TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về vi sinh vật đối kháng
Trong tự nhiên, nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác, được gọi là vi sinh vật đối kháng Việc áp dụng hiện tượng này trong bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học, là một phương pháp quản lý bệnh cây trồng hiệu quả Biện pháp này sử dụng các thành phần trong hệ sinh thái để giúp cây trồng chống lại các tác nhân gây bệnh, đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững.
1.1.1 Vai trò của vi sinh vật đối kháng
Các loài vi khuẩn đối kháng tồn tại tự nhiên, chủ yếu có lợi cho con người, đặc biệt trong nông nghiệp Chúng sống ở vùng rễ cây trồng và trong đất, tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như kháng sinh, enzyme, và chất điều hòa sinh trưởng Những chất này hỗ trợ sự phát triển của cây trồng bằng cách kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, kích thích sinh trưởng và chuyển đổi dinh dưỡng trong đất từ dạng khó tiêu thành dạng dễ tiêu cho cây hấp thụ.
1.1.2 Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng đến các vi sinh vật gây bệnh
VSV đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với các vi sinh vật khác trong hệ sinh thái, chiếm ưu thế về dinh dưỡng, oxy, không gian sống và sinh kháng sinh, đồng thời tạo ra siderophore để phát triển mạnh mẽ.
Cơ chế tiết kháng sinh ức chế VSV gây bệnh
Kháng sinh là các chất có khả năng chống lại vi sinh vật gây hại, được sản xuất bởi vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong môi trường sống của chúng Những chất này có hoạt tính sinh lý cao và tác động chọn lọc, giúp ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác ngay cả ở nồng độ thấp Chúng có thể can thiệp vào hoạt động sinh lý của các chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, từ đó kềm hãm hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp đồng thời nhiều chất kháng sinh với cấu trúc hóa học tương tự nhau Quá trình này phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, bao gồm các gen chịu trách nhiệm tổng hợp kháng sinh, các gen tổng hợp tiền chất, enzyme và cofactor.
Siderophore là protein do vi sinh vật (VSV) sản sinh trong quá trình sinh trưởng, có khả năng hấp thụ ion Fe 3+ với ái lực cao, phục vụ cho sự sinh trưởng và hô hấp của VSV Sự hiện diện của siderophore làm cho môi trường xung quanh trở nên nghèo sắt, gây khó khăn cho các loài VSV khác trong việc hấp thụ đủ sắt cần thiết cho sự phát triển của chúng.
Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng)
Plant growth-promoting bacteria (PGPB) play a crucial role in enhancing plant growth by interacting with plant roots These beneficial microorganisms can induce systemic resistance (ISR) in plants, strengthening their defense against pathogens such as bacteria, fungi, and viruses This phenomenon is similar to systemic acquired resistance (SAR), which also enhances a plant's ability to resist diseases.
PGPR (vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng) là các vi khuẩn sống xung quanh vùng rễ cây, có khả năng hình thành khuẩn lạc và phát triển số lượng lớn Chúng giúp ngăn chặn các tác nhân gây bệnh thực vật thông qua cơ chế cạnh tranh chất dinh dưỡng và sắt, cũng như sản xuất kháng sinh và enzyme thủy phân, từ đó tạo ra hệ thống đề kháng cho cây.
1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
Trong tự nhiên, sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ, ánh sáng, tính đặc hiệu, mật độ…
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật (VSV), với mỗi loại VSV có giới hạn nhiệt độ phát triển riêng Dựa vào khoảng nhiệt độ tối ưu, VSV được chia thành ba nhóm: nhóm ưa ấm (nhiệt độ tối ưu từ 20 - 45°C), nhóm ưa lạnh (nhiệt độ tối ưu dưới 20°C) và nhóm ưa nóng (nhiệt độ tối ưu trên 45°C) Ở nhiệt độ quá thấp, VSV có thể tồn tại nhưng không phát triển, trong khi ở nhiệt độ cao hoặc rất cao, VSV sẽ bị tiêu diệt do protein đông đặc, enzyme bị phá hủy và tổn thương màng nguyên tương, dẫn đến thay đổi tính thẩm thấu và phá hủy cân bằng lý hóa trong tế bào.
Ánh sáng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử sinh sản, tổng hợp sắc tố và chuyển động hướng sáng của vi sinh vật Bức xạ ánh sáng có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của chúng.
Độ pH của môi trường ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động sống của vi sinh vật (VSV) bằng cách thay đổi sự cân bằng trao đổi chất giữa môi trường và VSV, thậm chí có thể dẫn đến cái chết của chúng Mỗi loại VSV chỉ thích hợp với một giới hạn pH nhất định, thường nằm trong khoảng từ 5,5 đến 8,5, với đa số ưa thích pH trung tính (pH = 7), do pH nội bào của tế bào sống cũng ở mức trung tính.
Áp suất thẩm thấu của môi trường xung quanh ảnh hưởng đáng kể đến tế bào vi sinh vật (VSV) do tính thẩm thấu của màng nguyên tương Hầu hết các VSV phát triển tối ưu khi môi trường có áp suất thẩm thấu khoảng 7 atm.
Trong dung dịch NaCl 0,9%, áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn môi trường nhược trương, dẫn đến việc nước bị hút vào tế bào, làm tế bào phình to Ngược lại, trong dung dịch ưu trương, áp suất thẩm thấu bên ngoài cao hơn, khiến nước thoát ra ngoài và làm tế bào teo lại.
Hàm lượng nước trong môi trường ảnh hưởng đến độ ẩm và vai trò của nước như một dung môi cho các chất khoáng dinh dưỡng, tham gia vào quá trình thủy phân Vi khuẩn cần độ ẩm cao, trong khi nấm men yêu cầu ít nước hơn, và nấm sợi có thể tồn tại trong điều kiện độ ẩm thấp Do đó, nước có thể được sử dụng để kiểm soát sự phát triển của từng nhóm vi sinh vật, với mỗi loại vi sinh vật sinh trưởng trong một giới hạn độ ẩm nhất định.
Trong quá trình tồn tại, vi sinh vật (VSV) phải đối mặt với sự cạnh tranh từ các VSV khác, điều này có thể dẫn đến việc chúng bị tiêu diệt hoặc phải tìm cách đồng tồn tại.
1.1.4 Các vi sinh vật đối kháng được ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây hại
Vi sinh vật gây bệnh cây trồng thường gặp
Fusarium là một chi lớn của nấm nito, thuộc nhóm hyphomycetes, phân bố rộng rãi trên toàn cầu Chúng có mặt ở nhiều môi trường khác nhau, từ sa mạc đến vùng nhiệt đới, nhờ khả năng thay đổi hình thái và sinh lý để thích nghi với điều kiện sống Nấm Fusarium chủ yếu tồn tại trong đất dưới dạng hoại sinh hoặc ký sinh, với phổ ký chủ rộng, bao gồm cả động vật và thực vật.
Fusarium sản xuất các độc tố chính như fumonisins và trichothecenes, thường nhiễm vào lúa mạch khi có mưa vào cuối mùa, gây ảnh hưởng kinh tế lớn cho ngành chế biến bia Từ năm 1991 đến 1996, tổng thiệt hại đối với lúa mạch và lúa mì tại Hoa Kỳ ước tính lên tới khoảng 3 tỷ USD.
Nấm Fusarium gây ra các bệnh thối thân, rễ và rụng lá trên thực vật, thường xuất hiện muộn trong giai đoạn sinh trưởng Biểu hiện bệnh rõ ràng là lá gốc chuyển từ xanh sang vàng, sau đó lan đến các lá phía trên Mặc dù lá bị vàng nhưng chưa rụng ngay, phần thân gần mặt đất khô và có màu vàng nhạt, với ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe không rõ ràng Phần gốc tiếp giáp với rễ có màu nâu xám, khác với vết thương do trầy xước Cây bệnh héo từ dưới lên trên, phần thân dưới và rễ bị thối, dễ dàng nhổ lên do sợi nấm làm tắc nghẽn các bó mạch dẫn, dẫn đến tình trạng héo và thối dần.
Nấm Fusarium moniliorme là nguyên nhân gây bệnh l a von, với các triệu chứng như cây phát triển cao vọt, cong queo, và lá chuyển từ màu xanh nhạt sang vàng gạch cƣa Cây bệnh cứng gi n và chết nhanh chóng, trong khi thân cây phát triển vượt trội với nhiều rễ phụ ở các đốt Hạt bị bệnh thường có hiện tượng lửng, lép, và có màu xám.
Nấm Fusarium verticillioides gây bệnh mốc hồng trên ngô, với triệu chứng đặc trưng là xuất hiện vết đốm nhỏ màu nâu trên thân cây, sau đó lan rộng thành vết thối xung quanh thân, dẫn đến tình trạng thối mục Khi gặp gió lớn, phần này dễ bị gãy Ngoài ra, nấm còn gây thối đen trên rễ và hiện tượng cây héo vàng.
Nấm Fusarium oxysprorum là tác nhân chính gây ra các bệnh như héo, thối nõn, thân, rễ và mầm cây trên nhiều loại cây trồng như thuốc lá, cà chua, khoai lang, khoai tây và hoa huệ Bào tử của nấm này có kích thước lớn, trong suốt, có nhiều vách ngăn và hình dạng như trăng khuyết với một đầu thắt lại giống bàn chân Ngoài ra, nấm còn có bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào, hình cầu hoặc bầu dục Một số loài Fusarium oxysprorum có thể có bào tử nhỏ, bào tử hậu và quả thể, hoặc không có bào tử hậu Nhiệt độ lý tưởng để nấm phát triển là một yếu tố quan trọng cần lưu ý.
Nhiệt độ tối ưu để phát triển bệnh là từ 30 độ C trở lên, trong khi điều kiện ẩm độ từ 90 - 95% giúp quá trình này diễn ra trong 4 - 5 ngày Tuy nhiên, nhiễm trùng qua hạt giống vẫn có thể xảy ra ở nhiệt độ thấp tới 14 độ C.
Bệnh bạc lá ở cây lúa
Bệnh bạc lá ở cây lúa lần đầu tiên được phát hiện tại Fukouka, Nhật Bản vào năm 1884 Ban đầu, nguyên nhân gây triệu chứng bệnh được cho là do acid đất, nhưng sau đó các nhà khoa học đã xác định rằng nguyên nhân thực sự là do vi khuẩn Theo Ishiyama (1922), vi khuẩn gây bệnh thuộc loại Bacillus oryzae.
Vi khuẩn này sau đó đƣợc Tagami, Mizukami (1962), Wakimoto (1969) đặt tên là Pseudomonas oryzae, về sau Dowson đặt tên là Xanthomonas oryzae
Bệnh bạc lá ở cây lúa đã trở thành một vấn đề phổ biến tại nhiều vùng trồng lúa trên thế giới từ cuối thập kỷ 60 đến đầu thập kỷ 80 của thế kỷ XX Đặc biệt, bệnh này ảnh hưởng nghiêm trọng đến các nước trồng lúa ở châu Á như Ấn Độ (1990), Philippines (1957) và Indonesia.
Bệnh bạc lá lúa, được phát hiện ở Việt Nam sau năm 1945, đã bùng phát mạnh mẽ do phong trào thâm canh lúa Tình trạng này đã dẫn đến sự phát triển phức tạp của bệnh, gây hại nặng nề trong vụ mùa và thường xuyên tạo thành dịch lớn ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng từ năm 1950 đến 1957.
1968 – 1975 [10] Trong những năm gần đây, ở miền Bắc, thiệt hại do bệnh bạc lá l a có xu hướng tăng trở lại và gây hại ở cả vụ xuân
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có hình dạng gậy ngắn, hai đầu hơi tròn, với kích thước 1 - 2 x 0,8 - 1μm và một lông roi ở một đầu Trong môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn này có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn và bề mặt ướt, đồng thời là vi khuẩn hiếu khí và nhuộm gram âm.
Vi khuẩn này không phân giải nitrat, không dịch hóa gelatin, không tạo NH3, nhưng có khả năng tạo H2S và khí trong môi trường có đường mà không sinh ra acid.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30 o C, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5 o C, tối đa 40 o C Nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 53 o C
Xanthomonas oryzae có khả năng sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 –
pH thích hợp cho sự tồn tại của chất này là khoảng 6,8 – 7,2, với thời gian tồn tại ngắn trong đất từ 15 đến 38 ngày và lâu hơn trong hạt giống, lên đến 7 - 8 tháng, trong khi chỉ kéo dài 3 - 4 tháng trong rơm.
Vi khuẩn xâm nhập một cách thụ động qua thủy khổng và lỗ khí trên mép lá Khi tiếp xúc với bề mặt có màng nước, vi khuẩn dễ dàng di chuyển và xâm nhập vào bên trong lỗ khí, cũng như qua các vết thương, từ đó sinh sản và gia tăng số lượng, lan rộng qua các bó mạch dẫn.
Trong điều kiện mưa ẩm, vi khuẩn phát triển mạnh mẽ và tiết ra giọt vi khuẩn trên bề mặt vết bệnh Gió và sự va chạm giữa các lá lúa giúp lây lan bệnh sang các lá khác, dẫn đến sự xâm nhiễm lặp lại trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây.
Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng
Vi sinh vật đối kháng với bệnh cây trồng đã được nghiên cứu và ứng dụng từ đầu thế kỷ XX, với khoảng 30 quốc gia như Nga, Mỹ, Đức, Ấn Độ, và Thái Lan tham gia vào việc phát triển phương pháp này Hiện nay, hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng đã được xác định và kiểm soát nhờ vào sự can thiệp của vi sinh vật đối kháng.
Nghiên cứu của Elad và cộng sự (1982) cho thấy chế phẩm Trichoderma sp có khả năng phòng trừ bệnh hại cây trồng, giảm đáng kể tỷ lệ cây bị bệnh và giúp cây khỏe mạnh hơn, tăng cường sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, đồng thời kích thích sinh trưởng Dutta và Das (1999) đã thử nghiệm khả năng phòng trừ sinh học của Trichoderma harzianum bằng cách sử dụng bào tử nấm trong môi trường rắn để kiểm soát nấm Rhizoctonia solani trên cây đậu tương Việc bón Trichoderma harzianum vào đất với tỷ lệ phù hợp đã cho thấy hiệu quả tích cực trong việc bảo vệ cây trồng.
1:10 theo thể tích đã ngăn chặn đƣợc bệnh ở thân và rễ do nấm Rhizoctonia solani gây hại đồng ruộng
Nghiên cứu của Ganesan và Gnanamanickam (1987) cho thấy vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Sclerotium rolfsii, nguyên nhân gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở lạc Cụ thể, vi khuẩn này không chỉ giảm khả năng nảy mầm của hạch nấm mà còn làm giảm tỷ lệ bệnh trong điều kiện nhà kính Kết quả này được xác nhận thông qua các thí nghiệm in vitro, khẳng định tiềm năng ứng dụng của Pseudomonas fluorescens trong việc kiểm soát bệnh héo rũ trên cây lạc.
Theo nghiên cứu của Kishore và cộng sự (1995), 393 chủng vi khuẩn nội sinh Pseudomonas đã được sử dụng để xử lý hạt giống lạc và tưới vào đất nhằm đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thối trắng hại lạc.
Sclerotium rolfsii Trong đó, 12 chủng có khả năng giảm tỉ lệ bệnh cây chết
Nghiên cứu in vitro với 12 chủng này cho thấy chúng có khả năng giảm sự phát triển của nấm Sclerotium rolfsii, đồng thời các hoạt chất tiết ra từ chúng có khả năng ức chế enzyme phân hủy vách tế bào của nấm.
Nghiên cứu của Anand và Kulothungan (2010) cho thấy các chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phân lập từ rễ cây lạc khỏe có khả năng đối kháng với nấm Aspergillus niger gây bệnh héo rũ gốc Kết quả in vitro cho thấy 5 trong số 60 chủng Pseudomonas fluorescens có khả năng tạo ra enzyme thủy phân như protease, lipase và các hợp chất thứ cấp như xianhydric acid, salicylic acid Các chủng này cũng giảm tỷ lệ bệnh xuống 8,27%, trong khi đối chứng là 18,77%, và năng suất quả khô đạt 1800,48 kg/ha so với 1557,14 kg/ha ở đối chứng.
Viện Bảo vệ Thực vật đã phân lập các chủng Trichoderma từ nhiều nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của chúng đối với một số nấm gây bệnh Các nghiên cứu cho thấy các chủng nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế từ 67,7% đến 85,5% đối với các nấm gây hại như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium sp, và Aspergillus sp Viện cũng tìm kiếm phương pháp nuôi cấy để phát triển chế phẩm từ các chủng nấm này.
Dương Minh và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và tuyển chọn các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp có hiệu quả trong việc phòng ngừa và trị các bệnh do Phytophthora palmivora gây hại trên cây sầu riêng tại đồng bằng sông Cửu Long Các chủng Trichoderma được phân lập tại Việt Nam cho thấy khả năng tiết enzyme thủy phân đáng kể.
Nam cũng đã đƣợc nghiên cứu
Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1998) đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis để ứng dụng trong việc diệt trừ sâu bệnh hại Đinh Minh Hiệp và cộng sự (2007) đã tiến hành khảo sát hoạt tính của các enzyme như chitinase, β-glucanase, cellulose, pectinase, amylase và protease.
Nghiên cứu đã phân lập 92 chủng Trichoderma tại Việt Nam và cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hoạt tính của các enzyme giữa các chủng, ngoại trừ enzyme protease Đặc biệt, 26 trong số 92 chủng Trichoderma được chọn ra có khả năng sinh tổng hợp cao các enzyme chitinase, β-glucanase, cellulose, pectinase và amylase.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng một số chủng vi sinh vật gây bệnh ở thực vật.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng từ các mẫu đất thu thập đƣợc
Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh là một phương pháp quan trọng trong nông nghiệp Các chủng vi sinh vật này có thể ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas oryzae, nguyên nhân gây bệnh bạc lá trên cây lúa, nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng trên cây cà chua, và vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên phong lan Việc nghiên cứu và phát triển những chủng vi sinh vật này không chỉ giúp bảo vệ mùa màng mà còn góp phần vào việc nâng cao năng suất nông sản.
Xác định các đặc tính sinh lý và sinh hóa của các chủng vi sinh vật đối kháng là bước quan trọng trong nghiên cứu, giúp phục vụ cho việc định danh loài trong tương lai Các đặc tính này không chỉ giúp phân loại các chủng vi sinh vật mà còn cung cấp thông tin cần thiết cho việc ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp và y học.
+ Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
+ Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease)
+ Xác định hoạt tính catalase
+ Xác định khả năng lên men các loại đường
Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất lấy từ núi Luốt thuộc trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam và ruộng lúa ở thị trấn Xuân Mai, đƣợc kí hiệu theo bảng 2.1
Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu đất
STT Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu mẫu đất
1 Sườn phía Đông núi Luốt SN
2 Ruộng lúa ở thị trấn Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà
Các chủng vi sinh vật kiểm định do Phòng Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh cung cấp bao gồm những vi sinh vật gây bệnh phổ biến ở thực vật.
- Nấm Fusarium oxysprorum gây bệnh héo vàng trên cây cà chua, bệnh thối thân, rễ trên cây ớt,… (Hình 2.1A)
- Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá l a (Hình 2.1B)
- Vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên phong lan (Hình 2.1C)
Hình 2.1 Hình dạng tế bào vi sinh vật gây bệnh
Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), l vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím,…
Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, các dụng cụ cần thiết bao gồm đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong và que trang Tất cả các dụng cụ thủy tinh này đều phải được xử lý sạch sẽ, bao gói cẩn thận và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong việc nuôi cấy.
- Hóa chất cơ bản: Ethanol, K 2 HPO 4 , Glycerol, NaCl, Pepton,…
- Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh họá: acid sulfanilic,… Thuốc thử Lugol, Phenol Red,…
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu và thành phần môi trường, mục đích sử dụng được thống kê ở Bảng 2.3
Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật STT Môi trường Thành phần Khối lượng (g/l) Mục đích sử dụng
Phân lập các chủng vi khuẩn đối kháng
Phân lập các chủng xạ khuẩn phục vụ tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng
Xác định hoạt tính đối kháng nấm
Khoai tây NaHPO4.12H2O Ca(NO3)2.4H2O Pepton Sucrose Agar
Xác định hoạt tính đối kháng vi khuẩn
Pepton Cao nấm men NaCl Agar
Xác định hoạt tính đối kháng vi khuẩn
Chú thích: Khoai tây đun sôi lấy dịch chiết
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu
Mẫu đất được lấy trực tiếp tại sườn n i Luốt thuộc trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam và ruộng l a thuộc thị trấn Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội
Phương pháp lấy mẫu đất bao gồm việc sử dụng thìa hoặc dụng cụ lấy mẫu để gạt nhẹ lớp đất mặt, sau đó thu thập một lượng đất tơi gần khu vực rễ cây, nơi có nhiều vi sinh vật có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Mỗi mẫu đất cần được ghi nhãn rõ ràng với thông tin như tên mẫu, thời gian, địa điểm và tên người lấy mẫu Cuối cùng, đất cần được bảo quản trong tủ ở nơi thoáng mát để đảm bảo chất lượng mẫu.
Loại bỏ những cục đất to, đá, sỏi trong mẫu và sử dụng cho tiến hành phân lập vi sinh vật
2.5.2 Phương pháp pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu là một bước quan trọng trong phân tích vi sinh vật (VSV) Việc thực hiện pha loãng ở nồng độ thích hợp không chỉ hỗ trợ trong quá trình định lượng mà còn nâng cao độ chính xác trong phân tích VSV.
Cân 1 - 2g mẫu đất nghiền nhỏ trong cối chày sứ, dùng rây lọc loại bỏ đất to, nhỏ 10ml nước cất và dùng đũa khuấy đều, để lắng trong 5 ph t
Chuẩn bị 5 ống nghiệm được đánh dấu từ 1 đến 5, mỗi ống bổ sung 9ml nước cất Hút 1ml dịch mẫu cho vào ống 1 và khuấy đều để có nồng độ pha loãng 10^-1 Tiếp theo, chuyển 1ml dung dịch từ ống 1 sang ống 2 để đạt nồng độ pha loãng 10^-2 Lặp lại quy trình này cho các ống 3, 4 và 5 để thu được các nồng độ pha loãng lần lượt là 10^-3, 10^-4 và 10^-5.
2.5.3 Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật thuần khiết
Nguyên tắc phân lập vi sinh vật bao gồm việc tách rời các tế bào vi sinh vật và nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng, nhằm tạo ra các khuẩn lạc riêng biệt Đối với hầu hết các mẫu nghiên cứu, quá trình này thường diễn ra qua các bước để thu được vi sinh vật ở dạng thuần khiết.
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu
- Phân lập vi sinh vật thuần khiết
- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc
Hút 50 - 100μm dịch mẫu ở nồng độ pha loãng thích hợp (10 -3 , 10 -4 , 10 -5 ) nhỏ lên bề mặt môi trường King B agar đã được khử trùng và đổ ra đĩa petri Dùng que trang trải đều dịch mẫu ra bề mặt môi trường đến khi thấy sít bề mặt thì dừng lại Bọc kín bằng giấy parafilm, nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 - 32 o C
Để tách và thuần khiết khuẩn lạc, cần chọn những khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa petri và cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy chuyển một lần Sau đó, đặt ống nghiệm vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 - 32 độ C Sau khoảng thời gian thích hợp, cấy lại ra đĩa petri để tinh sạch chủng VSV, thực hiện quá trình này nhiều lần Cuối cùng, kiểm tra độ thuần khiết của chủng VSV thông qua việc quan sát vết cấy và tính đồng nhất về màu sắc, hình dạng khuẩn lạc.
2.5.4 Phương pháp bảo quản giống
Nguyên tắc bảo quản giống là giữ nguyên phẩm chất ban đầu của giống, nhằm phục vụ cho nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa.
- Bảo quản giống trên ống thạch nghiêng
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp với từng loại vi khuẩn tương ứng và ống nghiệm đã hấp khử trùng
Đổ môi trường vào từng ống và nghiêng để khô Sử dụng que ria để chấm một khuẩn lạc và cấy vào ống thạch theo đường zic zac Lặp lại quy trình này với các chủng khác, mỗi chủng cần thực hiện trong 2 ống.
+ Bao gói và ủ ở nhiệt độ 37 0 C, sau 24 giờ có thể cho vào tủ lạnh để bảo quản giống Phương pháp này có thể bảo quản giống từ 1 - 2 tháng
- Bảo quản VSV ở - 80 0 C trong glycerol
+ Chuẩn bị glycerol và ống Eppendorf đã hấp khử trùng
Để chuẩn bị dịch canh trường vi khuẩn, cần bảo quản vi khuẩn đã nuôi trong 24 giờ Tỉ lệ bảo quản nên là 20 - 25% dịch glycerol trộn với 75 - 80% dịch canh trường vi khuẩn nuôi từ 16 - 18 giờ Sau đó, bao gói và lưu trữ trong tủ lạnh ở -80°C để đảm bảo chất lượng.
2.5.5 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
2.5.5.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm
Nấm Fusarium oxysprorum, vi khuẩn Xanthomonas oryzae và Erwinia carotovora được cấy trên môi trường PGA, Wakimoto và LB Sau đó, sử dụng que cấy đã khử trùng để chấm vi sinh vật cần xác định hoạt tính lên bề mặt thạch Đĩa nuôi cấy được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 - 32 độ C trong thời gian từ 1 đến 3 ngày tùy thuộc vào loại nấm và vi khuẩn.
Quan sát hiện tượng trên bề mặt môi trường trong đĩa petri cho thấy nếu vi sinh vật (VSV) có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh, sẽ hình thành vòng đối kháng (không có VSV gây bệnh) xung quanh khuẩn lạc.
2.5.5.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp khoan lỗ thạch
Trong quá trình nuôi cấy lắc vi sinh vật, tế bào vi sinh vật tiết ra enzyme và chất kháng sinh Khi thu dịch nuôi thử nghiệm trên môi trường thạch có vi khuẩn và nấm kiểm định, nếu dịch nuôi chứa hoạt chất kháng khuẩn, sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn xung quanh lỗ thạch, tạo ra vòng trong suốt không có sự xuất hiện của vi khuẩn, được gọi là vòng kháng khuẩn.
- Chủng vi sinh vật đã đƣợc phân lập đem nuôi cấy lắc ổn nhiệt 30 0 C với tốc độ lắc 150 v ng ph t trong 72h trong môi trường King B và Gause I
- Ly tâm dịch nuôi lắc với tốc độ 6000 v ng ph t trong 5 ph t để thu dịch pha trên
Cấy 50μl dịch các chủng vi sinh vật kiểm định, bao gồm nấm Fusarium oxysporum trên môi trường PGA, vi khuẩn Xanthomonas oryzae trên môi trường Wakimoto và vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường LB.
- Dùng đầu côn vô trùng (đường kính d = 8 mm) khoan lỗ ở giữa đĩa chứa vi sinh vật kiểm định
Nhỏ 100μl dịch pha sau khi ly tâm từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn vào các lỗ thạch, sau đó bọc parafilm và bảo quản ở 4°C trong 2-4 giờ để xác định hoạt tính.
- Đặt trong tủ ấm ở 30 - 32 0 C, tùy thuộc vào chủng nấm và vi khuẩn mà thời gian nuôi cấy có thể từ 1 - 4 ngày hoặc nhiều hơn
- Hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn D = D - d (mm)
D: đường kính v ng phân giải d: đường kính lỗ thạch (d = 8mm)
Trị số D – d ≥ 20 mm : Hoạt tính đối kháng (HTĐK) rất mạnh;
D – d = 0 : không đối kháng, kí hiệu (-)
+ Nhƣ vậy trị số D - d (mm) càng lớn, hoạt tính ức chế của chủng vi sinh vật nghiên cứu càng mạnh
+ Dựa vào v ng ức chế vi sinh vật kiểm định, chọn lọc các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh nhất
2.5.6 Xác định đặc điểm hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật đối kháng đã tuyển chọn
Xác định đặc điểm hình dạng tế bào của vi khuẩn và xạ khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp nhuộm màu Gram
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod, hai loại phức chất khác nhau được hình thành.