Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro TT

MỞ ĐẦU Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, bảo quản lạnh tế bào sinh sản và phôi, sự giao t

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ

TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

Hà Nội, 2021

Công trình được hoàn thành tại:

1 Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Viện Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học 1: TS Bùi Xuân Nguyên

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Việt Linh

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Viện Công nghệ sinh học

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1 Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoàng Thịnh,

Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngô Thị Kim Cúc, Nguyễn Thanh Sơn, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Việt Linh Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến

sự phát triển của phôi lợn nhân bản vô tính Tạp chí sinh học, 2018, 40(2se):101-105

2 Nguyen Thi Nhung, Dong Van Quyen, Chu Hoang Ha, Tamas Somfai, Kazuhiro

Kikuchi, Ngo Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong, Bui Xuan Nguyen, Barbara Beck-Woerner, Nguyen Viet Linh Effect of donor cell type on the development of pig embryos produced by

somatic cell nuclear transfer Journal of Biotechnology 17(2): 1-5, 2019

3 Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen,

Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi N Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van

Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai Optimization of in vitro embryo

production and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: the effects of

different in vitro oocyte maturation systems Anim Science Journal 2020;91:e13412

4 Nguyen Viet Linh, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen

Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi

Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low

penetration ability in a native Vietnamese pig Anim Science Journal 2018

Aug;89(8):1079-1084 -3, Issue-1, Jan-Feb, 2019 ISSN: 2456-8635

5 Huỳnh Thị Hường, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Việt Linh

Ảnh hưởng của giới tính dòng tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn Bản nhân bản vô tính

Tạp chí hội chăn nuôi Việt Nam Số 256 tháng 4 năm 2020

MỞ ĐẦU

Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, bảo quản lạnh tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn và khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ y dược hiện đại

Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học Ngoài mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng lớn ứng dụng trong y học Lợn là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của người, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì vậy là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation)

Do khả năng tồn tại các cá thể không mang virus Porcine Endogenous Retrovirus (PERVs), giống lợn Bản đang được đánh giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài và là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài:

“Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam

bằng kỹ thuật in vitro”

Mục tiêu: Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản với các mục

tiêu: (1) Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản; (2) Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản; (3) Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm (TTON)

và nhân bản vô tính (NBVT)

Dựa trên các nội dung nghiên cứu: (1) Nghiên cứu đặc điểm hình thái

buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa; (2) Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi; (3) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tạo phôi lợn Bản TTON thông qua môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi; (4) Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản bằng NBVT khác loài

Tính mới của luận án: (1) Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh

hưởng của mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản lạnh phôi TTON, tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản

có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học (2) Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi NBVT trên đối tượng lợn

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và

phát triển phôi in vivo ở lợn

1.1.1 Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn

Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo

tế bào trứng (giao tử cái -noãn bào) Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi

1.1.2 Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo

1.1.2.1 Các giai đoạn thụ tinh

Cũng như các loài khác, quá trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóa tinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng được kích hoạt và phản ứng vỏ trứng xảy ra

1.1.2.2 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn

Khoảng 30 giờ sau thụ tinh trứng phân chia thành 2 tế bào, tiếp tục quá trình phân chia nhanh chóng đề tạo phôi 4, 8 tế bào Phôi dâu hình thành vào ngày 3-4 sau thụ tinh Phôi tiếp tục phân chia và tạo thành phôi nang và bắt đầu làm tổ trong tử cung

1.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn

Lợn là loài động vật đa thai, mặc dù việc khai thác trứng lợn có thể thực hiện trong suốt cả năm, các yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng trứng

1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro

1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục

Kết quả thí nghiệm nuôi thành thục trứng thu từ các nang có kích thước khác nhau cho thấy chất lượng và trạng thái nang có ảnh hưởng lớn tới sự thành thục của trứng

Môi trường nuôi trứng lợn thành thục thông thường bao gồm môi trường nền (môi trường Hank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS) hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin, các nhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP)

Kết hợp hài hòa sự thành thục tế bào chất và thành thục nhân của trứng

trong quá trình nuôi in vitro là yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng

thụ tinh và sự phát triển phôi

1.2.2 Tạo phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi

TTON bị chi phối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác động môi trường nuôi thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi và phương pháp bảo quản phôi

1.2.2.1 Bảo quản và hoạt hóa tinh

Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTONđược Nagai

và cs thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1988 Nghiên cứu của nhóm các tác giả Nagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khả năng khả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đông lạnh và sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục

1.2.2.2 Môi trường thụ tinh, nuôi phôi và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh

Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến là môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) và môi trường Fertilization Medium for Porcine oocytes (Pig-FM) Bổ sung 10 mg/mL BSA và 2 mmol/L caffein, dịch nang trứng (pFF) vào môi trường nuôi trứng và môi trường thụ tinh làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ phân chia

và phát triển của phôi Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3)

và PZM-5 được cho là có hiệu quả tạo phôi cao hơn và bắt đầu được sử dụng nhiều hơn những năm gần đây

Trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi tạo phôi lợn in vitro

là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic) Tỷ lệ phôi đa tinh trùng

ở lợn dao động từ 13% đến 90% Tế bào cận noãn có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng Hiệu quả TTON cao nhất trong điều kiện tế bào trứng còn các lớp tế bào cận noãn và được thụ tinh với nồng độ

ở 0.5 × 105 tinh trùng/ml

1.2.2.3 Đông lạnh phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Nghiên cứu đông lạnh phôi lợn được tiến hành từ khá sớm, tuy nhiên việc bảo quản phôi gặp khá nhiều khó khăn do phôi lợn rất nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ Các phương pháp đông lạnh nhanh với thể tích tối thiểu (minimum volume cooling: MVC), phương pháp thả trực tiếp phôi vào nito lỏng (microdrop), hoặc lên bề mặt kim loại đã được làm lạnh bằng nito lỏng (Solid Surface Vitrification- SSV), phương pháp mới Hollow Fiber Vitrification (HFV) đã được áp dụng để đông lạnh phôi lợn ở giai đoạn phôi nang

1.2.3 Tạo phôi lợn bằng kỹ thuật nhân bản vô tính

1.2.3.1 Kỹ thuật nhân bản vô tính, quá trình methyl hóa và sự tái lập trình trong phôi nhân bản

NBVT là kĩ thuật tạo ra những bản sao của một cá thể mà không qua sinh sản hữu tính Cơ thể sống đầu tiên được tạo ra nhờ kỹ thuật NBVT theo phương pháp này là chú cừu Dolly sinh ngày 5 tháng 7 năm 1996 tại Viện Nghiên cứu Roslin Yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của NBVT Các kỹ thuật NBVT phổ biến là kỹ thuật kinh điển sử dụng kính

hiển vi vi phẫu thuật để loại và cấy nhân bằng kim vi tiêm, kỹ thuật loại và cấy nhân kết hợp kính hiển vi vi phẫu thuật có gắn hệ thống piezo và kỹ thuật handmade cloning

1.2.3.2 Nhân bản vô tính khác loài

NBVT khác loài là kỹ thuật tạo phôi nhân bản do cấy nhân tế bào cho nhân của một loài này vào trứng đã loại nhân của loài khác (Interspecies somatic cell nuclear transfer –iSCNT) NBVT khác loài được xem là một giải pháp tiềm năng để tái tạo, bảo tồn các loài động vật quý hiếm đã và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng Wells và cs, 1998 đã công bố nhân bản thành công cá thể bò đảo Enderby (là cá thể duy nhất còn sống sót của giống giá súc quý hiếm bậc nhất thế giới)

1.2.3.3 Nhân bản vô tính trên lợn

Các nhóm nghiên cứu của Onishi và Polejaeva đã thông báo thành công trong việc tạo lợn nhân bản vào năm 2000 Tuy nhiên, cho đến nay hiệu quả NBVT trên lợn vẫn còn rất thấp Tỷ lệ lợn con được sinh ra chỉ dao động khoảng 1-3% tổng số phôi được cấy Chất lượng trứng, mùa vụ, yếu tố môi trường như photoperiod, nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên chất lượng trứng và qua đó lên hiệu quả NBVT Nghiên cứu của Kurome và cs, 2013 cho thấy khi tiến hành cấy phôi NBVT, tỷ lệ đậu thai đạt cao nhất vào mùa đông (5,3%) và thấp nhất vào mùa hạ Hiệu suất NBVT cao nhất, đạt 4.1% lợn sinh ra sau cấy phôi đã được thông báo trong thời gian gần đây

1.3 Nghiên cứu tạo phôi in vitro lợn Bản

1.3.1 Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản

Lợn Bản được xem là đối tượng lý tưởng đối với công nghệ ghép mô tạng khác loài (xenotransplantation) do nó có đặc điểm về kích thước, hệ gen tương đồng với con người Ngoài ra lợn Bản là giống lợn duy nhất hiện nay có số lượng bản sao virus PERV thấp, vì vậy chúng có tiềm năng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng y-sinh đặc biệt là cấy tạng khác loài Hiện nay, quần thể lợn Bản có khoảng 30.000 – 32.000 con nhưng đã bị lai tạp nhiều, phân bố ở khắp các huyện vùng núi cao của tỉnh Hòa Bình, trong đó

chủ yếu tập trung ở Đà Bắc, Cao Phong, Lạc Sơn, Mai Châu, Tân Lạc

1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam

Các thí nghiệm về nuôi thành thục trứng và tạo phôi in vitro trên lợn

Bản được triển khai lần đầu tiên trong khuôn khổ dự án hợp tác khoa học Việt-Nhật (JSPS-VAST, 2005-2007) Năm 2008, Ước và cs thông báo kết quả nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ TTON

và NBVT Các tác giả cũng đã tiến hành thành công thí nghiệm thử nghiệm tạo phôi NBVT bằng cấy nhân tế bào sinh dưỡng của lợn Bản vào tế bào trứng của lợn Landras, với tỷ lệ hợp nhất giữa trứng và tế bào đạt 70% và tỷ

lệ phôi nang đạt 12%

CHƯƠNG 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân loại tháng theo mùa

2.2.2 Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng

2.2.3 Phương pháp đo kích thước và trọng lượng buồng trứng

2.2.4 Phương pháp phân chia nhóm nang

2.2.5 Phương pháp thu trứng

2.2.6 Phương pháp phân loại chất lượng trứng

2.2.7 Phương pháp đo kích thước trứng lợn

2.2.8 Phương pháp nuôi trứng

2.2.9 Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi

2.2.10 Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh

2.2.11 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh 2.2.12 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm

2.2.13 Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh

2.2.14 Phương pháp đông lạnh phôi

2.2.15 Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn

2 2.16 Phương pháp nhân nuôi tế bào

2.2.17 Phương pháp đông lạnh tế bào

2.2.18 Phương pháp nhân bản vô tính

2.2.19 Phương pháp nuôi phôi

2.2.20 Phương pháp nhuộm Hoechst

2.2.21 Phương pháp nhuộm Orcein

2.2.22 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Chế

độ thụ tinh tối ưu

Hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT

Nuôi thành thục trứng lợn Landrace

NBVT

Loại tế bào cấy nhân

Môi trường nuôi phôi (NCSU-37, PZM-3)

% phôi nang, số TB/phôi

NỘI DUNG 2

Tiềm năng khai thác trứng theo mùa

Khảo sát kích thước và khối lượng BT

Khảo sát kích thước nang bề mặt

Khảo sát chất lượng trứng sau thu

Tỷ lệ thành thục của trứng theo mùa

Chọn lọc môi trường nuôi thành thục trứng tối ưu

Trứng sau nuôi

thành thục

(ND2)

Trạng thái TB cận noãn (để nguyên, tách 1 phần, bỏ hoàn toàn )

MT thụ tinh (TALP, Pig),

NĐ tinh (1x105, 1x106TT/ml)

NĐ cafein (2

mM, 5 mM) và thời gian thụ tinh (3 giờ, 6 giờ)

MT nuôi phôi (NCSU-37, PZM-3)

Chọn lọc môi trường nuôi trứng tối ưu (TCM-199, POM)

Ngân hàng

lạnh phôi

Hệ thống nuôi trứng, TTON

và nuôi phôi tối ưu

NỘI DUNG 1

NỘI DUNG 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa

Phần nội dung này được thực hiện với 3 nghiên cứu cơ bản:

1 Khảo sát ảnh hưởng của các mùa xuân, hạ, thu, đông lên kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản

2 Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên tiềm năng khai thác trứng căn cứ theo tỷ lệ trứng loại A,B,C thu được/BT

3 Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên kích thước trứng loại A, B sau thu Thí nghiệm được tiến hành trên các cá thể lợn Bản có cùng độ tuổi, chế

độ chăm sóc nuôi dưỡng, có khối lượng từ 20-25 kg

3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa

Bảng 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản theo mùa

Số BT(n)

Mùa xuân ( TB±SEM)

Mùa hạ ( TB±SEM)

Mùa Thu ( TB±SEM)

Mùa đông ( TB±SEM) Chiều dài

a (15±1)b (15,2±0,6)b (17,4±0,8)a Chiều rộng

a (10,9±0,7)b (11,3±0,4)b (11,9±0,5)a Chiều dầy

a (6,3±0,3)b (7±0,3)b (8±0,5)a Khối lượng

a (2.0±0,2)b (2,1±0,2)b (2,3±0,2)ab

Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, mỗi lần thu buồng trứng từ 1 lợn cái.Số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một hàng là sai khác có ý nghĩa

thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test)

Kết quả cho thấy, kích thước buồng trứng lợn Bản có sự khác biệt theo 2

lô: mùa xuân-đông và mùa hạ-thu Theo đó, kích thước cả 3 chiều của buồng trứng giữa mùa xuân và mùa đông là tương đương nhau và cao hơn so với 2 mùa là mùa hạ và mùa thu, kích thước giữa mùa hạ và mùa thu cũng tương đương nhau Tương tự, khối lượng buồng trứng lợn Bản có sự thay đổi theo mùa, trong đó khối lượng TB của buồng trứng trong mùa xuân là cao nhất

và trong mùa hạ là thấp nhất (Bảng 3.1)

3.1.2 Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản

Thí nghiệm được tiến hành với số lượng 10 buồng trứng được thu từ 5 lợn/mỗi mùa

Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy TB số nang/BT có kích thước 3-5 mm tương đương nhau ở các mùa xuân và đông (0,7±0,2; 0,6±0,2), cao hơn đáng kể so với mùa hạ và mùa thu (0,1±0,1; 0,1±0,1) (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước

Mùa

Số nang (n, TB số nang/buồng trứng) Tổng số nang

(n,TB số nang/BT)

< 2 mm 2-3 mm 3-5 mm >5mm

(10,2±0,7)

56 (5,6±0,3)a

7 (0,7±0,2)a 0 (0) 165

(16,5±0,8)a

(9,3±0,6)

39 (3,9±0,4)b

1 (0,1±0,1)b 0 (0)

133 (13,3±0,7)b

(10,5±0,5)

59 (5,9±0,3)a

1 (0,1±0,1)b 0 (0)

165 (16,5±0,6)a

(9,4±0,4)

53 (5,3±0,4)a

6 (0,6±0,2)a 0 (0)

153 (15,3±0,7)a

Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test)

3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng lợn Bản

3.1.3.1 Phân loại chất lượng trứng theo mùa

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản

TB: Trung bình, BT: Buồng trứng Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai

khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test)

Tổng số 15 lợn cái thành thục về tính, có cùng độ tuổi và chế độ chăm sóc đã được giết mổ trong mỗi mùa Trứng được thu và phân loại dựa vào hình thái theo phương pháp phân loại chất lượng trứng loại A, B và C Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy số trứng loại A/BT (Hình 3.3) trong mùa xuân và mùa đông cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (7,6±0,4 và 8,3±0,8 so với 6,2±0,4 và 6,8±0,9)

3.1.3.2 Kích thước trứng lợn Bản

Kết quả khảo sát đối với tổng số 30 trứng trong mỗi mùa cho thấy cho

Mùa Tổng số

trứng (n, TB/BT)

Tổng số trứng loại A (n, TB/BT)

Tổng số trứng loại B (n, TB/BT)

Tổng số trứng loại C (n,TB/BT)

Tổng số trứng loại A+B (n,TB/BT) Xuân 1025

(34,2±3,1) b

230 (7,6±0,4) a

312 (10,4±0,5) a

483 (16,1±3,6) b

542 (18,1±0,6) a

(33±0,7)b

187 (6,2±0,4)b

215 (7,2±0,4)b

588 (19,6±0,2)ab

402 (13,4±0,8)c Thu 1150

(38,3±0,7)a

205 (6,8±0,9)b

285 (9,5±0,6)a

660 (22±1,0)a

490 (16,3±0,7)b Đông 1168

(38,9±1,1) a

248 (8,3±0,8) a

279 (9,3±0,3) a

641 (21,4±1,8) a

527 (17,5±0,9) a

thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B Trong đó kích thước trứng không có màng sáng dao động từ 110,1±2,4 tới 113,6±2,1

Tổng hợp phần nghiên cứu ở phần này chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của mùa vụ lên tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản thể hiện qua các biến đổi có quy luật về sự tương quan về kích thước buồng trứng, sự phát triển của nang và chất lượng trứng BT được thu vào mùa xuân và mùa đông kích thước lớn hơn so với mùa thu và hạ, tương ứng với tỷ lệ trứng A+B thu được/BT trong mùa xuân và mùa đông cũng cao hơn so với mùa hạ và mùa thu Tương tự, trung bình số nang có kích thước lớn (>2 mm) trên mỗi buồng trứng có mối liên quan tỷ lệ thuận với số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản và có sự phụ thuộc vào mùa vụ Tỷ lệ thuận với số nang có kích thước

> 2 mm, trung bình số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản trong mùa xuân cũng đạt cao nhất (18,1), tuy nhiên kế tiếp là số trứng A+B thu được vào mùa đông (17,5), tiếp theo là mùa thu (16,3) và mùa hạ đạt tỷ lệ này thấp nhất (13,4) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B Kết quả tương

tự về sự thay đổi về kích thước của tế bào trứng các giống lợn ngoại theo mùa vụ cũng đã được một số tác giả thông báo trên đối tượng lợn ngoại Nghiên cứu của Kyzekova và cs, 2019 cho thấy các trứng thu từ các nang ≤ 3mm có kích thước trung bình nhỏ nhất vào mùa xuân và lớn nhất vào mùa đông, song với sự sai khác không có ý nghĩa thống kê [33]

3.2 Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản

Phần nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm hiều khả năng thành thục của trứng lợn Bản theo từng mùa vụ, qua đó xác định thời gian thu mẫu đạt hiệu quả tối ưu, đồng thời lựa chọn được loại môi trường nuôi thành thục phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản Nghiên cứu được bố trí với 2 thí nghiệm cơ bản: 1) Khảo sát trạng thái phát triển của trứng trong 4 mùa sau 44-46 giờ nuôi trong môi trường NCSU-37 với các chỉ tiêu: Tỷ lệ trứng

ở giai đoạn GV, GVDB, MI, MII, tỷ lệ trứng ở giai đoạn khác; 2) Nghiên cứu nuôi thành thục trứng trong 5 loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ hiến hiện nay là: NCSU-37+pFF, NCSU-37+FBS, TCM-199+pFF, TCM199+FBS, POM và chọn lựa loại môi trường nuôi phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản

3.2.1 Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản

Trứng lợn Bản sau khi thu được nuôi trong môi trường NCSU-37+10% pFF có bổ sung hormone trong 22 giờ, sau đó nuôi trong NCSU-37+10% pFF không bổ sung hormone trong 22 giờ tiếp theo Sau 44 h nuôi, trứng được tách tế bào cận noãn và nhuộm với Orcein 1% để kiểm tra tỷ lệ trứng

ở các giai đoạn GV, GVDB, MI, MII tại thời điểm 44 giờ

Kết quả thu được cho thấy trong cùng môi trường nuôi là 37+10% pFF và cùng điều kiện nuôi thành thục thì tỷ lệ thành thục của trứng

NCSU-lợn Bản khác nhau giữa các mùa, cụ thể tỷ lệ này trong mùa xuân và mùa đông cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (67,8±0,7% và 67,9±0,5% so với

58,8±1,0% và 61,2±1,8%) (sai khác có ý nghĩa thống kê, P<0,05) (Bảng

3.5) Mặc dù vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng nhận thấy, tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản thấp hơn so với tỷ lệ thành thục của các giống lợn ngoại đã được công bố trước đó khi sử dụng cùng một hệ thống nuôi

Kết quả cũng cho thấy có mối liên kết tương ứng về tiềm năng khai thác trứng và tỷ lệ thành thục theo mùa của trứng lợn Bản Mùa xuân và mùa đông số nang có kích thước lớn/buồng trứng nhiều hơn so với hai mùa còn lại (Bảng 3.2), ngoài ra trung bình số trứng loại A+B thu được trong hai mùa này cũng cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (Bảng 3.3) dẫn tới tỷ lệ thành thục của trứng trong hai mùa xuân, đông cao hơn so với hai mùa hạ, thu

Số trứng GVBD (n,%)

Số trứng

MI (n,%)

Số trứng MII (n,%)

Số trứng giai đoạn khác (n,%) Xuân 638 42

(6,6±0,7)

90 (14,1±0,7)

19 (2,9±0,4)

433 (67,8±0,7)a

54 (8,4±1,1)

(9,5±1,1)

79 (14,5±1,0)

40 (7,3±0,3)

322 (58,8±1,0)

b

54 (9,9±1,5)

Thu 611 47

(7,7±0,9)

65 (10,7±1,3)

42 (6,8±0,7)

375 (61,2±1,8)

b

82 (13,4±1,7)

25 (3,8±0,7)

437 (67,9±0,5) a

64 (9,9±1,3)

Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là

3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản

Nhằm xác định loại môi trường có hiệu quả cải thiện tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản chúng tôi tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu quả thành thục trên 5 loại môi trường: NCSU-37 +pFF, NCSU-37 +FBS, TCM-199+pFF, TCM-199 +FBS, POM Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy,

tỷ lệ trứng thành thục (trứng phát triển đến giai đoạn MII) trong môi trường POM (Hình 3.7A) và môi trường TCM-199+pFF (Hình 3.7D) là tương đương nhau (74,5±2,7% và 73,4±2,5%) và cao hơn trong các môi trường NCSU-37+pFF (Hình 3.7B), NCSU-37+FBS (Hình 3.7C), TCM-199+FBS (Hình 3.7E) (64,1±0,6%; 61,6±2,4%; 55,8±2,0%) (Bảng 3.6)

Kết quả so sánh sự phát triển của trứng được nuôi trong các loại môi trường khác nhau cho thấy, mặc dù trứng được nuôi trong môi trường

NCSU-37+pFF và NCSU-37+FBS có tỷ lệ trứng phát triển tới giai đoạn MI khá tốt, tuy nhiên trứng sau khi phát triển đến giai đoạn MI thì dừng lại, không tiếp tục phát triển đến giai đoan MII (tỷ lệ trứng MI lần lượt là: 17,9±3,7 và 23,8±0,5) Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, tỷ lệ trứng thành thục (trứng phát triển đến giai đoạn MII) trong môi trường POM (Hình 3.7A) và môi trường TCM-199+pFF (Hình 3.7D) là tương đương nhau (74,5±2,7% và 73,4±2,5%) và cao hơn trong các môi trường NCSU-37+pFF (Hình 3.7B), NCSU-37+FBS (Hình 3.7C), TCM-199+FBS (Hình 3.7E) (64,1±0,6%; 61,6±2,4%; 55,8±2,0%) (Bảng 3.6) Như vậy môi trường TCM-199+pFF và POM phù hợp hơn với sự phát triển của trứng lợn Bản

Bảng 3.6 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản

Môi trường Tổng số

trứng (n)

Số trứng GV (n,%)

Số trứng MI (n,%)

Số trứng MII (n,%)

Số trứng giai đoạn khác (n,%) NCSU-

37+pFF

(9,0±1,9)

23 (17,9±3,7) b

84 (64,1±0,6) b

12 (9,0±2,1) NCSU-

37+FBS

(9,3±1,5)

31 (23,8±0,5) a

80 (61,6±2,4) b

7 (5,2±3,5) TCM-

199+pFF

(9,6±1,3)

8 (5,9±1,2) c

99 (73,4±2,5) a

15 (11,1±3,0) TCM-

199+FBS

(11,2±2,4)

21 (15,6±1,8)b

91 (55,8±2,0)c

24 (17,4±2,5)

(7,6±1,3)

9 (6,2±0,6) c

108 (74,5±2,7) a

17 (11,7±3,5)

Thí nghiệm lặp lại 4 lần, mỗi lần thu trứng từ 5 lợn cái, số liệu% biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05),

Aspin-Welch T-test

3.2 Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm

Trứng được sử dụng trong các nghiên cứu tạo phôi là trứng được nuôi trong môi trường TCM-199+pFF và môi trường POM đã được chọn lọc phù hợp ở nội dung 1-2 Thí nghiệm trong nghiên cứu tạo phôi lợn Bản TTON bao gồm: 1) Nghiên cứu tạo nguồn tinh lợn Bản bằng phương pháp đông lạnh tinh thu từ mào tinh; 2) Nghiên cứu chế độ và điều kiện thụ tinh tối ưu; 3) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự thụ tinh và phát triển phôi ; 4) Nghiên cứu chọn lọc loại môi trường nuôi phôi phù hợp cho chất lượng phôi tốt; 5) Nghiên cứu đông lạnh phôi TTON

3.3.1 Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản

3.3.1.1 Khảo sát chất lượng tinh dịch lợn Bản thu từ mào tinh hoàn

Hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh, tỷ lệ sống và tỷ lệ kỳ hình trước và sau đông lạnh được kiểm tra bằng phương pháp kiểm tra chất lượng tinh đã trình bày trong phần phương pháp, trong đó mỗi chỉ số được kiểm tra 4 lần