Tách dòng gen mã hóa protein vỏ của virut gây bệnh vàng lùn ở lúa RGSV tại tỉnh ninh thuận

Rất nhiều thành tựu đã đạt được trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu - môi giới truyền bệnh vàng lùn gây hại ở lúa chủ yếu như: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lúa gạo là một trong những cây lương thực cơ bản nhất phục vụ cho con người Đây là nguồn lương thực giàu dinh dưỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lượng, cung cấp trên 20% calories, 15% protein, các chất khoáng - chất xơ cho con người Chính bởi vậy gạo là nguồn lương thực chủ yếu hiện nay trong bữa ăn của hàng tỷ người châu Á, châu Phi, châu Mỹ latin, khu vực Trung đông và trong tương lai nó vẫn là loại lương thực hàng đầu

Từ năm 1999 đến nay, năng suất lúa của Việt Nam hàng năm luôn đạt mức trên 4000 kg/ha Từ năm 1990 đến nay Việt Nam luôn đứng thứ năm trên thế giới về sản lượng lúa (36 triệu tấn thóc/năm 2005) sau Trung Quốc (180 triệu tấn thóc/năm 2005), Ấn Độ (129 triệu tấn thóc/năm 2005), Indonesia (54 triệu tấn thóc/năm 2005) và Bangladesh (40 triệu tấn thóc/năm 2005) [6] Tuy nhiên trong thời gian từ năm 2006 – 2008, sản lượng lúa bị giảm sút nghiêm

trọng bởi các bệnh virus do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc

biệt là bệnh vàng lùn xảy ra trong thời gian gần đây

Bệnh vàng lùn do virus thuộc họ Tenuivirus gây ra, có tên gọi virus vàng

lùn (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV) gây hại cho lúa qua môi giới truyền bệnh là rầy nâu Đầu vụ hè thu 2007, dịch bệnh lại phát triển trên diện rộng ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và các tỉnh Nam Trung Bộ với mật độ rầy nâu rất cao Do ảnh hưởng của dịch bệnh vàng lùn, sản lượng gạo suất khẩu năm 2007 đã giảm 1 triệu tấn so với năm 2006 [11], [4] Tính đến tháng 9/2008, trên diện tích lúa Thu Đông tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, tổng diện tích nhiễm rầy nâu là 25,198 ha và lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn là 3.546,8 ha [2] Rất nhiều thành tựu đã đạt được trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu - môi giới truyền bệnh vàng lùn gây hại ở lúa chủ yếu như: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hoá học, sinh vật học, áp dụng các biện pháp kỹ

thuật canh tác mới, sử dụng các giống kháng… Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp này vẫn chưa cao

Hiện nay dịch bệnh vàng lùn đang gây hại nặng nề về sản lượng lúa gạo cho các tỉnh Nam Trung Bộ đặc biệt là tại tỉnh Ninh Thuận Thông tin về việc phân loại cũng như cấu trúc phân tử của các chủng virus gây bệnh vàng lùn còn đang rất thiếu Chính vì vậy, công tác thu thập các mẫu lúa nhiễm bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá tại các địa phương nằm trong danh sách công bố nghi

có dịch để tách dòng và giải mã trình tự gen của RGSV là hết sức cần thiết Nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền của virus gây bệnh tại các địa phương khác nhau, từ đó xây dựng chiến lược cho việc phòng trừ loại virus này

Với những lý do trên, trong thời gian thực tập tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn khoa học của các chuyên gia tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, tôi đã thực hiện đề tài: “Tách dòng gen quy định protein vỏ của virus gây bệnh vàng lùn ở lúa (RGSV) tại tỉnh Ninh Thuận”

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình dịch bệnh vàng lùn gây hại lúa trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Thế giới

Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens

Stal) đã nổi lên như một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở châu Á Nhiều trận dịch đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chưa từng thấy ở nhiều nước như Ấn

Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan… gây tổn thất nặng

nề về kinh tế Rầy nâu phá hoại sẽ làm giảm một phần hoặc toàn bộ sản lượng lúa Rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virus nguy hiểm cho cây lúa như bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, bệnh héo lùn cây lúa ở các Quốc gia châu Á

Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lùn ở châu Á trong năm 1966-1975 lên tới hơn 300 triệu đôla Trong thực tế, tác hại này còn lớn hơn Tại hội nghị quốc tế về rầy nâu họp ở Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), Philippin tháng 5 năm 1977 và tại Việt Nam

tháng 4 năm 2006, rầy nâu được coi là: “mối đe dọa thường xuyên đối với sản

xuất lúa ở châu Á”

1.1.2 Việt Nam

Ở nước ta, dịch rầy nâu và các bệnh virus hại lúa (vàng lùn, lùn xoắn lá) đang gây thiệt hại nghiêm trọng trên hầu hết các vùng lúa trọng điểm cả nước Hiện trạng này không chỉ ảnh hưởng đến xuất khẩu lúa gạo mà còn có nguy

cơ ảnh hưởng đến an ninh lương thực ở trong nước cũng như ở các Quốc gia khác Theo báo cáo kết quả 01 năm thực hiện công tác phòng chống bệnh dịch rầy nâu, bệnh vàng lùn trên lúa ở các tỉnh, thành phố Nam Bộ tổng diện tích

bị nhiễm rầy nâu trong toàn vùng năm 2006 và vụ Đông Xuân năm

2006-2007 là 731.092 ha (chiếm 12,61% diện tích gieo sạ), trong đó diện tích nhiễm nặng là 67.238 ha Tổng diện tích nhiễm bệnh vàng lùn của năm 2006

và vụ đông xuân 2007 trong toàn vùng là 237.466 ha (chiếm 4,09% diện tích gieo sạ), trong đó có 118.021 ha nhiễm nặng

Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virus hại lúa tuy đã giảm so với năm trước nhưng vẫn đang ở mức báo động Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng Diện tích bị nhiễm rầy nâu tập trung ở các tỉnh Cần Thơ, Bạc Liêu, Tiền Giang, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Trà Vinh Lúa Thu Đông diện tích

bị nhiễm rầy nâu lên đến 774 ha, phần lớn diện tích bị nhiễm rầy nâu ở mức

độ nhẹ Diện tích bị nhiễm vàng lùn xoắn lá trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỷ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình là 13 ha (tỷ lệ bệnh 10-20%), nhiễm nặng là 138 ha (tỷ lệ bệnh 20-50%) Diện tích bị nhiễm bệnh vàng lùn xoắn lá trong vụ Thu Đông là 9.534,4 ha, diện tích tăng chủ yếu tại An Giang và Vĩnh Long Diện tích bị nhiễm nặng 3.867,2 ha với tỷ lệ bệnh 20-80%, diện tích bị nhiễm trung bình 2.767,3 ha với tỷ lệ bệnh 10-20%, diện tích bị nhiễm bệnh nhẹ: 2.889,9 với tỷ lệ bệnh 3-10%, ở huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp bị nhiễm

17 ha với tỷ lệ bệnh phổ biến từ 5-10%, nơi cao tới 50%.Tính đến tháng 9/2008, trên lúa Thu Đông tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tổng diện tích nhiễm rầy nâu là 25.198 ha và lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn là 3.546,8 ha

Hình 1.1 Lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn tại tỉnh Ninh Thuận

1.2 Đặc điểm của virus gây bệnh vàng lùn ở lúa

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Virus vàng lùn lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV) gây hại cho cây

lúa (Oryza sativa L.) ở vùng Nam và Đông Nam châu Á [25] Virus được phát

tán vòng tròn từ cây này sang cây khác thông qua trung gian rầy nâu

Nilaparvata lugens Stal [25], không truyền qua trứng rầy RGSV được xếp

vào giống Tenuivirus Bên cạnh RGSV, giống Tenuivirus còn bao gồm

RRSV, RTSV, RSV, RHBV, MStV, EHBV và UHBV Tuy nhiên có sự khác biệt lớn về cấu tạo genome của RGSV so với các virus khác trong giống

Tenuivirus Đặc điểm chung của RGSV với các loài khác trong giống Tenuivirus: Virus có cấu tạo dạng sợi xoắn rộng 6-8 nm và dài 200-2400 nm;

genome là các sợi RNA âm, lưỡng tính (nghĩa là tổng hợp các protein khác nhau từ sợi RNA âm lẫn sợi RNA dương, hai đầu 5’ của RNA âm và dương đều chứa đoạn ORF); Đầu 3’ và 5’ của mỗi sợi RNA bổ trợ cho nhau, nên có khả năng tạo cấu trúc dạng vòng Trình tự đoạn bổ trợ này tương đối ổn định

Đặc điểm riêng của RGSV: RGSV trong cây lúa nhiễm bệnh ở

Philippin đã được phân lập và công bố trên NCBI Độ lớn của bộ gen của virus RGSV là 25142 nucleotide Bộ gen của RGSV chứa 6 sợi RNA, trong khi đó RSV và RHBV chứa 4 sợi RNA, MStV chứa 5 sợi RNA Mỗi sợi đều

có 17 nucleotide đầu 3’ và 5’ bổ sung với nhau, đoạn 17 nucleotide này ở cả 6

sợi RNA đều giống nhau, ngoại trừ vị trí thứ 15 ở RNA1 Sợi RNA1 dài 9760

nucleotid Sợi âm RNA1 mã hóa protein 18,9 kDa, sợi dương RNA1 mã hóa protein 339,1 kDa, protein 339,1 kDa có độ lớn tương tự RNA polymerase protein mã hóa bởi RNA1 của RSV (37,9%) và phlebovirus (thuộc họ

Bunyaviridea) (36%) Nếu có đột biến dịch chuyển khung đọc -1 sợi âm

RNA1 mã hóa protein 18,2 kDa Sợi RNA2 dài 4056 nucleotide Sợi âm

RNA2 mã hóa protein 23,3 kDa, sợi dương RNA2 mã hóa protein 93,9 kDa

Sợi RNA3 dài 3123 nucleotide Sợi âm RNA3 mã hóa protein 22,9 kDa, sợi dương RNA3 mã hóa protein 30,9 kDa Sợi RNA4 dài 2915 nucleotide Sợi

âm RNA4 mã hóa protein 19,4 kDa, sợi dương RNA4 mã hóa protein 60,4

kDa Sợi RNA5 dài 2704 nucleotide Sợi âm RNA5 mã hóa protein 21,6 kDa,

sợi dương RNA5 mã hóa protein 35,9 kDa, cũng chính là protein vỏ Sợi

Hình1 2 RGSV nhuộm với uranul acetate (thanh đơn vị : 100nm)

RNA6 dài 2584 nucleotide Sợi âm RNA6 mã hóa protein 20,6 kDa, sợi

dương RNA6 mã hóa protein 36,4 kDa

Khi so sánh bộ gen của RGSV với các loài virus khác trong họ

Tenuivirus thì nhận thấy RNA5 và RNA6 của RGSV tương tự RNA3 và

RNA4 của các loài virus khác trong họ Tenuivirus RNA1 và RNA2 của RGSV tương tự RNA1 và RNA2 của các loài virus khác trong họ Tenuivirus

Hình1 3 Sơ đồ cấu tạo bộ gen của RGSV

Có 2 dòng RGSV Dòng 1: có 3 dạng phân lập ở Đài Loan: “héo lùn” gây lùn cây, vàng lá và thường chết cây; lùn lúa cỏ kiểu B: cây đẻ nhánh, lá hẹp, ngắn và màu nhạt; lùn lúa cỏ kiểu Y: ít lùn và ít đẻ nhánh hơn, chiều rộng bình thường, màu lá nhạt hoặc bình thường; Dòng 2: Xuất hiện ở Philippin, bên cạnh các triệu chứng của virus thông thường gây vàng lá lúa và chết cây thì dòng này gây bệnh trên cả cây lúa có gen kháng có nguồn gốc từ

lúa N nivara

1.2.2 Ký chủ và truyền bệnh

a) Dấu hiệu cây bệnh

Triệu chứng ban đầu chưa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thường Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngả màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam Thời gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện tượng kém dinh dưỡng nên nông dân thường bón thêm phân đạm) Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm

có thể có nhiều đốm màu rỉ sắt Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tương đương với các bụi khác, chưa khác biệt lắm Càng về sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô

và lụi dần như cháy rầy từng chòm ( có khác là có khi còn chen những nhánh lúa còn xanh trong 1 bụi lúa do bị nhiễm không đều ở ruộng mạ) Khi trỗ thường không có gié hoặc gié có hạt lép [12]

b) Tác nhân

Bệnh vàng lùn do virus RGSV gây ra qua môi giới truyền bệnh là rầy

nâu Nilaparvata lugens Stal RGSV không được truyền qua hạt của cây lúa

bệnh hoặc qua phấn hoa Virus cũng không được truyền qua bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khỏe mạnh với cây lúa bệnh, không lây qua nguồn nước hay không khí Virus được truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật

số trong rầy ký chủ, nhưng không được truyền qua trứng rầy Lúa nhiễm bệnh giảm năng suất trên những giống mẫn cảm và khi mật độ rầy trên ruộng cao [25]

Rầy nâu truyền virus gây bệnh từ cây này sang cây khác, từ ruộng này sang ruộng khác Rầy nâu dùng vòi chích hút nhựa cây làm cho cây lúa bị khô héo Khi rầy nâu chích vào thân, lá lúa để lại chỗ chích một vệt nâu cứng, cản trở sự luân chuyển nước và chất dinh dưỡng làm thân, lá bị khô héo Mật độ rầy cao gây ra hiện tượng cháy rầy Rầy có khả năng truyền bệnh trong suốt

quá trình sống của nó sau khi tiếp nhận mầm bệnh khoảng 1 giờ Khả năng nhiễm bệnh tăng nếu kéo dài thời gian rầy hút nhựa cây lúa mang bệnh [20]

Khi lúa bị nhiễm virus có nhiều bó sợi được quan sát trong nhân và tế bào chất hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp lục Quần thể mật số cao của rầy nâu và rầy xanh làm vector truyền bệnh nhanh chóng và gây thiệt hại kép (vừa thiệt hại do rầy vừa thiệt hại do bệnh) là rất nghiêm trọng Đồng thời, sự thâm canh, canh tác nhiều vụ liên tục là môi trường lây lan rất thuận lợi cho bệnh nguy hiểm này Ngoài ra giống lúa nhiễm rầy là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển trên diện rộng [12]

1.3 Các biện pháp phòng trừ

1.3.1 Biện pháp truyền thống

Sự phát triển và lây truyền bệnh virus tùy thuộc vào số lượng cây mang nguồn bệnh, số lượng và sự hoạt động của côn trùng truyền bệnh, sự mẫn cảm

của giống lúa với virus, với côn trùng truyền bệnh và thời tiết Trước hết phải

thực hiện canh tác lúa theo tinh thần 3 G, 3 T, trong đó không bón thừa N, giảm mật độ sạ cấy, giảm sử dụng thuốc hóa học nhằm tạo thế cân bằng sinh học trên diện rộng, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, sạ cấy thưa tạo điều kiện cho ánh sáng xuyên qua tán, sương mù sẽ tan nhanh trên lá,

do nhiệt độ tăng, ẩm độ giảm trong tán tạo thế bất lợi cho sâu bệnh phát triển

Nên thăm đồng thường xuyên để phát hiện rầy thật sớm Ngăn chặn bệnh suốt thời kỳ đầu của giai đoạn sinh trưởng (giai đoạn mạ đến đẻ nhánh),bằng cách nhổ bỏ những cây lúa bị bệnh, cỏ dại trong ruộng, trên bờ, xung quanh ruộng, vì rầy nâu có thể tiếp tục chích hút cây lúa bị bệnh và mang virus phát tán đi nơi khác, cây lúa bị bệnh còn tồn tại trên ruộng sẽ là mầm mống chứa virus, cày ải phơi đất sẽ diệt mầm virus trong gốc rạ Ở những vùng vừa có dịch bệnh virus xảy ra: cày lật gốc rạ ngay sau khi thu hoạch Gieo sạ đồng loạt trên diện rộng, nhằm hạn chế di chuyển của quần thể rầy,

do chuyển tiếp nguồn thức ăn cho nên rầy mang virus lây lan ra diện rộng, do

vậy không nên gieo trồng rải rác có liên quan đến vụ 3, chỉ nên tập trung 2 vụ (cách nhau tối thiểu 30 ngày) Dịch bệnh vàng lùn có liên quan mật thiết đến thời vụ gieo sạ liên tục trên ruộng, cả không gian và thời gian đều tối hảo để dịch bệnh phát tán.Tăng cường sức đề kháng của lúa đối với virus, sử dụng một số chất kích kháng có thể hạn chế sự phát triển của virus trong cây lúa như K2HPO4, CuCl2 cho xử lý hạt, Humid acid (Risopla V) 1-1,5 kg/ha, bón lót thì càng tốt Khi phát hiện có rầy nâu cánh dài ở giai đoạn mạ với mật độ

từ 7-10 con/tép thì phải phun thuốc trừ rầy ngay vì đây là rầy mới di chuyển đến và khả năng rầy mang mầm bệnh là rất cao Có thể dùng các loại thuốc trừ rầy nâu như Actara, Applaud, Butyl… Tuy sử dụng thuốc hóa học có thể làm giảm mật số rầy nhưng vẫn không thể giải quyết được bệnh vàng lùn, vì

sự truyền bệnh có thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong khoảng thời gian rất ngắn

Nên dùng giống kháng rầy, lúa giống có chất lượng tốt vì giống kháng

là biện pháp có hiệu quả kinh tế nhất Tuy nhiên, giống kháng đối với rầy nâu chưa hẳn là kháng đối với virus, hơn nữa bệnh vàng lùn là sự phối hợp của 3 loại virus (RGSV, RRSV, RTSV), do vậy công tác thanh lọc giống kháng là khá phức tạp, cần có sự hổ trợ về kinh phí để thực hiện các nghiên cứu này Trong cơ cấu giống lúa đang trồng phổ biến ở ĐBSCL (63 giống- kết quả điều tra của Viện Lúa ĐBSCL 2005), một số ít giống lúa tỏ ra chống chịu tốt rầy nâu và bệnh vàng lùn, có thể kể đến OM4498, OM4495, AS996, OM2395 Ngoài ra, một số giống khác với diện tích nhỏ trong sản xuất như OM576, IR50404, IR59606, MTL141, MTL392, MTL384 cũng tỏ ra chống chịu tốt Một số giống lúa mới trong sản xuất thử tỏ ra chống chịu tốt với rầy nâu và bệnh vàng lùn là OM5930, MTL384, MTL392, MTL466, MTL499, MTL500 [11]

1.3.2 Biện pháp sinh học

Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng ruộng, và đã cho kết quả khả quan, chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy các loại nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đưa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phương pháp này có thể diệt trừ rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Tuy nhiên hiện nay phương pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: hạn chế về mặt qui mô (mỗi lần áp dụng chỉ trên diện tích vài chục

ha đất), hạn chế về công nghệ chế biến, mưa sau khi phun sẽ làm trôi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mưa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu diệt ngay sau khi phun thuốc)

1.3.3 Biện pháp sinh học phân tử

1 Nghiên cứu genome virus gây bệnh vàng lùn ở các vùng dịch trong nước Thu thập mẫu, nhân dòng, giải mã trình tự gen và so sánh với tư liệu trên ngân hàng gen quốc tế

2 Xác định các gen mã hóa protein vỏ và thiết kế các vector chuyển gen

3 Xác định khả năng kháng rầy của gen GNA (snowdrop lectin –

Galanthus niavilis agglutinin)

4 Xây dựng qui trình chuyển gen vào cây lúa

5 Chuyển gen GNA và gen CP của RGSV vào cây lúa

6 Kiểm tra khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen

1.4 Ứng dụng Sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh virus

1.4.1 Kỹ thuật phân tích axit ribonucleic (RNA)

a) Tách chiết RNA tổng số ở thực vật

Ngoài màng tế bào thực vật còn có lớp thành cenllulose vững chắc Mặt khác, các phân tử RNA không bền dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (Rnase) Hơn nữa, các Rnase lại có mặt ở khắp nơi (có rất nhiều trên đầu ngón tay của người thao tác, …) có hoạt tính rất cao và rất bền vững

với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt độ 90ºC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính của Rnase) Vì những lý do đó việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các Rnase từ môi trường, thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần Chính vì vậy việc tách chiết RNA từ tế thực vật gặp phải những khó khăn phức tạp nhất định Cho đến nay có nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch RNA khác nhau từ nhiều đối tượng thực vật Nhưng có thể tách chiết RNA tổng số từ thực vật theo nguyên tắc

1 Nghiền các mô, mẫu tế bào thực vật bằng biện pháp cơ học: Nghiền

mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối chày sứ để phá vỡ thành tế bào cenllulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào

2 Sử dụng đệm có chất tẩy để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA, RNA

3 Sử dụng hóa chất để bảo vệ DNA, RNA khỏi sự phân hủy của các nuclease nội bào

4 Sử dụng các hóa chất như chlorofrom, isoamyl alcohol, phenol… để loại protein và các tạp chất ra khỏi DNA, RNA

5 Dịch chiết sau khi làm sạch protein được ủ với enzyme DNAase để phân hủy DNA

6 Gây kết tủa RNA bằng cồn ethylic, hoặc isopropanol để tách RNA tổng số

b) Phản ứng RT-PCR

Phản ứng này nhằm nhân bản các cDNA từ mẫu ban đầu là RNA Đầu tiên, RNA tổng số hoặc mRNA được làm mẫu để tổng hợp các sợi đơn nhờ enzym phiên mã ngược Reverse Transcriptase Tiếp đến các cDNA này được nhân bản trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Như vậy, chúng ta không nhất thiết phải sàng lọc cDNA từ ngân hàng cũng thu được một phân tử cDNA đặc hiệu cho một gen Đối với một cặp mồi đặc hiệu cho một gen, số

lượng sản phẩm RT-PCR ứng với các mẫu RNA từ các loại tế bào khác nhau cho phép so sánh mức độ phiên mã của gen đó RT-PCR được xem là phản ứng bán định lượng đối với mRNA

c) Kỹ thuật điện di

Điện di DNA là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được DNA bằng mắt thường Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose để xác định chất lượng của DNA Sản phẩm DNA được điện di trên Agarose tạo thành các giải băng khác nhau DNA mang điện tích âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc phân tử DNA, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di Dựa vào kích thước từng đoạn gen được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose sẽ chọn nồng độ thích hợp nhất nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi điện di cùng thang DNA chuẩn

1.4.2 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp

a) Khái niệm về DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu khác nhau Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài khác nhau

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi nhưng thực chất gồm các bước chủ yếu sau đây:

1 Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho

để cung cấp DNA

2 Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho Bước này còn được gọi

là phân lập gen

3 Cắt cả hai đoạn DNA (DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng

một loại enzym giới hạn (restriction enzyme - RE) Ví dụ, sử dụng enzym giới hạn Endonuclease EcoRI tạo ra đầu so le

4 Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi một enzym giới hạn như đã nêu ở trên

5 Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh

6 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (vi khuẩn E.coli) và nhân

dòng

7 Chọn lọc và tạo dòng tế bào vật chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp

và theo hoạt động biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy

từ tế bào cho

b) Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp

 Enzym giới hạn (restriction endonuclease –RE)

Có khả năng nhận biết và phân cắt DNA tại một vị trí có các nucleotide sắp xếp theo một trật tự Tùy thuộc vào khoảng cách giữa vị trí nhận biết và vị trí cắt để phân biệt enzym giới hạn thành các loại khác nhau Các enzym nhận biết và cắt ngay tại một vị trí được xếp vào loại II Đây là những enzym được

sử dụng nhiều trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Enzym giới hạn nhận biết và cắt trình tự đặc hiệu gồm bốn đến tám nucleotide Đặc điểm của các trình tự này là đối xứng, tức là trình tự nucleotide tại vị trí cắt trên hai sợi đơn đều giống nhau theo cùng một chiều (5'→3' hoặc 3'→5') Enzym có thể cắt hai sợi đơn DNA tại cùng một điểm tạo

ra hai đầu bằng Những enzym đó được gọi là enzym cắt đầu bằng Bên cạnh

đó, tại vị trí nhận biết, enzym giới hạn có thể cắt hai sợi đơn DNA lệch nhau vài nucleotide tạo ra hai đầu có các sợi so le nhau Những enzym này được gọi là enzym cắt đầu so le Enzym tạo đầu so le rất thông dụng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp do DNA ligase nối các đoạn DNA đầu so le với hiệu suất cao hơn rất nhiều so với các đoạn đầu bằng [18]

 Enzym nối (Ligase)

Enzym nối Ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào Các enzym này xúc tác hình thành các liên kết photphodieste để nối các đoạn axit nucleic với nhau DNA ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase xúc tác nối các đoạn RNA với nhau Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, DNA ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi Có một số loại enzym nối

khác nhau, nhưng enzym T 4 DNA ligase kết hợp với hai loại enzym T 4

polynucleotide kinase và alkaline phosphatase được sử dụng rộng rãi nhất trong các thí nghiệm về công nghệ di truyền [18]

Có ba loại enzym nối thường được dùng trong Công nghệ di truyền

Enzym E.coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác cho phản ứng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu so le Enzym T 4 DNA ligase được

tách chiết từ phage T 4 xâm nhiễm vào E.coli có chức năng giống như E.coli

DNA ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu bằng và

là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay Enzym T 4 RNA ligase tách chiết

từ phage T 4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự RNA bằng các liên kết phosphodiester [7]

 Enzym polymerase

Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic (DNA, hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong Công nghệ di truyền Các enzym này tổng hợp axit nucleotide theo nguyên tắc bổ sung với nhau dựa theo mạch khuôn Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều từ 5'→3' Gồm hai nhóm:

- Các DNA polymerase

Enzym DNA polymerase I (pol I) là enzym DNA polymerase I xúc tác cho việc lấp đầy chỗ trống trên phân tử DNA, hoặc mạch đơn của DNA ngắn Enzym DNA polymerase I xúc tác tổng hợp mạch đơn mới đồng thời có vai trò trong việc sửa chữa các sai sót trong quá trình sao chép DNA Ngoài chức năng tổng hợp, enzym DNA polymerase I còn có hoạt tính exonuclease, có

nghĩa là nó có khả năng thủy phân liên kết giữa các nucleotit từ hai đầu của phân tử DNA, cắt rời từng nucleotit theo cả hai chiều 5'→3' và 3'→5' Trong nhiều trường hợp, enzym DNA polymerase I được sử dụng trong kỹ thuật xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy, tổng hợp mẫu dò có đánh dấu phóng xạ, hoặc thiết kế các vector mạch đơn

Trong thực tế enzym DNA polymerase I ít được sử dụng mà người ta

sử dụng một sản phẩm thủy phân của nó được gọi là đoạn Klenow Đoạn này vẫn giữ được hoạt tính của polymerase và exonuclease 5'→3' Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử DNA mạch đơn vì chức năng exonuclease bị thiếu khả năng cắt đầu 3'→5' nên enzym này không thể thủy phân mạch đơn làm khuân trong quá trình tổng hợp DNA mới

Enzym T 4 DNA polymerase có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T 4 (phage

T 4 ) xâm nhiễm vào vi khuẩn E.coli Hoạt tính của enzym T 4 DNA polymerase tương tự đoạn Klenow Do nó có hoạt tính exonuclease 3'→5' mạnh nên thường được sử dụng để tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao

Enzym Taq polymerase được tách chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt

Thermophilus acquaticus Enzyme Taq polymerase thường được sử dụng

trong việc nhân gen trong kỹ thuật chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR) Enzym

Taq có khả năng tăng cường sự bắt cặp tạo DNA bổ trợ (cDNA) nhưng không

hoạt động trên các phân tử RNA

Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase) Enzym này có khả

năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuân mRNA, hoặc từ một đoạn polynucleotide được tổng hợp bằng con đường hóa học Nhờ có enzym phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có mặt mRNA của gen đó Các cDNA mạch đơn

có thể biến thành DNA mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng cDNA Nếu cDNA có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen Trong trường hợp mRNA trưởng thành khi đã ở ngoài nhân

thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon) Không có đoạn mã hóa (intron) [18]

- Các enzym RNA polymerase

Có ba loại enzym RNA polymerase thường được dùng trong thực tế, đó

là SP 6 RNA polymerase, T 3 RNA polymerase và T 7 RNA polymerase Các enzym này xúc tác quá trình phiên mã tổng hợp RNA từ mạch khuân của phân tử DNA theo chiều từ 5'→3' (mạch khuôn có chiều 3'→5') Trên thực tế RNA polymerase được ứng dụng trong tổng hợp mẫu dò RNA và trong việc nghiên cứu quá trình phiên mã tổng hợp mRNA [7]

c) Vector sử dụng trong kỹ thuật tách dòng

Để có thể lưu trữ và nhân bản một đoạn DNA (hoặc một gen) đến một

số lượng mong muốn, một trong các phương pháp thông dụng là gắn đoạn DNA đó vào vector Saou đó vector được đưa vào té bào nhận Sử dụng bộ máy tái bản DNA của tế bào nhận, vector được tái bản tạo ra số lượng lớn các bản sao giống hệt vector ban đầu Với những nhiệm vụ như vậy, vector cần phải có các đặc tính cơ bản sau: Có vị trí để ghép nối đoạn DNA lạ vào (vị trí

đa điểm tách dòng-polycloning site) Đây là những vị trí duy nhất trên vector

Có tâm sao chép (origin of replication - ori) được nhận biết bởi bộ máy tái

bản DNA của tế bào nhận, cho phép vector tái bản một cách tích cực trong tế

bào nhận Có gen chỉ thị (marker gene) giúp cho việc phân biệt tế bào nhận

vector mang DNA lạ với các tế bào khác Gen chỉ thị thường là gen quy định khả năng chống chịu kháng sinh

Tùy thuộc vào kích thước các đoạn DNA cần lưu giữ mà chọn các vector khác nhau Hầu hết các vector sử dụng hiện nay là các DNA tái tổ hợp Chúng được thiết kế nhằm đạt được hiệu suất sử dụng tối ưu nhất cho từng mục đích nghiên cứu phổ biến nhất là các plasmide [18]

Plasmid

Plasmid là những phân tử DNA dạng vòng, tồn tại trong tế bào vi khuẩn và nằm ngoài nhiễm sắc thể Plasmid có kích thước thay đổi trong

khoảng 1kb đến vài trăm kb Trong tự nhiên, các plasmid có thể tái bản đồng thời với nhiễm sắc thể hoặc có khả năng tái bản độc lập Các plasmid thường mang những gen chống chịu kháng sinh, vì vậy những gen đó được sử dụng như các chỉ thị (marker) để chọn lọc tế bào chứa plasmid

Có nhiều loại plasmid được thiết kế có mang hai hay nhiều gen chỉ thị

và vị trí đa điểm tách dòng gồm nhiều gen chỉ thị và vị trí đa điểm tách dòng gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzym giới hạn Kích thước plasmid được thiết kế sao cho không lớn giúp plasmid nhân bản rất nhanh trong tế bào nhận Đặc biệt vị trí đa điểm của plasmid thường được thiết kế nằm trong một gen chỉ thị Khi đoạn DNA xen vào một trong các điểm này, chúng gây bất hoạt gen chỉ thị Do đó, tế bào nhận plasmid gắn DNA lạ sẽ không tổng hợp được sản phẩm của gen chỉ thị Sự thiếu vắng sản phẩm của gen chỉ thị có thể liên quan đến sự chuyển màu của môi trường nuôi cấy Vì thế dựa vào màu sắc chúng ta có thể chọn được tế bào nhận plasmid gắn DNA lạ [7]

Hình1.4 Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hoàng và cộng sự 2005)

Ví dụ, các plasmid pBT có vị trí đa điểm nằm trong trình tự của gen chỉ thị mã hóa cho β-galactosidase Khi pBT có gắn DNA lạ enzym không được tổng hợp Nếu chúng ta cho vào môi trường nuôi cấy cơ chất của enzym, cơ chất không bị chuyển hóa nên tế bào nhận pBT gắn DNA lạ sẽ có màu trắng Ngược lại, những tế bào nhận pBT có gen chỉ thị nguyên vẹn, chúng sẽ có

màu xanh tạo ra do cơ chất bị chuyển hóa bởi β-galactosidase

Quá trình đưa plasmid vào vector được gọi là biến nạp Tế bào có khả năng tiếp nhận plasmid được gọi là tế bào khả biến [7]

d) Các loại tế bào chủ

Một loại tế bào vật chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi, dễ giữ và

nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector Vi khuẩn E.coli đáp ứng

các yêu cầu của tế bào vật chủ lý tưởng và được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen Do tính chất đặc biệt của tế bào lý tưởng nên

E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều

chủng khác nhau Các nghiên cứu đó làm cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp

và Công nghệ di truyền

E.coli là vi khuẩn gram âm, có hình que (dài khoảng 1µm), không gây

bệnh, thường gặp trong ruột người E.coli có một nhiễm sắc thể (phân tử

DNA) dạng vòng nằm trong vùng nhân Kích thước của các phân tử DNA này khoảng 4×106

cặp bazơ Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch

mã được xảy ra đồng thời Sau khi mRNA được tổng hợp sẽ sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước sửa đổi sau phiên mã vì gen của chúng

không có các intron (đoạn không mã hóa) Do vậy, E.coli được coi là tế bào

chủ đơn giản nhất Rất nhiều thí nghiệm tách dòng gen ở các phòng thí

nghiệm đang sử dụng E.coli làm tế bào chủ

Tùy thuộc mục đích sử dụng mà chọn một loại tế bào vật chủ thích hợp

nhất Ngoài tế bào chủ là nhân sơ như E.coli người ta còn sử dụng tế bào chủ

nhân chuẩn như: tế bào nấm men, tế bào thực vật và động vật [18]

e) Tạo, tách, và chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp

Mục đích của việc tạo dòng là nhằm mục đích thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm – tức tập hợp vi khuẩn cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng

Chọn và xử lý vector Việc chọn lọc vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố,

kích thước các đoạn DNA muốn tạo dòng, mục đích tạo dòng,…Trước hết, vector được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym giới hạn Sau đó, hai đầu chỗ mối cắt được xử lý để chúng không thể nối trở lại, vector chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu khi hai chỗ mối cắt được nối với một trình tự DNA

lạ Điều này nhằm tránh sự hình thành của các dòng vi khuẩn mang vector không tái tổ hợp

Xử lý DNA cần tạo dòng (insert) Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các

đoạn DNA có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector đã chọn Sau

đó, hai đầu của các DNA này cần được xử lí cho phù hợp với hai đầu chỗ mối cắt của vector (bằng cách cắt bởi cùng một enzym giới hạn để tạo các đầu so

le tương hợp chẳng hạn,…)

Tạo vector tái tổ hợp Vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lý sẽ

được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định với sự hiện diện của enzym ligase Ligase xúc tác cho phản ứng nối vector với insert tạo thành vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được tinh sạch thông qua tách chiết và tủa

Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Công đoạn này nhằm mục

đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một

số lượng lớn bản sao Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kỹ

thuật chuyển thích hợp Loại tế bào thông dụng nhất là E.coli Quá trình này gọi là biến nạp, biến nạp vào E.coli được thực hiện như sau: Xử lý tế bào

E.coli bằng sốc nhiệt trong 2 phút ở 42ºC rồi ủ plasmid tái tổ hợp làm cho khả

năng dung nạp tăng lên hàng trăm lần Sau khi plasmid mang đoạn DNA lạ

biến nạp chui được vào tế bào E.coli, chúng vẫn còn nguyên vẹn, đồng thời tế bào chủ vẫn sống bình thường Trong quá trình sinh trưởng của E.coli,

plasmid tái tổ hợp được sao chép tạo thành dòng DNA (gen) lạ Để xác định

tế bào chủ E.coli đã tiếp nhận plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen

kháng với chất kháng sinh vào plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen kháng với chất kháng sinh vào plasmid tái tổ hợp Nhờ đó có thể phát hiện sự dung nạp thông qua tính bền vững với kháng sinh đã được đánh dấu

Chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu Sau khi biến nạp DNA vào tế

bào vật chủ thì ở trong tế bào vật chủ DNA biến nạp được nhân bản, từ đó chúng tạo ra được dòng DNA Bước tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gen mong muốn Ví dụ, vector tái tổ hợp (pBT) được biến nạp vào

tế bào khả biến E.coli DH5α sau đó được cấy chuyển trên môi trường LB đặc

có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal, IPTG Sau đó ủ đĩa peptri ở 37ºC trong

16 giờ Trên môi trường có chứa kháng sinh, X-gal, IPTG sẽ phát triển hai loại khuẩn lạc xanh và trắng Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh ampicillin Những khuẩn lạc màu

trắng là các dòng tế bào mang plasmid có gen lacZ bị phá vỡ có thể do DNA

lạ chèn vào hoặc do đứt gẫy đầu vector trước khi đóng vòng Những khuẩn

lạc màu xanh là những khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase Enzym

này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh Ở đây người ta

sẽ quan tâm đến những khuẩn lạc trắng để đem đi kiểm tra xem plasmid có mang đoạn gen quan tâm không (Chạy phản ứng colony-PCR) [7]