 29 bệnh nhân không tìm thấy tinh trùng trong mẫu (azoospermia) và

37 bệnh nhân ít tinh trùng (cryptozoospermia) Đây là nghiên cứu đa trung tâmthực hiện tại Úc và Đức Kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI-AOA bằngA23187 cao hơn so với nhóm ICSI không AOA và sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê (azoospermia 64,4% và cryptozoospermia 48,4% so với 34,7%, p<0,001) Kếtquả lâm sàng 32 trẻ sinh sống trên 73 ca chuyển phôi [14] Năm 2013, nhómnghiên cứu Vanden Meerschaut thực hiện so sánh hiệu quả của AOA trên hainhóm đối tượng thụ tinh kém và thất bại thụ tinh hoàn toàn Nghiên cứu thực hiệnICSI tinh trùng của hai nhóm đối tượng trên noãn chuột, sau đó tiến hành sibling-AOA (AOA một nửa và không AOA một nửa) Kết quả, tỉ lệ thụ tinh nhóm thấtbại thụ tinh hoàn toàn thực hiện AOA cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhómchỉ ICSI thường qui (74,2% so với 43,5%, p<0,001) Tuy nhiên, ở nhóm thụ tinhkém, kết quả giữa hai nhóm ICSI-AOA và ICSI không có sự khác biệt đáng kể

[54] Một thống kê của nhóm Murugesu và cs (2017) tiến hành so sánh cácnghiên cứu thực hiện IVF có kết hợp thực hiện AOA, số liệu cho thấy sử dụngAOA kết hợp với ICSI có tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ làm tổ, tỉ lệ có thai lâm sàng và tỉ lệtrẻ sinh sống cao hơn nhóm không AOA [29]

2.6.174. CHƯƠNG 2

2.6.175. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN

2.6.176. CỨU 2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

2.6.177 Đối tượng người vợ và người chồng được lựa chọn đồng thời, mẫu đối

chứng là những trường hợp vợ bình thường, tinh trùng chồng yếu, đã thực hiệnIVF/ICSI không sử dụng phương pháp kích hoạt noãn từ năm 2017 đến năm 2019

2.6.178 Mẫu đánh giá được lựa chọn từ những trường hợp tương tự, đã thực

hiện IVF/ICSI có sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn bằng chất hóa học từ tháng 8năm 2019 đến tháng 8 năm 2020

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.6.179 Nghiên cứu này được thực hiện và thu thập số liệu tại khoa Hỗ trợ sinh

sản, Bệnh viện A Thái Nguyên Dự kiến nghiên cứu trong 1 năm từ tháng 8 năm

2019 đến tháng 8 năm 2020

2.3 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

2.3.1 Trang thiết bị

2.6.180. - Tủ thao tác vô trùng 2 người

2.6.181. - Tủ cấy CO2 nuôi phôi

2.3.2 Dụng cụ

- Đĩa petri O35mm

- Đĩa petri O100mm

- Đồng hồ bấm giờ

- Micropipette có độ điều chỉnh từ 10^1 - 100^1

- Đầu côn 10 p.1, đầu côn 200 Lil

- Falcon 10ml

- Ống nón eppendorf

2.3.3 Hóa chất nghiên cứu

2.6.182 - Chất hóa học: Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus 1mg

2.6.183 (10634-1MG, Sigma-Aldrich - Mỹ)

2.6.184. - Môi trường nuôi cấy noãn G-TL

2.6.185. - Dầu phủ OVOIL

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.6.186 Nội dung 1: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến

tỉ lệ thụ tinh sau ICSI

2.6.187 Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến

chất lượng phôi hữu dụng ngày 3

2.6.188 Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn tỉ lệ

lên phôi ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5

2.6.189 Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến

tỉ lệ có thai

2.5 Phương pháp

2.5.1 Phương pháp kích hoạt noãn

2.6.190 Noãn sau khi ICSI được ủ trong môi trường đã pha hóa chất

ionomycin 2 lần, mỗi lần 10 phút, thời gian nghỉ giữa 2 lần là 20 phút Sau đó noãn

đã hoạt hóa được nuôi trong đĩa nuôi cấy phôi

2.5.2 Các phương pháp đánh giá nhận mẫu

2.6.191 Công thức tính cỡ mẫu: N=

2.6.192 N: cỡ mẫu, ES: Hệ số ảnh hưởng, C: Hằng số

2.6.193.Phương pháp đánh giá lựa chọn mẫu, loại trừ mẫu đối tượng

người vợ và người chồng:

2.6.194.Đối tượng người vợ: Bệnh nhân dưới 38 tuổi, dự trữ buồng trứng bình

thường (số lượng nang thứ cấp > 6), các chỉ số nội tiết (Estradiol, LuteninizingHormone, Follicular Stimulating Hormone, Prolactin, Progesteron) trong ngưỡngbình thường Buồng tử cung bình thường

2.6.195.Đối tượng người chồng: Đối tượng nghiên cứu được chọn lọc dựa tên

kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 2010 [57] Tinh trùng OATnặng, <1 triệu tinh trùng bình thường/mẫu (theo tiêu chuẩn WHO 2010), bấtthường hình dạng đầu trên 80%, mẫu tinh trùng phẫu thuật, thủ thuật

2.6.196. Bảng 2.1 Đánh giá tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO 2010

2.6.232 Đánh giá khả năng thụ tinh

2.6.233 Sự thụ tinh được đánh giá khoảng 16 giờ sau ICSI Sự thụ tinh bình

thường được xác nhận bởi sự hiện diện của 2 nhân (PN) và sự xuất hiện của thể cựcthứ hai Sau khi dấu hiệu thụ tinh của các tế bào noãn được quan sát, noãn đã thụtinh được nuôi cấy trong một giọt môi trường 25LIL được phủ bằng dầu ở 37OCtrước khi chuyển phôi Phôi được theo dõi từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5.

2.6.234 Đánh giá chất lượng phôi ngày 3, ngày 5 dựa trên chuẩn đồng

thuận của ALPHA 2011 [3]

2.6.235 Hiện nay đánh giá chất lượng phôi chủ yếu là đánh giá của chuyên

viên phôi học được đào tạo dựa theo chuẩn đồng thuận của ALPHA 2011 Chuyênviên có thể đánh giá chủ quan bằng mắt khi quan sát hình ảnh phôi trên kính hiển vihoặc dựa vào hệ thống Timelapse quan sát động học của phôi xuyên suốt từ quátrình thụ tinh đến giai đoạn ngày 3, ngày 5 để đưa ra kết luận về chất lượng phôi

2.6.236 Tại trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện A Thái Nguyên, đánh giá chất

lượng phôi được đánh giá bằng cách quan sát trực tiếp hình ảnh phôi trên kính hiểnvi

2.6.237 Phôi được đánh giá và xếp loại thành 4 bậc: rất tốt (loại 1), tốt (loại 2),

trung bình (loại 3), xấu (loại 4) Phôi hữu dụng là phôi loại 1, 2, 3

2.6.238 Để đánh giá chính xác chất lượng phôi phát triển qua từng giai đoạn,

phải chú ý những cột mốc thời gian sau:

- Phôi phân chia sớm (2 tế bào) : 26h±1

- Phôi phân chia ngày 2 (4 tế bào): 44h±1

- Phôi phân chia ngày 3 (8 tế bào) 68h±1

- Phôi dâu ( morula) ngày 4: 92h±1

- Phôi nang (blastocyst) ngày 5: 116h±1