Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro

Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôitrứng và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT

NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ

TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ

THUẬT IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2021

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội, 2021

Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học vàCông nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu

và hoàn thành các thủ tục liên quan đến luận án

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS Nguyễn Thị Ước, Phòng công nghệPhôi, Viện công nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ nhữngngày đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS Nguyễn Thị Ước đã góp mộtphần rất lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà còn trong suốt thời gian làmviệc của tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhómnghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học,

tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹTamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phòng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, Việnchăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩmquốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành,Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tàiliệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, ViệnCông nghệ sinh học cùng các cán bộ Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học

đã có những góp ý để tôi hoàn chỉnh luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoahọc và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn

tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại họcviện.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo điểu kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và độngviên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn./

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021

Tác giả

NCS Nguyễn Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sựkhác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồngtác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021

Tác giả

NCS Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

1.1 Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 4

1.1.1 Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn 4

1.1.2 Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo 9

1.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn 12

1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro 15

1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục 15

1.2.2 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi 19

1.2.3 Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT 26

1.3. Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro 32

1.3.1 Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản 32

1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu, hoá chất nghiên cứu 35

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 35

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 36

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 36

2.1.5 Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phân loại tháng theo mùa 37

2.2.2 Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 37

2.2.3 Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng 37

2.2.4 Phương pháp phân chia nhóm nang 37

2.2.5 Phương pháp thu trứng 38

2.2.6 Phương pháp phân loại chất lượng trứng 38

2.2.7 Phương pháp đo kích thước trứng lợn 39

2.2.8 Phương pháp nuôi trứng 39

2.2.9 Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 40

2.2.10 Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 40

2.2.11 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh 42

2.2.12 Phương pháp TTON 43

2.2.13 Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 44

2.2.14 Phương pháp đông lạnh phôi 44

2.2.15 Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 45

2.2.16 Phương pháp nhân nuôi tế bào 45

2.2.17 Phương pháp đông lạnh tế bào 46

2.2.18 Phương pháp NBVT (NBVT) 46

2.2.19 Phương pháp nuôi phôi 49

2.2.20 Phương pháp nhuộm Hoechst 49

2.2.21 Phương pháp nhuộm Orcein 50

2.2.22 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 54 ở lợn Bản theo mùa

3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

3.1.2 Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản 56

3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 59 lợn Bản

3.2 Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản 65

3.2.1 Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 65

3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục 68 trứng lợn Bản

3.3 Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON 72

3.3.1 Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản 73

3.3.2 Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 78

3.3.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 84 triển phôi

3.3.4 Đông lạnh phôi TTON 89

3.4 Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT 91

3.4.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace 91

3.4.2 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace 94

3.4.3 Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT 96

3.4.4 Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN 109 ĐẾN ĐỀ TÀI

TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

Bảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước 57

Bảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản……… …60

Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62

Bảng 3.5 Sự thành thục của trứng lợn Bản 66

Bảng 3.6 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 67

Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau khi thu 73

Bảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74

Bảng 3.9 Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh 77

Bảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng 79

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản 80

Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau 81

Bảng 3.13 Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi 85

Bảng 3 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

Bảng 3.16 Kết quả đông lạnh phôi TTON 89

Bảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace 913

Bảng 3.18 Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi 94

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT 96

Bảng 3.20 Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi 97

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật

có vú 5

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân 6

Hình 1.3 Quá trình thành thục của trứng lợn. 7

Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng 10 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn 11

Hình 1.6 Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 12

Hình 1.7 Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24

Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27

Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43

Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim 47

Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47

Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân 47

Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48

Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49

Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: 55

Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 57 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C 59

Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn 62

A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa

Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM 67

Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường 72

Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản. 77

Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh. 91

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace 94

Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM 95

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển 96

Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace 101

Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT 102

Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn

giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong

cơ thể lợn cái104

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT

BSA Bovine serum albumin Huyết thanh thai bò

COCs Cumulus-Oocytes Complexes Tổ hợp trứng và tế bào cận noãn

dbc-AMP Dibutyryl-cAMP

DPBS Dulbecco′s phosphate buffered

salineEGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì

FSH Follicle Stimulating Hormone Hocmon kích thích nang trứng

GVBD Germinal vesicle breakdown Phá vỡ bóng mầm

hCG Chorionic gonadotropin human Hocmon nhau thai người

ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh vào trứng

nghiệm

LH Luteinizing hormone Hocmon thể vàng hóa

NCSU-37 North Carolina State University 37

NSCU-23 North Carolina State University

Medium-23

pFF Porcine follicular fluid Dịch nang trứng lợn

Pig FM Pig Fertilization Medium Môi trường thụ tinh lợnPZM-3 Porcine zygote medium Môi trường hợp tử ở lợnPOM Porcine oocyte maturation Môi trường nuôi thành thục

trứng lợnPERVs Porcine Endogenous Retroviruses Virus nội sinh ở lợn

TALP- Tyrode's albumin lactate

pyruvate-PVA Polyvinylalcohol

TCM Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cấy mô

TCM-199 Tissue culture medium-199 Môi trường nuôi cấy-199

β-ME Mercaptoethanol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54

Bảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước 57

Bảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản………59

Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62

Bảng 3.5 Sự thành thục của trứng lợn Bản 66

Bảng 3.6 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản 67

Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau khi thu 73

Bảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74

Bảng 3.9 Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh 76

Bảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng 78

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản 79

Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau 81

Bảng 3.13 Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi 84

Bảng 3 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 83

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh 86

Bảng 3.16 Kết quả đông lạnh phôi TTON 89

Bảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace 91

Bảng 3.18 Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi 94

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT 96

Bảng 3.20 Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi 97

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật

có vú 5

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân 6

Hình 1.3 Quá trình thành thục của trứng lợn. 7

Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng 10 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn 11

Hình 1.6 Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 12

Hình 1.7 Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24

Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27

Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43

Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim 47

Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47

Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân 47

Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48

Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49

Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: 54

Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 56 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C 58

Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn 61

A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa

Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM 66

Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường 71

Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản. 76

Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh. 90

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace 93

Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM 94

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển 95

Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace 100

Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT 101

Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn

giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong

cơ thể lợn cái103

y dược hiện đại.

Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học Ngoàimục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong

hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng ứng dụng lớn trong y học Lợn cũng

là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan củangười, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vìvậy lợn được xem là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấyghép tạng khác loài (xenotransplantation) Năm 2009, các nhà khoa học đã tạo ra các tếbào gốc cảm ứng đa năng ở lợn (induced pluripotent stem cell-iPS) với hầu hết các đặcđiểm giống với tế bào gốc phôi người và tế bào iPS của người Năm 2018, các nhànghiên cứu của đại học Missouri cũng cho biết đã tạo được các cá thể lợn có hệ miễndịch suy yếu làm mô hình cấy ghép tế bào gốc không bị đào thải Kết quả này giúp chocác nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc tiến về phía trước nhanh hơn

Việt Nam là nơi có nhiều giống lợn bản địa như lợn Ỉ, Bản, Cỏ, Mẹo, MườngKhương … ít bị ảnh hưởng bởi quá trình lai tạo giống do được chăn thả tự nhiên ởcác vùng núi cao Do khả năng tồn tại các cá thể không mang bản sao PERVs(Porcine Endogenous Retroviruses-là virus nội sinh có sẵn trong bộ gen lợn từ thời cổxưa Các virus này được tìm thấy trong DNA của lợn, mặc dù ở trạng thái bất hoạt,chúng có thể hoạt động trở lại khi lây nhiễm sang loài khác) lợn Bản đang được đánhgiá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài(xenotranspantation), là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển [1] [2]

Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh họcsinh sản vẫn chỉ được tiến hành chủ yếu trên các giống lợn ngoại, các nghiên cứutương tự vẫn chỉ mới được bắt đầu trên các giống lợn bản địa

Các kết quả nghiên cứu tạo phôi các giống lợn mini bản địa tại Việt Nam đã được

2một số tác giả công bố cho thấy một thực tế chưa được khắc phục đó là sự phát triển

phôi in vitro ở lợn bản địa vẫn còn thấp hơn rất nhiều so với các kết quả thu được

trên các giống lợn ngoại Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôitrứng và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân

bản được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu suất tạo phôi in vitro ở lợn nói

chung, lợn bản địa nói riêng còn thấp

Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo

phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro” Mục tiêu:

Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản là giống lợn bản địa đượcđánh giá có ưu việt về số lượng bản sao PERV thấp với các mục tiêu:

1 Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản

2 Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản

3 Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao bằng côngnghệ TTON và NBVT

Dựa trên các nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ởlợn Bản theo mùa

2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi

3 Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON thông quamôi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi

4 Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT

Tính mới của luận án

1 Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môitrường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quảnlạnh phôi TTON tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thànhcông hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảotồn đa dạng sinh học

2 Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi

NBVT trên đối tượng lợn.

Hiện nay các giống lợn địa phương đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, sốlượng lợn bản địa thuần đã bị giảm đi nghiêm trọng và có nguy cơ mất giống do sựlai tạp giao thoa với các giống lợn khác và nguy cơ gia tăng nhanh tỷ lệ đồng huyết

do tự phối giống trong cùng bầy đàn Hơn nữa phương thức chăn nuôi lạc hậu, khôngkiểm soát được những đe dọa về dịch bệnh, đã góp phần làm giảm số lượng cá thểcác giống lợn này

Việc xây dựng thành công hệ thống nuôi trứng và tạo phôi trên giống lợn bảnđịa tại Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ nhiệm vụ bảo tồn đa dạng sinh học, nâng caohiệu quả chăn nuôi và khai thác giá trị nguồn gen các giống lợn này phục vụ cácnghiên cứu y-sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển

phôi in vivo ở lợn

1.1.1 Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn

Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bàotrứng (giao tử cái-noãn bào) Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trongxoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu Buồng trứng ở các loàigia súc là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tửcung (buồng trứng phải và buồng trứng trái)

Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong

và miền vỏ bên ngoài Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền

vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp cáchormone progesterone và estrogen Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lậpphương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng Ngay bên dướibiểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết Phía dưới lớp này là nhu

mô chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3]

Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nangnguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1) Nangtrứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình pháttriển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi của chúng [3].Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang dichuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triểntiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho

sự rụng trứng Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, pháttriển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang Tế bào trứng tiếp tục phát triển chođến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng) Các hoạtđộng tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắcthể liên kết chặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời

sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4]

Nang phát triển

Trứng thứ cấp Mạch

vỡ

Thể vàng

Giải phóng trứng Thể vàng giai

đoạn sớm

Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5].

Ở lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến

sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phôi 24-26 ngày tuổi Sau khi sinh, mỗi cá thể

lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao quanh bởi

một lớp tế bào cận noãn [6] Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triển thành

nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạn nang

thành thục [7]; [8]

Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước

và sự thành thục của trứng (Hình 1.2) Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và

của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính Ở các giai đoạn tiếp sau, tế

bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa,

kích thước của trứng không đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9].Đường kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hoàn thành quátrình tăng trưởng trong các nang 1,8 mm Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu,đường kính trứng không màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10].

Trước rụng 8-10mm trứng rụng trứng

Hình 1.2 Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân [8].

Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục,

có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phânchia giảm nhiễm đặc trưng cho các loài động vật có vú [11]

Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành

thục về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh.

Noãn nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nangmỏng, dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai Số lượng noãn nguyên thủyđược tăng lên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các noãnbào được hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n

Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinh

dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn bàocấp I Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n Noãn sơ cấp của lợn bao gồmmột ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoàiđược bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng Noãn thứ cấp gồm một ovocyt

I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều noãn hoàng Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thànhmàng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh Ovocyt I có đường kính khoảng 120-150

µm [12]

Giai đoạn hình thành trứng khi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm phân

liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n Ở

7lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) cókhối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàng của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kíchthước bé (cực cầu thứ nhất) Ở lần phân bào II, noãn bào cấp II phân chia hình thành

tế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phânchia thành hai cực cầu bé

Giai đoạn thành thục trứng xảy ra sau khi các quá trình phân chia giảm phân kết

Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chất làhai quá trình thành thục cần phải cùng được hoàn thành trước khi rụng trứng Thôngthường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thành thục

về nhân) và trứng đang ở giai đoạn M.II Mặc dù tế bào trứng đã thành thục về

nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưađược hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lên

sự phát triển của phôi [14]

Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn

in vitro Trứng được thu từ các nang có kích thước ≥ 3 mm có khả năng phát triển

đến giai đoạn thành thục hoàn toàn trong điều kiện nuôi in vitro, trong khi trứng được

thu từ nang có kích thước từ 0,8 mm đến 2,9 mm có tỷ lệ thành thục thấp sau khinuôi cấy 48 giờ và trứng thu từ các nang có kích thước < 0,7 mm không có khả nănghoàn thành quá trình phân chia giảm nhiễm [15], [16]

Quá trình giảm phân của tế bào trứng được diễn ra dưới tác động của cyclin Bp34cdc2 được coi là nhân tố kích thích thành thục (MPF) và mitogen-activatedprotein (MAP) kinase (một protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, đặc trưng chocác axit amin serine và threonine) Đây là hai nhân tố đặc biệt quan trọng kiểm soátquá trình giảm phân MPF là một thành phần quan trọng liên quan hoạt động củanhân tố ức chế quá trình nhân lên của tế bào (CFS) Mức độ hoạt động của MPF đượcđánh giá thông qua phép đo hoạt tính của histone H1 kinase ( một loại enzyme xúctác hoạt động của Histone H1-một trong năm họ protein histone chính là thành phầncủa chất nhiễm sắc trong các tế bào nhân chuẩn) Quá trình kích thích này gây ra mộtloạt các phản ứng và kết quả dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, nhiễm sắc thể đóng xoắn

và gắn vào các thoi vô sắc, trứng chuyển sang giai đoạn MII, sẵn sàng cho quá trìnhthụ tinh và tạo phôi Hoạt động của MPF đạt mức cao nhất khi trứng ở giai đoạn MII

và giảm xuống khi trứng được hoạt hóa [17]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về sự thành thục tế bào chất của trứngđộng vật nói chung và trứng lợn nói riêng, nhưng cho đến nay quá trình này vẫn chưađược hiểu biết đầy đủ Bên cạnh đó, quá trình này được mô tả ở những thay đổi siêu cấutrúc diễn ra trong tế bào trứng từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII Những thay đổi siêucấu trúc trong tế bào chất bao gồm sự phân bố lại các bào quan, sắp xếp lại các vi ống,

hệ phức hợp Golgi, các cơ quan bài tiết, quá trình vận chuyển mRNA đến tế bào chất[18] Sự liên kết giữa tế bào cận noãn và tế bào trứng là yếu tố quan trọng điều hòa cáchoạt động bên trong tế bào chất và qua đó ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào chất.Cysteine, cysteamine, glutamine, gonadotropins, yếu tố kích thích tăng trưởng biểu bì(EGF), β-mercaptoethanol hoặc dịch nang trứng là các nhân tố cải thiện

sự thành thục tế bào chất của trứng [19]

1.1.2 Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo

1.1.2.1 Các giai đoạn thụ tinh

Đến ngày trứng rụng, trứng thành thục sẽ rụng khỏi buồng trứng, di chuyển vàoống dẫn trứng Sau khi phối giống, tinh trùng bơi qua vùng chất nhầy của buồng tửcung, tiến về phía ống dẫn trứng, sự thụ tinh sẽ xảy ra ở vị trí 1/3 ống dẫn trứng.Tinh dịch lợn là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng được sản sinh từ tinh hoàn vàcác chất tiết của các tuyến sinh dục phụ như tuyến tinh nang, tuyến hành niệu đạo(cowper), tuyến tiền liệt và tuyến niệu đạo (urethra) Tinh dịch lợn chứa nhiều tinhthanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết Lượng tinh dịchtrung bình trong một lần xuất tinh ở lợn ngoại là 250 ml, dao động từ 50-400 ml,nồng độ tinh trùng dao động từ 100-300 triệu tinh trùng/ml tinh dịch [20]

Tinh trùng lợn gồm có ba phần chính: (1) Phần đầu: chứa các vật chất di truyền,

có hai phần cơ bản là nhân và acrosome (2) Phẩn cổ thân: Là phần rất ngắn, hơi colại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân Phần cổ thân chứa nhiều loại enzym oxyhóa khử giúp cho các phản ứng trao đổi chất của tinh trùng; (3) Phần đuôi: Có chứcnăng giúp tinh trùng vận động [21]

Cũng như các loài khác, quá trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóatinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyênqua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng đượckích hoạt và phản ứng vỏ của noãn xảy ra

Quá trình hoạt hóa tinh xảy ra khi tinh trùng di chuyển trong buồng tử cung đểtiếp cận vòi trứng Tử cung tiết các albumin liên kết với lipoproteins, proteolytic,glycosidasic enzymes hỗ trợ hoạt động hoạt hóa của tinh trùng Ở lợn, giai đoạn pháttriển nang ảnh hưởng quan trọng đến kết quả hoạt hóa tinh Phần lớn tinh không đượchoạt hóa trong vòi trứng vào thời điểm nang đang ở giai đoạn tiền rụng trứng [22].Sau khi hoạt hóa, tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phảnứng acrosome Vùng trong suốt được cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein đồng phânZP1, ZP2, ZP3 pZP1 hoạt động như một thụ thể liên kết với tinh trùng thông qua hoạtđộng của 2 loại protein 55kd proacrosin và 44kd [23] Phản ứng thể đỉnh được đặc trưngbởi sự phân giải dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosome của tinh trùng

Quá trình này vừa hình thành những bọng của màng, mặt khác tạo ra những lỗ trống

để cho các chất chứa trong acrosome giải phóng ra ngoài Phản ứng thể đỉnh xảy rarất nhanh và phụ thuộc vào nồng độ Ca2+, ngoài ra bicarbonate cũng là một chất cầnthiết giúp phản ứng thể đỉnh của tinh trùng diễn ra thuận lợi [14]

Mỗi trứng thông thường được thụ tinh bởi 1 tinh trùng, các tinh trùng khác đóngvai trò hỗ trợ cho tinh trùng này lọt qua lớp tế bào nang bằng cách tiết enzymehyaluronidase làm tan rã màng Sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào trứng sẽnhanh chóng kích thích hàng loạt phản ứng sinh học, kích thích hoạt động của quátrình giảm phân và phản ứng vỏ trứng để ngăn chặn hiện tượng đa tinh trùng Trứng

sẽ tiết vào khoang quanh trứng một chất làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt, thiếtlập một rào cản ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng còn lại

Hình 1.4 Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng

ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng (a,b) Sự xâm nhập của nhiều tinh trùng được

quan sát với nhiều đầu và nhân (c,d) [24]

Hiện tượng đa tinh trùng là hiện tượng có nhiều hơn 1 tinh trùng xâm nhập vớimột tế bào trứng, là một hiện tượng thụ tinh bất thường ở động vật có vú Tỷ lệ đatinh trùng ở lợn đặc biệt cao hơn nhiều so với các loài khác Tỷ lệ đa tinh trùng ở lợn

trong thụ tinh in vivo có thể lên tới 30-40%, hậu quả của hiện tượng sự gia tăng tình

trạng phôi chết sớm [24]

1.1.2.2 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn

Khi tinh trùng lọt vào tế bào chất của trứng, trứng tiếp tục hoàn tất quá trình giảmphân để hình thành tiền nhân cái Tế bào chất của tinh trùng hòa lẫn với tế bào chất củatrứng, hình thành nhân của tinh trùng là tiền nhân đực Tiền nhân đực và tiền nhân cáitiến lại gần nhau, lượng ADN trong mỗi tiền nhân tăng lên gấp đôi và ngay sau đó

11màng của các tiền nhân tan rã, các thể nhiễm sắc xoắn lại, ngắn đi và dày lên và đượcphóng thích vào tế bào chất Thoi vô sắc xuất hiện, thể nhiễm sắc được sắp xếp trênthoi vô sắc Mỗi thể nhiễm sắc con tiến về một cực tế bào, rãnh phân chia sâu dần.

Ở lợn, đầu tinh trùng hòa vào tế bào chất của trứng khoảng 5 giờ sau thụ tinh,

giai đoạn anaphase II quan sát được ở khoảng 50% số trứng được thụ tinh Tiền nhần đực

và tiền nhân cái hình thành khoảng 8 giờ sau thụ tinh [25] Kết quả của Ka và cs

[26] cho thấy, ở các trứng có chứa lớp 2-5 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng có tỷ

lệ tiền nhân đực (male pronucleus: mPN) sau thụ tinh cao hơn so với trứng có rất ít hoặckhông có tế bào cận noãn

Trứng chưa thành thục Trứng thành thục Trứng thụ tinh

Phôi 2 tế bào Phôi dâu Phôi nang

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi lợn [27].

Khoảng 30 giờ sau thụ tinh trứng phân chia thành 2 tế bào, tiếp tục quá trìnhphân chia tiếp theo để tạo phôi 4-8 tế bào Phôi dâu hình thành vào ngày thứ 3-4 sauthụ tinh, các tế bào tiếp tục phân chia và các các tế bào kết hợp lại với nhau thànhmột khối chặt chẽ Phôi tiếp tục phân chia và tạo thành phôi nang, màng phôi căngphồng, khối tế bào nội phôi thoát ra ngoài màng trong suốt và bắt đầu làm tổ trong tửcung (hình 1.5)

Sự phân chia tế bào của phôi xảy ra trong suốt quá trình hợp tử di chuyển từ vòitrứng đến tử cung (hình 1.6; hình1.7), các tế bào nang vây quanh trứng bị thoái hóa dầndần, màng trong suốt vẫn tồn tại cho đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang sau đó biến

mất ở giai đoạn phôi nang muộn.

Giai đoạn phôi nang được tính vào khoảng ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, khi phôidâu lọt vào khoang tử cung và nằm trong vùng chất dịch nội mạc tử cung Chất dịchthấm qua màng trong suốt vào khoảng gian bào của đại phôi bào để nuôi phôi, cáckhoảng gian bào hợp lại và khoang này lớn dần lên và được gọi là khoàng phôi dướimầm (vì mầm phôi được tạo ra nằm phía trên nó) Màng trong suốt biến mất, khối tếbào trung tâm của phôi dâu và các đại phôi bào bị khoang phôi nang đẩy dần về mộtcực của phôi và lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cực phôi [28] Số tế bào củaphôi ở giai đoạn này dao động từ 42 tế bào đối với phôi loại B và 63 tế bào đối vớiphôi loại A Phôi làm tổ vào khoảng ngày thứ 15-20 sau thụ tinh [29]

Ngày 0-2 Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4 Ngày 5

Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8

Ngày 10

Hình 1.6 Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10 [30].

1.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn

Lợn nái sau khi cai sữa khoảng 4-6 ngày sẽ động dục trở lại Chu kỳ động dục ởlợn dao động từ 17-23 ngày, thời gian động dục thường kéo dài 3-4 ngày Kích thước

và cấu tạo nang biến động theo các giai đoạn tiền động dục, động dục, sau động dục

13Hoạt động buồng trứng và quá trình phát triển nang ở lợn có tính chu kỳ và gắnliền với các yếu tố môi trường và mùa vụ.

Các giống lợn khác nhau có tuổi động dục lần đầu khác nhau Các giống lợn nộinhư lợn Móng Cái động dục lần đầu ở 4-5 tháng tuổi, khối lượng lúc này đạt 30-40

kg, tuy nhiên ghép đực và thu trứng ở giai đoạn 6-8 tháng Các giống lợn lai ngoạivới nội có tuổi động dục lần đầu muộn hơn so với lợn nội thuần Lợn cái lai ngoại vớinội như F1 (Yorkshire x Móng Cái) và F1 (Landrace x Móng Cái) có tuổi động dụclần đầu lúc 6 tháng tuổi, khối lượng 70-75kg Các giống lợn ngoại có tuổi động dụclần đầu thường là 6-7 tháng, khối lượng 100-110 kg

Hoạt động buồng trứng được điều hành bởi trục thần kinh thể dịch tuyến đồithị-Tuyến yên-Buồng trứng (hypothalamo-pituitary-gonadal axis) Tuyến yên có vaitrò kiểm soát chức năng và hoạt động của buồng trứng thông qua sự điều tiết cáchocmon: LH và FSH Các hormone tuyến yên được vận chuyển qua máu để vàobuồng trứng (cơ quan đích) từ đó điều khiển hoạt động của buồng trứng, nang vàtrứng với các hoạt động của progesterone, oestrogen và inhibin LH có tác dụng kíchthích nang trứng phát triển, trưởng thành, thành thục và giải phóng trứng khỏi nang,

LH có tác dụng kích thích trứng rụng LH kết hợp với FSH giúp trứng phát triển,thành thục và giải phóng trứng, kích thích lớp tế bào cận noãn và lớp vỏ còn lại pháttriển thành thể vàng, kích thích thể vàng bài tiết estrogen và progesteron

Các yếu tố mùa vụ, nhiệt độ khí quyển là một trong những yếu tố có ảnh hưởngtrực tiếp đến hoạt động sinh sản của lợn Mùa vụ và các yếu tố thời tiết không thuậnlợi là một trong những nguyên nhân dẫn tới hiện tượng chậm thành thục tính, kéo dàithời gian từ khi cai sữa đến khi động dục, tỷ lệ con con sinh ra thấp, giảm số lứa đẻ,tăng tỷ lệ sẩy thai Sự giải phóng melatonin trong cơ thể lợn cái biến đổi theo mùa, từ

đó ảnh hưởng tới sự giải phóng gonadotropin của tuyến đồi thị, khả năng tiết LH,FSH của tuyến yên và chức năng buồng trứng, chu kỳ dộng dục, sự phát triển nangtrứng, chất lượng tế bào trứng [31]

Kết quả nghiên cứu của Miguel Mellado và cs về ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩmtới năng suất sinh sản của lợn nái hậu bị (nái lai giữa Yorkshire và Landrace) sau thụtinh nhân tạo cho thấy nhiệt độ môi trường cao làm giảm năng suất sinh sản của lợn náidẫn đến tỷ lệ mang thai vào mùa xuân và mùa hạ thấp hơn so với mùa thu và mùa

đông (90,0% vs 93,0%) [32].

Kyzeková và cs, 2019 kiểm tra kích thước buồng trứng lợn ngoại cho thấy kíchthước buồng trứng lớn nhất vào mùa thu với chiều dài trung bình đạt 25,8±3,4 mm,trong khi chiều dài trung bình của buồng trứng thu được vào mùa đông là 24,2±2,9

mm Khối lượng của buồng trứng thấp nhất vào mùa thu (trung bình 5,7±1,4 g) vàcao nhất vào mùa xuân (trung bình 6,2±2,2 g) Số lượng nang/buồng trứng của lợn hậu bịđạt lớn nhất vào mùa thu (trung bình 17,9±7,5) với số lượng nang có kích thước >3 mmchiếm ưu thế [33]

Mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tới

số lượng và chất lượng trứng đủ tiêu chuẩn đưa vào TTON Việc đánh giá ảnh hưởngcủa mùa đối với hoạt động của buồng trứng và khả năng cung cấp cũng như chấtlượng trứng đã được Kumar và cs tiến hành [34] Theo đó, trung bình số lượng nangtrứng/buồng trứng và trung bình số thể vàng/buồng trứng trong mùa đông cao hơn sovới mùa có gió mùa Số lượng tế bào trứng thu được từ các nang phát triển từ trứngthu vào mùa đông cao hơn đáng kể số với 2 mùa còn lại (mùa hạ và mùa gió mùa)(6,24±0,42 trứng so với 3,78±0,1 trứng)

Suzuki và cs, 2010 đã nghiên cứu ảnh hưởng của mùa (liên quan đến nhiệt độkhí quyển) đối với sự phát triển phôi trong ống nghiệm được tạo ra bằng phươngpháp tiêm tinh vào trứng thành thục (ICSI) Tỷ lệ hình thành phôi nang từ trứng thuvào mùa đông (48%) lớn hơn so với các mùa: xuân, hạ và thu (24%, 21% và 19%)cho thấy khả năng phát triển tế bào trứng của lợn bị ảnh hưởng bởi mùa Tốc độ hìnhthành phôi nang cũng có sự tương quan nghịch với nhiệt độ [35]

Sốc nhiệt làm giảm đáng kể chất lượng trứng với các biểu hiện như giảm quátrình phát triển của tế bào cận noãn, quá trình giảm phân diễn ra chậm hơn, giảm tỷ lệtrứng sống, tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực thấp, giảm biểu hiện của các gen mã hóaADN ty thể và tăng phản ứng oxy hóa ở ty thể Nghiên cứu của Yin và cs cho thấy bềmặt màng trong suốt của tế bào trứng có chứa các kênh vận chuyển TZP (transzonalprojection) giúp vận chuyển các chất chuyển hóa, trao đổi tương tác giữa trứng và tếnào cận noãn trong quốt quá trình phát triển của trứng Hiện tượng sốc nhiệt lànguyên nhân ức chế hoạt động tổng hợp các sợi actin (F-actin) dẫn đến sự gián đoạnkênh vận chuyển giữa trứng và tế bào cận noãn [36]

15Hiện tượng suy giảm khả năng sinh sản ở lợn nái vào các tháng cuối mùa hạ và đầu mùa thu được gọi là hiện tượng vô sinh theo mùa, thể hiện ngay cả trong trường hợp chăn nuôi công nghiệp Theo Bertoldo và cs, khả năng hình thành phôi nang vào mùa đông lớn hơn so với mùa hạ (54,94±6,11% so với 21,09±5,59%) Trong mùa đông, các trứng thu được từ các nang có kích thước lớn có tỷ lệ phát triển đến giai đoạn phôi cao hơn đáng kể so với các tế bào trứng được thu từ các nang nhỏ

(54,94±6,11% so với 23,17±6,02%) Số lượng tế bào/phôi nang ở các phôi phát triển

từ các trứng thu ở các nang có kích thước nhỏ đạt thấp nhất trong mùa hạ

(24,25±1,48) và đạt cao nhất ở các phôi phát triển từ trứng của các nang lớn thu trongmùa đông (37,51±1,3, P<0,05) [37]

Như vậy, lợn là loài động vật đa thai sinh sản quanh năm, trong một chu kỳđộng dục ở lợn, nhiều nang trứng cùng phát triển, thành thục và rụng trứng Mặc dùviệc khai thác trứng lợn có thể thực hiện trong suốt cả năm, các yếu tố mùa vụ có ảnh

hưởng đáng kể lên hiệu quả sản xuất phôi lợn in vitro.

1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro

Khác với công nghệ sản xuất phôi trong ống nghiệm đã được nghiên cứu thànhcông và ứng dụng phổ biến trên các loài gia súc và động vật nuôi như thỏ, dê, cừu và

bò, từ những năm 80-90 của thế kỷ 20, việc sản xuất phôi lợn trong ống nghiệm chỉbắt đầu đạt được những kết quả khả quan vào đầu thế kỷ 21 [38], [39]

Hiện tại, các tiến bộ khoa học về công nghệ sinh sản hiện đại đã cho phép chủ

động tạo nguồn trứng lợn bằng các phương pháp nuôi thành thục in vitro và sử dụng

chúng để sản xuất phôi với các hình thức phôi trinh sản (Parthenogenetic embryo[40] phôi TTON [41] và phôi NBVT do cấy nhân cùng loài hay khác loài [42]

1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng

và điều kiện nuôi thành thục

Trứng và chất lượng trứng thành thục là nguồn nguyên liệu cần thiết và yếu tố

quyết định quan trọng lên kết quả của tất cả các phương pháp tạo phôi in vitro Để

chủ động nguồn nguyên liệu trứng phục vụ sản xuất phôi lợn trong ống nghiệm, côngnghệ nuôi thành thục trứng thu từ lò mổ đã được triển khai phổ biến ở nhiều phòngthí nghiệm trên thế giới

Hầu hết các trứng thu từ lò mổ chưa thành thục, vì vậy trước khi thụ tinh, trứng

cần được nuôi thành thục in vitro.

Kết quả thí nghiệm nuôi thành thục trứng thu từ các nang có kích thước khácnhau cho thấy chất lượng và trạng thái nang có ảnh hưởng đáng kể tới sự thành thụccủa trứng Kết quả nghiên cứu của Petters và Well, 1993 [43] cho thấy hầu hết trứngthu từ các nang có đường kính <0,7 mm đều chưa hoàn thành quá trình giảm phân và

không thể thành thục in vitro; mặc dù tế bào trứng từ các nang có đường kính từ 0,8

mm đến 1,6 mm có khả năng thành thục in vitro, nhưng không phải tất cả các trứng

thu từ các nang trứng có đường kính >1,7 mm hoặc >3mm có thể phát triển đến giai

đoạn metaphase II sau 48 giờ nuôi in vitro.

Tế bào trứng lợn thành thục trong ống nghiệm trong điều kiện cơ bản thường bịthiếu một số yếu tố mà hiện nay vẫn chưa được xác định, dẫn tới tỷ lệ phát triển củaphôi thành con con sau cấy chuyển phôi rất thấp Bổ sung dịch nang trứng hoặc tếbào cận noãn (cumulus cell) vào môi trường nuôi thành thục có thể được khắc phụcmột phần các hạn chế này

Môi trường nuôi trứng lợn thành thục có nhiều loại khác nhau, có thành phần đơngiản hoặc phức tạp, tuy nhiên thông thường sẽ bao gồm môi trường nền (môi trườngHank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS)hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin, cácnhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP) [4]

Trong đó môi trường TCM-199 và môi trường NCSU-23 được sử dụng rộng rãitrong các nghiên cứu nhằm tăng khả năng thành thục hoàn toàn của trứng phục vụ

TTON và NBVT Kết quả nghiên cứu đánh giá sự thành thục của trứng lợn in vitro

trong hai loại môi trường TCM-199 và NCSU-23 và bổ sung 10% dịch nang trứng(pFF) hoặc 0,1% PVA cho thấy tỷ lệ thành thục ở các lô thí nghiệm tương ứng là:TCM+PVA (54,5%-61/112); TCM+pFF (65,0%-63/97); NCSU-23+PVA (54,6%-65/119) và NCSU-23+pFF (58,1%-61/105) Như vậy tỷ lệ thành thục của trứng trongmôi trường TM 199 TCM+pFF đạt cao nhất là 65,0% [44]

Liu và cs, 2011 cũng thông báo kết quả tương tự khi so sánh chất lượng trứng

thành thục in vitro trong các môi trường TCM-199 và NCSU-23 có bổ sung dịch nang

17trứng (pFF) hoặc huyết thanh thai bò (FBS) với tỷ lệ 10% cũng cho kết quả tươngtự.Tỷ lệ trứng thành thục sau 42 giờ nuôi trong môi trường TCM-199, TCM-199+FBS, TCM-199+pFF, NCSU-23, NCSU-23+FBS, NCSU-23+pFF tương ứng là:54,2%, 68,5%, 69,3%, 51,6%, 63,2% và 65,5% [45].

PyoosII và cs đã so sánh tỷ lệ thành thục và tỷ lệ xuất hiện thể cực của trứng lợnsau khi nuôi trong ống nghiệm với các loại môi trường NCSU-23, NCSU-37 và môitrường TCM-199 có bổ xung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF/TCM-199) Kết quảcho biết tỷ lệ trứng thành thục và tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực trong môi trườngNCSU-37 đạt 85,9% và 81,9%-cao hơn so với hai môi trường còn lại [46]

Yuka và cs cho biết, tỷ lệ trứng thành thục và tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực trongmôi trường TCM-199 và môi trường NCSU-23 không có sự khác biệt về mặt thống

kê với các tỷ lệ tương ứng là: 77,1% và 72,5% so với 77,1% và 72,7% [47]

Ngoài ra, một số tác giả sử dụng môi trường cơ bản nuôi trứng (Porcine oocytemedium: POM) làm nền cho môi trường nuôi thành thục Theo Yoshioka và cs, 2002

bổ sung 3 mg/mL polyvinyl alcohol (PVA),50 μmol/L β-mercaptoethanol (β-ME), 10mol/L β-mercaptoethanol (β-ME), 10IU/mL chorionic gonadotropin từ huyết thanh thai ngựa (pregnant mare serum: eCG),

10 IU/mL chorionic gonadotropin human (hCG) và 1.0 mmol/L dibutyryl cyclicadenosine monophosphate sodium salt (dbcAMP) cho kết quả trứng đạt được tỷ lệthành thục cao hơn so với môi trường nuôi cơ bản

Hiện tại, hệ thống TTON tại các nước phát triển thường cho kết quả 85-90%trứng thành thục sau khi nuôi từ 44-46 giờ ở điều kiện 39OC, 5% CO2, 5% O2, 90%N2, độ ẩm bão hòa [48] [49]

Kết hợp hài hòa sự thành thục tế bào chất và thành thục nhân của trứng trong quá

trình nuôi in vitro là yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh và sự phát

triển phôi Do trứng lợn thu từ các nang khác nhau có quá trình thành thục nhân và tếbào chất không đồng nhất, sự khác biệt đáng kể về nồng độ steroid, lượng tế bàogranulosa và nồng độ LH trong dịch nang trứng có thể ảnh hưởng đáng kể lên thời gian

cần thiết để trứng phát triển đến giai đoạn metaphase II [50] So với trứng thành thục in

vivo, trứng thành thục in vitro thường có tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỷ lệ phân chia

thấp hơn,sự phát triển của tiền nhân thường không đồng pha và tốc độ phát triển phôi

chậm hơn [51] Điều này chứng tỏ các điều kiện nuôi thành thục in vitro có thể

chưa đáp ứng đầy đủ các yếu tố cần thiết để bảo đảm chất lượng trứng khi tham giaquá trình TTON Việc bổ xung các yếu tố kích thích tổng hợp vào môi trường nuôitrứng trong 24 giờ đầu được xem là giải pháp có ảnh hưởng quan trọng đối với quá

trình tạo phôi in vitro.

Bổ sung 1 mmol/L dibutyryl cAMP (dbcAMP)-một hoạt chất cAMP có khảnăng thấm qua màng có tác dụng ức chế tạm thời sự phân chia giảm phân của trứng

là một phát hiện có giá trị đột phá đối với quá trình nuôi thành thục trứng lợn Bổxung dbcAMP từ có tác dụng tăng cường sự thành thục đồng bộ của nhân và tế bàochất, dẫn tới tăng tỷ lệ hình thành phôi nang từ 9% lên 22% [51] Bổ xung các yếu tốkiểm soát mức độ phản ứng oxy hóa trong tế bào (reactive oxygen species -ROS) nhưglutathione (GSH), các hợp chất cysteine, cysteamine, glutamine, b-mercaptoethanol,dịch nang trứng, LH, EGF, pFF cũng góp phần hỗ trợ sự thành thục tế bào chất củatrứng lợn [52]

Trạng thái tế bào cận noãn cũng có ảnh hưởng đối với sự thành thục tế bào chất Tếbào cận noãn bao quanh trứng có nguồn gốc từ các tế bào granulosa và đóng một vai tròquan trọng tới quá trình thành thục của trứng Ở động vật có vú, tế bào trứng của cácnang thứ cấp được bao quanh bởi một lớp các tế bào cận noãn liên kết chặt chẽ với nhau,tạo thành phức hợp tế bào trứng-tế bào cận noãn (Cumulus-Oocyte Complexes-COC).Vào giai đoạn chuẩn bị rụng trứng, các tế bào cận noãn trở lên bông tơi, nới rộng khoảngcách và hợp thành lớp màng nhầy bao bọc xung quanh trứng (Hình 1.7) [53] Cấu trúcnày cho phép tăng cường quá trình trao đổi các phân tử nhỏ (chất dinh dưỡng, cáchormone ), các tín hiệu paracrine giữa trứng và các tế bào nang

Bing và cs, 2002 [54] và Maedomari và cs, 2007 [55] cho biết tỷ lệ trứng thànhthục ở trứng có lớp tế bào cận noãn từ 2 lớp trở lên cao hơn nhiều so với trứng có íthơn 2 lớp tế bào cận noãn

Long và cs đã tiến hành nghiên cứu tác động tương hỗ giữa yếu tố kích thích quầnthể bạch cầu hạt-đại thực bào (granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF) và dịch nang trứng (pFF) nhằm mục đích cải thiện hiệu quả thành thục trong ốngnghiệm Kết quả cho thấy GM-CSF giúp cải thiện sự giãn cách và bông tơi của lớp tếbào cận noãn, kích thích sự trao đổi các hạt cortical và ty thể, là các bào quan có vai

19trò quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của tế bào và chu kỳ tế bào như quá trình sản xuất năng lượng, các quá trình tăng sinh, biệt hóa, truyền thông tin và quá trình apoptosis [56].

Sự phát triển của nang

Tổ hợp trứng và tế bào hạt Nang nguyên thủy

Hình 1.7 Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục

của trứng động vật có vú [53]

Như vậy, đã có nhiều nghiên cứu nhằm hoàn thiện hệ thống nuôi trứng, nângcao tỷ lệ trứng thành thục đồng bộ, chủ động nguồn nguyên liệu có chất lượng choTTON và NBVT Tuy nhiên, hiện nay chất lượng trứng trong ống nghiệm vẫn cònthấp hơn so với trứng thành thục tự nhiên trong cơ thể, nghiên cứu tạo được môitrường nuôi trứng có các điều kiện về lý hóa giống như môi trường sinh lý trong cơ

thể vẫn là những vấn đề mở đối với công nghệ tạo phôi in vitro trên lợn.

1.2.2 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi

phối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác độngmôi trường nuôi thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi và phương

20pháp bảo quản phôi.

1.2.2.1 Bảo quản và hoạt hóa tinh

Bảo quản tinh trùng là một giải pháp hữu ích để lưu giữ lâu dài những vật liệu

di truyền có giá trị, có thể khai thác sau khi giải đông để tạo ra phôi thông qua kĩthuật TTON Nghiên cứu bảo quản tinh trùng lợn đã được tiến hành trong khoảng 30năm nhằm mục đích tổ chức các ngân hàng tinh đông lạnh để phát triển các chươngtrình nhân giống và cải tạo di truyền theo phương thức chăn nuôi công nghiệp [57].Chất lượng tinh trùng sau bảo quản có ảnh hưởng quan trọng lên tỷ lệ thụ tinh

và sự phát triển phôi [58]

Thông thường có hai hình thức bảo quản tinh trùng lợn: bảo quản ngắn hạn ởnhiệt độ thấp trong khoảng 24 giờ tới một vài ngày và bảo quản dài hạn ở dạng đônglạnh trong ống rạ hoặc dạng tinh viên

Kết quả bảo quản lạnh tinh lợn ở nhiệt độ -79 °C đã được Polge công bố vàonăm 1952 [59] Các nghiên cứu đông lạnh sâu tinh trùng lợn theo hướng cải tiến hệthống đông lạnh tinh bò đã được các tác giả khác theo đuổi trong suốt giai đoạn1950-1960 với kết quả hạn chế, tinh trùng có thể vận động sau giải đông nhưngkhông có khả năng thụ thai

Thành công đầu tiên trong việc sử dụng tinh đông lạnh để thụ tinh đã đượcPolge và cs thông báo vào năm 1970, tuy vậy việc thụ tinh vẫn phải thông qua canthiệp giải phẫu để bơm trực tiếp tinh vào vòi trứng [60]

Tinh lợn sau khi thu được tiến hành đông lạnh ở nhiệt độ thấp, sau đó được giảiđông và thụ tinh trực tiếp qua cổ tử cung với lợn cái đến giai đoạn đọng dục đã đượccác nhóm nghiên cứu khác báo cáo vào năm 1971 [60] [61] Kết quả phối giống bằngtinh đông lạnh cho thấy lợn nái được thụ thai và sinh con, con con sinh ra khỏe mạnh,mặc dù tỷ lệ thụ thai và số lượng con sinh ra còn thấp

Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTON được Nagai và cs thựchiện thành công lần đầu tiên vào năm 1988, tuy nhiên kết quả thụ tinh còn thấp [39].Rath D và cs, 1997 so sánh chất lượng phôi lợn khi sử dụng tinh tươi và tinh đônglạnh cho thấy tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ hình thành tiền nhân và tỷ lệ phôi ở giai đoạn 2-4 tế bàokhi sử dụng tinh đông lạnh vẫn thấp hơn nhiều so với tinh tươi (16% so với 58,7%)

[62] Tiến bộ về TTON với tinh đông lạnh đạt tỷ lệ hơn 70-80% trứng được thụ tinh

và phân chia đã được các tác giả khác công bố [62] [63]

Nguồn tinh trùng sử dụng cho đông lạnh được khai thác chủ yếu bằng phươngpháp nhảy giá và sử dụng âm đạo giả Trên đối tượng lợn ngoại, lợn đực đến tuổitrưởng thành được huấn luyện riêng để khai thác tinh Trong các trường hợp đặc biệt,tinh trùng có thể được thu trực tiếp từ mào tinh hoàn Nghiên cứu của nhóm các tácgiả Nagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khảnăng khả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đônglạnh và sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục, tạo lợn con bằng cấy chuyển phôi ởgiai đoạn 2-4 tế bào [39], [64]

Quá trình thụ tinh tự nhiên diễn ra trong cơ thể con cái sau khi tinh trùng đượcxuất vào âm đạo và bơi ngược dòng đi vào tử cung Tử cung hỗ trợ quá trình hoạthóa, di chuyển của tinh trùng và quá trình thụ tinh giữa trứng và tinh bằng cách tiết rasterol-binding albumin, lipoproteins, heparin, các enzyme phân giải protein vàglycosidasic Đối với quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, tinh trùng được hoạt hóabằng cách ủ trong môi trường có các chất được chiết xuất từ mào tinh hoặc trong môitrường xác định có các thành phần tương tự như trong mào tinh Phản ứng hoạt hóatinh trùng, liên quan đến sự vận động và phản ứng acrosome của tinh trùng, quyết

định sự thành công của quá trình thụ tinh in vitro.

Dựa trên các nghiên cứu về hoạt động của tinh trùng trong điều kiện tự nhiên,các phương pháp rửa tinh, pha loãng tinh, lọc tinh và các chế độ thụ tinh thích hợp đãđược phát triển để kích hoạt quá trình hoạt hóa tinh trong ống nghiệm và hạn chế sựthụ tinh đa tinh trùng [63] [65]

pH có vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh Độ pH thích hợp cho TTON ởlợn là 7,4 Tuy nhiên, Brown và Cheng (1986) đã thử nghiệm và nhận thấy tỷ lệ tinhtrùng xâm nhập tế bào trứng đạt mức cao nhất (> 89%) đối với tinh trùng đã đượchoạt hóa ở 37oC trong môi trường pH 7,8 trước khi đưa vào thụ tinh ở môi trường có

pH 7,4 và nhiệt độ 39oC [66]

Albumin huyết thanh bò BSA fraction V, dịch nang trứng, caffein là các yếu tốđược bổ sung vào môi trường thụ tinh để hỗ trợ hoạt hóa tinh trùng Fukui và cs, 1983 đãkiểm tra nhiều yếu tố hoạt hóa tinh sau giải đông và nhận thấy dịch nang trứng lợn