Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene JAK2 v617f trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện trung ương thái nguyên​

LÊ HẠNH HUYÊNNGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG T

LÊ HẠNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

LÊ HẠNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hướng dẫn khoa học: 1 Ts Nguyễn Thế Tùng

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn làtrung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quảthu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi tríchdẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Hạnh Huyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thànhtới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học TháiNguyên Các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ,truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trongnhững năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ts Nguyễn Thế Tùng và cô giáo

Ts Nguyễn Thị Hải Yến, người thầy đã định hướng nghiên cứu và tận tìnhhướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thànhluận văn này

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quantâm giúp đỡ từ khoa Miễn dịch-Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ƯơngTháiNguyên, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động viên, khích lệ,tạo cho tôi động lực và niềm say mê trong nghiên cứu khoa học Tôi vô cùngbiết ơn tất cả những tình cảm tốt đẹp mà mọi người đã dành cho tôi

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019

Tác giả

Lê Hạnh Huyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 3

1.1.1 Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 3

1.1.2 Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 5

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 8

1.1.4 Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát 10

1.2 Tổng quan nghiên cứu về gene JAK2 V617F 12

1.2.1 Gene JAK2 12

1.2.2 Đột biến gene JAK2 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Vật liệu 16

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 17

2.4.2 Phân tích các đặc điểm cận lâm sàng 18

2.4.3 Xét nghiệm phát hiện đột biến gene JAK2 V617F 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 223.2 Các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu 233.4 Kết quả nghiên cứu về tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết

học của 2 nhóm có và không có đột biến JAK2 V617F 273.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số và Thực hiện phản ứng AS-PCR

kiểm tra đột biến JAK2 V617F từ mẫu máu các bệnh nhân 273.4.2 Tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và

không có đột biến JAK2 V617F 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

PHỤ LỤC 42

ECC Endogenous erythroid colony Cụm sinh hồng cầu

ET Essential Thrombocythemia Tăng tiểu cầu nguyên phát

JKA2 Janus kinase 2

LDH lactate dehydrogenase

MCV Mean corpuscular volume Thể tích trung bình hồng

cầuMPN myeloproliferative neoplasm Hội chứng tăng sinh tủyMPV Mean Platelet Volume Thể tích trung bình tiểu

cầu

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi

Polymerase

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố giới tính và độ tuổi của của đối tượng nghiên cứu 22Bảng 3.2 Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo giới (X ± SD) 23Bảng 3.3 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức số lượng tiểu cầu 23Bảng 3.4 Chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 24Bảng 3.5 Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các nhóm đối

tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 24Bảng 3.6 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở

máu ngoại vi 25Bảng 3.7 Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 25Bảng 3.8 Một số chỉ số hóa sinh của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 26Bảng 3.9 Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và nhóm không có đột biến (X ± SD) 29Bảng 3.10 Tần xuất 2 nhóm nghiên cứu nhóm có đột biến và không có đột

biến theo mức số lượng tiểu cầu 29Bảng 3.11 Các chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 30Bảng 3.12 Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các đối tượng

nghiên cứu theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 31Bảng 3.13 Tần xuất đối tượng nghiên cứu ở nhóm có đột biến và không có

đột biến theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi 31Bảng 3.14 Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tiểu cầu trong máu ngoại vi 3

Hình 1.2 Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F gây bệnh tăng sinh tủy 6

Hình 1.3 Tiêu bản máu dàn của bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát 9

Hình 1.4 Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gene JAK2 13

Hình 1.5 Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu 14

Hình 3.1 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm AS-PCR xác định đột biến gene JAK2 V617F từ các mẫu máu bệnh nhân 28

có nguyên nhân từ tế bào máu gốc vạn năng sản sinh quá mức một hoặc nhiềudòng tế bào, một số bệnh thuộc nhóm này chuyển thành bạch cầu cấp Cácbệnh đa hồng cầu nguyên phát, Tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy vô căn có thểchuyển dạng lẫn nhau [4], [5].

Bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, số lượng tiểu cầu thườngtăng từ 500 đến 1000 G/l Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầunguyên phát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơbiến chứng Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấuhiệu lâm sàng nào và hầu như những trường hợp mắc bệnh thường được pháthiện qua việc xét nghiệm công thức máu Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử

để loại trừ khả năng mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát

Ngày nay nhờ sự tiến bộ về sinh học phân tử và di truyền tế bào, bệnhtăng tiểu cầu tiên phát được biết đến có liên quan đến đột biến gene JAK2 tại

vị trí 617, Guanine (G) được thay bằng Thymine (T) và kết quả là Valine (V)được thay bằng Phenylalanine (P) Đột biến này làm xáo trộn dẫn truyền quatrục gene JAKSTAT, làm sản sinh quá mức các tế bào máu không kiểm soátđược Nhóm bệnh này có tiên lượng khá tốt, các phương pháp điều trị kinhđiển gồm các thuốc Hydroxyurea, Busulfan, Interferon, Bipobroman có thểkiểm soát được bệnh và kéo dài thời gian sống 10 -

20 năm Tuy nhiên, một số trường hợp chuyển sang bệnh lý ác tính như rốiloạn sinh tủy và tử vong, bệnh nhân cũng có thể tử vong do các biến chứnghuyết khối hoặc xuất huyết [12].

Tại Khoa miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện trung ương TháiNguyên đã xác định được đột biến gene JAK2 V617F, nguyên nhân gây bệnhtăng tiểu cầu tiên phát Tuy nhiên, chưa có thống kê cụ thể về số lượng bệnhnhân và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F phát hiện được trên nhóm bệnh này

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên” nhằm khảo sát các

đặc điểm về huyết học và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhântăng tiểu cầu nguyên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

Mục tiêu

Khảo sát các đặc điểm về cận lâm sàng và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F

trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên.

Nội dung nghiên cứu

1 Phân tích đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu

2 Phân tích các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu bao gồm chỉ

số về PLT trung bình, MPV của nam và nữ; Các chỉ số RBC, Hgb, MCV; WBC củanam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu

3 Phân tích các chỉ số hóa sinh như hàm lượng Albumin, Protein của nam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu

4 Phân tích đột biến gene JAK2 V617F của các bệnh nhân bằng phản ứng AS-PCR

5 Phân tích đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và không có đột biến geneJAK2 V617F bao gồm các chỉ số PLT, các chỉ số về dòng HC , tỉ lệ phần trăm HC lướingoại vi, WBC của nhóm đối tượng có đột biến và không có đột biến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

1.1.1 Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential Thrombocythemia - ET) là một bệnhnằm trong nhóm Hội chứng tăng sinh tủy được đặc trưng bởi sự tăng sinh tủytiên phát nghiêng về dòng mẫu tiểu cầu và có tăng số lượng tiểu cầu ở máungoại vi [1]

Đây là một bệnh lý tủy xương

không rõ nguyên nhân bao gồm các

rối loạn về máu, đặc biệt là tình trạng

huyết khối và chảy náu Rối loạn này

cũng có thể chuyển thành bệnh u Hình 1.1 Tiểu cầu trong máu ngoại vi

nguyên bào tủy, đặc biệt là suy tủy

Hội chứng tăng sinh tủy đã được chứng minh là có liên quan đến một

số gene như bcr-abl và JAK2 V617F Trong đó, bcr-abl là nguyên nhân gây

ra bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2 V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểucầu tiên phát và xơ tủy tiên phát Việc xác định các đột biến soma của geneJAK2 V617F được tìm thấy ở khoảng 90% bệnh nhân đã cải thiện đáng kểphương pháp chẩn đoán cho rối loạn này Cho đến nay, việc ngăn ngừa cácbiến cố về mạch máu là mục tiêu chính của điều trị và quản lý bệnh nhân mắcbệnh ET Ngoài ra, một số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu đượcdùng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến chứng mạch máu Các loạithuốc kích thích tế bào hiện đang được sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủyếu được sử dụng ở bệnh nhân lớn tuổi và interferon α được dùng chủ yếu ởbệnh nhân trẻ tuổi [1]

Về mặt lâm sàng, ở bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát, sốlượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l Trên thực tế, số lượng tiểucầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào và hầu như nhữngtrường hợp mắc bệnh thường được phát hiện qua việc xét nghiệm công thứcmáu Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả năng mắc bệnh tăngtiểu cầu thứ phát Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầu nguyênphát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơ biến chứng.Một phần nhỏ số lượng bệnh nhân có xuất hiện triệu chứng đau đỏ đầu chi.Đây là một loại biểu hiện của da, xuất hiện như một biến chứng ở bệnh nhân

ET Bệnh nhân có cảm giác bỏng rát, đau và đỏ ở các đầu ngón tay, ngónchân Khi kiểm tra tủy xương, có thể thấy xuất hiện các cụm mẫu tiểu cầu dàyđặc, trong khi dòng tủy và dòng hồng cầu đều ở mức bình thường, không có

sự gia tăng các tế bào Blast hoặc loạn sản Theo tiêu chuẩn của Hội nghiêncứu đa hồng cầu nguyên phát thì số lượng tiểu cầu phải trên 600 G/l là tiêu chíbắt buộc để chẩn đoán xác định bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát Từ năm

2001, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa thêm vào tiêu chuẩn chẩn đoánbao gồm sự tăng số lượng các mẫu tiểu cầu lớn, trưởng thành, đồng thời đưa

ra các tiêu chuẩn chẩn đoán loại trừ với các bệnh khác trong hội chứng tăngsinh tủy và lơ xê mi kinh dòng hạt Các nguyên nhân gẫy tăng tiểu cầu phảnứng như : thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật, nhiễm khuẩn, viêm, bệnh tự miễn,ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lympho cũng được loại trừ Tiêu chuẩn vềbiến đổi gene cũng được coi là một yếu tố quan trọng trong chẩn đoán

[Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.].

Một vấn đề được đặt ra đó là tuổi thọ trung bình của bệnh nhân cótrường hợp nào có thể sống thọ như một người bình thường hay không, thìviệc phát hiện ra những bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp của bệnh và cótiên lượng tốt sẽ có thời gian sống thêm gần với người bình thường cùng lứa

tuổi Ngoài ra, có một số trường hợp vẫn có tuổi thọ thấp chủ yếu là do tắcmạch, hoặc bị chuyển hoá thành lơ xê mi cấp.

1.1.2 Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

Các bệnh tăng sinh tủy được coi là rối loạn về dòng tế bào Rối loạn vềdòng tế bào xảy ra khi DNA của một tế bào gốc trong tủy xương có nhiềuthay đổi Các tế bào gốc tạo máu là loại tế bào máu non có khả năng phát triểnthành một trong ba dòng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu.Các thay đổi ở tế bào gốc (tế bào tạo máu) khiến cho tế bào này sinh sản liêntục, tạo ra các tế bào bất thường , từ đó chúng phát triển thành một hay nhiềuloại tế bào máu Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng hơn qua thời gian

do số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy ở tủy xương và máu ngoại vi

Trong hầu hết trường hợp, nguyên nhân khiến cho tế bào gốc bị biếnđổi không được tìm ra Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên thế giới đã chứngminh được mối liên quan giữa các bất thường về gene và bệnh tăng sinh tủy.Các đột biến có thể xảy ra do các yếu tố môi trường hoặc phát sinh trong quátrình phân chia tế bào

Theo số liệu báo cáo của Hội Leukiamia và Lymphoma Society, tỉ lệmắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát ở Hoa Kỳ trung bình từ 0.38 đến 1.7người trên 100.000 người mỗi năm Phụ nữ có nguy cơ mắc cao hơn namgiới Bệnh có thể gặp ở nhiều lứa tuổi, bao gồm phụ nữ ở độ tuổi sinh sản chotới trung niên

Hầu hết các trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát có liên quan đến mộthoặc nhiều đột biến gene mắc phải ở tế bào gốc tạo máu dẫn đến tình trạngsản xuất quá nhiều tế bào nhân khổng lồ, là tế bào tiền thân của tiểu cầu trongtủy xương Phần lớn các đột biến này không do di truyền mà phát sinh trongđời sống của bệnh nhân Có những trường hợp ít gặp hơn là do di truyền tronggia đình Khi được di truyền, bệnh này được gọi là “tăng tiểu cầu tiên phát cótính gia đình”

Đa số bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát có đột biến gene JAK2, MPL

hay CALR Theo ước tính, tần suất xảy ra đột biến gene JKA2 là 60%,

khoảng 10% bệnh nhân không có các đột biến gene trên Với những trường

hợp như vậy cần được thực hiện thêm các xét nghiệm khác để xác định gene

đột biến

Nhìn chung cơ chế bệnh sinh của tặng tiểu cầu tiên phát cũng liên quan với

các bệnh khác trong hội chứng tăng sinh tủy Trên thực tế, rất nhiều bệnh

nhân có thể chuyển từ dạng này sang

dạng khác trong hội chứng tăng sinh

tủy trong thời gian điều trị Từ năm

2005, trên thế giới đã biết đến vai trò

của gene JAK2 (Janus-associated Ip;

kinase 2) với điểm đột biến V617F

trong cơ chế bệnh sinh của hội

chứng tăng sinh tủy

Hình 1.2 Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F

Đột biến gene JAK2 V617F

gây bệnh tăng sinh tủy

gặp hầu hết ở bệnh đa hồng cầu thực,

khoảng 50% ở tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy Bình thường gene JAK2 có

vai trò trong sự phát triển dòng tủy bình thường do truyền các tín hiệu từ các

receptor của các Cytokin và các yếu tố phát triển như Interleukin 3 (IL- 3),

các yếu tố tạo máu như Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt và

mô nô (GM- CSF, G- CS.F) và Thrombopoetin (yếu tố kích thích tạo dòng

mẫu tiểu cầu) [Error! Reference source not found.], [Error! Reference

source not found.] Đột biến gene JAK2 V617F làm mất vai trò tự điều hòa

của JAK2 gây tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu Tuy nhiên tại sao từ

một đột biến có thể gây các bệnh tăng sinh tủy các dòng khác nhau thì vẫn

chưa rõ ràng

Hiện nay, có rất nhiều báo cáo đã được công bố góp phần chẩn đoánbệnh di truyền hoặc định hướng chữa bệnh trong lâm sàng, Từ những pháthiện về cấu trúc và chức năng sinh học của các thành phần cấu tạo nên DNA,nhân loại đã từng bước khám phá được nhiều vấn đề khác nhau, đặt nền tảngcho nhiều nghiên cứu khác Các acid deoxyribonucleic tạo nên gene, giúp duytrì các chức năng của tế bào dưới mức độ phân tử, cũng như quy định cấu trúc

di truyền sinh học của tế bào Cần phân biệt thường biến và biến dị di truyền,thường biến là các biến dị biểu hiện ra ở kiểu hình do tác động của điều kiệnmôi trường, nó thể hiện mức phản ứng của kiểu gene đối với điều kiện môitrường, thường biến không di truyền Biến dị di truyền là các biến đổi trongkiểu gene có thể được biểu hiện hoặc không ra kiểu hình, nguyên nhân có thể

do ngẫu nhiên hoặc do cơ chế tái tổ hợp trong hệ gene hoặc do tác nhân độtbiến lên ADN hay Nhiễm sắc thể như tác nhân hoá học, vật lý, sinh học Độtbiến gene là những biến đổi trong cấu trúc của gene, những biến đổi này cóthể xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử

ở tế bào sinh dục hoặc đột biến trong quá trình phát triển của tế bào sinh dưỡng, hay còn gọi là đột biến soma

Đột biến soma gây nên các biến đổi kiểu hình thể hiện ở mức độ môhoặc cơ quan trong thế hệ một cá thể chứ không di truyền cho thế hệ sau quagiao tử, thông thường những đột biến gene ít khi tạo ưu thế tiến hoá vì khảnăng phá vỡ tính ổn định của bộ gene sinh vật, thay vào đó đột biến thườngtrung tính hoặc có hại, đối với động vật và con người các đột biến somathường gây nên các hư hỏng ở mức độ tế bào, mô hoặc cơ quan nào đó ví dụnhư ung thư Qua giao tử đột biến soma được ứng dụng nhiều nhất trong ghépcành, chiết cành ở thực vật, đặc biệt là những cây ăn quả, để đạt giống tốt,chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khắc nghiệt khác Nếu đột biến gene trội

và được biểu hiện ra ngoài cơ thể thì được gọi là thể khảm

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

1.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi, thường là trên 50 tuổi Tuy nhiêncũng có trường hợp đặc biệt Triện chứng lâm sàng nổi bật của bệnh là tắcmạch hoặc xuất huyết Đối khi bệnh chỉ được phát hiện tình cờ qua kiểm tra

xét nghiệm tế bào máu ngoại vi [Error! Reference source not found.].

Tắc mạch có thể gặp ở hệ thống tĩnh mạch hoặc động mạch Bệnh nhâncũng có thể có các biểu hiện của tắc vi mạch như đau buốt, dị cảm, hoại tửđầu chi, loét cẳng chân, Một số bệnh nhân có thể có biến chứng tắc mạch ởnão, võng mạc mắt, cơ tim, tĩnh mạch chi, tĩnh mạch lách Bệnh nhân có thể

có các biểu hiện dị cảm kiểu rát buốt ở tay, chân và giảm dần nếu sử dụngaspirin

Biểu hiện xuất huyết có thể xuất hiện khi có bất thường về chức năngtiểu cầu, có thể có chảy máu cấp hoặc mạn tính Các tiểu cầu là những tế bàonhỏ lưu chuyển trong máu Chúng liên quan tới quá trình đông máu và sửachữa những mạch máu bị tổn thương Khi cơ thể bị tổn thương, các tiểu cầu bịphá hủy và lan ra khắp bề mặt vết thương làm máu ngừng chảy, các chất hóahọc được giải phóng từ các bao nhỏ, các chất hoá học góp phần tập trungthêm số lượng các tiểu cầu và các protein khác nếu vết thương quá rộng

Rối loạn chức năng tiểu cầu là sự bất thường trong hoạt động của tiểucầu hình thành các nút tiểu cầu không chính xác, gây nên xu hướng chảy máuhoặc thâm tím Khi các nút tiểu cầu không được hình thành một cách chínhxác, chảy máu sẽ vẫn tiếp tục và kéo dài lâu hơn thông thường

Khoảng 40% bệnh nhân có lách to, số khác có thể teo lách do nhồi máulách Lách to thường đi theo một số triệu chứng như: đau hay đầy bụng trênbên trái có thể lan lên vai trái, có cảm giác đầy bụng cả khi không ăn hoặc saukhi ăn chỉ một lượng nhỏ, điều này có thể xảy ra khi lá lách to ép vào dạ dày.Thiếu máu, dễ nhiễm trùng, chảy máu và thường hay mệt mỏi

Bệnh có thể tiến triển, chuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp Khimắc phải Leukemia cấp, bệnh nhân có thể có những triệu chứng như thiếumáu, xuất huyết thường do giảm số lượng tiểu cầu, hay gặp ở da - niêm mạc,nặng hơn có thể gặp xuất huyết nội tạng Dễ nhiễm trùng, thâm nhiễm Có thểgặp triệu chứng tắc mạch do tăng bạch cầu Người bệnh có sức khoẻ suygiảm, dễ mệt mỏi, suy sụp.

1.1.3.2 Triệu chứng cận lâm sàng

Đối với triệu chứng máu ngoại

vi bao gồm: Đôi khi có giảm hồng

cầu, bạch cầu có thể tăng vừa, chủ yếu

tăng bạch cầu hạt Số lượng tiểu cầu tăng,

thường tăng rất cao, có thể trên 1000 G/l

Có thể thấy các tiểu cầu khổng lồ trên tiêu

bản máu ngoại

vi Khi xét nghiệm tủy đồ thấy tủy đồ

giàu tế bào, tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu

với hình thái rối loạn

Hình 1.3 Tiêu bản máu dàn của bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát

Sinh thiết tủy xương thấy tăng sinh, rối loạn hình thái dòng mẫu tiểucầu Mẫu tiểu cầu đứng tập trung thành đám, có mẫu tiểu cầu lớn, bào tươngrộng và nhím nhiều thùy Có tăng sinh xơ

Về di truyền: Nhiễm sắc thể Phl âm tính Đa số các bệnh nhân không cóbất thường về nhiễm sắc thể Một số bệnh nhân có del (13) (q12ql4) có thểchuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp Khi thực hiện AS-PCR kết quảthường khoảng 50% bệnh nhân có đột biến gene JAK2 V617F

Xét nghiệm đông cầm máu: Có thể có thời gian máu chảy kéo dài tuy

nhiên ít gặp các trường hợp này, hoặc giảm ngưng tập tiểu cầu [Error! Reference source not found.].

1.1.4 Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát

* Chẩn đoán xác định được tiến hành theo tiêu chuẩn của WHO (2008):

Số lượng tiểu cầu máu ngoại vi: PLT ≥ 450 G/l; Sinh thiết tủy xương có tăng sinhmẫu tiểu cầu trưởng thành lớn, không có bằng chứng tăng tuổi đầu dòng của dònghạt và hồng cầu; Loại trừ được các bệnh đa hồng cầu, xơ tủy, Leukemia kinh dònghạt, rối loạn sinh tủy hoặc các bệnh tân sinh tủy khốc theo tiêu chuẩn của WHO; Cóđột biến gene JAK2 V617F hoặc không có bằng chứng về tăng tiểu cầu do phảnứng Chẩn đoán xác định khi có đủ cả 4 tiêu chuẩn trên

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh đa hồng cầu nguyên phát:

+ Tiêu chuẩn chính: HGB trên 185 g/1 đối với nam giới hoặc trên 165 g/

1 đối với nữ, hoặc tăng thể tích khối hồng cầu toàn thể trên 25% trị số bình thường

Có đột biến JAK2 V617F

+ Tiêu chuẩn phụ: Tăng sinh 3 dòng tế bào tủy; Nồng độ erythropoietinhuyết thanh giảm; Tạo cụm sinh hồng cầu EEC (endogenous erythroid colony);Chẩn đoán xác định đa hồng cầu khi có cả 2 tiêu chuẩn chính và 1 tiêu chuẩn phụhoặc tiêu chuẩn chính số l và 2 tiêu chuẩn phụ

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh Xơ tủy vô căn

+ Tiêu chuẩn chính: Tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu có bất thường hìnhthái đi kèm với xơ tủy sợi reticulin và/hoặc collagen; hoặc nếu không có xơ tủy vớicác sợi reticulin thì có bất thường mẫu tiểu cầu đi kèm với tăng mật độ tế bào tủy,tăng sinh dòng bạch cầu hạt và thường giảm dòng hồng cầu (giai đoạn tiền xơ tủycủa xơ tủy vô căn) Không đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán của WHO đối vớiLeukemia kinh dòng hạt, đa hồng cầu nguyên phát,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

tăng tiểu cầu tiên phát, rối loạn sinh tủy và các bệnh lý tân sinh tủy khác

[Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.] Có đột biến JAK2 V617F

hoặc không có bằng chứng về xơ tủy phản ứng

+ Tiêu chuẩn phụ: Tăng hồng cầu, bạch cầu; Tăng nồng độ LDH huyếtthanh; Thiếu máu, lách to Chẩn đoán xác định khi có cả 3 tiêu chuẩn chính và 2tiêu chuẩn phụ,

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh Leukemia kinh dòng hạt: Các triệuchứng lâm sàng (triệu chứng lách to điển hình, thiếu máu, gan to, biểu hiện tắcmạch v.v ); Xét nghiệm công thức máu ngoại vi có số lượng hạch cầu tăng cao vàgặp đủ các lứa tuổi của dòng bạch cầu hạt; Xét nghiệm tuỷ đồ cho thấy có sự tăngsinh dòng bạch cầu hạt biệt hoá; Xét nghiệm nhiễm sắc thể Ph1 và/hoặc biến đổigene abl/bcr dương tính

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh tăng tiểu cầu phản ứng

Các nguyên nhân như thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật , nhiễm khuẩn,viêm bệnh tự miễn, ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lymphocyte, có thể gâytăng sinh tiểu cầu do phản ứng

1.1.5 Điều trị tăng tiểu cầu tiên phát

Nguyên tắc điều trị: Giảm số lượng tiểu cầu bằng các hóa chất diệt tế bào

và gạn tách tiểu cầu (nếu số lượng quá cao); Chống và dự phòng tắc mạch [27]

Điều trị đặc hiệu: Chống và dự phòng tắc mạch: sử dụng aspirin liều

thấp, hoặc các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu khác như dipyridamol,ticlopidin, clopidogrl; Diệt tế bào: bằng hydroxyurea, pipobroman, anagrelid,interferon; Gạn tiểu cầu bằng máy tách tế bào: trong trường hợp số lượng tiểucầu trên 1000 G/1, có nguy cơ tắc mạch cao [29]

Điều trị hỗ trợ: bao gồm Nâng cao thể trạng; Tăng thải acid uric; Bồi

phụ nước và điện giải (nếu cần)

1.2 Tổng quan nghiên cứu về gene JAK2 V617F

1.2.1 Gene JAK2

Gene JAK2 nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 9 mang thông tin di

truyền tổng hợp protein nội bào JAK2 (Janus-associated tyrosine kinase).JAK2 là một tyrosine kinase tham gia truyền tin từ màng tế bào vào nhân chocác yếu tố tăng sinh gồm erythropoetin, GMCS-F, thrombopoetin ProteinJAK2 có 2 phần (domain), một domain hoạt tính “âm” có tính điều hòa làmcho hiệu ứng kích thích dừng lại, không tiếp tục Sau khi erythropoetin tácđộng vào EPO-R (vị trí tiếp nhận erythropoetin trên màng tế bào) thì lập tứcdomain “dương” của JAK2 sẽ phosphoryl hóa và qua STAT truyền tin vàonhân tế bào để kích hoạt hệ thống gene hoạt động giúp tế bào gốc tăng sinh,biệt hóa tạo ra hồng cầu, đồng thời phosphoryl hóa cả phần điều hòa củaJAK2 để làm dừng kích thích

Một ví dụ về vai trò của tyrosine kinase JAK2 trong việc truyền tín hiệubằng hormone tăng trưởng liên quan đến bệnh suy thận mãn tính ở trẻ em dẫnđến suy giảm tăng trưởng, suy thận không chỉ làm cho trẻ em kém phát triển

mà còn làm giảm sức khoẻ, chức năng của hệ bài tiết, gây ra suy giảm sứckhoẻ trầm trọng ở đa số trẻ em Tuy nhiên, cơ chế mà suy thận mãn tính gây

ra vẫn chưa được hiểu rõ Liệu pháp hormone tăng trưởng (GH) làm tăngchiều cao cơ thể ở trẻ sơ sinh, cho thấy GH thúc đẩy tăng trưởng cơ thể có thểgiúp hiểu rõ hơn về sự tăng trưởng của cơ thể khi mắc chứng suy thận mạntính và do đó các liệu pháp có hiệu quả hơn Qua các nghiên cứu, các kết luận

đã được đưa ra về những gì hiện được biết về cách GH hoạt động ở cấp độ tếbào GH liên kết với một thụ thể gắn màng và kích hoạt một tyrosine kinase tếbào chất gọi là Janus kinase (JAK2) JAK2 được kích hoạt lần lượtphosphorylates tyrosine trong chính nó và thụ thể GH liên kết, tạo thành các

vị trí gắn kết ái lực cao cho một loạt các phân tử tín hiệu

Hình 1.4 Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gene JAK2 1.2.2 Đột biến gene JAK2

Khi JAK2 bị đột biến ở phần mang thông tin cho domain điều hòa tạiexon 14, đó là đột biến thay thế base nitơ thứ 1849 từ guanin (G) thànhthymin (T) gọi là JAK2G1849T, sẽ làm thay đổi acid amin thứ 617 củadomain điều hòa từ valin thành phenylalanin, gọi là đột biến V617F Đột biến

đó làm cho domain này không dừng kích thích được, vì vậy, ADN nhân tế bào

bị hoạt hóa liên tục do đó quá trình tăng sinh hồng cầu không dừng lại, hậuquả là quá dư thừa hồng cầu trong máu Người ta thấy, khoảng 95% bệnhnhân đa hồng cầu đột biến JAK2 V617F Vì vậy, xác định đột biến JAK2 có ýnghĩa trong chẩn đoán đa hồng cầu thật Đây là một trong các bệnh thuộc hộichứng tăng sinh tủy, là bệnh ác tính Xét nghiệm JAK2 giúp phân biệt với đahồng cầu di truyền do đột biến gene mang thông tin tổng hợp Epor-R Người

ta thấy trong đa hồng cầu thật, nhiều trường hợp đột biến dạng đồng hợp tử vàtheo Hoffbrand; Pettit thì bệnh càng tiến triển tỉ lệ đồng hợp tử JAK2 V617Fcàng tăng

Hình 1.5 Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu

Đột biến gene JAK2 ở exon 12: Mặc dù hầu hết đột biến JAK2 là ởV617F, nhưng cũng có những trường hợp đột biến JAK2 ở exon 12, tại cáccodon từ 537 đến 544 Người ta cũng đã xác định hàng chục đột biến liênquan tới thay thế nucleotide, mất nucleotide ở đoạn DNA này Đột biến geneJAK2 ở exon 12 cũng có thể gây bệnh đa hồng cầu hay bệnh khác thuộc hộichứng tăng sinh tủy mạn tính, ác tính Do vậy, khi nghi ngờ chẩn đoán đahồng cầu mà xét nghiệm âm tính với JAK2 V617F cũng cần xét nghiệm tìmđột biến tại exon 12 của gene này

Đột biến JAK2 V617F cũng được phát hiện ở bệnh nhân tăng tiểu cầutiên phát, xơ tủy tiên phát; đồng thời có những bệnh nhân đa hồng cầu điểnhình nhưng không có đột biến JAK2, vì vậy người ta cho rằng đột biến geneJAK2 một mình chưa đủ gây bệnh và như vậy phát hiện JAK2 V617F có ýnghĩa lớn trong chẩn đoán bệnh đa hồng cầu nhưng cũng cần phân biệt vớicác bệnh khác thuộc hội chứng tăng sinh tủy

Hạch tủy (MPNs) là khối u ác tính, vô tính được đặc trưng bởi sự sảnxuất quá mức của một hoặc nhiều dòng tủy khác nhau Năm 1951, Dameshek

đã nhận ra mối quan hệ giữa bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính, bệnh đahồng cầu (PV), tăng tiểu cầu nguyên phát (ET) và bệnh tủy nguyên phát(PMF) Cơ sở phân tử cho MPNs phổ biến nhất vẫn chưa được biết đến chođến năm 2005, khi 4 nhóm nghiên cứu sử dụng các phương thức khác

nhau đều xác định được một đột biến soma duy nhất, V617F, trong miềnpseudokinase của Janus kinase-2 (JAK2) , một tyrosine kinase tế bào chất.JAK2 V617F đã được tìm thấy là nguyên nhân dẫn đến MPNs trong một sốthí nghiệm ở chuột.

Việc xác định đột biến JAK2 V617F (exon 14) đã kích thích các nỗ lựcnghiên cứu về JAK trong các bệnh về huyết học và đã dẫn đến một bức tranhkhá hoàn chỉnh về sự thay đổi di truyền ở MPNs Những đột biến bổ sung nàyđiều khiển tiến trình bệnh và cũng có thể xảy ra như đột biến chính, nhưng giờđây đã có những chứng minh rằng MPN có thể được bắt đầu từ một tế bàogốc tạo máu JAK2 V617F Vai trò quan trọng của Janus kinase-2 (JAK2)trong điều hòa tủy đã được công nhận cách đây hai thập kỷ Những phát hiệnnày đã cách mạng hóa việc chẩn đoán MPNs và dẫn đến sự phát triển củaphương pháp trị liệu JAK2 mới cho nền y học

Đột biến JAK cũng đã xuất hiện trong các bệnh về huyết học khác vàphần lớn các đột biến gây bệnh ở JAK2 (cũng trong JAK1 và JAK3) Tuynhiên, các cơ chế phân tử mà các đột biến khác nhau trong miền pseudokinasedẫn đến hoạt động tyrosine kinase cấu thành và bệnh ở người vẫn còn khónắm bắt

Hiện nay, người ta đã sản xuất được một số thuốc ức chế enzymtyrosine kinase, tuy nhiên, đang ở giai đoạn thử nghiệm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Lấy 19 mẫu máu và dịch tủy xương của 19 bệnh nhân được chẩn đoántăng tiểu cầu tiên phát (theo tiêu chuẩn của WHO năm 2008) đến khám vàđiều trị tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên từ tháng 04 năm 2018 đếntháng 10 năm 2018

* Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân có số lượng : PLT > 450 x 109/L kéo

dài; Tủy đồ cho thấy sự tăng sinh chủ yếu dòng nguyên mẫu tiểu cầu megakaryoblast) với tăng số lượng MTC kích thước lớn, trưởng thành Không có sựtăng đáng kể hay chuyển trái của dòng bạch cầu hạt hoặc dòng hồng cầu

(MTC-2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

* Hóa chất:

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Nơi sản xuất Đóng gói

1 Kit tách chiết DNA

điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ;

Tủ an toàn sinh học ESCO Class II BSC, Singapore; Máy ly tâm tốc độ cao(hãng SMART LABASSIST, nước sản xuất: Đài Loan; Máy vortex ModelDLAB MX-S, nước sản xuất: Trung Quốc; Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl,

200 µl, 1000 µl hãng Eppendoff, nước sản xuất: Phần Lan; Đầu côn có mànglọc; Ống Eppendorf các loại vô trùng

2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04 năm 2018 đến tháng 10 năm 2018 Địa điểm nghiên cứu: Các khoa lâm sàng hệ nội, Khoa Huyết học lâm

sàng, Trung tâm Huyết học truyền máu, Khoa Miễn dịch - Di truyền phân tửBệnh viện Trung ương Thái Nguyên

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng các phương pháp thống kê y học sử dụng phần mềm SPSS 20.0

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu

(1) Thu thập các thông tin bệnh nhân: đặc điểm lâm sàng và các thôngtin liên quan của đối tượng nghiên cứu thông qua bệnh án nghiên cứu: Tuổi, giới,dân tộc; Các chỉ tiêu cận lâm sàng gồm kết quả xét nghiệm Tổng phân tích tế bàomáu ngoại vi, Huyết đồ, Tủy đồ, các xét nghiệm đông máu, sinh hóa máu: Bilirubin

TP, Bilirubin tự do, AST, ALT…

+ Mẫu máu: 4 ml máu tĩnh mạch vào 02 ống nghiệm có chống đôngbằng EDTA để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, xét nghiệmhuyết đồ và dùng phân tích đặc điểm gene JAK2 V617F

+ Mẫu dịch tủy xương: 2 ml dịch tủy xương vào ống nghiệm có chống đông bằng EDTA để làm xét nghiệm tủy đồ.

2.4.2 Phân tích các đặc điểm cận lâm sàng

Phân tích các chỉ số huyết học, so sánh với các chỉ số bình thường;Phân tích đặc điểm các dòng tế bào máu ngoại vi trên huyết đồ Đánh giá một

số yếu tố liên quan; Phân tích các thông tin tủy đồ So sánh, đánh giá với một

số yếu tố liên quan

Các kỹ thuật tổng phân tích tế bào máu, xét nghiệm huyết đồ, xétnghiệm tủy đồ được thực hiện theo quy trình xét nghiệm đang thực hiện tạiTrung tâm Huyết học - Truyền máu Bệnh Viện Trung Ương Thái Nguyên

2.4.3 Xét nghiệm phát hiện đột biến gene JAK2 V617F

Phát hiện đột biến JAK2 V617F bằng kỹ thuật Allen-specific PCR PCR) Nguyên lý của AS-PCR là sử dụng một đoạn primer có trình tự saikhác so với trình tự đặc hiệu một nucleotide ở đầu 3’ để ngăn cản quá trìnhkéo dài chuỗi DNA của enzym Taq-polymerase trong phản ứng PCR Trongphương pháp này, hai ống phản ứng PCR được thực hiện song song: ống phảnthứ nhất sử dụng cặp primer đặc hiệu cho allen bình thường, ống phản ứngthứ hai sử dụng cặp primer để nhân bản allen đột biến Phản ứng AS-PCRluôn có ít nhất một sản phẩm: nếu người bệnh dị hợp tử thì trong hai ống phảnứng PCR đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, nếu người bệnh đồng hợp tửmang gene bệnh thì chỉ có ống phản ứng 2 có băng đặc hiệu, còn người bệnhđồng hợp tử bình thường thì chỉ ống phản ứng 1 có băng sản phẩm đặc hiệu

(AS-Bước 1: Tách chiết DNA từ máu bệnh nhân:

1- Chuẩn bị ống 1,5 ml ghi mã bệnh nhân lên nắp và thành ống; Hútvào mỗi ống 200µl máu tổng số, bổ sung thêm 50µl ELUTION BUFFER(Nếu lấy 250µl máu không phải bổ sung thêm ELUTION BUFFER)

2- Thêm 25µl OB PROTEASE SOLUTION và 250µl BL BUFFER.Vortex mạnh trong 10 giây; Ủ 65°C, lắc 300rpm trong 10 phút

3- Thêm 260µl EtOH 96% đảo đều ngược xuôi ống trong 10 giây

4- Chuyển toàn bộ dịch lên các cột đã ghi mã bệnh nhân tương ứng ; Ly

tâm 13.000rpm/1 phút Chuyển cột sang ống Eppendorf 2ml mới ; Thêm

500µl HBC BUFFER

5- Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch qua cột

6 Thêm 700µl DNA WASHING BUFFER ; Ly tâm 13.000 rpm trong1

phút, Loại bỏ dịch qua cột (bước này làm 2 lần)

7- Ly tâm 13.000rpm trong1 phút, loại bỏ dịch qua cột Ly tâm tiếp

14.000 rpm trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch

8- Chuyển cột sang ống 1,5 ml mới đã ghi mã bệnh nhân tương ứng ;

Thêm 50µl ELUTION BUFFER Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút ( ủ trước