Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro

Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôi trứng và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu

VÀ CÔNG NGH Ệ VIỆT NAM

-

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà N ội, 2021

VÀ CÔNG NGH Ệ VIỆT NAM

-

Chuyên ngành: Công ngh ệ sinh học

Mã s ố: 9 42 02 01

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Bùi Xuân Nguyên

2 TS Nguy ễn Việt Linh

Hà N ội, 2021

L ỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên, Nguyên Trưởng

Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng

Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành các thủ tục liên quan đến luận án

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS Nguyễn Thị Ước, Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS Nguyễn Thị Ước đã góp một phần rất lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà còn trong suốt thời gian làm việc của tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến

sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phòng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, Viện chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn

kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã có những góp ý để tôi hoàn chỉnh luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn

tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học viện

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo điểu kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn./

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả

NCS Nguy ễn Thị Nhung

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả

NCS Nguy ễn Thị Nhung

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN i

L ỜI CAM ĐOAN ĐOAN iii

M ỤC LỤC iv

DANH M ỤC CÁC BẢNG vii

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ viii

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

1.1 C ấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 4

1.1.1 Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn 4

1.1.2 Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo 9

1.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn 12

1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro 15

1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục 15

1.2.2 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi 19

1.2.3 Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT 26

1.3 Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro 32

1.3.1 Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản 32

1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 V ật liệu, hoá chất nghiên cứu 35

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 35

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 36

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 36

2.1.5 Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phân loại tháng theo mùa 37

2.2.2 Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 37

2.2.3 Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng 37

2.2.4 Phương pháp phân chia nhóm nang 37

2.2.5 Phương pháp thu trứng 38

2.2.6 Phương pháp phân loại chất lượng trứng 38

2.2.7 Phương pháp đo kích thước trứng lợn 39

2.2.8 Phương pháp nuôi trứng 39

2.2.9 Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 40

2.2.10 Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 40

2.2.11 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh 42

2.2.12 Phương pháp TTON 43

2.2.13 Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 44

2.2.14 Phương pháp đông lạnh phôi 44

2.2.15 Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 45

2.2.16 Phương pháp nhân nuôi tế bào 45

2.2.17 Phương pháp đông lạnh tế bào 46

2.2.18 Phương pháp NBVT (NBVT) 46

2.2.19 Phương pháp nuôi phôi 49

2.2.20 Phương pháp nhuộm Hoechst 49

2.2.21 Phương pháp nhuộm Orcein 50

2.2.22 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa 54

3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

3.1.2 Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản 56

3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng lợn Bản 59

3.2 K ết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản 65

3.2.1 Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 65

3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản

68 3.3 K ết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON 72

3.3.1 Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản 73

3.3.2 Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 78

3.3.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát triển phôi 84

3.3.4 Đông lạnh phôi TTON 89

3.4 K ết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT 91

3.4.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace 91

3.4.2 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace 94

3.4.3 Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT 96

3.4.4 Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT 97

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107

NH ỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 109

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 110

PH Ụ LỤC 1

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

B ảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước 57

B ảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản……… …60

Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62

B ảng 3.5 Sự thành thục của trứng lợn Bản 66

B ảng 3.6 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 67

Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau khi thu 73

B ảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74

Bảng 3.9 Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh 77

B ảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng 79

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản 80

Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau 81

B ảng 3.13 Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi 85

B ảng 3 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

B ảng 3.15 Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

B ảng 3.16 Kết quả đông lạnh phôi TTON 89

B ảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace 913

B ảng 3.18 Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi 94

B ảng 3.19 Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT 96

B ảng 3.20 Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi 97

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật

có vú 5

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân 6

Hình 1.3 Quá trình thành thục của trứng lợn 7

Hình 1.4 Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng 10

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn 11

Hình 1.6 Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 12

Hình 1.7 Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú 19

Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24

Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27

Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43

Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim 47

Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47

Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân 47

Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48

Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49

Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: 55

Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 57

Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C 59

Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn 62

Hình 3.5 Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng 64

A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa

Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM 67

Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường 72

Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản 77

Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh 91

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace 94

Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM 95

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển 96

Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace 101

Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT 102

Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong cơ thể lợn cái 104

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

T Ừ VIẾT

COCs Cumulus-Oocytes Complexes Tổ hợp trứng và tế bào cận noãn

FSH Follicle Stimulating Hormone Hocmon kích thích nang trứng

hCG Chorionic gonadotropin human Hocmon nhau thai người

ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh vào trứng

nghiệm

LH Luteinizing hormone Hocmon thể vàng hóa

NCSU-37 North Carolina State University 37

NSCU-23 North Carolina State University

Medium-23

Pig FM Pig Fertilization Medium Môi trường thụ tinh lợn

trứng lợn PERVs Porcine Endogenous Retroviruses Virus nội sinh ở lợn

TCM-199 Tissue culture medium-199 Môi trường nuôi cấy-199

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

B ảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước 57

B ảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản………59

Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62

B ảng 3.5 Sự thành thục của trứng lợn Bản 66

B ảng 3.6 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 67

Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau khi thu 73

B ảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74

Bảng 3.9 Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh 76

B ảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng 78

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản 79

Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau 81

B ảng 3.13 Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi 84

B ảng 3 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 83

B ảng 3.15 Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

B ảng 3.16 Kết quả đông lạnh phôi TTON 89

B ảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace 91

B ảng 3.18 Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi 94

B ảng 3.19 Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT 96

B ảng 3.20 Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi 97

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật

có vú 5

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân 6

Hình 1.3 Quá trình thành thục của trứng lợn 7

Hình 1.4 Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng 10

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn 11

Hình 1.6 Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 12

Hình 1.7 Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú 19

Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24

Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27

Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43

Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim 47

Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47

Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân 47

Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48

Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49

Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: 54

Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 56

Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C 58

Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn 61

Hình 3.5 Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng 63

A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa

Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM 66

Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường 71

Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản 76

Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh 90

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace 93

Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM 94

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển 95

Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace 100

Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT 101

Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong cơ thể lợn cái 103

Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học Ngoài

mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong

hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng ứng dụng lớn trong y học Lợn cũng là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của người, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì vậy lợn được xem là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation) Năm 2009, các nhà khoa học đã tạo

ra các tế bào gốc cảm ứng đa năng ở lợn (induced pluripotent stem cell-iPS) với hầu hết các đặc điểm giống với tế bào gốc phôi người và tế bào iPS của người Năm 2018, các nhà nghiên cứu của đại học Missouri cũng cho biết đã tạo được các cá thể lợn có

hệ miễn dịch suy yếu làm mô hình cấy ghép tế bào gốc không bị đào thải Kết quả này giúp cho các nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc tiến về phía trước nhanh hơn

Việt Nam là nơi có nhiều giống lợn bản địa như lợn Ỉ, Bản, Cỏ, Mẹo, Mường Khương … ít bị ảnh hưởng bởi quá trình lai tạo giống do được chăn thả tự nhiên ở các vùng núi cao Do khả năng tồn tại các cá thể không mang bản sao PERVs (Porcine Endogenous Retroviruses-là virus nội sinh có sẵn trong bộ gen lợn từ thời cổ xưa Các virus này được tìm thấy trong DNA của lợn, mặc dù ở trạng thái bất hoạt, chúng có thể hoạt động trở lại khi lây nhiễm sang loài khác) lợn Bản đang được đánh giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài (xenotranspantation), là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển [1] [2]

Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh học sinh sản vẫn chỉ được tiến hành chủ yếu trên các giống lợn ngoại, các nghiên cứu tương

tự vẫn chỉ mới được bắt đầu trên các giống lợn bản địa

Các kết quả nghiên cứu tạo phôi các giống lợn mini bản địa tại Việt Nam đã được

một số tác giả công bố cho thấy một thực tế chưa được khắc phục đó là sự phát triển

phôi in vitro ở lợn bản địa vẫn còn thấp hơn rất nhiều so với các kết quả thu được trên

các giống lợn ngoại Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôi trứng

và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản

được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu suất tạo phôi in vitro ở lợn nói chung,

lợn bản địa nói riêng còn thấp

Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro”

M ục tiêu:

Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản là giống lợn bản địa được đánh giá có ưu việt về số lượng bản sao PERV thấp với các mục tiêu:

1 Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản

2 Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản

3 Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao bằng công nghệ TTON và NBVT

D ựa trên các nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa

2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi

3 Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON thông qua môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi

4 Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT

Tính m ới của luận án

1 Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản lạnh phôi TTON tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học

2 Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi

NBVT trên đối tượng lợn

Hiện nay các giống lợn địa phương đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, số lượng lợn bản địa thuần đã bị giảm đi nghiêm trọng và có nguy cơ mất giống do sự lai tạp giao thoa với các giống lợn khác và nguy cơ gia tăng nhanh tỷ lệ đồng huyết do tự phối giống trong cùng bầy đàn Hơn nữa phương thức chăn nuôi lạc hậu, không kiểm soát được những đe dọa về dịch bệnh, đã góp phần làm giảm số lượng cá thể các giống lợn này

Việc xây dựng thành công hệ thống nuôi trứng và tạo phôi trên giống lợn bản địa tại Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ nhiệm vụ bảo tồn đa dạng sinh học, nâng cao hiệu quả chăn nuôi và khai thác giá trị nguồn gen các giống lợn này phục vụ các nghiên cứu y-sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 C ấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển

phôi in vivo ở lợn

1.1.1 Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn

Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái-noãn bào) Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu Buồng trứng ở các loài gia súc

là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung (buồng trứng phải và buồng trứng trái)

Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong

và miền vỏ bên ngoài Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền

vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các hormone progesterone và estrogen Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết Phía dưới lớp này là nhu mô chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3]

Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1) Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi của chúng [3] Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển tiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát triển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng) Các hoạt động tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kết chặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4]

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5]

Ở lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến

sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phôi 24-26 ngày tuổi Sau khi sinh, mỗi cá thể lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao quanh bởi một lớp tế bào cận noãn [6] Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triển thành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạn nang thành thục [7]; [8]

Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước

và sự thành thục của trứng (Hình 1.2) Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính Ở các giai đoạn tiếp sau, tế bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa, kích thước của trứng không đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9] Đường kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hoàn thành quá trình tăng trưởng trong các nang 1,8 mm Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu, đường kính trứng không màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10]

Nang sơ cấp Nang phát triển

Nang thành

tr ứng

Th ể vàng

Th ể vàng giai đoạn sớm

B ạch thể

Tr ứng sơ cấp

Nang nguyên th ủy

Mạch

máu

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân [8] Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục,

có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phân chia giảm nhiễm đặc trưng cho các loài động vật có vú [11]

Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành thục

về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh Noãn nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng,

dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai Số lượng noãn nguyên thủy được tăng lên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các noãn bào được hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n

Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinh

dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n Noãn sơ cấp của lợn bao gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng Noãn thứ cấp gồm một ovocyt

I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều noãn hoàng Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh Ovocyt I có đường kính khoảng 120-

150 µm [12]

Giai đoạn hình thành trứng khi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm

phân liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n Ở

Nang nguyên

th ủy

S ự hình thành khoang

Nang hình thành

lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) có khối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàng của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thước bé (cực cầu thứ nhất) Ở lần phân bào II, noãn bào cấp II phân chia hình thành

tế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia thành hai cực cầu bé

Giai đoạn thành thục trứng xảy ra sau khi các quá trình phân chia giảm phân kết

Sự rụng trứng xảy ra khi trứng phân chia đến giai đoạn kỳ giữa II (Metaphase II-M.II) [7]

Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chất

là hai quá trình thành thục cần phải cùng được hoàn thành trước khi rụng trứng Thông thường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thành

thục về nhân) và trứng đang ở giai đoạn M.II Mặc dù tế bào trứng đã thành thục về

nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưa được hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lên

sự phát triển của phôi [14]

Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn

in vitro Trứng được thu từ các nang có kích thước ≥ 3 mm có khả năng phát triển đến

giai đoạn thành thục hoàn toàn trong điều kiện nuôi in vitro, trong khi trứng được thu

từ nang có kích thước từ 0,8 mm đến 2,9 mm có tỷ lệ thành thục thấp sau khi nuôi cấy

48 giờ và trứng thu từ các nang có kích thước < 0,7 mm không có khả năng hoàn thành quá trình phân chia giảm nhiễm [15], [16]

Quá trình giảm phân của tế bào trứng được diễn ra dưới tác động của cyclin B p34cdc2 được coi là nhân tố kích thích thành thục (MPF) và mitogen-activated protein (MAP) kinase (một protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, đặc trưng cho các axit amin serine và threonine) Đây là hai nhân tố đặc biệt quan trọng kiểm soát quá trình giảm phân MPF là một thành phần quan trọng liên quan hoạt động của nhân tố ức chế quá trình nhân lên của tế bào (CFS) Mức độ hoạt động của MPF được đánh giá thông qua phép đo hoạt tính của histone H1 kinase ( một loại enzyme xúc tác hoạt động của Histone H1-một trong năm họ protein histone chính là thành phần của chất nhiễm sắc trong các tế bào nhân chuẩn) Quá trình kích thích này gây ra một loạt các phản ứng

và kết quả dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gắn vào các thoi

vô sắc, trứng chuyển sang giai đoạn MII, sẵn sàng cho quá trình thụ tinh và tạo phôi Hoạt động của MPF đạt mức cao nhất khi trứng ở giai đoạn MII và giảm xuống khi trứng được hoạt hóa [17]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về sự thành thục tế bào chất của trứng động vật nói chung và trứng lợn nói riêng, nhưng cho đến nay quá trình này vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ Bên cạnh đó, quá trình này được mô tả ở những thay đổi siêu cấu trúc diễn ra trong tế bào trứng từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII Những thay đổi siêu cấu trúc trong tế bào chất bao gồm sự phân bố lại các bào quan, sắp xếp lại các vi ống, hệ phức hợp Golgi, các cơ quan bài tiết, quá trình vận chuyển mRNA đến tế bào chất [18] Sự liên kết giữa tế bào cận noãn và tế bào trứng là yếu tố quan trọng điều hòa các hoạt động bên trong tế bào chất và qua đó ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào chất Cysteine, cysteamine, glutamine, gonadotropins, yếu tố kích thích tăng trưởng biểu bì (EGF), β-mercaptoethanol hoặc dịch nang trứng là các nhân tố cải thiện

sự thành thục tế bào chất của trứng [19]

1.1.2 Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo

1.1.2.1 Các giai đoạn thụ tinh

Đến ngày trứng rụng, trứng thành thục sẽ rụng khỏi buồng trứng, di chuyển vào ống dẫn trứng Sau khi phối giống, tinh trùng bơi qua vùng chất nhầy của buồng tử cung, tiến về phía ống dẫn trứng, sự thụ tinh sẽ xảy ra ở vị trí 1/3 ống dẫn trứng Tinh dịch lợn là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng được sản sinh từ tinh hoàn và các chất tiết của các tuyến sinh dục phụ như tuyến tinh nang, tuyến hành niệu đạo (cowper), tuyến tiền liệt và tuyến niệu đạo (urethra) Tinh dịch lợn chứa nhiều tinh thanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết Lượng tinh dịch trung bình trong một lần xuất tinh ở lợn ngoại là 250 ml, dao động từ 50-400 ml, nồng

độ tinh trùng dao động từ 100-300 triệu tinh trùng/ml tinh dịch [20]

Tinh trùng lợn gồm có ba phần chính: (1) Phần đầu: chứa các vật chất di truyền,

có hai phần cơ bản là nhân và acrosome (2) Phẩn cổ thân: Là phần rất ngắn, hơi co lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân Phần cổ thân chứa nhiều loại enzym oxy hóa khử giúp cho các phản ứng trao đổi chất của tinh trùng; (3) Phần đuôi: Có chức năng giúp tinh trùng vận động [21]

Cũng như các loài khác, quá trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóa tinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng được kích hoạt và phản ứng vỏ của noãn xảy ra

Quá trình hoạt hóa tinh xảy ra khi tinh trùng di chuyển trong buồng tử cung để tiếp cận vòi trứng Tử cung tiết các albumin liên kết với lipoproteins, proteolytic, glycosidasic enzymes hỗ trợ hoạt động hoạt hóa của tinh trùng Ở lợn, giai đoạn phát triển nang ảnh hưởng quan trọng đến kết quả hoạt hóa tinh Phần lớn tinh không được hoạt hóa trong vòi trứng vào thời điểm nang đang ở giai đoạn tiền rụng trứng [22] Sau khi hoạt hóa, tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosome Vùng trong suốt được cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein đồng phân ZP1, ZP2, ZP3 pZP1 hoạt động như một thụ thể liên kết với tinh trùng thông qua hoạt động của 2 loại protein 55kd proacrosin và 44kd [23] Phản ứng thể đỉnh được đặc trưng bởi sự phân giải dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosome của tinh trùng

Quá trình này vừa hình thành những bọng của màng, mặt khác tạo ra những lỗ trống

để cho các chất chứa trong acrosome giải phóng ra ngoài Phản ứng thể đỉnh xảy ra rất nhanh và phụ thuộc vào nồng độ Ca2+, ngoài ra bicarbonate cũng là một chất cần thiết giúp phản ứng thể đỉnh của tinh trùng diễn ra thuận lợi [14]

Mỗi trứng thông thường được thụ tinh bởi 1 tinh trùng, các tinh trùng khác đóng vai trò hỗ trợ cho tinh trùng này lọt qua lớp tế bào nang bằng cách tiết enzyme hyaluronidase làm tan rã màng Sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào trứng sẽ nhanh chóng kích thích hàng loạt phản ứng sinh học, kích thích hoạt động của quá trình giảm phân và phản ứng vỏ trứng để ngăn chặn hiện tượng đa tinh trùng Trứng sẽ tiết vào khoang quanh trứng một chất làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt, thiết lập một rào cản ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng còn lại

Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng

ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng (a,b) Sự xâm nhập của nhiều tinh trùng được

quan sát với nhiều đầu và nhân (c,d) [24]

Hiện tượng đa tinh trùng là hiện tượng có nhiều hơn 1 tinh trùng xâm nhập với một tế bào trứng, là một hiện tượng thụ tinh bất thường ở động vật có vú Tỷ lệ đa tinh trùng ở lợn đặc biệt cao hơn nhiều so với các loài khác Tỷ lệ đa tinh trùng ở lợn trong thụ tinh in vivo có thể lên tới 30-40%, hậu quả của hiện tượng sự gia tăng tình trạng phôi chết sớm [24]

1.1.2 2 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn

Khi tinh trùng lọt vào tế bào chất của trứng, trứng tiếp tục hoàn tất quá trình giảm phân để hình thành tiền nhân cái Tế bào chất của tinh trùng hòa lẫn với tế bào chất của trứng, hình thành nhân của tinh trùng là tiền nhân đực Tiền nhân đực và tiền nhân cái tiến lại gần nhau, lượng ADN trong mỗi tiền nhân tăng lên gấp đôi và ngay sau đó

màng của các tiền nhân tan rã, các thể nhiễm sắc xoắn lại, ngắn đi và dày lên và được phóng thích vào tế bào chất Thoi vô sắc xuất hiện, thể nhiễm sắc được sắp xếp trên thoi vô sắc Mỗi thể nhiễm sắc con tiến về một cực tế bào, rãnh phân chia sâu dần

Ở lợn, đầu tinh trùng hòa vào tế bào chất của trứng khoảng 5 giờ sau thụ tinh,

giai đoạn anaphase II quan sát được ở khoảng 50% số trứng được thụ tinh Tiền nhần

đực và tiền nhân cái hình thành khoảng 8 giờ sau thụ tinh [25] Kết quả của Ka và cs [26] cho thấy, ở các trứng có chứa lớp 2-5 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng có tỷ

lệ tiền nhân đực (male pronucleus: mPN) sau thụ tinh cao hơn so với trứng có rất ít hoặc không có tế bào cận noãn

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn [27]

Khoảng 30 giờ sau thụ tinh trứng phân chia thành 2 tế bào, tiếp tục quá trình phân chia tiếp theo để tạo phôi 4-8 tế bào Phôi dâu hình thành vào ngày thứ 3-4 sau thụ tinh, các tế bào tiếp tục phân chia và các các tế bào kết hợp lại với nhau thành một khối chặt chẽ Phôi tiếp tục phân chia và tạo thành phôi nang, màng phôi căng phồng, khối

tế bào nội phôi thoát ra ngoài màng trong suốt và bắt đầu làm tổ trong tử cung (hình 1.5)

Sự phân chia tế bào của phôi xảy ra trong suốt quá trình hợp tử di chuyển từ vòi trứng đến tử cung (hình 1.6; hình1.7), các tế bào nang vây quanh trứng bị thoái hóa dần dần, màng trong suốt vẫn tồn tại cho đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang sau đó biến

Trứng chưa thành thục Trứng thành thục Trứng thụ tinh

Phôi 2 tế bào Phôi dâu Phôi nang

mất ở giai đoạn phôi nang muộn

Giai đoạn phôi nang được tính vào khoảng ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, khi phôi dâu lọt vào khoang tử cung và nằm trong vùng chất dịch nội mạc tử cung Chất dịch thấm qua màng trong suốt vào khoảng gian bào của đại phôi bào để nuôi phôi, các khoảng gian bào hợp lại và khoang này lớn dần lên và được gọi là khoàng phôi dưới mầm (vì mầm phôi được tạo ra nằm phía trên nó) Màng trong suốt biến mất, khối tế bào trung tâm của phôi dâu và các đại phôi bào bị khoang phôi nang đẩy dần về một cực của phôi và lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cực phôi [28] Số tế bào của phôi ở giai đoạn này dao động từ 42 tế bào đối với phôi loại B và 63 tế bào đối với phôi loại A Phôi làm tổ vào khoảng ngày thứ 15-20 sau thụ tinh [29]

Hình 1.6. Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 [30]

1.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn

Lợn nái sau khi cai sữa khoảng 4-6 ngày sẽ động dục trở lại Chu kỳ động dục ở lợn dao động từ 17-23 ngày, thời gian động dục thường kéo dài 3-4 ngày Kích thước

và cấu tạo nang biến động theo các giai đoạn tiền động dục, động dục, sau động dục

Ngày 10 Ngày 8 Ngày 7 Ngày 6 Ngày 5 Ngày 4 Ngày 3 Ngày 2 Ngày 0-2

Hoạt động buồng trứng và quá trình phát triển nang ở lợn có tính chu kỳ và gắn liền với các yếu tố môi trường và mùa vụ

Các giống lợn khác nhau có tuổi động dục lần đầu khác nhau Các giống lợn nội như lợn Móng Cái động dục lần đầu ở 4-5 tháng tuổi, khối lượng lúc này đạt 30-40 kg, tuy nhiên ghép đực và thu trứng ở giai đoạn 6-8 tháng Các giống lợn lai ngoại với nội

có tuổi động dục lần đầu muộn hơn so với lợn nội thuần Lợn cái lai ngoại với nội như F1 (Yorkshire x Móng Cái) và F1 (Landrace x Móng Cái) có tuổi động dục lần đầu lúc

6 tháng tuổi, khối lượng 70-75kg Các giống lợn ngoại có tuổi động dục lần đầu thường

là 6-7 tháng, khối lượng 100-110 kg

Hoạt động buồng trứng được điều hành bởi trục thần kinh thể dịch tuyến đồi Tuyến yên-Buồng trứng (hypothalamo-pituitary-gonadal axis) Tuyến yên có vai trò kiểm soát chức năng và hoạt động của buồng trứng thông qua sự điều tiết các hocmon:

thị-LH và FSH Các hormone tuyến yên được vận chuyển qua máu để vào buồng trứng (cơ quan đích) từ đó điều khiển hoạt động của buồng trứng, nang và trứng với các hoạt động của progesterone, oestrogen và inhibin LH có tác dụng kích thích nang trứng phát triển, trưởng thành, thành thục và giải phóng trứng khỏi nang, LH có tác dụng kích thích trứng rụng LH kết hợp với FSH giúp trứng phát triển, thành thục và giải phóng trứng, kích thích lớp tế bào cận noãn và lớp vỏ còn lại phát triển thành thể vàng, kích thích thể vàng bài tiết estrogen và progesteron

Các yếu tố mùa vụ, nhiệt độ khí quyển là một trong những yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sinh sản của lợn Mùa vụ và các yếu tố thời tiết không thuận lợi là một trong những nguyên nhân dẫn tới hiện tượng chậm thành thục tính, kéo dài thời gian từ khi cai sữa đến khi động dục, tỷ lệ con con sinh ra thấp, giảm số lứa đẻ, tăng tỷ lệ sẩy thai Sự giải phóng melatonin trong cơ thể lợn cái biến đổi theo mùa, từ

đó ảnh hưởng tới sự giải phóng gonadotropin của tuyến đồi thị, khả năng tiết LH, FSH của tuyến yên và chức năng buồng trứng, chu kỳ dộng dục, sự phát triển nang trứng, chất lượng tế bào trứng [31]

Kết quả nghiên cứu của Miguel Mellado và cs về ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm tới năng suất sinh sản của lợn nái hậu bị (nái lai giữa Yorkshire và Landrace) sau thụ tinh nhân tạo cho thấy nhiệt độ môi trường cao làm giảm năng suất sinh sản của lợn nái dẫn đến tỷ lệ mang thai vào mùa xuân và mùa hạ thấp hơn so với mùa thu và mùa

đông (90,0% vs 93,0%) [32]

Kyzeková và cs, 2019 kiểm tra kích thước buồng trứng lợn ngoại cho thấy kích thước buồng trứng lớn nhất vào mùa thu với chiều dài trung bình đạt 25,8±3,4 mm, trong khi chiều dài trung bình của buồng trứng thu được vào mùa đông là 24,2±2,9

mm Khối lượng của buồng trứng thấp nhất vào mùa thu (trung bình 5,7±1,4 g) và cao nhất vào mùa xuân (trung bình 6,2±2,2 g) Số lượng nang/buồng trứng của lợn hậu bị đạt lớn nhất vào mùa thu (trung bình 17,9±7,5) với số lượng nang có kích thước >3

mm chiếm ưu thế [33]

Mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tới

số lượng và chất lượng trứng đủ tiêu chuẩn đưa vào TTON Việc đánh giá ảnh hưởng của mùa đối với hoạt động của buồng trứng và khả năng cung cấp cũng như chất lượng trứng đã được Kumar và cs tiến hành [34] Theo đó, trung bình số lượng nang trứng/buồng trứng và trung bình số thể vàng/buồng trứng trong mùa đông cao hơn so với mùa có gió mùa Số lượng tế bào trứng thu được từ các nang phát triển từ trứng thu vào mùa đông cao hơn đáng kể số với 2 mùa còn lại (mùa hạ và mùa gió mùa) (6,24±0,42 trứng so với 3,78±0,1 trứng)

Suzuki và cs, 2010 đã nghiên cứu ảnh hưởng của mùa (liên quan đến nhiệt độ khí quyển) đối với sự phát triển phôi trong ống nghiệm được tạo ra bằng phương pháp tiêm tinh vào trứng thành thục (ICSI) Tỷ lệ hình thành phôi nang từ trứng thu vào mùa đông (48%) lớn hơn so với các mùa: xuân, hạ và thu (24%, 21% và 19%) cho thấy khả năng phát triển tế bào trứng của lợn bị ảnh hưởng bởi mùa Tốc độ hình thành phôi nang cũng có sự tương quan nghịch với nhiệt độ [35]

Sốc nhiệt làm giảm đáng kể chất lượng trứng với các biểu hiện như giảm quá trình phát triển của tế bào cận noãn, quá trình giảm phân diễn ra chậm hơn, giảm tỷ lệ trứng sống, tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực thấp, giảm biểu hiện của các gen mã hóa ADN

ty thể và tăng phản ứng oxy hóa ở ty thể Nghiên cứu của Yin và cs cho thấy bề mặt màng trong suốt của tế bào trứng có chứa các kênh vận chuyển TZP (transzonal projection) giúp vận chuyển các chất chuyển hóa, trao đổi tương tác giữa trứng và tế nào cận noãn trong quốt quá trình phát triển của trứng Hiện tượng sốc nhiệt là nguyên nhân ức chế hoạt động tổng hợp các sợi actin (F-actin) dẫn đến sự gián đoạn kênh vận chuyển giữa trứng và tế bào cận noãn [36]

Hiện tượng suy giảm khả năng sinh sản ở lợn nái vào các tháng cuối mùa hạ và đầu mùa thu được gọi là hiện tượng vô sinh theo mùa, thể hiện ngay cả trong trường hợp chăn nuôi công nghiệp Theo Bertoldo và cs, khả năng hình thành phôi nang vào mùa đông lớn hơn so với mùa hạ (54,94±6,11% so với 21,09±5,59%) Trong mùa đông, các trứng thu được từ các nang có kích thước lớn có tỷ lệ phát triển đến giai đoạn phôi cao hơn đáng kể so với các tế bào trứng được thu từ các nang nhỏ (54,94±6,11% so với 23,17±6,02%) Số lượng tế bào/phôi nang ở các phôi phát triển từ các trứng thu ở các nang có kích thước nhỏ đạt thấp nhất trong mùa hạ (24,25±1,48) và đạt cao nhất ở các phôi phát triển từ trứng của các nang lớn thu trong mùa đông (37,51±1,3, P<0,05) [37]

Như vậy, lợn là loài động vật đa thai sinh sản quanh năm, trong một chu kỳ động dục ở lợn, nhiều nang trứng cùng phát triển, thành thục và rụng trứng Mặc dù việc khai thác trứng lợn có thể thực hiện trong suốt cả năm, các yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng

đáng kể lên hiệu quả sản xuất phôi lợn in vitro

1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro

Khác với công nghệ sản xuất phôi trong ống nghiệm đã được nghiên cứu thành công và ứng dụng phổ biến trên các loài gia súc và động vật nuôi như thỏ, dê, cừu và

bò, từ những năm 80-90 của thế kỷ 20, việc sản xuất phôi lợn trong ống nghiệm chỉ bắt đầu đạt được những kết quả khả quan vào đầu thế kỷ 21 [38], [39]

Hiện tại, các tiến bộ khoa học về công nghệ sinh sản hiện đại đã cho phép chủ

động tạo nguồn trứng lợn bằng các phương pháp nuôi thành thục in vitro và sử dụng

chúng để sản xuất phôi với các hình thức phôi trinh sản (Parthenogenetic embryo [40] phôi TTON [41] và phôi NBVT do cấy nhân cùng loài hay khác loài [42]

1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng

và điều kiện nuôi thành thục

Trứng và chất lượng trứng thành thục là nguồn nguyên liệu cần thiết và yếu tố quyết định quan trọng lên kết quả của tất cả các phương pháp tạo phôi in vitro Để chủ động nguồn nguyên liệu trứng phục vụ sản xuất phôi lợn trong ống nghiệm, công nghệ nuôi thành thục trứng thu từ lò mổ đã được triển khai phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Hầu hết các trứng thu từ lò mổ chưa thành thục, vì vậy trước khi thụ tinh, trứng cần được nuôi thành thục in vitro

Kết quả thí nghiệm nuôi thành thục trứng thu từ các nang có kích thước khác nhau cho thấy chất lượng và trạng thái nang có ảnh hưởng đáng kể tới sự thành thục của trứng Kết quả nghiên cứu của Petters và Well, 1993 [43] cho thấy hầu hết trứng thu từ các nang có đường kính <0,7 mm đều chưa hoàn thành quá trình giảm phân và không thể thành thục in vitro; mặc dù tế bào trứng từ các nang có đường kính từ 0,8

mm đến 1,6 mm có khả năng thành thục in vitro, nhưng không phải tất cả các trứng

thu từ các nang trứng có đường kính >1,7 mm hoặc >3mm có thể phát triển đến giai

đoạn metaphase II sau 48 giờ nuôi in vitro

Tế bào trứng lợn thành thục trong ống nghiệm trong điều kiện cơ bản thường bị thiếu một số yếu tố mà hiện nay vẫn chưa được xác định, dẫn tới tỷ lệ phát triển của phôi thành con con sau cấy chuyển phôi rất thấp Bổ sung dịch nang trứng hoặc tế bào cận noãn (cumulus cell) vào môi trường nuôi thành thục có thể được khắc phục một phần các hạn chế này

Môi trường nuôi trứng lợn thành thục có nhiều loại khác nhau, có thành phần đơn giản hoặc phức tạp, tuy nhiên thông thường sẽ bao gồm môi trường nền (môi trường Hank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS) hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin, các nhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP) [4] Trong đó môi trường TCM-199 và môi trường NCSU-23 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhằm tăng khả năng thành thục hoàn toàn của trứng phục vụ TTON và NBVT Kết quả nghiên cứu đánh giá sự thành thục của trứng lợn in vitro

trong hai loại môi trường TCM-199 và NCSU-23 và bổ sung 10% dịch nang trứng (pFF) hoặc 0,1% PVA cho thấy tỷ lệ thành thục ở các lô thí nghiệm tương ứng là: TCM+PVA (54,5%-61/112); TCM+pFF (65,0%-63/97); NCSU-23+PVA (54,6%-65/119) và NCSU-23+pFF (58,1%-61/105) Như vậy tỷ lệ thành thục của trứng trong môi trường TM 199 TCM+pFF đạt cao nhất là 65,0% [44]

Liu và cs, 2011 cũng thông báo kết quả tương tự khi so sánh chất lượng trứng

thành thục in vitro trong các môi trường TCM-199 và NCSU-23 có bổ sung dịch nang

trứng (pFF) hoặc huyết thanh thai bò (FBS) với tỷ lệ 10% cũng cho kết quả tương tự.Tỷ

lệ trứng thành thục sau 42 giờ nuôi trong môi trường TCM-199, TCM-199+FBS, TCM-199+pFF, NCSU-23, NCSU-23+FBS, NCSU-23+pFF tương ứng là: 54,2%, 68,5%, 69,3%, 51,6%, 63,2% và 65,5% [45]

PyoosII và cs đã so sánh tỷ lệ thành thục và tỷ lệ xuất hiện thể cực của trứng lợn sau khi nuôi trong ống nghiệm với các loại môi trường NCSU-23, NCSU-37 và môi trường TCM-199 có bổ xung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF/TCM-199) Kết quả cho biết tỷ lệ trứng thành thục và tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực trong môi trường NCSU-37 đạt 85,9% và 81,9%-cao hơn so với hai môi trường còn lại [46]

Yuka và cs cho biết, tỷ lệ trứng thành thục và tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực trong môi trường TCM-199 và môi trường NCSU-23 không có sự khác biệt về mặt thống kê với các tỷ lệ tương ứng là: 77,1% và 72,5% so với 77,1% và 72,7% [47]

Ngoài ra, một số tác giả sử dụng môi trường cơ bản nuôi trứng (Porcine oocyte medium: POM) làm nền cho môi trường nuôi thành thục Theo Yoshioka và cs, 2002

bổ sung 3 mg/mL polyvinyl alcohol (PVA),50 μmol/L β-mercaptoethanol (β-ME), 10 IU/mL chorionic gonadotropin từ huyết thanh thai ngựa (pregnant mare serum: eCG),

10 IU/mL chorionic gonadotropin human (hCG) và 1.0 mmol/L dibutyryl cyclic adenosine monophosphate sodium salt (dbcAMP) cho kết quả trứng đạt được tỷ lệ thành thục cao hơn so với môi trường nuôi cơ bản

Hiện tại, hệ thống TTON tại các nước phát triển thường cho kết quả 85-90%

trứng thành thục sau khi nuôi từ 44-46 giờ ở điều kiện 39OC, 5% CO2, 5% O2, 90% N2, độ ẩm bão hòa [48] [49]

Kết hợp hài hòa sự thành thục tế bào chất và thành thục nhân của trứng trong quá

trình nuôi in vitro là yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh và sự phát triển phôi Do trứng lợn thu từ các nang khác nhau có quá trình thành thục nhân và tế bào chất không đồng nhất, sự khác biệt đáng kể về nồng độ steroid, lượng tế bào granulosa và nồng độ LH trong dịch nang trứng có thể ảnh hưởng đáng kể lên thời gian cần thiết để trứng phát triển đến giai đoạn metaphase II [50] So với trứng thành thục

in vivo , trứng thành thục in vitro thường có tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỷ lệ phân

chia thấp hơn,sự phát triển của tiền nhân thường không đồng pha và tốc độ phát triển

phôi chậm hơn [51] Điều này chứng tỏ các điều kiện nuôi thành thục in vitro có thể

chưa đáp ứng đầy đủ các yếu tố cần thiết để bảo đảm chất lượng trứng khi tham gia quá trình TTON Việc bổ xung các yếu tố kích thích tổng hợp vào môi trường nuôi trứng trong 24 giờ đầu được xem là giải pháp có ảnh hưởng quan trọng đối với quá

trình tạo phôi in vitro

Bổ sung 1 mmol/L dibutyryl cAMP (dbcAMP)-một hoạt chất cAMP có khả năng thấm qua màng có tác dụng ức chế tạm thời sự phân chia giảm phân của trứng là một phát hiện có giá trị đột phá đối với quá trình nuôi thành thục trứng lợn Bổ xung dbcAMP từ có tác dụng tăng cường sự thành thục đồng bộ của nhân và tế bào chất, dẫn tới tăng tỷ lệ hình thành phôi nang từ 9% lên 22% [51] Bổ xung các yếu tố kiểm soát mức độ phản ứng oxy hóa trong tế bào (reactive oxygen species -ROS) như glutathione (GSH), các hợp chất cysteine, cysteamine, glutamine, b-mercaptoethanol, dịch nang trứng, LH, EGF, pFF cũng góp phần hỗ trợ sự thành thục tế bào chất của trứng lợn [52]

Trạng thái tế bào cận noãn cũng có ảnh hưởng đối với sự thành thục tế bào chất

Tế bào cận noãn bao quanh trứng có nguồn gốc từ các tế bào granulosa và đóng một vai trò quan trọng tới quá trình thành thục của trứng Ở động vật có vú, tế bào trứng của các nang thứ cấp được bao quanh bởi một lớp các tế bào cận noãn liên kết chặt chẽ với nhau, tạo thành phức hợp tế bào trứng-tế bào cận noãn (Cumulus-Oocyte Complexes-COC) Vào giai đoạn chuẩn bị rụng trứng, các tế bào cận noãn trở lên bông tơi, nới rộng khoảng cách và hợp thành lớp màng nhầy bao bọc xung quanh trứng (Hình 1.7) [53] Cấu trúc này cho phép tăng cường quá trình trao đổi các phân tử nhỏ (chất dinh dưỡng, các hormone ), các tín hiệu paracrine giữa trứng và các tế bào nang Bing và cs, 2002 [54] và Maedomari và cs, 2007 [55] cho biết tỷ lệ trứng thành

thục ở trứng có lớp tế bào cận noãn từ 2 lớp trở lên cao hơn nhiều so với trứng có ít hơn 2 lớp tế bào cận noãn

Long và cs đã tiến hành nghiên cứu tác động tương hỗ giữa yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt-đại thực bào (granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF) và dịch nang trứng (pFF) nhằm mục đích cải thiện hiệu quả thành thục trong ống nghiệm Kết quả cho thấy GM-CSF giúp cải thiện sự giãn cách và bông tơi của lớp tế bào cận noãn, kích thích sự trao đổi các hạt cortical và ty thể, là các bào quan có vai

trò quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của tế bào và chu kỳ tế bào như quá trình sản xuất năng lượng, các quá trình tăng sinh, biệt hóa, truyền thông tin và quá trình apoptosis [56]

Hình 1.7. Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục

của trứng động vật có vú [53]

Như vậy, đã có nhiều nghiên cứu nhằm hoàn thiện hệ thống nuôi trứng, nâng cao

tỷ lệ trứng thành thục đồng bộ, chủ động nguồn nguyên liệu có chất lượng cho TTON

và NBVT Tuy nhiên, hiện nay chất lượng trứng trong ống nghiệm vẫn còn thấp hơn

so với trứng thành thục tự nhiên trong cơ thể, nghiên cứu tạo được môi trường nuôi

trứng có các điều kiện về lý hóa giống như môi trường sinh lý trong cơ thể vẫn là những vấn đề mở đối với công nghệ tạo phôi in vitro trên lợn

1.2.2 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi

Thụ tinh trong ống nghiệm là một phương pháp hỗ trợ sinh sản mà tinh trùng và trứng được kết hợp ở ngoài cơ thể, là một quá trình khôi phục cơ cấu di truyền bị chi phối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác động môi trường nuôi thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi và phương

S ự phát triển của nang

Nang nguyên thủy

Giai đoạn giảm phâm

Giai đoạn MI giTiảm phân ếp tục Giai đoạn MII

Tr ứng thành thục

pháp bảo quản phôi

1.2.2.1 Bảo quản và hoạt hóa tinh

Bảo quản tinh trùng là một giải pháp hữu ích để lưu giữ lâu dài những vật liệu di truyền có giá trị, có thể khai thác sau khi giải đông để tạo ra phôi thông qua kĩ thuật TTON Nghiên cứu bảo quản tinh trùng lợn đã được tiến hành trong khoảng 30 năm nhằm mục đích tổ chức các ngân hàng tinh đông lạnh để phát triển các chương trình nhân giống và cải tạo di truyền theo phương thức chăn nuôi công nghiệp [57]

Chất lượng tinh trùng sau bảo quản có ảnh hưởng quan trọng lên tỷ lệ thụ tinh và

sự phát triển phôi [58]

Thông thường có hai hình thức bảo quản tinh trùng lợn: bảo quản ngắn hạn ở nhiệt độ thấp trong khoảng 24 giờ tới một vài ngày và bảo quản dài hạn ở dạng đông lạnh trong ống rạ hoặc dạng tinh viên

Kết quả bảo quản lạnh tinh lợn ở nhiệt độ -79 °C đã được Polge công bố vào năm

1952 [59] Các nghiên cứu đông lạnh sâu tinh trùng lợn theo hướng cải tiến hệ thống đông lạnh tinh bò đã được các tác giả khác theo đuổi trong suốt giai đoạn 1950-1960 với kết quả hạn chế, tinh trùng có thể vận động sau giải đông nhưng không có khả năng thụ thai

Thành công đầu tiên trong việc sử dụng tinh đông lạnh để thụ tinh đã được Polge

và cs thông báo vào năm 1970, tuy vậy việc thụ tinh vẫn phải thông qua can thiệp giải phẫu để bơm trực tiếp tinh vào vòi trứng [60]

Tinh lợn sau khi thu được tiến hành đông lạnh ở nhiệt độ thấp, sau đó được giải đông và thụ tinh trực tiếp qua cổ tử cung với lợn cái đến giai đoạn đọng dục đã được các nhóm nghiên cứu khác báo cáo vào năm 1971 [60] [61] Kết quả phối giống bằng tinh đông lạnh cho thấy lợn nái được thụ thai và sinh con, con con sinh ra khỏe mạnh, mặc dù tỷ lệ thụ thai và số lượng con sinh ra còn thấp

Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTON được Nagai và cs thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1988, tuy nhiên kết quả thụ tinh còn thấp [39] Rath D và cs, 1997 so sánh chất lượng phôi lợn khi sử dụng tinh tươi và tinh đông lạnh cho thấy tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ hình thành tiền nhân và tỷ lệ phôi ở giai đoạn 2-4 tế bào khi sử dụng tinh đông lạnh vẫn thấp hơn nhiều so với tinh tươi (16% so với 58,7%)

[62] Tiến bộ về TTON với tinh đông lạnh đạt tỷ lệ hơn 70-80% trứng được thụ tinh

và phân chia đã được các tác giả khác công bố [62] [63]

Nguồn tinh trùng sử dụng cho đông lạnh được khai thác chủ yếu bằng phương pháp nhảy giá và sử dụng âm đạo giả Trên đối tượng lợn ngoại, lợn đực đến tuổi trưởng thành được huấn luyện riêng để khai thác tinh Trong các trường hợp đặc biệt, tinh trùng có thể được thu trực tiếp từ mào tinh hoàn Nghiên cứu của nhóm các tác giả Nagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khả năng khả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đông lạnh

và sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục, tạo lợn con bằng cấy chuyển phôi ở giai đoạn 2-4 tế bào [39], [64]

Quá trình thụ tinh tự nhiên diễn ra trong cơ thể con cái sau khi tinh trùng được xuất vào âm đạo và bơi ngược dòng đi vào tử cung Tử cung hỗ trợ quá trình hoạt hóa,

di chuyển của tinh trùng và quá trình thụ tinh giữa trứng và tinh bằng cách tiết ra binding albumin, lipoproteins, heparin, các enzyme phân giải protein và glycosidasic Đối với quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, tinh trùng được hoạt hóa bằng cách ủ trong môi trường có các chất được chiết xuất từ mào tinh hoặc trong môi trường xác định có các thành phần tương tự như trong mào tinh Phản ứng hoạt hóa tinh trùng, liên quan đến sự vận động và phản ứng acrosome của tinh trùng, quyết định sự thành công của quá trình thụ tinh in vitro

sterol-Dựa trên các nghiên cứu về hoạt động của tinh trùng trong điều kiện tự nhiên, các phương pháp rửa tinh, pha loãng tinh, lọc tinh và các chế độ thụ tinh thích hợp đã được phát triển để kích hoạt quá trình hoạt hóa tinh trong ống nghiệm và hạn chế sự thụ tinh

đa tinh trùng [63] [65]

pH có vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh Độ pH thích hợp cho TTON ở lợn là 7,4 Tuy nhiên, Brown và Cheng (1986) đã thử nghiệm và nhận thấy tỷ lệ tinh trùng xâm nhập tế bào trứng đạt mức cao nhất (> 89%) đối với tinh trùng đã được hoạt hóa ở 37oC trong môi trường pH 7,8 trước khi đưa vào thụ tinh ở môi trường có pH 7,4 và nhiệt độ 39oC [66]

Albumin huyết thanh bò BSA fraction V, dịch nang trứng, caffein là các yếu tố được bổ sung vào môi trường thụ tinh để hỗ trợ hoạt hóa tinh trùng Fukui và cs, 1983

đã kiểm tra nhiều yếu tố hoạt hóa tinh sau giải đông và nhận thấy dịch nang trứng lợn

(pFF) có tác dụng hoạt hóa tinh trùng [67]

1.2.2.2 Môi trường thụ tinh và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh

Thành phần của môi trường thụ tinh, các loại phân tử, nồng độ tinh trùng, sự có mặt của các yếu tố kích thích có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thụ tinh và chất lượng của phôi [68]

Muối, cơ chất năng lượng (glucose, pyruvate, lactate) và nguồn protein, ion Ca2+, bicarbonate, Na+, K+là các chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng trong môi trường thụ tinh cơ bản ở lợn

Hiện nay, có nhiều loại môi trường thụ tinh khác nhau, nhưng 2 loại môi trường

cơ bản được sử dụng phổ biến là môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP)

bổ sung 3 mg/mL bovine serum albumin (BSA) và 1,10 mmol/L sodium pyruvate; và môi trường Pig-FM có chứa 90 mM NaCl, 12 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgSO4, 10 mM sodium lactate và 10 mM Hepes (có chứa 8 mM CaCl2, 2 mM sodium pyruvate, 2 mM cafein, 5 mg/ml BSA) [69]

Bổ sung 10 mg/mL BSA và 2 mmol/L caffein vào môi trường thụ tinh có tác dụng tăng tỷ lệ tạo phôi tốt và con con được sinh ra sau cấy phôi đối với trứng lợn được nuôi thành thục in vitro và thụ tinh với tinh trùng đông lạnh [40], Yue Zhang Ngoài tác dụng hỗ trợ hoạt hóa tinh, BSA có khả năng kết dính cholesterol và kẽm nên còn đóng một vai trò quan trọng trong việc tách bỏ các phân tử này khỏi tinh

Bổ sung dịch nang trứng (pFF) vào môi trường nuôi trứng và môi trường thụ tinh làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ phân chia và phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang [70]

Môi trường nuôi phôi lợn luôn đẳng trương, chứa các ion cần thiết cho quá trình

sống của phôi (Na+, K+¸Ca++, Mg++, PO43++, Cl-),hệ đệm bicarbonate (HCO3) và các kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn và một lượng protein tối thiểu

Môi trường NCSU-23 đã được sử dụng để nuôi phôi lợn trong ống nghiệm từ năm 1993 [43] Kikuchi và cs, 2002 thông báo tỷ lệ hình thành phôi nang đạt 25,3% khi nuôi phôi lợn trong môi trường North Carolina State University-37 medium (NCSU-37) có chứa 4mg/ml BSA và 50 µM β-mercaptoethanol, bổ sung 0,17 mM sodium pyruvate và 2,73 mM sodium lactate (IVC-PyrLac) trong 2 ngày đầu, và sử

dụng môi trường nền có bổ sung 5.55 mM D-glucose (IVC-Glu) trong 5 ngày tiếp theo [71]

Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3) và PZM-5 được cho là có hiệu quả tạo phôi cao hơn và bắt đầu được sử dụng nhiều hơn những năm gần đây Yoshioka và cs, 2002; Li và cs, 2013, Nie và cs 2016 cho biết môi trường nuôi phôi PZM-3 bao gồm các thành phần của dịch ống dẫn trứng lợn và các amino acid bổ sung

hỗ trợ sự phát triển của phôi trong giai đoạn phôi nang nhiều hơn so với môi trường NCSU-23 Tỷ lệ hình thành phôi nang và số tế bào/phôi nang của phôi được nuôi trong môi trường PZM-3 đều cao hơn so với phôi nuôi trong môi trường NCSU-23 (15,2%

so với 9,6%) và (23,6 tế bào và 21,4 tế bào) [72], [73], [74]

Tỷ lệ phôi nang lên tới 27% đã được Suzuki và cs, 2003 [75] và Nhien và cs,

2018 [76] thông báo đối với hệ thống nuôi phôi ống nghiệm trong môi trường PZM5 Cho đến nay hệ thống TTON đã được cải tiến, hiệu suất thụ tinh cũng tăng cao,

tỷ lệ hình thành phôi nang ở các hệ thống TTON tại các nước tiên tiến trên thế giới có thể đạt trên 60% [77], [78]

Trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi tạo phôi lợn in vitro là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic) Tỷ lệ phôi đa tinh trùng ở lợn có thể dao động từ 13% đến 90% [79] Hệ quả của sự thụ tinh đa tinh trùng là sự hình thành các thể phôi lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm chỉ có thể phát triển bình thường tới một giai đoạn nhất định [80]

Khả năng màng sáng (zonae pelucidae-ZP) không hoàn thành quá trình đóng lại hoàn toàn sau sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên là nguyên nhân trực tiếp gây ra sự thụ tinh đa tinh trùng Wang và cs cho biết, màng sáng của tế bào trứng thành thục in

vivo trải qua quá trình phát triển tự nhiên thường mỏng hơn so với màng sáng của trứng được nuôi thành thục trong ống nghiệm và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê này là một trong những nguyên nhân dẫn tới tỷ lệ đa thụ tinh trong TTON cao hơn so với thụ tinh

tự nhiên trong cơ thể con cái [81]

Hiện tượng đa tinh trùng ở lợn xảy ra với tần số cao hơn rất nhiều so với các loài động vật khác như bò, dê, khỉ và liên quan đến nhiều yếu tố như chất lượng tinh tại thời điểm thụ tinh, chất lượng trứng và môi trường thụ tinh Tỷ lệ đa tinh trùng liên quan chặt chẽ theo tỷ lệ thuận với số lượng tinh trùng/số tế bào trứng sử dụng trong

TTON Tuy nhiên, giảm số lượng tế bào tinh trùng trên số tế bào trứng trong quá trình thụ tinh sẽ làm giảm khả năng xâm nhập của tinh trùng và kéo theo đó là giảm tỷ lệ thụ tinh [82]

Hình 1.8. Thụ tinh bình thường so với polyspermic

Tế bào lợn nhuộm Hoechst 33342±20h sau khi thụ tinh Tiền nhân được đánh dấu

bằng * (A) Thụ tinh bình thường, (B) Đa thụ tinh [43]

Rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mục đích giảm tỷ lệ đa thụ tinh trong TTON ở lợn Lựa chọn thời gian tiếp xúc tối ưu giữa trứng và tinh trong quá trình thụ tinh, bổ sung các thành phần của dịch ống dẫn trứng, bổ sung dịch ống dẫn trứng, dịch nang trứng, tế bào ống dẫn trứng đã giúp cải thiện tỷ lệ thụ tinh và giảm

tỷ lệ đa tinh trùng [83] Theo Funahashi và Romar xử lý tinh trùng tươi với adenosine

và nuôi giao tử sau thụ tinh trong môi trường chứa caffein trong 1 thời gian ngắn có tác dụng giúp giảm tỷ lệ đa tinh trùng [84]

Tuổi của lợn vào thời điểm thu trứng là một trong các yếu tố liên quan tới hiện tượng đa thụ tinh [85] Trong các nghiên cứu TTON ở lợn, chất lượng trứng có thể bị hạn chế do hầu hết trứng sử dụng được thu từ các lò mổ từ lợn nái chưa hoàn toàn thành thục về tính hoặc lợn nái hậu sản

Một hệ thống TTON lý tưởng là hệ thống đạt đươc tỷ lệ tinh trùng thâm nhập cao (>80%) và tỷ lệ đa thụ tinh thấp (<10%) Nhiều công trình nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi trứng và nuôi phôi đã được thực hiện để đạt mục đích này

Theo Abeydeera và cs, 2002; Kouba và cs, 2000 [86], [87] bổ xung dịch tiết hoặc protein của ống dẫn trứng vào môi trường nuôi thành thục trứng và thụ tinh có tác dụng bảo đảm sự tích hợp thành thục của nhân và thành thục tế bào chất của trứng, tạo điều