TỔNG QUAN VỀ BACILLUS MEGATERIUM
ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS MEGATERIUM
Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, nổi bật với bào tử và thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên Với chiều dài tế bào lên tới 4 micromet và đường kính 1,5 micromet, B megaterium là một trong những vi khuẩn lớn nhất được biết đến Các tế bào của vi khuẩn này thường xuất hiện theo cặp hoặc chuỗi, được nối với nhau bằng polysaccharide trên thành tế bào.
Vào thập niên 1960, Bacillus megaterium đã trở thành sinh vật mẫu chính trong các nghiên cứu về sinh hóa, bào tử và vi khuẩn gram dương Hiện nay, Bacillus megaterium được ứng dụng phổ biến trong công nghệ sinh học nhờ khả năng sản xuất protein tái tổ hợp và làm phân bón.
ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI
Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli
ĐẶC ĐIỂM
B megaterium phát triển ở nhiệt độ từ 3°C đến 45°C, với mức tối ƣu khoảng 37°C Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã đƣợc tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên tới 63°C
B megaterium đã đƣợc công nhận là một endophyte và là một tác nhân tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật Sự cố định đạm đã đƣợc chứng minh ở một số chủng B megaterium
B megaterium là một sinh vật công nghiệp quan trọng trong nhiều thập kỷ Nó sản xuất penicillin amidase đƣợc sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp, các loại amylase khác nhau đƣợc sử dụng trong ngành làm bánh và glucose dehydrogenase đƣợc sử dụng trong xét nghiệm glucose máu Hơn nữa, nó đƣợc sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, các loại thuốc có đặc tính diệt nấm và kháng vi-rút, Nó tạo ra các enzyme để điều chỉnh corticosteroid, cũng nhƣ một số axit amin dehydrogenase
B megaterium đƣợc biết là sản xuất axit poly-glutamic Sự tích lũy của polymer được tăng lên rất nhiều trong môi trường nước muối (2 xăng10% NaCl ), trong đó polymer bao gồm phần lớn L-glutamate (hàm lƣợng đồng phân L lên tới 95%) Ít nhất một chủng B megaterium có thể đƣợc coi là halophile , vì sự tăng trưởng của NaCl lên đến 15% đã được quan sát thấy
Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu
Dựa trên phân tích 16S rRNA, B megaterium có mối liên hệ chặt chẽ với B flexus, loài đã được phân biệt cách đây một thế kỷ nhưng chỉ mới được công nhận là một loài riêng biệt Mặc dù B megaterium có nhiều điểm tương đồng về kiểu hình và phát sinh gen với các mầm bệnh như B anthracis và B cereus, nhưng bản thân nó lại tương đối vô hại.
LỊCH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM
Loài này được mô tả bởi de Bary vào năm 1884 với tên gọi Bacillus megaterium, nhưng không có nguồn gốc rõ ràng Một số tác giả sau đó đã gọi nó là B megatherium, cho rằng đây là một lỗi chính tả Xu hướng này vẫn tiếp tục khi nhiều nhà khoa học, chủ yếu từ các nước đang phát triển, vẫn sử dụng tên B megatherium, gây ra sự nhầm lẫn trong cộng đồng khoa học.
Tên B megaterium xuất phát từ tiếng Hy Lạp "mega", có nghĩa là "lớn", chỉ ra rằng vi khuẩn này có kích thước lớn hơn so với các vi khuẩn khác trong chi Bacillus.
Lỗi chính tả không chủ ý của de Bary và học sinh của ông liên quan đến việc sử dụng biệt danh "megaterium" thay vì "megatherium" Từ "megatherium" có nguồn gốc từ "therion" (θηρίον), mang nghĩa là "con quái vật".
TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG
B megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thường có trong đất Chu trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy, giáng hóa chất
B megaterium là một trong những vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ thành các hợp chất đơn giản hơn, nhờ vào sự hỗ trợ của nhiều loài vi khuẩn và nấm khác Những vi sinh vật này sử dụng chất dinh dưỡng từ vật liệu hữu cơ chết hoặc hoại sinh để phát triển Trong môi trường đất, vi khuẩn tồn tại ở dạng sinh dưỡng khi có đủ nguồn thức ăn và chuyển sang dạng bào tử khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, một chiến lược sinh tồn phổ biến trong môi trường hiếu khí Ngoài vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra kháng sinh và tham gia vào quá trình hình thành bào tử Sự hiện diện của nhiều loài vi sinh vật tạo bào tử có khả năng phân hủy các polymer sinh học như protein, tinh bột, và pectin, cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong chu trình carbon và nitrogen Chính vì những đặc tính này, B megaterium hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường.
B megaterium đƣợc coi là vi khuẩn không gây bệnh nhƣng V đóng vai trò lớn trong việc tạp nhiễm các môi trường vô khẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các hạt bụi, và chúng có thể là tác nhân gây nên hiện tƣợng phân hủy và thối rữa[30]
Vi khuẩn B megaterium, với kích thước lớn, đã trở thành một công cụ quan trọng trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong nghiên cứu protein và màng tế bào Chủng vi khuẩn này được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào Nhiều ứng dụng của B megaterium đã được phát triển trong xử lý môi trường và công nghiệp, bao gồm sản xuất enzyme như glucose dehydrogenase, penicillin aminidase và b-amylase, cũng như trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin và P450 cytocrome, cùng nhiều ứng dụng khác trong công nghệ gen và tái tổ hợp.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACILLUS MEGATERIUM
B megaterium thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm và được sử dụng nhƣ một sinh vật công nghiệp có khả năng sản xuất nhiều loại protein và nguồn sinh học Bacillus megaterium là một nguồn protein công nghiệp tốt vì nó vừa là vật chủ nhân bản vừa mong muốn và tạo ra một biến thể lớn của các enzyme Loài này là vật chủ nhân bản tốt vì có thể chứa nhiều vectơ plasmid, sử dụng Bacillus megaterium nhà khoa học đã phát triển nhiều loại protein thường đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y tế và nông nghiệp Ví dụ, nhiều penicillin tổng hợp đã đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng penicillin amidase trong vi khuẩn; glucose dehydrogenase thu hoạch đƣợc sử dụng trong xét nghiệm glucose mỏu; ò-Amylase thường được sử dụng trong ngành cụng nghiệp bỏnh mì; và protease trung tính đƣợc sử dụng bởi ngành công nghiệp da Một số chủng đã đƣợc chứng minh là vật chủ tốt cho biểu hiện gen Một chủng, QM B1551, vẫn đƣợc sử dụng để tạo kháng nguyên cho Bộ chẩn đoán HIV Nghiên cứu công nghệ sinh học của Bacillus megaterium cung cấp rất nhiều protein khác nhau mà họ có thể sử dụng trong các tiến bộ y tế, khoa học và công nghiệp quan trọng [19]
Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 18 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin Trong đó có dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lông lên đến 40,48% [21]
Nhóm nấm đối kháng Trichoderma đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất phân hữu cơ sinh học tại Việt Nam Phân hữu cơ sinh học có bổ sung nấm Trichoderma có hiệu quả cao trong việc phòng trừ các bệnh như vàng lá chết nhanh do nấm Phytophthora palmirova và bệnh vàng héo rũ do các nấm như Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii gây ra.
Trên thị trường phía Nam, các sản phẩm phân hữu cơ sinh học chất lượng tốt và uy tín, điển hình là nhóm sản phẩm phân hữu cơ Cugasa của Công ty.
Ty Anh Việt, phân VK của Công ty Viễn Khang, phân hữu cơ Phaga, Trimix của Công ty Phaga……
Nhóm phân hữu cơ sinh học, hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh, được chế biến bằng cách bổ sung vi sinh vật có ích sau khi nhiệt độ ủ đạt 30°C Các vi sinh vật này bao gồm vi khuẩn cố định nitơ tự do như Azotobacter, cũng như vi khuẩn và nấm phân giải photphát khó tan như Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas striata và Aspergillus awamori, cùng với xạ khuẩn Streptomyces Hiện nay, nhiều loại phân hữu cơ vi sinh và phân lân vi sinh đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam.
Phân gà, phân heo và phân bò từ các trại chăn nuôi là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng, với hàm lượng đạm vượt quá 2% Tuy nhiên, do độ ẩm cao từ 70-80%, chúng dễ phát sinh mùi Để xử lý, quá trình ủ phân cần được thực hiện bằng cách phơi hoặc trộn với các giá thể khác nhằm giảm độ ẩm.
- Hàm lƣợng hữu cơ trong phân gà (hoặc phân heo, phân bò) cao, rất dễ gây ngộ độc hữu cơ cho cây trồng nếu chƣa qua quá trình ủ hoai
Phân gà, phân heo và phân bò chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella và E coli, có thể gây ra các bệnh đường ruột ở người Do đó, cần phải ủ hoai phân trước khi sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp để đảm bảo an toàn cho sức khỏe.
MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium được phân lập có khả năng cố định nitơ và sản sinh một số enzyme ngoại bào Bài viết cũng xác định một số đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn đã được phân lập.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus megaterium có khả năng cố định Nitơ từ ba mẫu đất ruộng
- Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạnh tế bào của Bacillus megaterium các chủng vi khuẩn đã phân lập
- Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập
+ hả năng cố định Nitơ
+ hả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau
+ hả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí
- Xác định hoạt tính loại enzyme (amylase, protease, cellulase) ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã phân lập
Xác định khả năng chống chịu của các chủng vi khuẩn đối với những yếu tố bất lợi từ môi trường, bao gồm khả năng chịu nhiệt độ cao và nồng độ NaCl cao, là rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật.
- Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng Bacillus megaterium đã phân lập.
NGUYÊN LIỆU
NGUỒN VI SINH VẬT
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus megaterium từ một số mẫu đất thu thập ở ruộng lúa của tỉnh Cao Bằng
HÓA CHẤT
Chemical compounds such as peptone, yeast extract, NaCl, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, mannitol, glucose, lactose, glycerol, maltose, sucrose, and fructose are produced by countries including China, Vietnam, the USA, and Germany.
THIẾT BỊ SỬ DỤNG
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp bao gồm:
- Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter – Ý, Nồi khử trùng HVE
Nhật Bản cung cấp máy ly tâm lạnh và tủ lạnh với các mức nhiệt độ 4ºC, -20ºC và -80ºC, trong khi Mỹ nổi bật với máy lắc ổn nhiệt và cân phân tích OHAUS PA 213 Thụy Sĩ mang đến tủ ấm Memmert, trong khi kính hiển vi quang học và tủ cấy (Box laminar PII) cũng là những sản phẩm quan trọng Ngoài ra, Micropipet và máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels từ Nhật Bản, cùng với lò vi sóng dung tích 20 lít và 30 lít từ Liên Doanh, đều góp phần làm phong phú thêm danh mục thiết bị.
MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1: Công thức Môi trường Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi khu n Bacillus megaterium
- Môi trường LB nuôi cấy các chủng Bacillus
Bảng 2.2: Công thức môi trường LB
- Môi trường ISP4 xác định khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Bảng 2.3: Môi trường xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon
(NH4)2SO4 2 pH = 7 + Nguồn cacbon: Bổ sung một số loại đường Glucose, Lactose, Glyxerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol
- Môi trường xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn
Bảng 2.4: Công thức môi trường thử hoạt tính enzyme
Môi trường định tính enzyme
Thành phần, hàm lƣợng Thuốc thử
Amylase 2% Agar + 1% Tinh bột Lugol 1%
Protease 2% Agar + 1% Casein Thuốc thử Comassi blue
Ghi chú: Các môi trường trên được hấp khử trùng ở 121ºC, 20 phút trước khi sử dụng.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHÂN LẬP, GIỮ CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CHẾ PHẨM
Để pha loãng mẫu, cân 1g đất và cho vào 9ml nước cất vô trùng trong ống falcon, tạo ra mẫu pha loãng với nồng độ 10^-1 Lắc đều và gia nhiệt ở 80ºC trong 20 phút Sau đó, hút 1ml dịch từ mẫu nồng độ 10^-1 và cho vào ống falcon mới chứa 9ml nước cất vô trùng để tạo mẫu nồng độ 10^-2 Tiếp tục quy trình này để pha loãng đến nồng độ 10^-3.
Cấy phõn lập là quá trình sử dụng 50 mẫu được pha loãng trong môi trường Ashby agar Để thực hiện, cần dùng que cấy vô trùng để trải đều dịch lên bề mặt thạch Các đĩa sau đó được ủ ở 37ºC trong 48 giờ, và sau thời gian này, chúng ta sẽ quan sát sự hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn.
Để bảo quản giống vi khuẩn hiệu quả, dịch vi khuẩn nuôi lỏng cần được bổ sung khoảng 70% glycerol và làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng, sau đó giữ ở nhiệt độ -80ºC Phương pháp này giúp bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm và đảm bảo vi khuẩn được hoạt hóa trước khi tiến hành nhân giống.
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
Chủng vi khuẩn được quan sát trên môi trường Ashby-agar thông qua mắt thường và kính hiển vi quang học Các đặc điểm nuôi cấy và hình thái của vi khuẩn được xác định dựa trên các chỉ số như khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và màu sắc của khuẩn lạc.
2.4.2.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường LB-agar: khả năng phát triển của khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc
Nhuộm Gram là một phương pháp quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn Quá trình này bắt đầu bằng việc xử lý tế bào vi khuẩn với tím kết tinh và iot, tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram âm tiếp xúc với cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan, làm tăng tính thấm của màng và dẫn đến việc rửa trôi phức chất tím – iot, khiến vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung, vi khuẩn sẽ bắt màu với các thuốc nhuộm như Safranin (màu vàng) hoặc Fuchsin (màu đỏ tía).
14 dương cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào
Để tiến hành nhuộm vi khuẩn, đầu tiên, bạn cần làm vết bôi vi khuẩn trên một lá kính sạch Sau đó, để vết bôi khô tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn Cuối cùng, nhỏ vài giọt Crystal Violet (tím kết tinh) lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong một khoảng thời gian nhất định.
Để thực hiện quy trình nhuộm, đầu tiên, rửa nhanh bằng nước và nhỏ vài giọt Lugol lên bề mặt vết nhuộm, để yên trong 1 phút trước khi rửa lại bằng nước Tiếp theo, nghiêng lamen và nhỏ từ từ cồn lên vết nhuộm; khi giọt cồn không còn màu tím, dừng lại và rửa nhanh bằng nước Sau đó, nhỏ vài giọt safranine lên vết nhuộm, để yên trong 1 phút và rửa lại bằng nước Cuối cùng, thấm khô vết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100.
Khi đọc kết quả, VK Gram âm sẽ hiển thị màu hồng, trong khi V Gram dương sẽ có màu tím Cần chú ý đến hình dạng của vi khuẩn như cầu khuẩn hay trực khuẩn, cũng như cách sắp xếp của chúng, có thể là chuỗi, chùm hoặc rời rạc.
2.4.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh nội bào tử của vi khuẩn
Bào tử vi khuẩn được hình thành tự nhiên nhằm giúp vi khuẩn tồn tại lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt, nơi mà vi khuẩn trưởng thành không thể sống sót Quá trình tạo bào tử phụ thuộc chủ yếu vào sự suy giảm dinh dưỡng hoặc các điều kiện môi trường khắc nghiệt Để xác định khả năng sinh bào tử, các nhà nghiên cứu thường tạo ra những điều kiện khắc nghiệt như sốc nhiệt.
Để tiến hành theo phương pháp gia nhiệt, lấy một khuẩn lạc đơn từ đĩa petri và cấy vào môi trường LB lỏng (pH=7) Sau đó, nuôi ở nhiệt độ 37ºC với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ để thu được huyền phù vi khuẩn.
Tiến hành pha loãng dịch huyền phù vào các ống Eppendorf đã được khử trùng và đun cách thủy ở 80ºC trong 10 phút Sau đó, sử dụng micropipet hút 100 µl dịch cấy trải trên môi trường LB-agar và đặt vào tủ ấm ở 30ºC Sau 24 giờ, nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc, có thể kết luận rằng chủng có khả năng hình thành bào tử; ngược lại, nếu không có khuẩn lạc, chủng không có khả năng này.
Xác định khả năng hình thành nội bào tử của vi khuẩn theo phương pháp của Schaeffer–Fulton cải tiến
Phương pháp nhuộm màu theo Schaeffer–Fulton cải tiến bắt đầu bằng việc vô trùng lam kính với cồn 70%, sau đó trải sinh khối vi khuẩn lên lam và cố định bằng nhiệt Tiếp theo, phủ một mảnh giấy lọc lên vết bôi và nhỏ dung dịch xanh methylene để nhuộm, giúp loại bỏ cặn và tạo điều kiện quan sát mẫu vi khuẩn dễ dàng hơn Trong quá trình nhuộm, cần duy trì nhiệt độ bằng cách đun nhẹ lam kính, liên tục nhỏ thuốc nhuộm để tránh khô Sau 5 phút nhuộm, lam kính được rửa bằng nước cất cho đến khi nước rửa không còn màu xanh, sau đó hong khô và nhuộm lại với thuốc nhuộm fuchsin trong một phút Cuối cùng, rửa lại và quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính x100 trong giọt dầu, bào tử vi khuẩn sẽ bắt màu xanh của xanh methylene trong khi tế bào chất bắt màu hồng của fuchsin.
2.4.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase
Catalase là enzyme có mặt ở các vi sinh vật (VSV) hiếu khí và kị khí tùy ý, có chức năng phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2), ngăn chặn sự tích tụ của phân tử độc hại này trong tế bào Quá trình thủy phân H2O2 sẽ giải phóng oxy, được quan sát qua hiện tượng sủi bọt khí Thí nghiệm này thường được sử dụng để phân biệt các VSV hiếu khí như Bacillus với các VSV kị khí như Clostridium.
- Cách tiến hành: Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 30% lên trên khuẩn lạc
Bacillus, hoặc chuyển một lƣợng VSV lên lamen rồi thử bằng dung dịch
H 2 O 2 30% Ghi nhận hiện tƣợng sủi bọt nếu có
- Đọc kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo ra, ngƣợc lại là (-) khi không có sủi bọt khí
2.4.2.5 Xác định khả năng cố định Nitơ
Để tiến hành thí nghiệm, lấy một khuẩn lạc đơn từ đĩa petri và cấy vào môi trường Ashby (pH=7) Sau đó, nuôi khuẩn lạc ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Kết quả sẽ được xác định dựa trên hình dạng khuẩn lạc phát triển trên môi trường.
2.4.2.6 Xác định khả đồng hóa nguồn cacbon
Để tiến hành thí nghiệm, lấy một khuẩn lạc đơn của chủng đã chọn và cấy vào môi trường ISP4 lỏng với nồng độ carbon 1%, bao gồm các loại đường như Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol Sau đó, ủ ở 37ºC trong 24 giờ Kết quả sẽ dựa trên sự đổi màu của môi trường với các loại đường khác nhau, từ đó xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng được tuyển chọn.
2.4.2.7 Xác định khả năng sinh trưởng, phát triển trong điều kiện kỵ khí
Để tiến hành thí nghiệm, sử dụng que cấy đầu nhọn đã được khử trùng để lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường đĩa thạch Cấy vi khuẩn bằng cách ấn que cấy vào môi trường LB-agar trong ống nghiệm có nắp đậy, sau đó đổ thêm một lớp môi trường LB ở nhiệt độ 45ºC đến gần miệng ống nghiệm và đậy nắp lại Ủ ống nghiệm ở 37ºC trong 5-7 ngày, theo dõi sự hình thành sinh khối dọc theo vết cấy để đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí.
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO
Để tiến hành thí nghiệm, nuôi vi khuẩn trong môi trường LB-lỏng trong 24 giờ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút để thu phần dịch nổi (enzyme thô) Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính với tinh bột 1%, CMC 1% và casein 1% Sử dụng khoan nút chai (đường kính d=0,7cm) để khoan lỗ ở giữa đĩa thạch, rồi dùng pipet hút 0,05ml dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch và ủ ở 4ºC trong 2 giờ, tiếp theo ủ ở 37ºC trong 24 giờ Kiểm tra hoạt tính amylase và cellulase bằng thuốc thử lugol, và protease bằng Comasi blue; nếu vi khuẩn có sinh, sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan, trong khi vùng tinh bột chưa bị phân giải vẫn có màu tím đậm.
Đánh giá khả năng sinh amylase, protease và cellulase thông qua việc đo đường kính vòng phân giải (D-d) tính bằng cm Trong đó, D là đường kính vòng phân giải và d là đường kính lỗ thạch Nếu giá trị D-d lớn hơn hoặc bằng 2,5 cm, thì hoạt tính sinh enzyme được coi là có.
17 ngoại bào rất mạnh, D-d ≥ 2,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào mạnh, D-d ≥ 1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào yếu
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG
- Cỏch 1: Hỳt 30àl dịch khuẩn được nuụi lắc ở mụi trường LB-lỏng trong
24 giờ vào môi trường LB-lỏng Ủ ở 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC , trong 24 giờ Đo OD 600nn rồi kết luận khả năng chịu nhiệt của các chủng đƣợc tuyển chọn
Để đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn, tiến hành lấy một khuẩn lạc đơn của chủng đã chọn và cấy ria trên môi trường LB-agar Sau đó, ủ ở các nhiệt độ 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC trong 24 giờ Kết quả hình thành khuẩn lạc tại các nhiệt độ khác nhau sẽ giúp rút ra kết luận về khả năng chịu nhiệt của các chủng được tuyển chọn.
2.4.42 Xác định khả năng chịu NaCl
Các chủng Bacillus có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối cao, điều này khác biệt so với nhiều loài vi khuẩn khác Trong bối cảnh tình trạng nhiễm mặn ngày càng gia tăng, việc thí nghiệm để xác định khả năng chịu mặn của các chủng Bacillus trở nên cần thiết Điều này hỗ trợ trong việc phát triển chế phẩm probiotic cho nuôi thủy sản và xử lý ao hồ.
Để tiến hành thí nghiệm, 30ml dịch khuẩn được nuôi lắc trong môi trường LB-lỏng trong 24 giờ, sau đó chuyển vào môi trường LB-lỏng với các nồng độ muối 1,5%; 2%; 3% và 5% Mẫu được ủ ở 37ºC trong 24 giờ Kết quả OD600 nm được đo ở các nồng độ muối khác nhau nhằm đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng đã được tuyển chọn.
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật thử nghiệm được thực hiện đối với các vi khuẩn gây bệnh như E Coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shigella và nấm men, theo phương pháp của Aslim và cộng sự (2005).
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên tắc này dựa trên khả năng kháng các vi sinh vật chỉ thị của 2 sản phẩm
Môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ lên đĩa Petri chứa vi khuẩn kiểm định và sau khi đông cứng, tiến hành đục lỗ thạch Dịch nuôi cấy đã được li tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút được nhỏ vào các lỗ đã đục và bảo quản ở 4ºC trong 6 giờ, sau đó chuyển đến 37ºC Sau 24 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn hình thành Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D, với công thức ∆D = D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ thạch.
QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC CHỦNG BACILLUS
Từ 3 mẫu đất thu thập đƣợc ở ruộng lúa ở tỉnh Cao Bằng phân lập đƣợc các chủng Bacillus megaterium trên môi trường Ashby-agar (không chứa Nitơ) thu đƣợc 3 dạng khuẩn lạc khác nhau, đƣợc kí hiệu là B1, B2, B3 Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, làm tiêu bản nhuộm Gram và khả năng sinh nội bào tử theo quy trình đã trình bày ở trên Kết quả đƣợc trình bày tóm tắt ở Bảng 3.1 và Hình 3.1
Bảng 3.1 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khu n lạc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khu n phân lập đƣợc STT
Hình thái khu n lạc trên môi trường Ashby-agar
Khả năng sinh nội bào tử
Trắng đục ở giữa và nhạt dần ra xung quanh, đường kính
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ hoặc xếp theo cụm
Trắng, bề mặt hơi bông xốp, có tia xung quanh, đường kính 3mm
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, xếp thành đơn hoặc đôi
B3 Có tia, mờ, đường kính
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, xếp đơn hoặc đôi
Hình 3.1 A, Ba dạng khuẩn lạc đặc trưng được làm thuần trên môi trường Ashby agar
B, Hình ảnh nhuộm gram của ba khuẩn lạc
Từ kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.1 cho thấy cả 3 chủng
Các chủng VK đều phát triển tốt trên môi trường Ashby agar và đều là vi khuẩn gram dương, thể hiện qua việc bắt màu tím kết tinh Tất cả ba chủng có khả năng sinh nội bào tử, cho phép chúng tồn tại ở nhiệt độ cao lên đến 80ºC Khi nhuộm bằng thuốc nhuộm xanh methylen và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính ×100, bào tử hiện rõ hình thái đặc trưng.
Hình 3.1.A,B cho thấy khuẩn lạc B3 có hình dạng lớn hơn so với các chủng B1 và B2, đồng thời có khả năng sinh nội bào tử khi chịu nhiệt độ cao lên đến 80ºC trong 20 phút Vi khuẩn này phát triển tốt nhất trên môi trường Asbhy, phù hợp với mô tả của Bacillus megaterium trong khóa phân loại của Bergey (1884) Do đó, B3 rất có khả năng là vi khuẩn Bacillus megaterium.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA NGUỒN CARBON
Từ phương pháp xác định khả năng đồng hóa được nêu trên ta thu được kết quả nhƣ Bảng 3.2:
Bảng 3.2 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của các chủng vi khu n
Khả năng đồng hóa Của chủng B1
Khả năng đồng hóa của chủng B2
Khả năng đồng hóa của chủng B3
Ghi chú: - : Không có khả năng đồng hóa
+ : Có khả năng đồng hóa
Theo Bảng 3.2, hai chủng B1 và B2 có khả năng đồng hóa tất cả các loại đường Chủng B3 có khả năng đồng hóa Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol, nhưng không đồng hóa được Xylose Từ đặc điểm sinh lý sinh hóa, vi khuẩn được xác định là Bacillus megaterium, phù hợp với khóa luận về khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng B3.
22 loại bergey (2004) và có khả năng là vi khuẩn Bacillus megaterium, tuy nhiên để khẳng định chính xác hơn cần định dạng bằng sinh học phân tử.
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS
Các đặc điểm của chủng vi khuẩn đã được xác định bao gồm khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường Ashby không chứa Nitơ, cũng như khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí Kết quả khả năng sinh catalase được trình bày trong Bảng 3.3 và Hình ảnh 3.3.
Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của Bacillus
STT Ký hiệu chủng vi khuẩn
Khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường Ashby không chứa Nitơ
Khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường kỵ khí
Ghi chú: -: Không có khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường kỵ khí +: Có khả năng sinh catalase
++: Sinh trưởng và tạo lượng sinh khối trung bình trên môi trường Ashby
+++: Sinh trưởng và tạo nhiều sinh khối trên môi trường Ashby không chứa Nitơ
Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khu n B2 và B3 trên môi trường cố định Nitơ
B, Hình ảnh các chủng vi khu n có khả năng sinh catalase
Kết quả từ Bảng 3.3 cho thấy ba chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường Ashby agar chuyển sang môi trường Ashby-lỏng, trong đó B3 thể hiện khả năng sinh trưởng hiếu khí tốt nhất trên môi trường không có Nitơ Đặc biệt, Bacillus megaterium là chủng duy nhất phát triển mạnh mẽ trong điều kiện này, phù hợp với nghiên cứu của Bergey (1884) Bảng 3.2 và Hình 3.2 cũng xác nhận rằng cả ba chủng đều thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí và có khả năng sinh trưởng trên môi trường.
Ashby agar và môi trường Ashby lỏng trong đó, đáng chú ý là về khả năng cố định Nitơ của chủng B3.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO
Thức ăn chăn nuôi chủ yếu bao gồm protein, xơ thô và tinh bột Tuy nhiên, việc tiết enzyme tiêu hóa ở dạ dày và ruột non còn hạn chế.
Khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật còn hạn chế, do đó, sự sinh sản các enzyme ngoại bào như amylase, protease và cellulase từ các chủng vi khuẩn là rất quan trọng Những enzyme này hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa các chất khó tiêu thành dạng dễ tiêu, giúp động vật hấp thu dinh dưỡng tốt hơn Vì lý do này, ba chủng Bacillus đã được chọn lọc và khảo sát khả năng sinh các enzyme ngoại bào.
3.4.1 Xác định hoạt tính amylase
Bảng 3.4 Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng vi khu n sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh bột 1% của Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau D-d (cm)
Hình 3.3 Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của các chủng Bacillus megaterium đã phân lập
Kết quả từ Bảng 3.3 và Hình 3.3 cho thấy ba chủng có khả năng phân giải tinh bột 1% rất mạnh Cụ thể, chủng B1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị cao nhất 2,40 cm tại 48 giờ, sau đó giảm xuống 2,36 cm ở 72 giờ Chủng B2 cũng có hoạt tính mạnh nhưng yếu hơn B1, đạt 2,00 cm trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, và giảm còn 1,87 cm ở 72 giờ.
B3 có hoạt tính mạnh nhất trong ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 48 giờ là 4,05 (cm) và giảm dần ở thời gian 72 giờ còn 3,97 (cm)
3.4.2 Xác định hoạt tính cellulase
Enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, dẫn đến sự phân hủy và hình thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme, như được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh CMC 1% của Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau D-d (cm)
Hình 3.4 Hoạt tính phân giải cellulase của các chủng Bacillus phân lập
Kết quả từ Bảng 3.4 và Hình 3.4 chỉ ra rằng ba chủng có khả năng phân giải CMC 1% rất mạnh Trong đó, chủng B1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất trong 24 giờ với giá trị đạt 2,50 cm, sau đó giảm dần ở thời gian 48 giờ.
Chủng B2 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở thời điểm 48 giờ với kích thước 2,75 cm, trong khi đó, hoạt tính yếu nhất của nó xuất hiện ở 72 giờ với kích thước giảm xuống còn 1,67 cm Ngoài ra, chủng B3 cũng cho thấy hoạt tính mạnh trong khoảng thời gian ba ngày.
26 chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 48 giờ là 2,65 (cm) và giảm dần ở thời gian
3.4.3 Xác định hoạt tính protease
Enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, dẫn đến sự phân hủy và hình thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme, được thể hiện rõ ràng trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6 Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh casein 1% của
Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Hình 3.5 Hoạt tính phân giải protease của các chủng Bacillus phân lập
Kết quả từ Bảng 3.6 và Hình 3.5 cho thấy ba chủng vi khuẩn có khả năng phân giải casein 1% rất mạnh Chủng B1 có hoạt tính mạnh nhất, đạt 3,30 cm sau 48 giờ, nhưng giảm xuống còn 2,26 cm sau 72 giờ Chủng B2 cũng thể hiện hoạt tính mạnh, đạt đỉnh 2,60 cm trong khoảng thời gian 24 đến 48 giờ, sau đó giảm nhẹ xuống 1,57 cm ở 72 giờ Cuối cùng, chủng B3 cũng có hoạt tính đáng kể.
27 mạnh và nhất trong ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 24 giờ là 5,50 (cm) và hoạt tính giữ nguyên ở thời gian 48 và 72 giờ là 5,43 (cm)
Các bước tiến hành xác định enzyme ngoại bào của ba chủng phân lập cho thấy tất cả các chủng Bacillus đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào Trong đó, chủng B3 nổi bật với hoạt tính mạnh nhất, cụ thể là hoạt tính phân giải tinh bột 1% đạt 4,05 cm, hoạt tính phân giải CMC đạt 2,65 cm, và hoạt tính phân giải casein 0,8% đạt 5,50 cm Dựa trên kết quả này, chủng B3 được chọn là Bacillus megaterium để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG
3.5.1 Xác định khả năng chịu nhiệt
Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng trong nuôi cấy Mỗi chủng thường có một giá trị nhiệt độ tối ưu trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm Do đó, việc khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng ở các nhiệt độ khác nhau là cần thiết, và kết quả được trình bày trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7 Khả năng chịu nhiệt của chủng L3 trên môi trường LB-lỏng và agar
Nhiệt độ nuôi cấy Môi trường LB-lỏng
Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau ở môi trường
LB-lỏng Ghi chú: A Nuôi ở nhiệt độ 40ºC; B Nuôi ở nhiệt độ 45ºC; C Nuôi ở nhiệt độ 50ºC và D Nuôi ở nhiệt độ 60ºC
Kết quả từ Bảng 3.7 và Hình 3.6 cho thấy các chủng phân lập có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 30-50°C, với sự sinh trưởng mạnh mẽ nhất ở khoảng 40-55°C sau 20 giờ nuôi cấy Tuy nhiên, ở nhiệt độ 45°C, sự phát triển của các chủng giảm sút Nhiệt độ lý tưởng để nuôi các chủng Bacillus megaterium B3 là trong khoảng 37-45°C.
3.5.2 Xác định khả năng chịu NaCl
Mục đích của thí nghiệm là xác định khả năng chịu mặn của vi khuẩn Bacillus megaterium B3, vì hầu hết các chủng Bacillus đều ưa mặn Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc đề xuất ứng dụng của vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm sinh học như phân bón hữu cơ và xử lý môi trường, đặc biệt cho các vùng đất ven biển hoặc khu vực ô nhiễm mặn Do đó, chúng tôi đã khảo sát khả năng chịu muối của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau, với kết quả được trình bày trong Hình 3.7a.
Ghi chú: a, A nồng độ NaCl 2%; B nồng độ NaCl 3%; C nồng độ NaCl 4% và
Biểu đồ khả năng chịu muối của vi khuẩn cho thấy sự phát triển của chủng B3 Bacillus megaterium trong các môi trường với nồng độ NaCl khác nhau Cụ thể, nồng độ NaCl được thử nghiệm bao gồm 1,5%, 2%, 3% và 5% Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.
Chủng phân lập B3 cho thấy khả năng chịu đựng nồng độ muối từ 2-5%, với sự sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ 1,5% (OD 600nm đạt 2,058) và giảm rõ rệt ở nồng độ 5% (OD 600nm đạt 1,440) Điều này cho thấy đây là một đặc tính ưu việt, phù hợp với nồng độ muối trong ao nước lợ tại Việt Nam (1,5-2,5%) Nhờ vào khả năng chịu muối rộng, chủng B3 rất thích hợp để phát triển thành chế phẩm sinh học, như phân bón sinh học và sản phẩm xử lý môi trường.
3.6 Xác định hoạt tính háng hu n
Khả năng đối kháng với vi khuẩn E Coli, Salmonella, Bacillus cereus, shigela và nấm men của chủng Bacillus megaterium B3 đƣợc trình bày ở Bảng 3.8
Bảng 3.8: Khả năng háng vi sinh vật kiểm định của vi khu n Bacillus megaterium B3
Hoạt tính kháng của vi sinh vật kiểm định
Ghi chú: -: Không có tính kháng vi khuẩn kiểm định
Chủng Bacillus megaterium B3 không có khả năng kháng lại các vi khuẩn như E.coli, Samonella, Shighella, B cereus và nấm men, theo kết quả thể hiện trong Bảng 3.9 Đặc điểm này cho phép chủng B3 có thể phối trộn với các vi sinh vật khác trong quá trình sản xuất chế phẩm sinh học.
Qua quá trình sàng lọc và tuyển chọn các đặc tính probiotic của các chủng Bacillus trong điều kiện in vitro, chúng tôi đã xác định chủng L3 là ứng cử viên tiềm năng cho chế phẩm probiotic nhờ vào nhiều ưu điểm vượt trội.
- Có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) với hoạt tính enzyme mạnh
- Có khả năng sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ cao (đến 60 o C)
- Có khả năng chịu muối ở nồng độ cao (NaCl 5%)
- Không đối kháng một số vi sinh vật kiểm định
Chủng Bacillus megaterium B3 đã được phân lập và cho thấy nhiều đặc điểm sinh học phù hợp, điều này khẳng định tiềm năng của nó trong việc sản xuất chế phẩm phân bón sinh học.
LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
- Đã phân lập đƣợc 3 chủng vi khuẩn có khả năng là Bacillus megaterium và cả 3 chủng đều thuộc chi Bacillus
- Xác định đƣợc hình thái khuẩn, hình dạnh tế bào của các chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium đã phân lập
- Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn gram dương có khả năng sinh nội bào tử và có kích thước tế bào lớn Loại vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường thiếu Nitơ, đồng thời có khả năng đồng hóa carbon từ đường Xylose và sản sinh catalase.
Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã được xác định với mức độ mạnh mẽ Cụ thể, hoạt tính phân giải tinh bột 1% đạt 4,05 cm, hoạt tính phân giải CMC mạnh mẽ đạt 2,65 cm, và hoạt tính phân giải casein 0,8% đạt 5,50 cm.
Nghiên cứu khả năng chống chịu của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium với các yếu tố môi trường bất lợi cho thấy vi khuẩn này có thể chịu nhiệt độ lên đến 60ºC và nồng độ NaCl cao tới 5% Việc xác định khả năng chịu đựng này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng Bacillus megaterium trong các lĩnh vực công nghiệp và sinh học.
- Không đối kháng một số vi sinh vật kiểm định
KIẾN NGHỊ
Do thời gian hạn chế nên nếu đƣợc tiếp tục chúng tôi sẽ tiến hành các công việc nhƣ sau:
- Tiến hành lặp lại các thí nghiệm để tăng tính chính xác
- Tạo chế phẩm probiotic kết hợp chủng B3 với các chủng vi khuẩn có lợi khác.