TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về vi-rút cúm A
1.1.1 Khái quát và phân loại vi-rút cúm A
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm, do vi-rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Vi-rút này có genome RNA đơn, sợi (-), và phân đoạn Họ Orthomyxoviridae bao gồm bốn chi chính: Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C và Thogotovirus.
Việc phân loại vi-rút cúm dựa vào sự hiện diện của các kháng nguyên glycoprotein bề mặt, bao gồm Hemagglutinin (H) - glycoprotein gây ngưng kết hồng cầu, và Neuraminidase (N) - men tan nhầy Các loại vi-rút cúm được phân loại theo các kháng nguyên này.
Vi-rút cúm A (influenza A virus) là tác nhân gây bệnh cúm ở cả động vật và con người, có khả năng bùng phát thành dịch và được xem là loại vi-rút cúm nguy hiểm nhất Loại vi-rút này được phân loại thành nhiều phân type khác nhau dựa trên hai glycoprotein kháng nguyên bề mặt là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), với 18 phân type HA (H1-H18) và 11 phân type NA (N1-N11).
Vi-rút cúm (influenza type) chủ yếu xuất hiện ở người và không bao gồm các phân nhóm khác Mặc dù vi-rút cúm có khả năng gây bệnh nặng, nhưng nó ít gây thành dịch hơn so với vi-rút cúm A.
Vi-rút cúm C (influenza type C): Người bị nhiễm vi-rút cúm C có thể biểu hiện các triệu chứng ở dạng nhẹ Vi-rút cúm C không gây thành dịch
Các phân type virus cúm A đƣợc ghi nhận đã gây dịch hoặc đại dịch ở người trong các thời kỳ lịch sử là: H2N8 (1889-1890), H3N8 (1900-1903), H1N1 (1918-1919 và 1946-1947; 1977-1978), H2N2 (1957-1958), H3N2 (1968-1969)
1.1.2 Danh pháp vi-rút cúm
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã thiết lập quy định thống nhất về danh pháp vi-rút cúm, trong đó vi-rút được phân lập từ người bệnh sẽ được ký hiệu theo một thứ tự cụ thể.
Tuýp huyết thanh được phân lập từ người tại Việt Nam, với mã số A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), cho thấy thời gian và loại hình phân tuýp theo kháng nguyên HA và NA.
Vào năm 1994, vi-rút được phân lập có kháng nguyên HA thuộc loại H5 và NA thuộc loại N1 Đối với vi-rút phân lập từ vật bệnh, thông tin bao gồm: Tên Serotype, loài động vật bị nhiễm, vùng địa lý phân lập, số hiệu đăng ký chủng vi-rút, thời gian phân lập và loại hình phân type HA(H) và NA(N).
Ví dụ: /duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1): Chủng đƣợc phân lập từ vịt tại Việt Nam, kí hiệu chủng ST0970, năm phân lập 2009, có kháng nguyên
HA là H5 và NA là N1 [1]
1.1.3 Cấu trúc vi-rút cúm A
Vi-rút cúm A có cấu trúc gồm ba phần chính: lõi (genome) chứa thông tin di truyền, lớp vỏ protein (capsid) bảo vệ lõi genome, và lớp vỏ lipoprotein (envelope) bao bọc bên ngoài capsid.
Hình 1.1 Cấu trúc vi-rút cúm A [25]
1.1.3.1 Vỏ của vi-rút cúm A
Vỏ vi-rút có vai trò quan trọng trong việc bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi-rút Cấu trúc của vỏ vi-rút được hình thành từ màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, và được đặc hiệu hóa bằng cách gắn các protein màng của vi-rút.
Các hạt vi-rút cúm A có hình dạng đa dạng, bao gồm hình cầu hoặc hình khối đa diện với đường kính từ 80 đến 120 nm, và đôi khi xuất hiện dưới dạng hình sợi Khối lượng phân tử của chúng khoảng 250 triệu Da.
Bề mặt vi-rút có khoảng 500 "gai mấu" dài 10 - 14 nm và đường kính 4 - 6 nm, là các kháng nguyên vỏ vi-rút, chủ yếu là glycoprotein bao gồm HA, NA, MA cùng các dấu ấn khác Tỷ lệ phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA là khoảng 1NA/4HA, hai loại protein kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi-rút vào tế bào cảm nhiễm.
1.1.3.2 Hệ en và các protein của vi-rút cúm A
Hệ gen của vi rút cúm A bao gồm 8 phân đoạn RNA đơn âm riêng r , ký hiệu bằng số từ 1 - 8 hoặc ký hiệu theo tên các protein tương ứng là P 2,
P 1, PA, HA, NP, NA, M và NS Tám phân đoạn RNA mã hóa cho 10 hoặc
11 loại protein (tùy theo từng chủng vi-rút mà có thể có hoặc không có protein P 1-F2), tất cả đều là các protein cấu trúc, trừ NS1 và P 1-F2 [3]
Bảng 1.1 Các phân đoạn RNA và chức năn của vi-rút cúm A
Phân đoạn RNA Mã hóa protein Chức năn
Tiểu đơn vị gắn mũ chụp, polymerase, quyết định độc lực
Tiểu đơn vị xúc tác của RNA polymerase
Tiểu đơn vị, RNA polymerase
4 Hemagglutinin (HA) Gắn với thụ thể trên màng tế bào chủ, dung hợp màng tế bào chủ và vi-rút Khởi đầu quá trình xâm nhiễm
5 Nucleoprotein (NP) Tổng hợp vi-rút
6 Neuraminidase (NA) Tránh sự kết tụ vi-rút và hỗ trợ giải phóng phần tử vi-rút mới
7 Matrix protein (MP) Tương tác với bộ gen và các nhân tố ngoại nhân, hỗ trợ đóng gói vi-rút
Hình 1.2 Các phân đoạn gen và các protein của vi-rút
Tạo kênh ion, kiểm soát pH trong Golgi của quá trình tổng hợp HA và cởi bỏ lớp vỏ virion
Kiểm soát RNA sau phiên mã, trung hòa interferon
Hỗ trợ sự di chuyển ra ngoài nhân của RNA vi- rút, đóng gói vi-rút
1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm của vi-rút cúm A/H5N1 trong tế bào chủ
Vi-rút cúm A/H5N1 là một loại vi-rút kí sinh nội bào bắt buộc, chủ yếu xâm nhập và nhân lên trong các tế bào biểu mô của đường hô hấp và đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm.
Quá trình xâm nhiễm virus bắt đầu khi hemagglutinin (HA) gắn kết với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm nhiễm, sau đó giải phóng hệ gen của virus vào bào tương của tế bào đó.
Trong bào tương tế bào nhiễm, vi-rút lợi dụng bộ máy sinh học của tế bào chủ để tổng hợp protein vi-rút và enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp), loại enzyme không có ở tế bào chủ Enzyme này xúc tác cho việc tổng hợp genome RNA từ sợi khuôn RNA Phức hợp protein – RNA của vi-rút sau đó được vận chuyển vào nhân tế bào.
Trong tế bào, RNA của vi-rút được tổng hợp từ các sợi âm của hệ gen vi-rút, tạo thành các sợi dương nhờ enzyme RNA-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa ở đầu 3’- và kết hợp với nucleoprotein (NP) để hình thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh, sau đó được vận chuyển ra bào tương Đồng thời, RNA thông tin của vi-rút cũng được sao chép qua hệ thống enzyme tại từng phân đoạn gen, với enzyme PB2 gắn thêm 10.
12 nucleotide Adenin ở đầu 3’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của vi-rút [19]
Kháng nguyên NA của vi-rút cúm
1.2.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của kháng nguyên NA
Phân đoạn NA là một gen kháng nguyên của vi-rút, có chiều dài thay đổi theo từng chủng vi- rút cúm A: ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp [12]
Neuraminidase (NA) là một kháng nguyên bề mặt có tính chất enzyme, được mã hóa bởi một đoạn gen Hiện tại, kháng nguyên NA được phân thành 11 phân type từ N1 đến N11, với khối lượng phân tử ước tính khoảng 50.000 Da, nhưng thực tế dao động từ 50.000 đến 60.000 Da.
Phân tử NA có cấu tạo dạng nút lồi hình nấm với đầu tự do chứa vùng hoạt động, bao gồm 4 dưới đơn vị giống hình cầu trên một mặt phẳng, trong khi phần kị nước gắn vào vỏ capsid.
Neuraminidase đóng vai trò quan trọng trong việc cắt đứt liên kết glycosid giữa axit sialic của tế bào chủ và glycoprotein trên bề mặt virus, cho phép virus xâm nhập vào tế bào Quá trình này không chỉ giúp virus lây nhiễm mà còn hỗ trợ các hạt virus mới tách ra khỏi bề mặt tế bào nhiễm, từ đó phát tán trong cơ thể vật chủ.
Các thuốc ức chế neuraminidase (NAI) đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh cúm, giúp ngăn chặn sự lây lan của vi-rút trong cơ thể vật chủ.
Vi-rút H5N1 rất nhạy cảm với thuốc ức chế neuraminidase như Oseltamivir và Zanamivir, được WHO khuyến cáo là thuốc đầu tay cho điều trị và dự phòng nhiễm H5N1 Tuy nhiên, gần đây, một số nghiên cứu cho thấy vi-rút H5N1 đã xuất hiện các đột biến kháng Oseltamivir, trong đó có sự thay thế His274Tyr trên gen NA liên quan đến khả năng kháng thuốc Ngoài ra, các thay thế axit amin ở một số vị trí khác như Arg292Lys, Glu119Val và Asn294Ser cũng làm giảm nhạy cảm của vi-rút với Oseltamivir.
Nghiên cứu về gen NA của vi-rút cúm A cho thấy phần đầu 5’ của gen này có tính biến đổi cao, ảnh hưởng đến khả năng thích ứng và gây bệnh của vi-rút trên nhiều vật chủ khác nhau Đặc biệt, tất cả các chủng vi-rút cúm A/H5N1 được phân lập từ năm 2003 đến nay đều ghi nhận hiện tượng đột biến mất đoạn gen mã hóa cho vùng "thân" của protein NA, dẫn đến sự mất mát một số axit amin quan trọng.
68 đối với clade 1 và 2 và mất các axit amin từ 54-72 đối với clade 3)
1.2.2 Vai trò của kháng nguyên NA
Kháng nguyên NA phá vỡ liên kết giữa gốc Sialic acid trên màng tế bào nhiễm và phân tử carbohydrate của protein HA, dẫn đến việc giải phóng hạt vi-rút khỏi màng tế bào Quá trình này không chỉ thúc đẩy sự lây nhiễm của vi-rút trong cơ thể vật chủ mà còn ngăn cản sự tập hợp của các hạt vi-rút mới trên màng tế bào.
NA tham gia vào quá trình phân cắt liên kết Sialic acid trong giai đoạn hòa màng, thúc đẩy quá trình cởi áo uncoating Điều này giúp giải phóng hệ gen của vi-rút vào bào tương tế bào nhiễm, từ đó tăng tốc độ nhân lên của vi-rút.
NA phân cắt liên kết glycoside, giải phóng acid neuraminic, làm giảm độ dày của màng nhầy trên bề mặt biểu mô đường hô hấp Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho vi-rút tiếp cận nhanh chóng tế bào biểu mô và vượt qua các chất ức chế không đặc hiệu.
Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của
Enzyme NA đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường độc lực của vi-rút cúm A trong cơ thể vật chủ Vì lý do này, NA trở thành mục tiêu chính cho các loại thuốc và hóa dược ức chế vi-rút không đặc hiệu, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược Tamiflu) Thuốc này hoạt động bằng cách phong tỏa enzyme NA, ngăn chặn sự giải phóng các hạt vi-rút mới ra khỏi tế bào, từ đó bảo vệ cơ thể khỏi sự lây nhiễm.
NA là một kháng nguyên bề mặt của vi-rút, đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ Sự hiện diện của NA giúp sinh ra các kháng thể đặc hiệu, có khả năng phong tỏa protein NA của các chủng vi-rút đang nhiễm.
Kháng nguyên NA và HA của vi-rút cúm A là những mục tiêu chính trong cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể Chúng cũng là nền tảng cho việc phát triển các vắc-xin phòng cúm cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và giảm thiểu nguy cơ lây truyền sang người.
Hình 1.4: NA bị bao vây bởi chất ức chế
Hình1.5: Liên kết giữa NA và các kháng thể.
Giới thiệu về vắc -xin phòng chống cúm A/H5N1
1.3.1 Nguyên tắc chung của việc phát triển chủng dự tuyển vắc-xin phòng chống cúm A/H5N1
Phát triển chủng dự tuyển vắc-xin đại diện cho mỗi vùng lãnh thổ là chủ trương chung trong chương trình toàn cầu phòng chống cúm A/H5N1
Chủng vi-rút phát triển vắc-xin cần có tính tương đồng về kháng nguyên và di truyền với chủng đang lưu hành Vắc-xin cúm gia cầm A/H5N1 được phát triển bằng công nghệ di truyền ngược và phải trải qua kiểm tra an toàn cũng như khả năng sinh miễn dịch trước khi sản xuất lô vắc-xin quy mô pilot cho thử nghiệm lâm sàng Sau khi đạt tiêu chí an toàn và miễn dịch, vắc-xin sẽ được sản xuất quy mô lớn để dự trữ quốc gia phòng ngừa đại dịch cúm Các công ty sản xuất vắc-xin cần tuân thủ quy định của cơ quan chức năng và đảm bảo chủng vắc-xin có khả năng miễn dịch chéo với các chủng H5N1 đang lưu hành hoặc mới xuất hiện.
1.3.2 Các chủng vi-rút vắc-xin dự tuyển
Các chủng vi-rút đại diện cho subclade 1 (A/Indonesia/5/2005) và subclade 2, bao gồm A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005, A/Whooper swan/Mongolia/244/2005 và A/turkey/Turkey/1/2005, đã được chọn để thu nhận gen HA và NA nhằm phát triển chủng dự tuyển vắc-xin bằng công nghệ di truyền ngược Chủng tham chiếu A/PR8/34 cung cấp các gen mã hóa polymerase (PB1, PB2, PA), nucleoprotein (NP), matrix protein (M1, M2) và protein phi cấu trúc (NS1, NS2) Phân tích bằng phản ứng HI cho thấy các chủng dự tuyển vắc-xin có đặc tính kháng nguyên tương đồng với chủng gốc và các chủng cùng subclade đang lưu hành Dựa trên kết quả phân tích di truyền, chủng dự tuyển vắc-xin từ subclade 3 cũng đã được tạo ra dựa trên chủng gốc A/Anhui/1/2005.
1.3.3 Khuyến cáo cho việc sử dụng các chủng dự tuyển vắc-xin
Các chủng dự tuyển vắc-xin thuộc clade 1 đƣợc phát triển bằng công nghệ di truyền ngƣợc bao gồm các chủng rg A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-
14) và rg A/Vietman/1203/2004 (CDCRG-1 and SJRG-161052) Các chủng này đã đƣợc sử dụng để sản xuất vắc-xin clade 1, thử nghiệm lâm sàng thành công và làm nguồn vắc-xin dự trữ quốc gia phòng đại dịch Vì chúng ta không thể biết trước được clade hoặc subclade nào s gây đại dịch nên việc giám sát thường xuyên các chủng lưu hành để chọn chủng cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin là cần thiết Trên cơ sở về vùng địa lý, dịch tễ học và đặc tính kháng nguyên của các chủng lưu hành trong vòng 12 tháng, những người có thẩm quyền s đƣa ra quyết định cho việc chọn chủng sản xuất vắc-xin phù hợp
1.3.4 Điều trị và dự phòng
Tại Việt Nam, dưới sự chỉ đạo của Bộ Khoa học và Công nghệ cùng Bộ Y tế, các nghiên cứu sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 cho người và gia cầm đã được triển khai Các chủng vắc-xin được cung cấp bởi WHO đã được sử dụng để sản xuất vắc-xin tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh và Công ty Vắc-xin và Sinh phẩm số 1 (VA IOTEC) Viện Pasteur áp dụng công nghệ nuôi cấy vi-rút cúm trên tế bào Vero và trứng gà có phôi, trong khi Công ty VA IOTEC sử dụng công nghệ nuôi cấy vi-rút trên tế bào thận khỉ tiên phát.
1.4 Các phươn pháp iải trình tự gen
1.4.1 Giải trình tự en theo phươn pháp Maxam và Gilbert Được phát minh vào năm 1977 là phương pháp giải trình tự gene theo phương pháp hóa học Tạo mạch khuôn DNA trên cơ sở đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ và biến tính tính phân tử DNA thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch đơn đƣợc đánh dấu phóng xạ đƣợc phân vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kĩ thuật xử lí hóa học đặc hiệu để phân cắt các mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotide, từ đó xác định trình tự DNA bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid
1.4.2 Giải trình tự en theo phươn pháp dideoxy của Sanger
Phương pháp này do F Sanger, Smith và Coulson phát hiện vào năm
Năm 1977, phương pháp tổng hợp DNA được phát triển dựa trên cơ chế tự nhiên trong cơ thể sinh vật Trong quá trình này, một lượng nhỏ ddNTP, với đặc điểm mất 2 nhóm OH ở carbon số, được bổ sung để hỗ trợ việc tổng hợp DNA.
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA, sự xuất hiện ngẫu nhiên của một ddNTP tại vị trí số 2 hoặc số 3 sẽ làm dừng phản ứng tổng hợp Kết quả là các chuỗi mạch đơn mới được tạo ra có độ dài khác nhau, chênh lệch nhau một nucleotide, từ đó giúp xác định trình tự của mạch khuôn.
1.4.3 Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động
Máy giải trình tự gen bán tự động và tự động hoạt động dựa trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F Sanger phát minh Thiết bị này sử dụng các mồi và ddNTP được đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, với mỗi loại ddNTP mang màu sắc riêng biệt Máy có khả năng tổng hợp các mạch đơn DNA mới từ cả hai mạch khuôn DNA, đồng thời sử dụng phần mềm tính toán để xử lý kết quả, giúp kiểm soát sai sót và đảm bảo độ chính xác cao trong quá trình giải trình tự gen.
CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu
-Tổng hợp nhân tạo gen kháng nguyên bề mặt NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin cúm gia cầm
Tách dòng gen NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 đã tạo ra vector tái tổ hợp pHW2000-NA clade 2.3.2.1C Vector này được sử dụng để tạo ra chủng vi-rút gốc, phục vụ cho việc phát triển vắc-xin phòng chống cúm A/H5N1 cho gia cầm thông qua kỹ thuật di truyền ngược.
- Sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen NA-N1 của chủng vi-rút cúm A H5/N1 clade 2.3.2.1C
- Nhân dòng đoạn gen NA – N1 của chủng vi-rút cúm H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000
- Kiểm tra sự có mặt của gen NA –N1 trong vector pHW2000
- Giải trình tự đoạn gen NA – N1 trong vector pHW2000
2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
Chủng vi-rút cúm A/duck/Viet Nam/HT-02/2014 (H5N1) (clade 2.3.2.1C)
- Hóa chất: Cao nấm men, trypton, agar, kháng sinh Amp, X- gal, EDTA, MgCl2, SDS 10%, Chloroform, trizol, acetat natri, ethanol, agarose, N2, NaCl, TAE, isoamylalcohol, NaOH, CaCl2,…
The study utilizes E coli DH5α cells sourced from the USA, along with the pHW2000 vector provided by St Jude Children's Research Hospital Additionally, restriction enzymes BsaI, NheI, SmaI, and T4 ligase are supplied by Fermentas/Thermo Scientific For sequencing, the igDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems is employed.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị và máy móc như tủ lạnh sâu, máy xác định trình tự DNA tự động ABI 310, nồi khử trùng Nhật Bản, box cấy vô trùng Sanyo, bộ nguồn điện di Bio-Rad, và bộ điện di DNA Advance Tech từ Nhật Bản đóng vai trò quan trọng Ngoài ra, máy soi chụp bản gel Pharmacia, pipettman của Gilson, máy li tâm Microcentrifuge-Sorvall từ Mỹ, lò vi sóng Samsung, máy lắc ổn nhiệt 37°C, máy khuấy từ RotoLab và OSI, cùng với máy khuấy trộn Vortex RotoLab và OSI, cũng như các loại cân phân tích 10-4 g và cân điện 10-2 g của Mettler Toledo, đều là những thiết bị thiết yếu trong quá trình nghiên cứu và phân tích.
Tách chiết RNA tổng số của vi-rút cúm
A/H5N1 Đo nồn độ OD của RNA đã tách chiết bằng máy quang phổ kế
Tổng hợp cDNA từ RNA của vi-rút
Khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên NA từ cDNA của vi – rút cúm A/H5N1
Nuôi cấy, chọn lọc Tách chiết AND tái tổ hợp và tinh sạch
Thiết kế gen NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1
Biến nạp vector pHW2000 mang gen NA vào vi khuẩn E.coli DH5
Xác định trình tự gen NA và phân tích gen NA
Quy trình phần I đã được thực hiện bởi một số nhóm trước đó, và đề tài của chúng tôi sẽ tiếp tục từ phần II Trong quy trình I, chúng tôi đã thiết kế trình tự cặp mồi nhân gen NA theo bảng [10].
2.2 Gen NA clade 1.1 và clade 2.3.2.1C sau khi thiết kế đƣợc đặt tổng hợp nhân tạo bởi hãng Phusa iochem dưới dạng lưu giữ trong vector pJET1.2.
2.4.1 Phươn pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli DH5
Phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt của Cohen (1972) sử dụng tế bào E.coli DH5α đã được xử lý để làm mỏng và yếu đi thành tế bào, tạo điều kiện cho plasmid dễ dàng thâm nhập vào nguyên sinh chất khi nhiệt độ thay đổi đột ngột Plasmid trong nguyên sinh chất sẽ nhân lên cùng với tế bào chủ khi được nuôi trong môi trường thích hợp.
Lấy tế bào khả biến từ tủ -80 độ C và để tan từ từ trong đá lạnh trong 10 -
Trong quy trình thực hiện, sau 15 phút, bổ sung 2 ul sản phẩm vào 50 ul tế bào khả biến và để trên đá trong 5 phút Tiếp theo, ủ ở 42 độ C trong bể ủ nhiệt chính xác trong 90 giây, sau đó đặt ngay vào đá trong 5 phút Cuối cùng, bổ sung 200 ul môi trường LB lỏng để nuôi lắc tế bào ở tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37 độ C trong 1 giờ.
2.4.2 Phươn pháp điện di trên gel agarose 1%
Phương pháp điện di trên gel agarose là kỹ thuật quan trọng trong việc phân tích, định tính và định lượng mẫu acid nucleic Do các acid nucleic mang điện tích âm, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương khi chịu tác động của điện trường Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự di chuyển của các acid nucleic về điện cực trái dấu dưới dòng điện một chiều Khả năng di chuyển của chúng trong gel với cùng nồng độ phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và cấu trúc không gian của DNA.
- Chuẩn bị gel agarose 1%: cho 1 g agarose vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống
Mục tiêu nghiên cứu
-Tổng hợp nhân tạo gen kháng nguyên bề mặt NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin cúm gia cầm
Tách dòng gen NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 đã tạo ra vector tái tổ hợp pHW2000-NA clade 2.3.2.1C Việc này nhằm phục vụ cho việc tạo chủng vi-rút gốc, góp phần phát triển vắc-xin phòng chống cúm A/H5N1 cho gia cầm thông qua kỹ thuật di truyền ngược.
Nội dung nghiên cứu
- Sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen NA-N1 của chủng vi-rút cúm A H5/N1 clade 2.3.2.1C
- Nhân dòng đoạn gen NA – N1 của chủng vi-rút cúm H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000
- Kiểm tra sự có mặt của gen NA –N1 trong vector pHW2000
- Giải trình tự đoạn gen NA – N1 trong vector pHW2000
Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
Chủng vi-rút cúm A/duck/Viet Nam/HT-02/2014 (H5N1) (clade 2.3.2.1C)
- Hóa chất: Cao nấm men, trypton, agar, kháng sinh Amp, X- gal, EDTA, MgCl2, SDS 10%, Chloroform, trizol, acetat natri, ethanol, agarose, N2, NaCl, TAE, isoamylalcohol, NaOH, CaCl2,…
The study utilized E coli DH5α cells sourced from the USA and the pHW2000 vector provided by St Jude Children's Research Hospital Essential restriction enzymes, including BsaI, NheI, SmaI, and T4 ligase, were supplied by Fermentas/Thermo Scientific For sequencing, the igDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems was employed.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và phân tích, các thiết bị và máy móc hiện đại đóng vai trò quan trọng, bao gồm tủ lạnh sâu, máy xác định trình tự DNA tự động ABI 310, nồi khử trùng Nhật Bản, box cấy vô trùng Sanyo, bộ nguồn điện di Bio-Rad, và bộ điện di DNA Advance Tech từ Nhật Bản Ngoài ra, máy soi chụp bản gel Pharmacia, pipettman các loại của Gilson, máy ly tâm Microcentrifuge Sorvall từ Mỹ, lò vi sóng Samsung, máy lắc ổn nhiệt 37°C, máy khuấy từ RotoLab OSI, và máy khuấy trộn Vortex RotoLab OSI cũng rất cần thiết Cuối cùng, các thiết bị cân phân tích 10-4 g và cân điện 10-2 g từ Mettler Toledo đảm bảo độ chính xác trong các thí nghiệm.
Tách chiết RNA tổng số của vi-rút cúm
A/H5N1 Đo nồn độ OD của RNA đã tách chiết bằng máy quang phổ kế
Tổng hợp cDNA từ RNA của vi-rút
Khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên NA từ cDNA của vi – rút cúm A/H5N1
Nuôi cấy, chọn lọc Tách chiết AND tái tổ hợp và tinh sạch
Thiết kế gen NA-N1 của vi-rút cúm A/H5N1
Biến nạp vector pHW2000 mang gen NA vào vi khuẩn E.coli DH5
Xác định trình tự gen NA và phân tích gen NA
Quy trình phần I đã được thực hiện bởi một số nhóm nghiên cứu trước đó, và đề tài này sẽ tiếp tục từ phần II Trong quy trình I, trình tự cặp mồi nhân gen NA đã được thiết kế theo bảng [10].
2.2 Gen NA clade 1.1 và clade 2.3.2.1C sau khi thiết kế đƣợc đặt tổng hợp nhân tạo bởi hãng Phusa iochem dưới dạng lưu giữ trong vector pJET1.2.
2.4.1 Phươn pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli DH5
Phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt của Cohen (1972) sử dụng tế bào E.coli DH5α đã được xử lý để làm mỏng và yếu thành tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho plasmid xâm nhập vào nguyên sinh chất khi có sự thay đổi nhiệt độ đột ngột Plasmid sẽ nhân lên cùng với tế bào chủ khi được nuôi trong môi trường thích hợp.
Lấy tế bào khả biến từ tủ -80 độ C và để tan từ từ trong đá lạnh trong 10 -
Trong quy trình thực hiện, hãy bổ sung 2 ul sản phẩm vào 50 ul tế bào khả biến và để trên đá trong 5 phút Sau đó, ủ hỗn hợp ở 42 độ C trong bể ủ nhiệt chính xác trong 90 giây, rồi ngay lập tức đặt vào đá trong 5 phút Cuối cùng, bổ sung 200 ul môi trường LB lỏng để nuôi lắc tế bào ở tốc độ 200 vòng/phút tại 37 độ C trong 1 giờ.
2.4.2 Phươn pháp điện di trên gel agarose 1%
Phương pháp điện di trên gel agarose là kỹ thuật quan trọng trong việc phân tích, định tính và định lượng mẫu acid nucleic Các acid nucleic, với bề mặt tích điện âm, di chuyển về phía cực dương khi chịu tác động của điện trường Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự di chuyển của acid nucleic về điện cực trái dấu dưới tác dụng của dòng điện một chiều Trong cùng một nồng độ gel, khả năng di chuyển của các phân tử này phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và cấu trúc không gian của DNA.
- Chuẩn bị gel agarose 1%: cho 1 g agarose vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống
Khi nhiệt độ đạt 50 độ C, hãy đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã cài răng lược sẵn Sau khoảng 30 phút để gel đông lại, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di Tiếp theo, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi dung dịch ngập cách mặt gel từ 1-2mm.
- Tra mẫu DNA: 4μl mẫu + 2μl loading Dye vào mỗi giếng
Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 20 phút, đồng thời quan sát sự di chuyển của màu sắc Thời điểm dừng điện di thường là khi loading dye đã di chuyển được khoảng 2/3 chiều dài của bản gel.
Để nhuộm gel bằng dung dịch EtBr, bạn cần lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 30 phút Sau đó, rửa gel qua nước và quan sát dưới ánh sáng tia UV.
2.4.3 Phươn pháp ắn sản phẩm PCR vào vector pHW2000
Sau khi thực hiện điện di kiểm tra trên gen agarose 1% và nhuộm với EtBr, các phân đoạn gen được phát hiện dưới máy soi gel bằng đèn UV Gen NA được phân lập với kích thước đúng theo lý thuyết để tiến hành tinh sạch bằng kit Đồng thời, phản ứng cắt và phân lập gen NA từ vector tái tổ hợp cũng được thực hiện, trong đó vòng vector pHW2000 được cắt mở bằng enzyme BsaI để tiến hành ghép nối gen.
NA clade 2.3.2.1C được đưa vào vector pHW2000 để tạo ra vector tái tổ hợp, sử dụng enzyme T4 ligase Enzyme này, được chiết xuất từ vi khuẩn E.coli nhiễm phage, là loại enzyme phổ biến trong kỹ thuật nối DNA Nó có khả năng nối các đoạn DNA đầu bằng và đầu dính, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 37°C, nhưng thường được sử dụng ở nhiệt độ thấp hơn để bảo vệ sự ổn định của các đoạn kết cặp ngắn.
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng ligation Thành phần Thể tớch (àl)
2.4.4 Phươn pháp PCR khuếch đại đoạn gen NA
Phản ứng PCR khuếch đại gen NA sử dụng hai cặp mồi: cặp mồi đặc hiệu cho gen NA (Ba-NA-F và Ba-NA-R) và cặp mồi đặc hiệu cho vector pHW2000 (pHW2000-F và pHW2000-R), với trình tự các cặp mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi [10]
Gen/vector Mồi Trình tự các cặp mồi
NA Ba-NA-R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT pHW2000 pHW2000F CGACTCACTATAGGGAGACCCAAGC pHW2000R ACAGGTGTCCGTGTCGCGCGTCGCC
Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94 độ C/5 phút, 30 chu kỳ (94 độ C/30 giây,
58 độ C/30 giây, 72 độ C/1 phút 30 giây), 72 độ C/10 phút, 4 độ C/∞
Chọn các khuẩn lạc màu trắng và nuôi cấy trong lọ penicillin với 2ml môi trường LB lỏng có chứa Amp (nồng độ 100 µg/ml) Tiến hành nuôi lắc qua đêm ở 37 độ C với tốc độ 200 vòng/phút.
- Lấy 1,5ml dịch nuôi vào ống Eppendorf
- Ly tâm 12000v/p, trong 1 phút loại dịch, thu tế bào
- Bổ sung 150àl Sol I (Tris - HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0), trộn đều bằng máy vortex
- Bổ sung 150àl Sol II (200mM NaOH + SDS 1 ), đảo nhẹ
- Bổ sung 150àl Sol III (Kac - Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ
- Bổ sung 450àl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ
- Hỳt dịch nổi chuyển sang Eppendorf mới, bổ sung 40àl NaOAc 3M, pH=5,2 và 1000àl ethanol 100 Để -20 o C trong 2 giờ tủa DNA plasmid
- Ly tâm 12000v/p, 30 phút, loại dịch nổi thu cặn
- Rửa cặn bằng 500àl ethanol 70%
- Hũa cặn DNA trong 40 àl TE - RNAase (100àg/ml)
- Ủ ở bể ổn nhiệt 37 o C trong 1h loại RNA
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
2.4.6 Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
- Bổ sung 100àl Binding Buffer vào 100àl plasmid, trộn đều
- Bổ sung tiếp 100àl isopropanol 100% vào hỗn hợp trờn, trộn đều
- Chuyển 300àl hỗn hợp trờn lờn cột A/B, ly tõm với tốc độ 10.000 v/p Loại dịch ở cột B
- Bổ sung dung dịch Wash buffer 100àl lờn cột, ly tõm 10.000v/p
- Đổ hết phần dịch, ly tâm tiếp 12.000v/p
- Chuyển cột A sang cột B mới
- Bổ sung 50 àl nước giữ ở nhiệt độ phũng 10 phỳt để thu plasmid
- Điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 1%
2.4.7 Phươn pháp iải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
The process of determining gene sequences using the ABI PRISM® 3100-Avant™ Genetic Analyzer from Applied Biosystems involves utilizing the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Step 1 entails performing a synthesis reaction with the components outlined in Table 2.3, which details the necessary reagents for sequence determination.
Chu trình nhiệt đƣợc thực hiện nhƣ sau: 96 0 C 1 phút, 96 0 C 10 giây, 50 0 C
5 giây, 60 0 C 4 phút, 25 chu kỳ , 60 0 C 4 phút, kết thúc ở 4 0 C
- ƣớc 2: Tinh sạch sản phẩm sau khi tổng hợp
Nước khử ion vô trùng 5,725
+ ổ sung 60l Ethanol 100 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
+ Ly tâm 12000 v/p trong 20 phút, thu cặn
+ Rửa cặn bằng 60l Ethanol 70% Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút, thu cặn + Làm khô cặn trong 10 phút bằng máy Speed vac
- ƣớc 3: Xác định trình tự trên máy tự động A I 3100 Avant.
Phương pháp nghiên cứu
Trình tự nucleotide gen NA-N1 của clade 2.3.2.1C và clade 1.1 được thiết kế dựa trên gen NA từ các chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009 (H5N1) và A/duck/Vietnam/HT-02/2014 (H5N1), có kích thước 1453 bp, bao gồm 1 vùng mã hóa 1350 bp và 2 vùng không mã hóa Vùng mã hóa chứa 1347 bp mã hóa 449 amino acid, trong khi 3 bp còn lại tương ứng với bộ ba kết thúc không mã hóa Hai vùng không mã hóa có kích thước 46 bp và 57 bp, với các nucleotide in nghiêng là vị trí gắn mồi trong PCR và nucleotide gạch chân là điểm nhận biết của enzyme BsaI Cấu trúc gen NA cho phép PCR tạo sản phẩm đặc hiệu 1434 bp So sánh trình tự amino acid giữa clade 1.1 và 2.3.2.1C cho thấy độ tương đồng 92%, với cả hai clade mã hóa protein NA gồm 449 amino acid, đảm bảo chức năng và tính kháng nguyên của protein.
Vị trí thực hiện chức năng xúc tác của neuraminidase (NA) được xác định bởi 7 amino acid quan trọng trên bề mặt của 4 tiểu đơn vị hợp thành đầu tetramer, bao gồm Arg (R) - 98, Asp (D) - 131, Glu (E) - 258, Arg (R) - 273, Arg (R) - 348, Tyr (Y) - 382, và Glu (E) - 405 Các nghiên cứu về trình tự gen NA của vi-rút H5N1 thuộc clade 1.1 và clade 2.3.2.1C đã được công bố trên ngân hàng NCBI (National Center for Biotechnology Information).