LỜI CAM ĐOANEm xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacter
Trang 1NGUYỄN VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở
MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
LUẬN VĂN THẠC SĨ
• • CÔNG NGHỆ SINH HỌ C
• •
Thái Nguyên - 2020
Trang 2NGUYỄN VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở
MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN
Thái Nguyên - 2020
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng
tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là trung thực, được thực hiện tại Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm- Đại học TháiNguyên Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đãđược trích dẫn rõ ràng và được phép công bố
Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung kháctrong đề tài của mình
Học viên
Trang 4Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sựgiúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn T.S
Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành luận văn này
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thựcphẩm cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành
đề tài nghiên cứu này
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thựchiện đề tài
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020
Học Viên
Trang 5LSD Least Singnificant Difference Test - Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa
CV Coeficient of Variation - Hệ số biến động
MT Môi trường
TN Thí nghiệm
AS Acetosyringone
LB Left border- ranh giới trái
RB Right border-ranh giới phải
MS Murashige Skoog
DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
Trang 6Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 9Bảng 1.2 Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 9Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu 19Bảng 3.1 Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu
(sau 7 ngày nuôi cấy) 29Bảng 3.2 Ảnhhưởngcủa môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo
của một số giống lúa 30Bảng 3.3 Ảnhhưởngcủa 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo ở một số giống lúa
(sau 14 ngày) 33Bảng 3.4 Ảnhhưởngcủa BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa 34Bảng 3.5 Ảnhhưởngcủa kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa 35Bảng 3.6 Ảnhhưởngcủa tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS
0^7
của một số giống lúa 37Bảng 3.7 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa 39Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS
của một số giống lúa 40Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 42Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyểngen 43Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc môsẹochuyển gen 44
Trang 7Hình 1.1 Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16] 6
Hình 1.2 Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 7
Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens 10
Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10
Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid 11
Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA 12
Hình 1.7 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13
Hình 2.1 T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải) 20
Hình 3.1 Mô sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B) ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày nuôi cấy 31
Hình 3.2 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa (sau 14 ngày) A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết 33
Hình 3.3 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày) A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai 34
Hình 3.4 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày) A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai 35
Hình 3.5 Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 38
Hình 3.6 Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 uM ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 40
Hình 3.7 Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 41
Hình 3.8 Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 43
Hình 3.9 Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin 10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D) 44
MỤC LỤC
Trang 8DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
MỤC LỤC vi
MỞ ĐẦU 1
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục đích nghiên cứu 3
3 Đối tượng nghiên cứu 3
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
4.1 Ý nghĩa khoa học 3
4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3
Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 Vai trò của cây lúa 4
1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới 5
1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới 5
1.2.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới 6
1.3 Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam 7
1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam .7
1.3.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam 8
1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 10
1.4.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 10
1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA 11
1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 12
1.5 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu 14
1.5.1 Gen gusA 14
1.5.2 Gen bar 14
1.6 Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa 14
1.6.1 Phương pháp vi tiêm 14
1.6.2 Chuyển gen bằng xung điện 15
1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) 15
1.6.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen 15
1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 16
1.8 Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam 16
1.9 Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới và Việt Nam 17
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2 Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu 19
2.1.3 Thiết bị sử dụng 20
2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 20
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 21
Trang 92.4 Điều kiện bố trí thí nghiệm 26
2.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 26
2.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi 26
2.5.2 Các chỉ tiêu đánh giá 26
2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29
3.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa 29
3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy 29
3.1.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo 30
3.1.3 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa 32
3.1.4 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa 33
3.1.5 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam 35
3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen 36
3.2.1 Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen 36
3.2.2 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen 38
3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa 39
3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 41
3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 42
3.2.6 Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
1 Kết luận 45
2 Kiến nghị 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
Trang 12Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành côngthấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả tái sinhcủa các giống lúa indica thấp hơn Họ đã tìm ra được hai môi trường mới để cấy chuyển,phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các giống lúa indica.Hiei và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa indica
bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn 8-12 ngày.
Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên 7 dòng/phôi)cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, NanJin 11 và Suewon 258 [20]
1.2.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2018 tương đối thuận lợiđạt đến 782 triệu tấn, tăng 1,6% so với năm 2017, mặc dù điều kiện khí hậu bất thườngxảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng toàn cầu khoảng 168 triệu ha
Hình 1.1 Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16]
Hình 1.2 Tỷ trọ ng sả n xuất lúa theo vùng năm 2018
Châu Á, sản xuất lúa đứng đầu châu lục chiếm gần 90,7% tổng sản ngạch thế giớihay đạt đến 594,7 triệu tấn
Ở Châu Phi, sản xu ất 22,6 triệu tấn, hay 3,4% mặc dù gặp hạn hán và ngập lụt tạivài nơi ở Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania và Madagascar
Ở Châu M ỹ, sản xuấ t lúa đạt đến 33,8 triệu tấ n, Brazil là nước sản xuất lúa lơnnhất của vùng, năm 2018 với sản lượng 11,3 triệu tấn
Oceania 0.1 % Europe
£ Africa • Americas w Asia • Eiuope • Oceania
Trang 13Ở Châu Âu, sản xuất trong 2018 khoảng 3,6 triệu tấn lúa Hai nước trồng lúa lớncủa Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha.
Châu Úc, năm 2018 Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 815.964 tấn
1.3 Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam
1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam.
1.3.1.1 Chọn tạo giống bằng lai hữu tính
Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có năngsuất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng phương pháplai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2 (N98) [2]
1.3.1.2 Chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào
* Tình hình nghiên c ứ u tái sinh in vitro
Phan Thị Hương và cộng sự (2014) đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh củabảy giống lúa bao gồm BM9630, NV1, NV2, NV3, J02 (thuộc nhóm japonica), HươngCốm và BC15 (thuộc nhóm indica) [4] Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống lúa nghiên cứutrong khoảng 72-98%; trong đó, giống Hương cốm, NV1 và J02 có tỷ lệ tạo mô sẹo trên90% (tương ứng 97%, 92% và 98%) Môi trường tạo mô sẹo thích hợp đối với giốngHương cốm và các giống japonica là môi trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D+ 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l L- proline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l caseinhydrolysate + 30 g/l sucrose
1.3.1.3 Nghiên cứu chuyển gen
Nguyễn Thị Hồng Châu và cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống lúa
C71 thông qua A.tumerfaciens Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm nền, cho
tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh Gen được chuyển gồm 3 gen là
CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein độc tố tr ừ sâu của vi khu ẩ n Bt và gen Xa21 - gen kháng bệnh bạc lá) Vật liệu là giống lúa C71 Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92% Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt 6,6% Tác giả
cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với japonica Thời giancho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [1]
Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công nghệnuôi cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn
1.3.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam
Việt Nam có truyền thống trồng lúa lâu đời, lúa gạo là một lương thực quan trọng
Trang 14và chủ yếu nhất đối với người dân Việt Nam, lúa gạo ngoài dùng làm lương thực chongười, thức ăn cho vật nuôi còn dùng để chế biến các sản phẩm khác Đặc biệt với mộtnước dân số đông tới khoảng trên 90 triệu người, việc tự sản xuất lúa là rất quan trọng.Việt Nam có điều kiện tự nhiên thích hợp cho cây lúa có 2 vựa lúa chính là đồng bằngsông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long Diện tích sản xuất lúa được xếp hạng 5 vàxuất khẩu gạo đứng thứ 3 trên thế giới, gạo Việt Nam đã được xuất khẩu sang gần 160quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 15% thị phần gạo toàn cầu và cũng bước đầu thâmnhập được các thị trường có yêu cầu chất lượng cao, như: Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ,EU,
Trang 15Diện tích lúa
Hè thu (Nghìn ha)
Diện tích lúa Mùa (Nghìn ha)
Tổng diện tích (Nghìn ha)
Sản lượng lúa
Hè Thu (Nghìn tấn)
Sản lượng lúa Mùa (Nghìn tấn)
Tổng sản lượng (Nghìn tấn)
Từ năm 2015 đến năm 2019, sản lượng lúa các mùa vụ sụt giảm qua các năm, chỉ
có năm 2018 là sản lượng có tăng so với năm 2017 Nguyên nhân là do diện tích gieo
Trang 16trồng bị thu hẹp dần, người dân dần chuyển sang loại nông sản cho thu nhập cao hơn.Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình xuất khẩu gạo của Việt Nam.
1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật
1.4.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens
Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens
A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x
0,7-0,8ụm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí,
nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn A.tumefaciens là loài vi khuẩn gây
ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Chỉ rất ít thực
vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chop
[1]
Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA
- Ti-plasmid
Cytc-Í nin
Trang 17Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid
Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm độclập trong tế bào chất Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc vào sự saochép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ
dưới 300C Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp, người ta
đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Trong đó, vùng T-DNA (transferred
DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u còn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium [1], [8].
Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ởthực vật Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp
hợp giữa A tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương Hiện nay trong kỹ thuật
chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần chuyển vào
thực vật Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được chuyển vào bộ
gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình chuyển T- DNA vào trong tếbào thực vật
Trang 18- T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa chosinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí củaT-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border)
Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng mộtđoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một đoạn genliên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme
cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr
mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinine.Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng được nghiên cứu nhiều hơn cả
là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2
[1], [8]
Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA 1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật
Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩnnhư: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các hợp chất
này, A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid được hoạt hóa và phiên mã [1],
[8]
ro
Trang 19Hình 1.7 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens
Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với
As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen
virG
Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG Các sản phẩm của operon virD
mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25bp Từ
đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là mộtmạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5'-3', bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải
Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein VirD2 với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa Còn protein VirE2 gắn vào mạch đơn T-
DNA sau khi được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào
thực vật Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình thành nên một cầu nối cho T-DNA
được chuyển sang tế bào thực vật [1], [8]
1.5 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi
khuẩn A tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu
Nucleu
Opines
Opine Hydrolases
Opine Synthases
Phylctiormcne Synthases
* □
VrrD2
3 T-complex
Karvopherin T c vclophilin o
Trang 20thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao Hoạt tính gus trong tế
bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơchất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl b-D-Glucuronide) và đo bằng RE-Mini
150 Fluometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4-methylumbelliferone,Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm [1]
1.5.2 Gen bar
Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses hygroscopicus, là
tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tácdụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏnhư Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta Glufosinate là hợp chất tự nhiên đượcphân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế hoạt tính của enzyme tổng hợp glutamin,enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia Việc sử dụngglufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thựcvật Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây chết sau này [1]
1.6 Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa
Ngoài phương pháp biến nạp gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens,
các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều trong chuyển genvào lúa, cụ thể:
1.6.1 Phương pháp vi tiêm
Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏDNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn Phương pháp này có ưuđiểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác vị trí đã xác định và có thể quan sátđược Phương pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, các thao tác thực hiện cầnchính xác và thành thạo
Trang 211.6.2 Chuyển gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi đặtcác tế bào trần trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh thayđổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổngtrên màng tế bào Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành, DNA sẽ đi vào
tế bào qua các lỗ hổng Một số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện màkhông cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì Zang và cộng sự, (1988)đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần nhờ sử dụng phương pháp xung điện [37].Năm 1989, Shimamoto và cộng sự đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ởlúa Japonica cũng sử dụng phương pháp chuyển gen qua xung điện [34]
1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)
Phương pháp này lần đầu tiên được Z Luo và Ray Wu và các cộng sự ở trườngĐại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên cây lúa Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy(quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ này mầm hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mongmuốn theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử
có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công đặc biệt trên cây lúa và bông[38]
1.6.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen
Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991)
và được cải tiến bởi Cao và cs, (1992); Li và cs, (1992) [8, 12, 25] Sau đó kỹ thuật này
đã được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa Japonica Cheng và cs(1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica
sử dụng súng bắn gen khi sử dụng súng bắn gen tạo áp lực đẩy viên đạn được làm bằngkim loại đã được bọc plasmid mang gen thiết kế, có kích thước khoảng 1pm, với vận tốc130m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểuhiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ Hiệu quả chuyển gen lúa thông quaphương pháp này cũng khá cao [10]
1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
Phạm Thu Hằng và cộng sự đã đã tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện gen
CaMV35S:OsNAC1:Nos (liên quan đến tính chịu hạn) và chuyển vào giống lúa J02(Oryza sativa L japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sự có
Trang 22mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong cây chuyển gen được kiểm tra bằng PCR với cáccặp mồi đặc hiệu Nhóm tác giả đã thu được các dòng lúa chuyển gen T0 có mang cấu
trúc biểu hiện gen OsNAC1 Kết quả thu được là tiền đề cho việc nghiên cứu chức năng gen OsNAC1 ở lúa, từ đó hướng tới tạo ra các giống cây trồng chuyển gen OsNAC1 có
khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn của môi trường
Nhóm tác giả Hoàng Thị Giang và cộng sự (2015) [5] tại Viện Di truyền Nôngnghiệp Việt Nam đã cải tiến thành công quy trình chuyển gen vào giống lúa Taichung 65thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen cao Kết quảthí nghiệm cho thấy sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm và phơi mẫu không chỉ làm tăng
tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mà còn tăng kích thước và chất lượng mô sẹo dùng cho quátrình chuyển gen Dịch khuẩn với mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu với tần số biểu hiệngen GUS ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp Ở giai đoạn chọn lọc sau lâynhiễm, mô sẹo phát triển tốt hơn khi tiến hành phơi mẫu và sử dụng đĩa petri có gờ cao15mm Phân tích sự có mặt của promoter R4 cho thấy tỷ lệ cây tái sinh mang cấu trúcgen biến nạp cao (90,24%) Đánh giá sự biểu hiện của gen GUS ở cây lúa chuyển gen đãchứng tỏ sự hoạt động mạnh của promoter R4, điều khiển quá trình phiên mã, dẫn tớitổng hợp enzym GUS Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự
di truyền ổn định của gen biến nạp sang thế hệ sau [5]
1.8 Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam
Trong sự hình thành và phát triển bệnh đạo ôn ở lúa, gen MPG1 đóng vai trò quantrọng, liên quan đến tính gây bệnh được biểu hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp,quá trình phát triển triệu chứng và hình thành bào tử Do vậy, việc ức chế biểu hiện củagen MPG1 có thể khiến nấm đạo ôn không gây được bệnh trên lúa Trên cơ sở đó, Bộmôn CNSH Thực vật - Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu vàthiết kế vector mang miRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu sự biểu hiện của gen MPG1 [6].Việc chuyển thành công cấu trúc miRNA này vào cây lúa sẽ tạo ra giống lúa có khả năngkháng được nhiều chủng nấm đạo ôn Trong quá trình chuyển gen vào cây lúa bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens, phôi lúa trưởng thành thường được sử dụng làm vật
liệu chuyển gen do đây là vật liệu sẵn có và dễ thao tác hơn so với các loại vật liệu khác[3, 13, 21, 29, 32, 33] Tuy nhiên khả năng cảm ứng mô sẹo từ và tái sinh cây từ calluslúa không cao và bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như kiểu gen, thành phần môi
Trang 23trường, phương pháp và điều kiện nuôi cấy [35] Khả năng cảm ứng mô sẹo và tái sinhcây của các giống thuộc loài phụ japonica cao hơn so với các giống thuộc loài phụindica [31] Nghiên cứu này được tiến hành nhằm chọn được các giống lúa có khả năngtạo mô sẹo và tái sinh cây cao từ vật liệu ban đầu là phôi trưởng thành trong bảy giốnglúa khảo sát đang được trồng phổ biến tại Việt Nam nhằm phục vụ chuyển cấu trúcmiRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu sự biểu hiện của gen MPG1 giúp kháng nấm đạo ôn do
nấm Magnaporthe grisea gây ra.
1.9 Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới và Việt Nam
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của Việt Nam.
Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú trọng và giữmột vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng Bằngphương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được các gen kiểm soátnhững đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất lượng hạt, tính chốngchịu strees sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh dưỡng Thành công trong kỹthuật chuyển gen lua mở đường cho các nghiên cứu theo hướng chức năng gen
Trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens không
được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [18, 30] Nhưng trong những năm gần đây
có nhiều công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi
khuẩn A tumefaciens Chan cs (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus
lúa mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu
này đã thu được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A tumefaciens bằng
cách nuôi cấy phôi non [9] Hiện nay, phương pháp biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn
A tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao của gen
biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20] Đặc biệt,phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được đoạn ADN cókích thước lớn và chi phí thấp Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước
tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A tumefaciens là công trình
của Hiei cs (1994) [19] Nhóm nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình chuyển genhiệu quả cho một số giống lúa nhóm japonica như Tsukinohikari, Asanohikari vàKoshihikari Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí
Trang 24nghiệm trên thế giới Giống lúa Taichung 65 được xem là giống mô hình đóng vai tròquan trọng trong nghiên cứu về di truyền ở cây lúa Cho đến nay đã có nhiều thể độtbiến phục vụ nghiên cứu được phát triển trên nền di truyền của Taichung 65 như: các thể
đột biến phôi nhỏ re (Hong cs., 1995) [21], các thể đột biến phôi lớn ge (Hong cs., 1995), các thể đột biến không có chồi shl (Satoh cs., 1999) [28]; các thể đột biến không
có rễ bên lrt, một số thể đột biến không có rễ bất định crl (Inukai cs., 2005) [23], thể đột biến không có rễ mầm ral (Enrico cs., 2003) [15], Do các thể đột biến này đều có
chung nền di truyền với giống lúa Taichung 65, nên việc xây dựng một quy trình chuyểngen hiệu quả áp dụng cho Taichung 65 là đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu gendựa trên những thể đột biến này, góp phần thúc đẩy quá trình nghiên cứu cơbản và ứngdụng ở lúa Trong nghiên cứu biến nạp gen vào Taichung 65 từ callus phôi hóa, nhómnghiên cứu của Yara cs (2001) [36] đã sử dụng nền môi trường cơ bản N6 cho nuôi cấy
và đạt được tỷ lệ chuyển gen là 4,6% Mới đây, Chopita cs (2014) [11] đã công bốnghiên cứu về chức năng của gen OSB2 liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợpanthocyanin ở cây lúa bằng cách gây siêu biểu hiện gen OSB2 trong giống Taichung 65
Nhóm nghiên cứu cũng đã áp dụng phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn A tumefaciens từ callus phôi hóa và chọn lọc callus chuyển gen lần lượt trên hai môi
trường dinh dưỡng có bổ sung hygromycin với lượng tăng từ 15 - 30 mg/l, cho tỷ lệ mẫucallus biểu hiện gen GUS 7,59%
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• ' •
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là hạt chín của 4 giống lúa thuần được tr ồng phổ biế n ở các tỉnh miền núi phía Bắc
Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu
1 Đoàn kết Indica
rin -A rr^ K ♦ /s 1 ♦ , À rr^1 S'- J
Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật
Trang 252 Bao thai Indica
rin -A rr^ K ♦ /s 1 ♦ , À rr^1 S'- J
Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật
3 Nếp 87 Indica rin -A rr^ K ♦ /s 1 ♦ , À rr^1 S'- J
Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật
4 Khang dân Indica Công ty giống cây trồng Thái Bình
2.1.2 Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu
2.1.2.1 Hóa chất thiết bị sử dụng:
- NaClO, c ồn, tween
- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS(Murashige & Skoog, 1962), N6; các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa),NAA (Trung quốc), Acetoseringone (Sigma), L-pyroglutamic (Duchefa), L-asparagine(Duchefa),
- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,
- Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,
Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử(Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức),
tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), tủnuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo (Nhật bản),micropipette,
2.1.2.2 Vật liệu di truyền
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: AGL1, EHA105, GV3101,
LBA4404 Vector chuyển gen pCAMBIA3301 mang gen chỉ thị GUS được cung cấp bởiphòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thựcphẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Hình 2.1 T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)
Vector pCambia 3301 (hình 3.1) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen chọn
Trang 26lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là pUC18- lacZa, dưới sự
điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và được quy định bởitrình tự CaMV35S polyA
2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩmtrường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
- Thời gian tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng5/2019
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa
❖ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl đến hiệu quả
vô trùng mẫu nuôi cấy.
Thí nghiệm được bố trí 4 công thức khác nhau:
Cách tiến hành: Hạt lúa được tách vỏ, sau đó hạt lúa được rửa bằng cồn 70°C trong
1 phút để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng Sau đó đổ cồn và ngâm hạtvào dung dịch sodium hypochlorite 3% với thời gian khử trùng khác nhau
Trang 27Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng Sau khi khử trùng mẫuđược gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng, đợi khô Cấy mẫu vào môi trường môsẹo tạo mô sẹo có chứa 2,4-D Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành theo dõi mẫu.Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi côngthức nhắc lại 3 lần và mỗi công thức 100 mẫu.
Các chỉ tiêu theo dõi như sau: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết
❖ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô
sẹo của một số giống lúa
Hạt sau khi khử trùng bằng NaClo được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường bổsung 2,4-D trên nền môi trường MS và N6 + 30g đường/l + 7g agar/l, pH 5,6 Các thínghiệm được bố trí theo công thức sau:
Trang 28Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi côngthức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo
❖ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô
sẹo ở một số giống lúa
Để xác định nồng độ 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo ở lúa, tiến hành thử nghiệmmột số nồng độ 2,4-D dựa trên nền môi trường xác định ở Thí nghiệm 2 Các công thứcthí nghiệm bao gồm:
Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lầ
n nhắc lạ i
Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết, hình thái mô sẹo sau
14 ngày nuôi cấy
❖ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Sau 28 ngày nuôi cấy mô sẹo có hình thái đồng đều trên môi trường 2,4-D đượcchuyển sang môi trường tái sinh chồi bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau theo cáccông thức thí nghiệm như sau:
Trang 29Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 28 ngày nuôi cấy Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar, pH 5,6.
❖ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi T
ương tự nh ư BAP, kinetin đượ c s ử d ụ ng để đ ánh giá kh ả n ă ng tái sinh in vitro ở các n ồ ng độ khác nhau Các công thứ c thí nghiệ m bao g ồ m:
Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 28 ngày nuôi cấy Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar, pH 5,6
2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chuyển gen ở m ột số giống lúa
Để xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận gen ở giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87, thí nghiệm sử dụng gen chỉ thị GUS cho các thí nghiệm ở nội dung nghiên cứu này
❖ Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen
GUS của một số giống lúa
Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường thích hợp đã được xác định ở Nội dung 1
Để xác định tuổi mô sẹo phù hợp cho chuyển gen, thí nghiệm tiến hành lây nhiễm ở các giai đoạn mô sẹo khác nhau từ 3 đến 10 ngày tuổi Các công thức bao gồm:
Trang 30Công thức Tuổi mô sẹo
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu GUS dương tính (GUS+)
❖ Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen GUS ở
❖ Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu
quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa
Mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 6 sử dụng làm vật liệu biếnnạp Để nâng cao hiệu quả chuyển gen môi trường biến nạp sẽ được bổ sung chấtacetosyringnone (AS) ở các nồng độ khác nhau:
Sau biến nạp mô sẹo được đồng nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị, mỗi đĩa 10
mô sẹo, nhiệt độ đồng nuôi cấy là 250C
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+
❖ Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả
biến nạp gen GUS
Sau khi lựa chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, thí nghiệm tiến hành xác địnhthời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn Các công thức thí nghiệm gồm: