Nghiên cứu đa dạng di truyền loài dầu song nàng (diptercarpus dyeri pierre) ở rừng nhiệt đới đông nam bộ​

LỜI CAM ĐOANĐề tài nghiên cứu của tôi về “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng Dipterocarpus dyeri Pierre ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ” do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, ch

CAO THỊ VIỆT NGA

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI DẦU

SONG NÀNG (DIPTEROCARPUS DYERI PIERRE)

Ở RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài nghiên cứu của tôi về “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu

song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ” do

tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, chưa từng được công bố trong bất kì côngtrình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Người thực hiện

Cao Thị Việt Nga

LỜI CÁM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại Phòng Ph n loại Thực nghiệm

và Đa dạng ngu n gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam- Viện Hàn l m Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học L m nghiệp –Trường Đại học

l m nghiệp Việt Nam Qua đ y, tôi xin gửi lời cảm ơn ch n thành tới Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của

đề tài được tiến hành thuận lợi.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s u sắc tới TS NCVCC Nguyễn Minh Tâm và PGS-TS-GVCC Bùi Văn Thắng người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn Tôi xin ch n thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Ph n loại Thực nghiệm và Đa dạng ngu n gen của Bảo tàng và Viện Công nghiệp sinh học L m nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài, điều này khiến tôi thực sự cảm kích và biết ơn.

Trong suốt quá trình học tập và công tác, tôi đã nhận được sự động viên, quan t m và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại học L m nghiệp; bạn bè và các đ ng nghiệp, nơi tôi công tác.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người th n đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn.

Đề tài được hỗ trợ bởi Quỹ NAFOSTED, # 106.06-2017.14.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên

Cao Thị Việt Nga

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan c y họ Dầu (Dipterocarpaceace) 3

1.2 C y Dầu song nàng 5

1.3 Đánh giá đa dạng di truyền bằng sinh học ph n tử 6

1.3.1 Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể 6

1.3.2 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử 8

1.4 Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Dầu 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 19

2.2 Khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Các bước nghiên cứu 27

2.3.2 Khảo sát ngoài thực địa 28

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28

2.3.4 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài

Dầu song nàng 29

2.3.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 31

2.3.6 Phương pháp điện di 32

2.3.7 Phân tích số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR-SSR 35

3.2 Đánh giá hiệu quả chỉ thị marker SSR 37

3.3 Kết quả ph n tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng bằng chỉ thị phân tử SSR 38

3.2.1 Tần số allele trong quần thể 38

3.2.2 Đa dạng di truyền loài Dầu song nàng 42

3.2.3 Hệ số cận noãn 45

3.2.4 Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền quần thể 47

3.2.5 Mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể Dầu song nàng 48

3.2.6 Phân tích AMOVA 49

3.3.7 Mức độ khác nhau giữa các quần thể 49

3.4 Kết quả phân tích thụ phấn chéo ở mỗi cây trội và quần thể 50

3.5 Một số giải pháp bảo t n loài Dầu song nàng 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

12345

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Địa điểm thu thập mẫu cho ph n tích đa dạng di truyền 19

Bảng 2.2 Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10ml: 28

Bảng 2.3 Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10ml: 28

Bảng 2.4 Trình tự nucleotide các cặp m i SSR dùng trong nghiên cứu 30

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 31

Bảng 3.1 Số allele và các giá trị PIC, PD, Rp và MI cho 9 locus đa hình 38

Bảng 3.2 Tần số allele cho mỗi locus của 3 quần thể ở Đông Nam Bộ 41

Bảng 3.3 Đa dạng di truyền loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới 43

Bảng 3.4 Đa dạng di truyền của một số loài Dầu ở Việt Nam 47

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (dưới) vàhệ số tương đ ng di truyền (trên) theo công thức Nei (1978) 48

Bảng 3.6 Phân tích AMOVA của loài Dầu song nàng ở Đông Nam Bộ 49

Bảng 3.7 Mức độ khác nhau (FST) giữa các quần thể Dầu song nàng 50

Bảng 3.8 Thông số sinh sản của Dầu song nàng 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số từ vỏ cây một số mẫu Dầu song nàng

thu ở Đông Nam Bộ trên gel agarose 1% 35

Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% 36

Hình 3.3 Mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể Dầu song nàng 48

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó cókhoảng 20% số loài là đặc hữu Các nhà khoa học dự đoán Việt Nam cókhoảng 15.000 loài thực vật, trong đó trên 10.000 đã được nhận biết Tuynhiên, do nhiều nguyên nh n như chiến tranh kéo dài, khai thác lạm dụng, ducanh du cư, chuyển đổi mục đích sử dụng đất đã làm diện tích và chất lượngrừng của nước ta bị suy giảm Các hệ sinh thái rừng cũng bị suy thoái nghiêmtrọng Nhiều loài thực vật rừng quý hiếm đang bị khai thác, chặt hạ trái phépnên đang đứng trước nguy cơ bị đe doạ tuyệt chủng

Các loài cây họ Dầu là những loài c y rừng chiếm ưu thế và đóng mộtvai trò sinh thái và kinh tế quan trọng Hiện nay, có hơn 45 loài được biết đếnthuộc 6 chi ở Việt Nam, chủ yếu là bản địa và đặc hữu Bởi vì giá trị thươngmại và nhu cầu gỗ địa phương, các loài cây họ Dầu đang bị khai thác mạnh.Hơn nữa, trong nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế đã dẫn đến một sự giảmlớn trong khu vực rừng và tăng mức độ ph n mảnh rừng còn sống sót Những

xu hướng này có ảnh hưởng bất lợi đến môi trường sống của c y họ Dầu.Hiện nay, 33 loài c y họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ toàn cầu Loài c y Dầu

song nàng (Dipterocarpus dyeri) có th n thẳng, gỗ tốt được sử dụng nhiều

trong sơn kỹ nghệ hay đóng tàu Ngoài ra, chúng còn được sử dụng như mộtngu n tinh dầu có giá trị

C y Dầu song nàng ph n bố trong các khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp

Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trường sống và khai thác quá mức dẫn đếnloài câynày đã được liệt kê là bị đe dọa Theo sách đỏ Việt Nam năm 2007Dầu song nàng được xếp vào bậc VU A1c,d + 2c, d; vì vậy rất cần nhữngnghiên cứu bảo t n phát triển loài c y này Vì vậy đề tài này nghiên cứu tậptrung đánh giá hiện trạng quần thể, mức độ đa dạng di truyền của ba

quần thể Dầu song nàng tại rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ bằng kỹ thuật SSRgóp phần cho các nhà quản lý đƣa ra các giải pháp bảo t n, phục h i và pháttriển bền vững.

Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

- Mục tiêu đề tài:

Xác định đƣợc sự đa dạng di truyền và thụ phấn chéo của loài Dầu

song nàng (Dipterocarpus dyeri) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ.

- Nội dung nghiên cứu:

Ph n tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng trên cơ sở ph n tích 9 cặp m i Microsatellite (SSR)

Xác định các thông số thụ phấn chéo loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới Mã Đà (Đông Nam Bộ)

- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Kết quả nghiên cứu là dẫn liệu khoa học đa dạng di truyền loài Dầu song nàng phục vụ cho công tác bảo t n và phục h i loài hữu hiệu ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cây họ Dầu (Dipterocarpaceace)

Họ Dầu còn được gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học làDipterocarpaceae g m có 17 chi và khoảng 580 – 680 loài cây thân gỗ chủ yếu

ở các rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh Tên gọi khoa học

của họ xuất phát từ chi điển hình là Dipterocarpus, có ngu n gốc từ tiếng Hy Lạp (di là hai, pteron là cánh và karpos là quả, nghĩa là quả có hai cánh) Các chi lớn nhất là Shorea (196 – 360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (60 – 65 loài) Nhiều loài chiếm ưu thế trong các hệ sinh thái

rừng, thông thường có thể cây cao tới 40–70 m, đôi khi trên 80 m

(Dryobalanops, Hopea và Shorea) Họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m 3 phân

họ Monotoideae g m có 3 chi và 30 loài phân bố ở Châu Phi, đảo Madagascar

và vùng Amazon thuộc Colombia Pakaraimoideae g m có 1 loài duy nhất là

Pakaraimaea roraimae, ph n bố ở vùng cao nguyên Guiana (Nam Mỹ).

Dipterocarpoideae là ph n họ lớn nhất g m có 13 chi và 470 - 650 loài Khuvực ph n bố bao g m Seychelles, Sri Lanka, Ấn Độ, Đông Nam Á, NewGuinea, nhưng chủ yếu ở miền t y Malesia, tại đ y chúng tạo thành quần thểthống lĩnh trong các cánh rừng vùng đất thấp [1,2,18]

Ở Việt Nam theo danh lục các loài thực vật ở Việt Nam, họ Dầu(Dipterocarpaceae) g m 6 chi, 42 loài và 3 phân loài, trong đó: chi Vên vên

(Anisoptera) có 2 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có 11 loài và 2 phân loài; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 loài; chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài và 1 phân loài Theo Nguyễn

Hoàng Nghĩa (2005), Việt Nam có 42 loài và 1 phân loài thuộc họ Dầu

(Dipterocarpaceae), trong đó: chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài Hai loài

Vên vên trong danh lục thực vật Việt Nam gộp lại thành 1 loài là Vên vên

(A costata); chi Dầu (Dipterocarpus) có 12 loài, bổ sung loài Dầu cát (D condorensis) so với Danh lục thực vật Việt Nam; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 loài trong đó không nhắc đến loài Sao xanh (H helferi) như trong Danh lục

thực vật Việt Nam và bổ sung thêm một loài chưa định danh chính xác là Sao

đá (Hopea sp.); chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài và chi Táu (Vatica) có 8 loài với 1 phân loài Theo tác giả, các loài Sao đá (Hopea sp.), Dầu cát (D condorensis) được ghi nhận thực sự t n tại ở Việt Nam trong khi các loài khác là Sao xanh (H helferi), Kiền kiền nhẵn (A scaphula) không chắc chắn t n tại ở Việt Nam [1,2].

Về thực trạng của họ Dầu, có 23 loài được ghi nhận mức bị đe dọa theoIUCN (2001), trong đó 2 loài rất nguy cấp (CR) có 3 loài nguy cấp (EN) và

18 loài đang bị đe dọa (VU) Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), có

11 loài được xếp hạng đe dọa, trong đó có 1 loài rất nguy cấp (CR), 5 loài nguy cấp (EN) và 5 loài đang bị đe dọa (VU) [1,2,3]

Về sự phân bố, theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), các loài họ Dầu(Dipterocarpaceae) phân bố trong các sinh cảnh rừng khô cây họ Dầu, rừngmưa mùa thường xanh hoặc nửa rụng lá, rừng kín mưa mùa thường xanh ẩm[6]

Các loài họ Dầu (Diptercarpaceae) là những loài cây gỗ có giá trị kinh

tế cao bởi thân thẳng, gỗ tốt và chiếm lĩnh các sinh cảnh tốt Khoảng giữanhững năm 80 của thế kỷ trước, chúng chiếm đến 25% thị phần thương mại

gỗ cứng của thế giới, trong đó hơn 80% là Shorea Bên cạnh đó, nhựa và các

hợp chất của câu họ Dầu cũng có giá trị cao như resin, oleoresin, lac hoặcchiết xuất các chất béo có bơ từ quả [14]

Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), năm 1959 diện tích các loạirừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ là 1146 275 ha (chiếm 49% diện tíchtoàn vùng) Đến năm 1968 giảm xuống còn 834 050 ha (chiếm 36% diện tích

khu vực), năm 1982 giảm còn 416 900 ha (bằng 18% diện tích) và năm 1992chỉ còn 183 081 ha (8%) Rõ ràng là việc bảo t n các loài cây họ Dầu ở nước

ta đã trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết, nó góp phần vào việc bảo t n ngu n gencây rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nước ta

1.2 Cây Dầu song nàng

Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) là cây thuộc họ Dầu có

kích thước lớn nhất, phân bố ở các tỉnh phía Nam Gỗ cứng, khá nặng (tỷtrọng 0.8) có giác lõi phân biệt; lõi màu đỏ n u, được dùng để đóng tài hoặcchế tạo đ gỗ C y cũng cho loại nhựa như Dầu rái, dùng trong kỹ nghệ sơnhay đóng tàu Hiện nay, nơi cư trú của c y đang bị tàn phá và thu hẹp, cây bịkhai thác mạnh, có xu hướng bị tiêu diệt ở từng vùng lớn, được phân loại vàonhóm VU A1c,d + 2c,d Vì vậy, việc nghiên cứu và bảo t n ngu n gen của loàinày rất cần thiết [2]

Trong tự nhiên, hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm khi đất đủ ẩm nhờ cómưa lớn Nếu không gặp mưa, chúng sẽ mất sức nảy mầm nhanh chóng sau 1– 2 tuần kể từ khi rụng xuống đất Hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm trongbóng râm, không nảy mầm trên nền đất trống có nhiều ánh sáng và khô hạn.Ngoài ra, Dầu song nàng có khả năng sinh sản mạnh bằng ch i gốc, nhưngchỉ bắt gặp ở những gốc chặt có D0 < 20 cm, sinh sản tốt nhất trên những gốcchặt có đường kính từ 3 – 7 cm và chiều cao dưới 20 cm Gốc chặt có khảnăng sinh ch i nhiều lần Điều kiện đất ẩm mát dưới tán rừng có độ tàn che0,5 – 0,6 hoặc môi trường trong các lỗ trống là tối ưu cho tái sinh ch i củadầu song nàng Cây ch i thường hình thành dưới tán rừng sau khi khai tháchoặc dưới tán cây mẹ bị đổ gẫy do gió hay chết tự nhiên

Ngoài ra, theo Lê Văn Long (2016) nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũngnhư ưu hợp của Dầu song nàng trên 6 ô tiêu chuẩn, số loài cây gỗ bắt gặp trongnhững ưu hợp Dầu song nàng trên đất xám (43 loài) thấp hơn so với

ưu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ (49 loài) Những loài cây gỗ ưu thế và

đ ng ưu thế đối với ưu hợp Dầu song nàng trên đất xám và đất n u đỏ biếnđộng động từ 6 – 9 loài Mật độ của ưu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ(660 cây/ha) còn ở đất xám (616 cây/ha) Những ưu hợp Dầu song nàng cókhả năng tái sinh tự nhiên khá tốt dưới tán rừng, quá trình tái sinh diễn ra liêntục theo thời gian, phần lớn cây tái sinh có ngu n gốc hạt và có chất lượng tốt.Cây tái sinh Dầu song nàng phân bố trên mặt đất theo dạng phân bố cụm [16]

1.3 Đánh giá đa dạng di truyền bằng sinh học phân tử

1.3.1 Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể

Quần thể là tập hợp một nhóm cá thể của một loài, sống trong cùng mộtkhông gian nhất định, có khả năng sinh sản để tạo ra cơ thể mới hữu thụ.Quần thể là đơn vị tiến hóa của loài trong tự nhiên Các quần thể khác nhaucủa cùng một loài được đặc trưng bởi mật độ cá thể, kiểu ph n bố và đặc biệt

là kích thước của quần thể

Kích thước quần thể là số lượng cá thể của quần thể Trong đó, kíchthước tối thiểu là số lượng cá thể ít nhất mà quần thể cần có để duy trì và pháttriển, kích thước tối đa là giới hạn cuối cùng mà quần thể có thể đạt được để phùhợp với khả năng cung cấp ngu n sống của môi trường Kích thước của quần thểphụ thuộc vào mức sinh sản, mức tử vong và sự phát tán của cá thể trong quầnthể Trong tự nhiên, quần thể của các loài luôn có xu hướng tự điều chỉnh sốlượng cá thể để duy trì trạng thái ổn định và phù hợp với môi trường

Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá

vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể có kích thước nhỏ, cô lập.Nếu trạng thái này t n tại trong khoảng thời gian dài có thể ảnh hửng đến sựsinh trưởng và sinh sản của quần thể, cuối cùng làm suy giảm khả năng thíchnghi của quần thể với môi trường sống của chúng

Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống,

loài và quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng và tất cả sự tập hợp phứctạp của chúng thành các quần xã và hệ sinh thái Đa dạng sinh học là kết quảcủa quá trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao g m cả 3 mức độ

hệ sinh thái, loài và di truyền

Đa dạng di truyền thể hiện đa dạng về ngu n gen và genotype của mỗiloài Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài thích nghi được với nhữngbiến đổi bất lợi của môi trường sống và có khả năng tự phục h i trong môitrường sống của chúng Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như làmức độ đa hình di truyền của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó,hoặc được phản ánh bởi số alen của quần thể tại một địa điểm và thời gian cụthể hoặc số allele của một loài trong một phạm vi ph n bố địa lý và lịch sử t ntại của nó

Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài Ph

n cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận cáccảnh quan khác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự t n tại của loài.Như vậy, ph n cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống Tác nh n g y ra ph n cắt bao g

m mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, x ydựng khu d n cư và khai thác khoáng sản Ph n cắt đe doạ đến tính thống nhấtsinh thái đã được hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trongnhững nguyên nh n g y ra sự tuyệt chủng

Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể và ph

n bố lại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán của loài Hậuquả của quá trình ph n cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái vàcuối cùng mất nơi sống Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơisống còn lại dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môitrường sống của chúng bị thay đổi Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đadạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe

dọa tuyệt chủng.

Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mốiquan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể Ảnh hưởng này có thể làmmất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao vàcuối cùng giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trườngbiến đổi và tăng khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh.

1.3.2 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử

Bảo t n và quản lý của một loài đòi hỏi thông tin về sự đặc điểm sinhthái và đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể Để có được thông tin đó,đặc biệt là một sự hiểu biết tốt hơn về các quá trình di truyền, kỹ thuật sinhhọc được yêu cầu Tiềm năng tiến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khácnhau di truyền của nó Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp nhữngthông tin hữu ích để xây dựng chiến lược bảo t n và sử dụng loài một cáchbền vững Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm năng lớn cho quátrình trao đổi di truyền sẽ duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong quầnthể và loài [28],[29]

Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triểnmạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độphân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụngtrong nghiên cứu và bảo t n đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mớinhư tiến hóa phân tử, di truyền bảo t n Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩnthể và loài thực vật, ngoài kỹ thuật isozym, còn có kỹ thuật ADN với cácphương pháp như RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP,

Kỹ thuật RAPD

RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn

ADN được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh

và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Watson và Barker, 2004) Phương pháp này

sử dụng cùng một số m i ngẫu nhiên (m i ngẫu nhiên là các đoạn oligonucleotide g m khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng PCRnhằm nh n các đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫunghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được g m cácđoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen củacác mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nh n được các đoạnkhác biệt nhau [5,18,28].

*Ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công dokhông cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, thao tácđơn giản, chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gianthực hiện nhanh, khả năng nh n bản cao

Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp Trong nghiêncứu, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật caocấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị ph n tử có độ tincậy cao [4]

* Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ởmức độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nh n bản trong phản ứng PCR caonhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao

Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài

các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểmcủa các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhauphân biệt được bằng điện di đ , các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân

tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN Bản đ di truyền kết quả RFLP có tínhchính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấutrúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữacác mẫu nghiên cứu, xác định ngu n gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của cácloài sinh vật [5,18].

Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay Kỹ thuậtRFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theoqui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vậthoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật Kỹ thuật RFLPđược thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn DNA của mẫu nghiên cứusau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng 1 số loại enzyme giớihạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA

ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra sốlượng và kích thước các đoạn cắt ADN khác nhau, những bộ gen giống nhauthì sẽ cho ra số lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước vá sốlượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đ

Kỹ thuật SSR

Chỉ thị SSR (simple sequence repeat) hay còn gọi là vi vệ tinh

(Microsatellite), là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ

g m 1 – 6bp Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nh n chuẩn là khá phổbiến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng cácnucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và sốlượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiềuhơn Thông thường có các kiểu lặp lại:

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc củanhiễm sắc thể như vùng t m động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quantrọng trong việc điều hòa phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyênnhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong cácquá trình ph n bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quanđến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.

Phương pháp xác định đa hình SSR là nhờ sự nh n bội từ DNA tổng sốcủa hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn m i bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu củavùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nh nđoạn DNA nhờ phản ứng PCR Kích thước sản phẩm PCR được xác định mộtcách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sựkhác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đadạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền của c y tr ng, chọn lọc tínhkháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ đến năng suất, lập bản đ ,nghiên cứu locus tính trạng số lượng

Thuận lợi to lớn của ph n tích SSR là phương pháp này biểu hiện sốlượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng ph n biệt các cá thể khi có sự kếthợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trongcác thí nghiệm ph n tích mối quan hệ di truyền SSR là marker đ ng trội, do

đó, dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm tính

đ ng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phéptoán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khácnhư RAPD và AFLP Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm chonhững ph n tích phả hệ, sự lai giống, dòng gen trở nên dễ dàng hơn Hạn chếcủa chỉ thị này là quá trình thiết kế primer chi phí cao liên quan đến trình tự m

i chính xác cho loài quan t m không hề có sẵn

1.4 Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Dầu

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Để bảo t n và quản lý các loài cây Dầu, các thông tin về đặc điểm sinhthái và đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài là cần thiết, và đóngvai trò quan trọng góp phần đưa ra các giải pháp bảo t n một cách phù hợp.Nghiên cứu ảnh hưởng của khai thác chọn dẫn đến mật độ thấp trong tự nhiên

đã làm tăng khả năng thụ phấn cận noãn của nhiều loài cây Dầu như Shorea megistophylla ở Sri Lanka (Murawski et al., 1994), Drybalanops aromatica (Lee, 2000), Shorea curtisii và Dryobalanops aromatica (Wickneswari et al., 2004), Neobalanocarpus heimii (Naito et al., 2005; 2008), Shorea leprosula (Fukue et al., 2007) và S curtisii (Obayashi et al., 2002) ở rừng nhiệt đới Malaysia Số lượng quả của loài S siamensis được sản sinh ở nơi sống bị tác động mạnh thấp hơn ở nơi ít bị tác động (Ghazhoul et al., 1998) Kitamura et

al (1994) đã đề cập đến mức độ thụ phấn chéo là cao (82%) của loài Dryobalanops aromatica ở Brunei Năm 2006, Lee và cộng sự đã nghiên cứu

và phối hợp thống kê các thông số hệ thống trong rừng rậm nhiệt đới của loài

Shorea leprosula Miq (Dipterocarpaceae) từ rừng nhiệt đới thấp Malaysia Cung cấp các đặc điểm sinh học đặc trưng của loài Shorea leprosula Miq

(Dipterocarpaceae) tại rừng nhiệt đới Malaysia

Cui-Ping Cao và cộng sự năm 2009 đã nghiên cứu biến đổi di truyền

trong chín loài Shorea (Dipterocarpaceae) ở Indonesia bằng chỉ thị AFLP.

Công trình nghiên cứu 274 cây với 84 locus AFLP đa hình tại 2 địa điểm khácnhau Từ kết quả nghiên cứu độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt tần sốcao giữa cac loài và giữa các vùng trong các loài Thông tin trình tự của cácdấu hiệu này có khả năng sử dụng để phát triển các dấu hiệu phản ứng chuỗipolymerase cụ thể để xác định danh tính loài [37]

Yoshihiko Tsumura và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu cơ sở dữ liệu

phân tử để phân loại các loài Shorea (Dipterocarpaceae) và các kỹ thuật kiểm

tra danh tính hợp pháp của các loài gỗ Từ đó hình thành cơ sở dữ liệu DNA

lục lạp và hình thái giải phẫu để phân loại loài Shorea (Dipterocarpaceae) ở

trong cac khu rừng ở Đông Nam Á Tuy nhiên phương pháp ph n tích DNA từ

gỗ vẫn cần được nghiên cứu để hoàn thiện hơn đặc biệt đối với các mẫu gỗdán [38]

Sự phân cắt nơi sống ảnh hưởng đến khả năng thụ phấn của một số

loài cây Dầu đã được phân tích cho loài Vateriopsis seychellarum (Finger etal., 2012), Shorea javanica ở Sumatra (Rachmat et al., 2012) và Vateria indica ở Ấn Độ (Ismail et al., 2014).

Cùng năm 2016, Cheng choon Ang và cộng sự đã tiến hành đánh giá đa

dạng di truyền của 02 loài Shorea leprosula và Parashorea malaanonansau khi

khai thác và phục h i tại Borneo Các mẫu được lấy từ mô lá non và sử dụng cácMarker microsatellite Từ đó đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa các câygiống họ Dầu được sử dụng để làm giàu cho các khu rừng được khai thác chọnlọc ở Sabah, Malaysia và so sánh nó với sự đa dạng trong cây tái sinh tự

nhiên.Cây giống được tr ng của P malaanonan thể hiện mức độ đa dạng di truyền tương tự như c y con tái sinh tự nhiên trong khi những cây S leprosula

có sự đa dạng di truyền thấp hơn đáng kể so với cây con tự nhiên [39].

Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liênquan đến số lượng cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị suygiảm Hệ số thụ phấn cận noãn cao cũng là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng

di truyền Suy giảm (phân cắt nơi sống và số lượng cá thể thấp) có thể hạnchế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ

di truyền khác nhau giữa chúng [33]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Đinh Xu n Lý (1993) đã nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật tạo cây con

Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb) phục vụ tr ng rừng gỗ lớn, gỗ lạng ở các

tỉnh phía Nam Trong nghiên cứu này tác giả đã chỉ ra khả năng tái sinh trong

tự nhiên thấp cũng nhƣ các đặc tính sinh học của cây Dầu rái (hình thái, sinhlý); cũng nhƣ đƣa ra kết quả sự tái sinh của loài cây này trên các nguyên liệuruột bầu khác nhau [17]

Các công trình khác nghiên cứu về giá trị của các loài c y gỗ của TrầnHợp và Nguyễn Bội Quỳnh (1993) đề cập đến giá trị của các loài c y gỗ vàcác loài c y trong họ Dầu ở Việt Nam Trong nghiên cứu này, các tác giả mô tảđặc điểm hình thái các loài c y trong các chi thuộc họ Sao - Dầu, khu ph n bố

và công dụng của chúng, đ ng thời kết luận ở Việt Nam họ Dầu có sáu chi bao

g m: Chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có khoảng

12 loài; chi Sao (Hopea) có khoảng 9 loài; chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến (Shorea) có khoảng 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài [9].

Năm 2005, Nguyễn Thúy Hạnh và cộng sự nghiên cứu mẫu lá của 12

loài thuộc chi Dipterocarpus bao g m: D alatus Roxb.- Dầu rái, D baudii Korth - Dầu bao, D chartaceus Sym - Dầu cát, D costatus Gaertn - Dầu mít,

D dyeri Pierre - Dầu song nàng, D gandiflorus Blco - Dầu đọt tím, D intricatus Dyer- Dầu lông, D obtusifolius Teysm - Dầu trà beng, D tuberculatus Roxb.ssp grandifolius Craib - Dầu đ ng, D turbinatus Gaertn.- Dầu lá bóng, D hasseltii Bl - Dầu Haselt, D tonkinensis Chev.- Chò n u sử

dụng chỉ thị RAPD để ph n tích đa dạng di truyền Kết quả cho thấy xét về đa

hình các loài c y thuộc chi Dipterocarpus cho thấy: tất cảcác loài đều cho tỷ lệ

đa hình lớn hơn 64%, trong đó loài Dầu cát cho tỷ lệ băng đa hình cao nhất(83.33%), và loài Dầu đọt tím cho tỷ lệ băng đa hình thấp nhất (64,29%).Những số liệu nhận đƣợc chứng tỏcác loài c y nghiên cứu này rất khác nhau

về mặt di truyền Trên cơ sở các hệ số tương đ ng di truyền giữa 12 loàinghiên cứu cho thấy: hai loài Dầu đọt tím và Dầu rái có quan hệ di truyền xa

so với 10 loài còn lại và có hệ số tương đ ng di truyền tương ứng là 0,18 và0,21 10 loài còn lại này ph n thành hai nhóm: nhóm 1 g m 3 loài: Dầu mít,Dầu Haselt, Dầu song nàng có mức tương đ ng di truyền là 0,26 Nhóm 2

g m 7 loài: Dầu bao, Chò n u, Dầu cát, Dầu trà beng, Dầu lông, Dầu đ ng,Dầu lá bóng có mức tương đ ng di truyền là 0,27 Ngoài ra các loài trong hainhóm trên đều có mức độ tương đ ng di truyền rất khác nhau và ở mức độthấp, chỉ riêng hai loài Dầu trà beng và Dầu cát có mức độ tương đ ng ditruyền cao hơn cả, tuy nhiên vẫn ở mức thấp (0,41) Những kết quả trên chothấy 12 loài nghiên cứu có quan hệ di truyền rất xa nhau Điều này chứng tỏ

sự đa dạng di truyền cao của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus ở Việt Nam.

[12] Thành và cộng sự (2007) đã điều tra mức độ đa hình di truyền của 17loài Dầu ở Việt Nam bằng 7 chỉ thị RAPD và 4 cặp m i lục lạp (trnD-trnT,trnH-trnK, psbC-psbS và trnM-rbcL), và chỉ ra rằng hệ số đa dạng di truyềndao động từ 0,18 đến 0,58 Thành và cộng sự (2009) đã điều tra đa dạng di

truyền của loài Sao mạng (Hopea reticulata Tardicu) bằng chỉ thị RAPD và

một số gen lục lạp và chỉ ra mức độ đa dạng di truyền thấp [8]

Quách Thị Liên và cộng sự (2009) sử dụng 5 cặp mối cpSSR và 6 cặp

m i SSR để ph n tích đa dạng di truyền 30 mẫu lá của loài Dầu nước thuđược từ các xuất xứ khác nhau Kết quả thu được với 5 cặp m i cpSSR cho 7alen đa hình trong tổng số 10 alen nhận được Với 6 cặp m i SSR cho 9 alen

đa hình trên tổng số 12 alen Một số mẫu thu được ở khác khu vực có tính đadạng di truyền cao, một số mẫu cùng khu vực có tính đa dạng thấp [15]

Cùng năm 2010, Nguyễn Văn Hường đã nghiên cứu đặc tính sinh thái

của cây tái sinh Vên vên (Anisoptera cochinchinensis Pierre) trong kiểu rừng

thườngxanh và nửa rụng lá ẩm nhiệt đới ở Đ ng Nai Từ đó cho thấy độ

phong phú của tái sinh Vên vên ở 2 cấp tuổi đều phụ thuộc vào trạng tháirừng, độ ẩm đất và độ tàn che tán rừng Độ ẩm đất thích hợp cho cấp tuổi 1 từ61,8 - 82,3%, tối ưu là 73,0%; ở cấp tuổi 2 tương ứng là 62,8 - 83,9% và73,0% Độ tàn che tán rừng thích hợp cho cấp tuổi 1 là 0,65 – 0,85, tối ưu0,75; ở cấp tuổi 2 từ 0,63 - 0,88, tối ưu là 0,75 Độ phong phú của tái sinhVên vên thay đổi tùy thuộc vào sự thay đổi của 2 yếu tố độ ẩm đất và độ tànche tán rừng [13].

Nguyễn Hoàng Nghĩa (2012) đã điều tra sinh thái 4 loài cây họ Dầu là

Dầu cát (Dipterocarpus chartaceus), Sến cát (Shorea roxburghii), Chai lá cong (Shorea falcata) và Sao lá hình tim (Hopea cordata) trên vùng đất cát

ven biển Nghiên cứu này cung cấp các thông tin lâm sinh cần thiết cho côngtác bảo t n do 4 loài cây họ Dầu đang rất khó phục h i trên đất sau tàn phá này [19]

Nguyễn Thị Hải H ng và cộng sự (2010) Nghiên cứu nhân giống bằng

hom Dầu rái (Dipterocarpus alatus) Loài c y này được xác định khó ra rễ đối

với những hom thu hái từ cây mẹ trưởng thành Trong nghiên cứu này vớicông thức xử lý 2,4D n ng độ 500ppm và IAA 100ppm (38,33% - 48,33%);hom từ cây mẹ 1 năm tuổi cho tỷ lệ rễ rất cao 82,5% và giảm đi đáng kể đốivới cây mẹ từ 2 năm tuổi trở lên Thời điểm thu hái hom vào tháng 4 cho kếtquả ra rễ cao nhất đ ng thời chất lượng rễ có xu hướng tỷ lệ thuận với tỷ lệ ra

rễ [10]

Trần Hữu Biển và Phan Văn Huống (2011) nghiên cứu một số đặc điểm

sinh thái và gây tr ng loài Lò Bo ( Brownlowia tablaris Pierre), Xoan Mộc (Toona surenii (Blume) Merr) và Dầu cát( Dipterocarpus condorensisAshton) Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh thái của 3 loài cây từ đó cho thấy phân bố

lâm phần của chúng theo quy luật phân bố giảm, chứng tỏ rừng đang trong giaiđoạn sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra đánh giá rừng

tr ng cho thấy khả năng sinh trưởng kém và tỷ lệ sống thấp của cây tr ng bản địakhi chúng bị tách ra khỏi trạng thái tự nhiên (Xoan mộc, s u đục ngọn ) [3]

Năm 2012 Nguyễn Thị Hải H ng và cộng sự đã tiến hành đánh giá đa

dạng di truyền dựa trên 41 mẫu lá Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb.) thu

thập từ 10 tỉnh thuộc 3 vùng sinh thái l m nghiệp tại Việt Nam bằng chỉ thịRAPD với 18 m i ngẫu nhiên Kết quả cho thấy các mẫu Dầu rái có đa dạng ditruyền khá cao Hệ số tương đ ng dao động trong khoảng 43 - 100% [11]

Trần Quốc Hoàn và cộng sự (2013) nghiên cứu xác định chỉ số sinh

trưởng của c y Dầu rái (Dipterocarpus alatus) trên một số dạng lập địa ở tỉnh

Bình Phước Từ đó tính được chỉ số sinh trưởng chiều cao, đường kính của c

y Dầu rái trên các điều kiện lập địa; các mô hình (phương trình) h i quy nhiềulớp phản ánh mối liên hệ giữa chỉ số sinh trưởng của c y tr ng với các yếu tốlập địa [12]

Tô Bá Thanh và cộng sự (2014) nghiên cứu về chất lượng c y trong mô

hình rừng tr ng Sao đen (Hopea odorata) và Dầu rái (Dipterocarpus alatus)

tại khu bảo t n thiên nhiên văn hóa Đ ng Nai Kết quả nghiên cứu cho thấy:Phương pháp tr ng đã ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ sống, nhìn chung tỉ lệ sốngcủa loài Sao đen thấp hơn loài Dầu rái nhưng sai lệch không có giá trị trongthống kê; Tỷ lệ sống của những loài này có quan hệ chặt chẽ với tuổi c y,phương thức và quy cách tr ng khác nhau thì tỷ lệ c y có phẩm chất tốt vẫnluôn nhiều hơn đáng kể so với c y trung bình và c y xấu [22]

Tam và cộng sự (2014) và Duy và cộng sự (2013) đã đánh giá mức độ

đa dạng di truyền của loài Dầu rái (Dipterocarpus alatus) ở một số tỉnh Đông

Nam Bộ trên cơ sở sử dụng 9 cặp m i microsatellite và chỉ ra mức độ đa dạng

di truyền bị ảnh hưởng bởi quá trình ph n cắt nơi sống và mật độ cá thể trongmỗi quần thể Sự trao đổi di truyền giữa các quần thể cao (>1) thường xuấthiện giữa các quần thể có khoảng cách địa lý trong cùng một khu vực (tỉnh),

chẳng hạn giữa các quần thể ở vườn Quốc gia Cát Tiên, Mã Đà và rừng đặcdụng T n Phú thuộc tỉnh Đ ng Nai, có hệ số trao đổi di truyền lớn hơn 1; trongkhi đó giữa các quần thể ở Mã Đà (Đ ng Nai), Lò Gò-Xa Mát (Tây Ninh) và

Bù Gia Mập (Bình Phước), có hệ số trao đổi di truyền < 1 Kết quả nghiên

cứu về đa dạng di truyền giữa các quần thể của loài Sao đen (Hopea odorata) cũng cho kết quả tương tự (Trang et al., 2014) Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 11 loài Dầu thuộc chi Dầu (Dipterocarpus) sử dụng gen lục lạp

(matK) đã chỉ ra các loài trong cùng một chi có quan hệ mật thiết với nhau(Đức và cộng sự 2013) Trang và cộng sự (2014) cũng đã ph n tích đa dạng di

truyền của 3 loài dầu sao, Sao hòn gai (Hopea chinensis), Sao hải nam (H hainanensis) và Sao mặt quỷ (H mollissima) dùng 3 vùng gen rcbL, psbA- trnH và matK và chỉ ra sự khác biệt di truyền giữa 3 loài Sao là rất thấp, từ

0,2 đến 0,6 [6,34]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri

Pierre) ở ba khu rừng bảo t n thuộc rừng nhiệt đới núi thấp Đông Nam Bộ,Rừng Phòng hộ T n Phú (huyện Định Quán, tỉnh Đ ng Nai), Khu Bảo t nThiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai (huyện Vĩnh Cửu, Đ ng Nai) và VườnQuốc gia Lò Gò – Xa Mát (huyện T n Biên, tỉnh T y Ninh) rừng nhiệt đớiĐông Nam Bộ

Để ph n tích đa dạng di truyền loài D dyeri ở rừng nhiệt đới Đông Nam

Bộ, 73 mẫu vỏ th n của c y trưởng thành đã được thu thập Mẫu được thuthập ngẫu nhiên tại mỗi địa điểm nghiên cứu (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Địa điểm thu thập mẫu cho phân tích đa dạng di truyền

Địa điểm

Rừng Phòng hộ Tân Phú

Khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai (Mã Đà)

Vườn Quốc gia

Lò Gò – Xa Mát

Rừng phòng hộ Tân Phú

Công ty mía đường La Ngà, phía Nam giáp sông La Ngà (huyện Xu n Lộc),phía Đông giáp sông La Ngà (Tỉnh Bình Thuận) và phía T y giáp Công ty míađường La Ngà Về mặt địa hình, rừng phòng hộ T n Phú bao g m đ i núi thấpdưới 300 m, độ dốc không quá 10o Lượng mưa hằng năm khoảng 1500 mm,tập trung chủ yếu vào mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 11, nhiệt độ trung bìnhnăm 27,3oC với độ ẩm 78% Về thổ nhưỡng g m 5 loại đất chính như đấtbazan trên vùng đ i thấp, đất bazan trên đ i núi trung bình, đất phù sa cổ trên đ

i thấp đất phù sa cổ trên vùng bán bình nguyên và đất hình thành trên sa thạch,phiến thạch vùng đ i trung bình Thảm thực vật đặt trưng bởi rừng kín thườngxanh và nửa rụng lá ẩm nhiệt đới với các họ đặc trưng như họ Dầu(Dipterocarpaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), họCơm nguội (Myrtaceae), họ Côm (Elaeocarpaceae), họ Cà phê (Rubiaceae) và

họ Dẻ (Fagaceae) Rừng phòng hộ T n Phú g m có khoảng 200 loài thực vậtvới 45 họ (Tài liệu của Ban quản lý rừng phòng hộ T n Phú năm 2011) Cácloài c y họ Dầu (Dipterocarpaceae) thường ở tầng vượt tán bao g m Vên vên

(Anisoptera costata), Dầu rái (Dipterocarpus alatus), Dầu mít (D costatus), Sao đen (Hopea odorata), Sến mủ (Shorea roxburghii), Dầu lông (D intricatus), Dầu lá bóng (D turbinatus), Dầu song nàng (D dyeri), Táu trắng (Vatica odorata) Một số loài khác cũng có mặt ở khu vực này, như Chiêu liêu nước (Terminalia calamansanai), Sang đen (Diospyroslancaefolia), Côm đ ng nai (Elaecarpus tectorius) Rừng này thuộc rừng phục h i sau khai thác chọn

vào những năm 1980 và 1990

Tầng vượt tán: Là tầng hình thành bởi những c y gỗ cao trên 30 m, g m các loài c y thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) như Dầu rái (Dipterocarpus alatus), Dầu song nàng (D.dyeri), Dầu mít (D costatus), Vên vên (Anisoptera costata), Sến mủ (Shorearoxburghii), Sao đen (Hopea odorata), Táu trắng (Vatica odorata), một số loài khác như Huỳnh (Heritiera

cochinchinensis) họ Trôm (Sterculiaceae), Vấp (Mesua ferrea) họ Bứa (Clusiaceae), Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) họ Tử vi (Lythraceae), Cẩm lai (Dalbergia bariensis), Căm xe (Xylia xylocarpa) họ

Đậu (Fabaceae) Tầng này có những c y thường xanh nhưng cũng có những c

y rụng lá trong mùa khô, là tầng không liên tục

Tầng ưu thế sinh thái: Là tầng c y gỗ cao trung bình từ 20 - 30 m thân

thẳng, tán liên tục hoặc gián đoạn phụ thuộc vào mức độ khai thác, g m nhiều

c y của nhiều họ khác nhau, đa số là các c y thường xanh như Bông gạo

(Ceiba pentandra) họ Gạo (Bombaceae), Trám lá đỏ (Canarium subulatum),

Gỗ đỏ (Afzelia xylocarpa) họ Đậu (Fabaceae), Thành ngạnh (Cratoxylon formosum) họ Bứa (Clusiaceae), Mẫn kinh (Vitex quinata) họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), Chiêu liêu nghệ (Terminalia triptera) họ Bàng (Combretaceae), Côm đ ng nai (Elaeocarpus tectorius) họ Côm (Elaeocarpaceae), Kơ nia (Irvingia malayana) họ Kơ nia (Ixononthaceae), Bằng lăng (Lagerstroemia duppereana) họ Tử vi (Lythraceae), Mít nài (Artocarpus rigida) họ D u tằm (Moraceae), Vối rừng (Syzygium cumini), Trâm (Syzygium sp.) họ Cơm nguội (Myrtaceae), Sưa (Dalbergia cochinchinensis) họ Đậu (Fabaceae), Săng mã (Carallia brachata) họ Đước

(Rhizophoraceae) Tầng ưu thế sinh thái tuy không có c y gỗ to và cao nhưtầng vượt tán nhưng số lượng c y khá tập trung và có nhiều c y thuộc lớp kếcận cho tầng trên tham gia vào trữ lượng ổn định l u dài và liên tục của rừng

Tầng dưới tán: g m những c y mọc rải rác dưới tán rừng, có chiều cao

trên dưới 15 m, đường kính nhỏ hơn, tạo thành lớp tán không liên tục vàmỏng Tổ thành loài c y trong tầng này g m những loài thuộc các họ thực vật

có giá trị kinh tế thấp như: Lành ngạnh nam (Cratoxylon cochinchinensis), Bứa (Garciniacochinchinensis) họ Bứa (Clusiaceae), Máu chó Pierre (Knema pierrei), Máu chó kính (K lenta) họ Máu chó (Myristicaceae), Trường chua

(Pavieasia annamensis) họ B hòn (Sapindaceae), San (Aporusa tetrapleura), Giâu gia ta (Baccaurearamiflora), Sóc thon (Glochidion lanceolarium) Thầu dầu (Euphorbiaceae), Thị lá rộng (Diospyros latisepala) họ Thị (Ebenaceae),

Cò ke (Grewia paniculata) họ Đay (Tiliaceae), Xương cá (Canthium dicoccum) họ Cà phê (Rubiaceae), Săng ớt (Xanthophyllum excelsum) họ

Săng ớt (Xanthophyllaceae)

Tầng thảm cỏ cây bụi: g m những c y mọc rải rác thấp nhỏ, cao từ 2 - 8

m, thuộc các loài như Tà hay (Aidia cochinchinensis), Dành dành (Gardeniaannamensis), Găng trắng (Randia dasycarpa)họ Cà phê (Rubiaceae), Chòi mòi tía (Antidesma bunius), Chòi mòi (A ghaesembilla), Sòi tía (Sapium discolor) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), Bôm bà (Scolopia macrophylla) họ Mùng qu n (Flacourtiaceae), Bời lời đắng (Litsea umbrellata) họ Long não (Lauraceae), Củ rối (Leea rubra) họ Gối gạc (Leeaceae), Cọ tàu (Livistonia chinensis) họ Cau dừa (Arecaceae), B an (Colona auriculata) họ Đay (Tiliaceae) và đôi khi có Tre l ô (Schizostachyum zollongeri) họ Hòa thảo (Poaceae) mọc xen kẽ rải rác Thấp nhất g m những loài thực vật như cỏ tranh (Imperata cylindrical), cỏ may (Chrysopogon acticulatus) họ Hòa thảo (Poaceae), Sẹ (Alpinia globosa) họ Gừng (Zingiberaceae), Dương xỉ (Christella parasitica), cao không quá 2 m,

thường làm c y chỉ thị cho hoàn cảnh môi trường rừng Trong rừng còn cónhiều d y leo họ D y gối (Selastraceae) và Cơm nguội (Myrsinaceae) cùng vớimột số c y phụ sinh thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), họ Đỗ quyên(Ericcaceae) và Hymenophyllaceae

2.2 Khu Bảo tồn Thiên nhiên và Văn hóa Đồng Nai

Khu Bảo t n nằm trên địa bàn xã Mã Đà (huyện Vĩnh Cửu, Đ ng Nai),nằm ở vị trí 106o54’ đến 107o13’ kinh độ Đông và 11o03’ đến 11o30’ vĩ độBắc Đ y là khu rừng đặc dụng có diện tích tự nhiên lớn nhất nước ta, với hệ

sinh thái đặc trưng Đông Nam Bộ Khu rừng này được thiết lập năm 2003 vớidiện tích 53822 ha, trực thuộc Ủy ban nh n d n tỉnh Đ ng Nai Khu vực này có

3 di tích lịch sử như c n cứ Trung ương cục Đông Nam bộ, căn cứ Khu ủymiền Đông Nam bộ và địa đạo Suối Linh Về thảm thực vật khu rừng này

g m các kiểu rừng kín nửa rụng lá ẩm nhiệt đới, rừng kín rụng lá hơi ẩm nhiệtđới với các loài c y họ Dầu như Dầu nước, dầu mít, dầu song nàng, dầu lông,sao đen và một số loài khác như B hòn, họ Sim và kiểu rừng kín thường xanhmưa nhiệt đới

Cấu trúc phân tầng ở Khu Bảo tồn với đặc trưng là rừng c y họ Dầu

(Dipterocarpaceae) có diện tích lớn Các loài c y họ Dầu chiếm tỷ lệ cao hoặc

có ưu thế tuyệt đối trong tổ thành loài c y như Dầu song nàng, Dầu con rái,Sao đen, Chai, Vên vên thường mọc thành cụm hoặc không liên tục, chiếm

ưu thế ở tầng vượt tán, đôi khi mọc tập trung thuần loại thường được gọi là

“lán dầu”

Bên cạnh loài cây họ Dầu còn có nhiều loài cây gỗ mọc hỗn giao đa sốthuộc loài cây họ Đậu (Fabaceae) như Gõ đỏ, Gõ mật, Cẩm lai, Giánghương và các loài c y gỗ thuộc các họ khác như họ Xoài (Anacardiaceae),

họ Dâu tằm (Moraceae), họ B hòn (Sapindaceae), họ Tử vi (Lythraceae) tạo thành rừng nhiều tầng tán, độ đa dạng thực vật khá cao, cây phụ sinhphong phú, độ tàn che 0,7 là kiểu rừng có cảnh sắc đa dạng phức tạp, tiêu biểucủa kiểu rừng thường xanh ẩm nhiệt đới

Cấu trúc phức tạp nhiều tầng được phân biệt thành 5 tầng, trong đó có

3 tầng cây gỗ lớn, 1 tầng cây bụi thấp, 1 tầng thảm tươi

Tầng vượt tán: Là tầng hình thành bởi những cây gỗ cao trên 40 m,

g m các loài cây thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Dâu tằm (Moraceae),

họ Đậu (Fabaceae) Tầng này có những c y thường xanh nhưng cũng cónhững cây rụng lá trong mùa khô, là 1 tầng không liên tục

Tầng ưu thế sinh thái: Là tầng cây gỗ cao trung bình từ 20 - 30 m thânthẳng, tán liên tục g m nhiều cây của nhiều họ khác nhau, đa số là các cây

thường xanh như Tr m (Syzygium sp.), Trường (Pometia sp.), Re (Cinnamomum sp.), Kơ nia (Irvingia malayana), Cám (Parinarium annamensis), Bình linh (Vitex glabra), Gáo vàng (Sarcocephalus coadunata) Tầng ưu thế sinh thái tuy không có cây gỗ to và cao như tầng

vượt tán nhưng số lượng cây khá tập trung và có nhiều cây thuộc lớp kế cậncho tầng trên tham gia vào trữ lượng ổn định lâu dài và liên tục của rừng

Tầng dưới tán: g m những cây mọc rải rác dưới tán rừng, có chiều caotrên dưới 15 m, đường kính nhỏ hơn, tạo thành lớp tán không liên tục vàmỏng Tổ thành loài cây trong tầng này g m những loài thuộc các họ thực vật

có giá trị kinh tế thấp như: Bứa (Clusiaceae), Máu chó (Myristicaceae), Thầudầu (Euphorbiaceae), Thị (Ebenaceae)

Tầng cây bụi: g m những cây mọc rải rác thấp nhỏ, cao từ 2 - 8 m,thuộc các họ Cà phê (Rubiaceae), Trúc đào (Apocynaceae) và một số loài câythuộc họ Cau dừa (Arecaceae) như Cau rừng, Lá nón, Song m y và đôi khi

có Tre l ô (họ Hòa thảo-Poaceae) mọc xen rải rác

Tầng thảm tươi: là tầng cuối cùng thấp nhất, g m những loài thực vậtnhư cỏ Quyết, Sẹ, Sa nh n, Dương xỉ cao không quá 2m, thường làm câychỉ thị cho hoàn cảnh môi trường rừng

Trong rừng còn có nhiều dây leo thuộc họ Đậu (Fabaceae) họ Na

(Annonaceae) cùng với một số cây phụ sinh như Quyết tổ diều, Phong lan

Kiểu rừng này có một số ưu hợp chính như:

Ưu hợp Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri): trên vùng đất feralit

vàng và vàng đỏ, gần đ y còn thấy ở rừng Mã Đà, Hiếu Liêm và phía Bắcsông Đ ng Nai

Ưu hợp Dầu rái (Dipterocarpus alatus) trên nền đất phù sa cổ, trước

đ y có ở một số vùng, nhưng nay chỉ còn những đám nhỏ.

Ưu hợp Sao đen (Hopea odorata) Theo tài liệu điều tra thảm thực vật

cũng như đối chiếu tài liệu của Maurand (1943), ở Đ ng Nai có những ưu hợpSao đen tự nhiên mọc hầu như thuần loại trên đất feralit vàng đỏ nhưng naygần như không còn

Ưu hợp Vên vên (Anisoptera glabra) - Sao đen (Hopea odorata) - Sến

mủ (Shorea roxburghii) là ưu hợp khá phổ biến ở nhiều nơi trên một số loại

đất khác nhau ở Đ ng Nai

Vườn Quốc gia Lò Gò-Xa Mát (T n Biên, T y Ninh): Được thành lập

năm 2001 của Ủy ban nhân dân tỉnh Tây Ninh Về vị trí địa lý, phía Bắc giápvới biên giới Việt Nam – căm Pu Chia Đông giáp đường ranh giới Lâm nôngtrường Tân Lập, Tân Bình và phía Nam giáp với L m nông trường Hòa Hiệp

và Tây giáp với sông Vằm cỏ Đông Tạo độ địa lý là 105o57’ đến 106o04’kinh độ Đông và 11o02’ đến 11o47’ vĩ độ Bắc, độ cao trung bình 13 m so vớimặt biển và độ dốc dưới 5o Khu vực này có nhiều chỗ ngập nước vào mùamưa Vườn Quốc gia có diện tích khoảng 800 ha chủ yếu là rừng phục h i saukhai thác gỗ, có trữ lượng gỗ thấp Về cấu trúc thảm thực vật, rừng nhiềutầng Tầng tán g m các cây gỗ cao trên 25 m như các loài thuộc họ Dầu như

đ u nước, dầu mít, Sao đen, Sến mủ, vên vên và một số loài thuộc họ đậu nhưgiàng hương Nhìn chung, khu rừng Lò Gò- Xa Mát vừa có các kiểu rừng lárộng thường xanh, rừng nửa rụng lá, rừng khộp, vừa có trảng cỏ ngập nước theomùa Rừng nửa rụng lá và rừng rụng lá là những kiểu rừng đặc trưng trên đấtxám phù sa cổ khô vào mùa khô với ưu thể các loài cây họ Dầu Dầu rái ở

Lò Gò - Xa mát là rừng khô rụng lá ưu thế họ Dầu ở T y Ninh, đặc trưng nhất

ở Lò Gò-Xa Mát có đặc điểm chung là đất bằng phẳng, gợn sóng, dạng đất cáthay laterit, thoát nước, xói mòn, có 2 mùa mưa và mùa khô, mùa khô thườngxuyên có lửa rừng, cấu trúc tầng chỉ có 2 tầng: tầng cây gỗ và tầng cây bụi

Thành phần loài đa phần là loài rụng lá trong mùa khô Kiểu rừng này thườngxuất hiện trên nền đất xám điển hình thoát nước kém có khi mang nhiều sét,hạn chế sự xâm nhập của hệ thống rễ Về cấu trúc thảm thực vật thuộc kiểurừng này tương đối giống với hầu hết các nước chung quanh trong khu vực

do cùng ngu n gốc Cấu trúc tán rừng thường mở hay thưa với tầng cây bụirải rác và thảm cỏ nghèo về loài Cấu trúc phân tầng rừng như sau:

Tầng tán: Chiều cao các loài cây trong tầng cao nhất có thể đạt trung bình đến 20-25 m bao g m các loài như Kơ nia (Irvingia malayana), Trám Canarium sp., các loài da sung Ficus spp (Moraceae), Dầu Dipterocarpus

spp (Dipterocarpaceae) Trên tầng đất feralit nông và mỏng, Dầu trà beng

(Dipterocarpus obtusifolius) hình thành như một tầng tán thưa.

Tầng cây bụi: g m các loài cây thấp hơn bao g m các loài có chiều cao trung bình hay cây bụi như cơm nguội Ardisia sp (Myrsinaceae), Quả dẹt (Hymenocardia punctata)(Euphorbiaceae), Bằng lăng Lagerstroemia sp (Lythraceae), Memecylon sp (Melastomataceae), Bưởi bung (Acronychia pedunculata)(Rutaceae) và một số c y như nhỏ đùng đình Caryota sp., kè Livistona sp (Arecaceae) Dây leo trong khu vực này nhìn chung không đa

dạng, tầng cây bụi nhiều nơi vắng hay thưa thớt, các loài phụ sinh hiếm, gần

như không gặp và đa phần là các loài dương xỉ (Drynaria, Platycerium, Polypodium), họ Thiên lý (Asclepiadaceae: Dischidia, Hoya), rất ít đại diện của họ Lan (Orchidaceae) (nếu có thì là Dendrobium, Oberonia, Otochilus) Tầng thảm cỏ đa niên bao g m các loài thuộc họ Poaceae, Fabaceae, và Asteraceae, chúng có chiều cao trung bình 1-1,5m Trên đất ngập nước còn tìm thấy loài Pseudopogonantherum, mọc xen kẽ với Cỏ tranh (Imperata cylindrica), Heteropogon contortus, Themeda triandra và Alloteropsis semialata.

Gần như các loài c y gỗ trong kiểu rừng ở Lò Gò-Xa Mát là loài rụng

lá, quá trình rụng lá chủ yếu do thiếu nước trong mùa khô hơn là do quang

chu kỳ (photoperiod), tùy theo loài, quá trình rụng lá có khác nhau nếu loài

Shorea roxbughii rụng lá vào khoảng tháng 12 trong đầu mùa khô và sau đó lá

non sẽ hình thành vào tháng giêng sau đó Nhưng loài Dầu trà beng

(Dipterocarpus obtusifolius) lại thay lá dần dần trong suốt mùa khô và rất ít

khi bị trơ cành Trong khi các c y con loài này lại không rụng lá như các c y

bố mẹ Hoa Dầu trà beng xuất hiện tương đối sớm thường vào cuối mùa khô.Một đặc điểm khá phổ biến cho các loài họ Sao Dầu trong kiểu rừng này làlớp vỏ cây dày dễ bong ra và khả năng tái sinh bằng ch i do khả năng thíchứng với lửa rừng thường xuyên xảy ra tại kiểu rừng này

Một số loài họ Dầu thường gặp trong kiểu rừng này là: Dầu trà beng

(Dipterocarpus obtusifolius), Dầu rái (D alatus), Dầu mít (D costatus), Dầu lông (D intricatus), Sến mật (Shorea roxburghii), Cẩm liên (Shorea siamensis), và các loài cây gỗ phổ biến khác: Vừng (Careya arborea), Chiêu liêu xanh (Terminalia chebula), Chiêu liêu ổi (Terminalia corticosa) Trong đó

Dầu rái có thành phần không lớn, mọc hỗn giao với các loài cây họ Dầu vàmột số loài cây gỗ khác Dầu mít mới chỉ gặp một vài cá thể

Sinh cảnh điển hình của kiểu này là: đất bằng phẳng, có gợn sóng, dạngđất cát hay laterit, thoát nước, xói mòn, có 2 mùa mưa và mùa khô, với mùakhô khắc nghiệt, thường xuyên có lửa rừng, chỉ có 2 tầng: tầng cây gỗ và tầngcây bụi Thành phần loài đa phần hay phần lớn là loài rụng lá trong mùa khô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các bước nghiên cứu

- Khảo sát thực địa quần thể loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ.

- Thu thập mẫu để ph n tích

- Tách chiết, kiểm tra và tinh sạch DNA tổng số từ 73 mẫu Dầusong nàng

- Sử dụng phương pháp PCR với các cặp m i SSR

- Điện di sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di gel

Polyacrylamide

- Ph n tích kết quả nghiên cứu

2.3.2 Khảo sát ngoài thực địa.

Chúng tôi tiến hành thu mẫu theo tuyến Mẫu g m các cá thể trưởng

thành Do số lượng cá thể trong mỗi khu vực nghiên cứu khá lớn, mẫu

được thu ngẫu nhiên Tổng số 73 mẫu đã được thu thập tại 3 khu bảo t n,

rừng phòng hộ Tân Phú, khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai, và

vườn Quốc gia Lò Gò – Xa Mát

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp của Doyle JJ

và Doyle JL, 1987 có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số

của các mẫu

a Dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10ml :

STT

1234

Bảng 2.3 Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10ml STT

123

6

b Quy trình thực hiện

Bước 1: C n 200mg mẫu Nghiền mẫu với nitơ lỏng bằng cối chày sứ

vô trùng thành dạng bột mịn và chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml Mỗi ốngeppendorf chứa khoảng 10mg bột nghiền

Bước 2: Bổ sung 800µl đệm rửa (bảng 1) vào ống eppendorf 2ml, votex

tạo thành dịch đ ng nhất Ly t m 13.000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi (lặplại bước này 1-3 lần)

Bước 3: Bổ sung 600µl đệm tách chiết (bảng 2), đảo nhẹ tạo thành hỗn

hợp đ ng nhất, ủ 1 giờ ở 65oC (thỉnh thoảng đảo đều)

Bước 4: Để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Bổ sung 600µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1),

đảo đều để tạo thành dịch Ly t m 13.000 v/p trong 10 phút, hút dịch nổi chovào ống eppendorf 1,5ml mới

Bước 6: Bổ sung 600µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều để

tạo thành dịch Ly t m 13.000 v/p trong 10 phút, hút dịch nổi cho vào ốngeppendorf 1,5ml mới

Bước 7: Bổ sung Isopropanol lạnh vào mẫu theo tỷ lệ (Vmẫu :

Visopropanol = 1:1) đảo nhẹ để ở tủ -20oC trong 1 giờ

Bước 8: Sau đó lấy trong tủ m ra và ly tâm ngay, ly tâm 13.000 v/p

trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 9: Bổ sung 800µl c n 70% Ly t m 13.000v/p trong 15 phút ở 4oC,loại c n thu tủa

Bước 10: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 100µl

HOH deion

Bước 11: Bổ sung 2µl RNase (10mg/ml), ủ ở 37oC trong 1 giờ

Bước 12: Điện di kiểm tra kết quả trên gel Agarose 1%

Bước 13: Cất mẫu vào tủ lạnh ở -20oC

2.3.4 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài

Dầu song nàng

Trình tự các cặp m i sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.4 Trình tự nucleotide các cặp mồi SSR dùng trong nghiên cứu

[25]

4

Dipt4 [25]

5

Shc2 [27]

6

Dipt7 [25]

[26]